KR20140052626A

KR20140052626A - 식물의 건조 스트레스 저항성을 증가시키는 조성물 및 이를 이용한 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR20140052626A
Application number: KR1020120118961A
Authority: KR
Inventors: 김성룡
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2014-05-07

Abstract

본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스(abiotic stress) 저항성 향상용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물세포 또는 식물체, 그리고 상기 형질전환 식물세포 또는 식물체의 제조방법을 제공한다. 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 건조(drought) 스트레스에 대한 식물체의 저항성 증대에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환 하면 상술한 스트레스에 대한 식물체의 저항성이 증가하여 식물체 재배 지역의 한계 극복할 수 있으며, 벼에 적용될 경우 건조 스트레스에 강한 벼의 생산이 가능하여 생산력을 극대화시킬 수 있다.

Description

식물의 건조 스트레스 저항성을 증가시키는 조성물 및 이를 이용한 형질전환 식물체{Compositions for Enhancing Drought Stress Tolerance and Transgenic Plants Using the Same}

본 발명은 식물의 건조 스트레스 저항성을 증가시키는 조성물 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다.

건조(drought), 고염 및 콜드(cold) 같은 환경 스트레스들은 직접적으로 곡물의 성장 및 생산에 해로운 효과들을 야기한다. 많은 식물체들에서 다양한 유전자들의 발현은 상술한 스트레스들에 의해 유도되었다(Ingram and Bartels, 1996; Thomashow, 1999; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000). 상기 유전자들은 스트레스 저항성, 유전자 발현의 조절 및 스트레스 시그널 트랜스덕션(stress signal transduction)에서 중요한 기능들을 한다(Xiong, et al ., 2002; Shinozaki, et al ., 2003). cis- 및 trans-조절 엘리먼트들(cis- and trans-acting elements)은 스트레스-유도성 유전자들의 발현에 중요한 스트레스-반응 기작들을 연구하기 위해 동정되어 왔다. C-반복/탈수-반응성 엘리먼트(C-repeat/dehydration-responsive element, CRT/DRE) 및 저온-반응성 엘리먼트(low temperature-responsive element, LTRE)은 많은 스트레스-유도성 유전자들의 스트레스-유도의 조절에 중요한 cis-조절 엘리먼트이다(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994; Baker, et al ., 1994; Jiang, et al ., 1996). CRT/DRE 결합인자(CBF/DREB)는 trans-조절 엘리먼트 중에서 중요한 스트레스-반응성 전사인자로서 보고되었다. 상기 결합인자는 스트레스-유도성 유전자의 프로모터 내 CRT/DRE 서열에 특이적으로 결합하여 유전자들의 발현을 활성화시킨다(Stockinger, et al ., 1997; Liu, et al ., 1998; Dubouzet, et al ., 2003; Qin, et al ., 2004). 상기 결합인자는 DNA-결합 단백질들의 AP2/EREBP 패밀리에 속한다(Riechmann and Meyerowitz, 1998). AP2/EREBP 패밀리는 5개의 그룹으로 분류되었다: APETAL2(AP2) 서브패밀리, RAV 서브패밀리, DREB 서브패밀리, ERF 서브패밀리 및 다른 하나의 서브패밀리. 또한, DREB 서브패밀리는 6개의 그룹으로 추가적으로 분류되었다. 이중, CBF/DREB1 및 DREB2을 포함하는 2개의 그룹이 가장 큰 그룹을 구성하였다(Sakuma, et al ., 2002). 아라비돕시스에서, CBF/DREB1 유전자들은 콜드 스트레스에 의해서는 유도되지만, 건조 또는 염 스트레스에 의해서는 유도되지 않는다(Liu, et al ., 1998; Shinwari, et al ., 1998). 이와 대조적으로, DREB2 유전자들은 건조 및 염 스트레스에 의해 유도되는 반면에 콜드 스트레스에 의해서는 유도되지 않는다(Liu, et al ., 1998; Nakashima, et al ., 2000). 최근 연구들은 CBF/DREB-포함 시그널링 경로도 다양한 식물 종들에서 잘 보존되어 있다는 것을 보여주고 있다. 이제까지, CBF/DREB1 전사인자들은 카놀라(canola), 밀 및 벼를 포함하는 많은 식물들에서 동정되었으며, 모두 콜드 스트레스에 의해 빠르게 유도되었다(Jaglo, et al ., 2001; Dubouzet, et al ., 2003; Qin, et al ., 2004; Skinner, et al., 2005).

벼는 전세계 인구를 위해 가장 중요한 기본 곡물이다. 하지만, 벼의 스트레스들에 대한 민감성은 낮은-생산성(low-productivity)을 초래한다. 이에, 상기 식물체에서 스트레스 기작을 이해하고 스트레스 저항성을 증대시키는 것이 매우 중요하다. 이를 위한 많은 후보 유전자들 중에서, CBF/DREB1 전사인자들이 매우 유용한데, 이는 상기 전사인자들이 스트레스-시그널링에서 다운스트림 유전자들의 조절에 중요한 인자들이기 때문이다. 현재까지, 9개의 벼 CBF/DREB1 상동체들(OsDREB1s)이 동정되었다(Dubouzet, et al., 2003; Chen, et al ., 2003; Skinner, et al ., 2005). 이들 중, 6개의 OsDREB1 유전자들은 스트레스 저항성 관련 기능을 조사하기 위한 트랜스제닉 접근방법들을 이용하여 분석되었다. 벼 및 담배에서, OsDREB1A 및 OsDREB1B의 과다발현(overexpression)은 다양한 비생물적(abiotic) 스트레스에 대한 스트레스 저항성을 초래했다(Ito, et al ., 2006; Gutha and Reddy, 2008). 또한, OsDREB1D를 과다발현하는 트래스제닉 아라비돕시스 식물체는 콜드 및 염에 대한 스트레스 저항성을 나타냈다(Zhang, et al ., 2009). OsDREB1E, OsDREB1F 및 OsDREB1G을 과다발현하는 트랜스제닉 벼 식물체들은 다양한 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 나타냈다(Wang, et al ., 2008; Chen, et al ., 2008).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 비생물적 스트레스(abiotic stress)에 대하여 식물체의 내성(저항성)을 증진시킬 수 있는 방법을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 벼(Oryza sativa)로부터 비생물적 스트레스(바람직하게는, 건조(drought) 스트레스)에 의해 유도되는 OsDREB1D( O ryza s ativa Dehydration Responsive Element Binding 1D) 유전자가 상술한 스트레스 저항성을 증가시키고 이를 이용하여 형질전환 식물체를 제조한 경우에 증대된 스트레스 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 획득할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 식물체의 비생물적 스트레스(abiotic stress) 저항성 향상용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 OsDREB1D 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 비생물적 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 제조방법에 따라 제조된 비생물적 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스(abiotic stress) 저항성 향상용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 비생물적 스트레스에 대하여 식물체의 내성(저항성)을 증진시킬 수 있는 방법을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 벼로부터 비생물적 스트레스(바람직하게는, 건조 스트레스)에 의해 유도되는 OsDREB1D 유전자가 상술한 스트레스 저항성을 증가시키고 이를 이용하여 형질전환 식물체를 제조한 경우에 증대된 스트레스 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 획득할 수 있음을 확인하였다.

비생물적 스트레스는 식물체의 성장 및 발달에 매우 해로운 영향을 미치며, 콜드(cold) 스트레스, 건조(drought) 스트레스 및 염(salt) 스트레스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "콜드 스트레스(cold stress)"는 저온, 바람직하게는 15℃ 이하, 보다 바람직하게는 10℃ 이하, 보다 더 바람직하게는 7℃ 이하, 가장 바람직하게는 4℃ 이하의 온도에 의한 스트레스를 의미하며, 이에 따른 식물체의 표현형으로는 잎의 팽창(expansion), 시들음(leaf-wilting), 백화(chlorosis) 및 괴사(necrosis)를 포함할 뿐 아니라, 생식기관의 성장 및 발달에 해로운 영향을 미친다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 콜드 스트레스는 2℃에서 40시간 동안 식물체에 가함으로써 실시하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서의 용어 "건조 스트레스(drought stress)"는 물의 부족/결핍(water deficit)에 의한 스트레스를 의미한다. 상기 건조 스트레스는 정상적인 이중막(lipid bilayer)에 구멍이 뚫리는 현상을 유도하며, 최종적으로 이의 파괴를 초래한다. 보다 상세하게는, 물의 부족/결핍은 이중막 내 막 단백질의 구성의 변화를 유도하여 막 통합성(membrane integrity) 및 선택성(selectivity), 세포 내 구획화(cellular compartmentalization )의 파괴, 그리고 효소 활성의 소실을 야기한다. 이 외에도, 세포질 및 소기관 단백질들은 탈수화의 정도에 따라 활성 감소 또는 분해를 거친다. 또한, 탈수에 따른 세포 내 전해질의 증가는 세포 내 대사과정의 파괴를 초래할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 건조 스트레스는 물을 36시간 동안 결핍시킴으로써 실시하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 비생물적 스트레스에 대한 식물체의 내성(저항성) 개선을 위하여 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열(GenBank Accession number, AY785895)이다. 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자(nucleic acids)"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 비생물적 스트레스(바람직하게는, 건조 스트레스)-유도성 OsDREB1D 단백질을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 70% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 보다 더욱더 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명은 ClustalX 및 NJ(neighbor-joining) 알고리즘을 이용한다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul, et al ., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 전달체는 (a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, et al ., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, p_L ^λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgtㆍλ4B, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 OsDREB1D 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 유전자는 식물에서 분리되었고, 비생물적 스트레스(바람직하게는, 건조 스트레스)에 대한 식물체의 내성을 증진하는 작용을 할 수 있으므로, 식물에 대하여 가장 바람직한 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 벡터가 식물 세포에 적용되는 경우, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트(ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터, BCB(blue copper binding protein) 프로모터, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터 및 PM 프로모터를 포함한다. 가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 프로모터는 옥수수의 유비퀴틴 프로모터(Pubi)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 튜메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것(NOS 3' end)(Bevan, et al ., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 노팔린합성효소(nopaline synthase) 유전자의 종결서열(Tnos)이다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 또는 제초제(예: 바스타)에 대한 내성 유전자(예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(npt), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hpt), 등)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.

본 명세서에서 용어 "바이너리 벡터(binary vector)"는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) AGL1이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method), 열충격법(heat shock) 및 냉동-해빙법(freeze-thaw method) 등이 있으며, 가장 바람직하게는 냉동-해빙법(freeze-thaw method)을 이용한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물에 의해 형질전환된 형질전환 식물세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 형질전환 식물세포 및 식물체는 상술한 본 발명의 벡터를 이용하여 제조되기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 한편, 본 발명의 OsDREB1D 유전자는 식물에서 유용성이 크기 때문에, 상기 형질전환체는 세포 뿐만 아니라, 식물 세포 또는 조직으로부터 유래된 캘러스를 포함한다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현되며, 이러한 경우에는 다량의 비생물적 스트레스(바람직하게는, 건조 스트레스)-유도성 OsDREB1D 단백질을 얻게 된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비생물적 스트레스(abiotic stress) 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다: (a) 식물 세포 또는 식물 조직을 상술한 조성물로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포 또는 식물조직을 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포 또는 식물조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 제조방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스(abiotic stress)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물세포 또는 식물체를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물체의 제조방법은 상술한 본 발명의 조성물을 이용하여 제조되기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton, et al ., Cell, 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol . Genet . 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미국 등록특허 제5,004,863호, 제5,349,124호 및 제5,416,011호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

본 명세서에서 용어 "식물(체)(plants)"는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있으며, 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 건조 스트레스에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우 건조 스트레스에 대한 저항성을 높이는 데 효과적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용된다.

본 발명에서 이용되는 익스플랜트로는 식물 세포 또는 식물 조직이며, 식물 조직을 이용하는 경우에는 캘러스를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공(Neumann, E., et al ., EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트(Yang, et al ., Proc. Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 및 아그로박테리움-매개된 형질전환(미국 등록특허 제 5,004,863호, 제5,349,124호 및 제5,416,011호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-매개된 형질전환이 가장 바람직하다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(미국 등록특허 제5,004,863호, 제5,349,124호 및 제5,416,011호).

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: (i) 본 발명의 OsDREB1D 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ii) 상기 (i)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (iii) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.

식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜메파시엔스를 가지고 실시된다(Depicker, A., et al ., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York(1983)).

보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320, pGA1611 및 pGA1991과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다(An, G., et al ., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); An et al., 1988; 및 Lee et al., 1999). 본 발명에 적합한 바이너리 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (iii) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 바이너리 벡터에 이용되는 프로모터의 예는 옥수수 유비퀴틴 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 1 프로모터, 2 프로모터 및 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아그로박테리움 튜메파시엔스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테이룸 튜메파시엔스의 배양물에 익스플랜트를 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이를 통해 아그로박테이룸 튜메파시엔스는 식물내로 감염된다.

아그로박테이룸 튜메파시엔스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 최종적으로 형질전환 식물체를 형성한다.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다(Maniatis, et al ., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)).

본 발명의 OsDREB1D 유전자 및 단백질은 식물체에 비생물적 스트레스(바람직하게는, 건조 스트레스)에 대한 내성(저항성)을 증진하는 데 매우 유효하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스(abiotic stress) 저항성 향상용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물세포 또는 식물체, 그리고 상기 형질전환 식물세포 또는 식물체의 제조방법을 제공한다.

(b) 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 건조(drought) 또는 염(salt) 스트레스에 대한 식물체의 저항성 증대에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환 하면 상술한 스트레스에 대한 식물체의 저항성이 증가하여 식물체 재배 지역의 한계 극복할 수 있으며, 벼에 적용될 경우 건조 스트레스에 강한 벼의 생산이 가능하여 생산력을 극대화시킬 수 있다.

도 1은 OsDREB1들에 대한 유사성 트리 분석 결과이다. 9개의 OsDREB1들의 유도된 아미노산 서열들이 비교되었다. 상기 트리는 ClustalW 및 MEGA 2.1 소프트웨어의 NJ(neighbor-joining) 알고리즘을 이용하여 제작하였다.
도 2는 다양한 스트레스에 대한 OsDREB1 유전자들의 발현 패턴을 RT-PCR로 분석한 결과이다. RT-PCR 분석을 위해, 지정된 시간에 스트레스-처리된 모종(seedling)으로부터 추출한 총 RNA를 템플레이트로 이용하였다. OsDREB1A, OsDREB1C, OsDREB1D, OsDREB1E, OsDREB1G, OsDREB1I 및 OsDREB1J에 대해 특이적인 프라이머들이 이용되었다. RAc1은 PCR 대조군으로 이용하였다. 약어: C, 대조군; 콜드(cold), 4℃; 건조(drought), 공기 중 건조(air-drying); 염(salt), 250 mM NaCl; g, PCR 템플레이트로서 게놈(genomic) DNA.
도 3은 OsDREB1D 과다발현(OX) 라인들의 제조를 보여주는 결과이다. 도 3a는 벼 형질전환에 이용된 과다발현용 바이너리 벡터(binary vector)의 맵을 보여주는 도식도이다. OsDREB1D의 ORF(open reading frame)을 포함하는 DNA 단편이 증폭되어 Pubi와 Tnos의 사이로 삽입시켰다. 약어: Pubi, 옥수수 유비퀴틴 프로모터; P35S, CaMV 35S 프로모터; Tnos, 노팔린합성효소(nopaline synthase) 유전자의 종결서열; T7, 전사체 7의 종결서열; hph, 트랜스제닉 벼 켈러스(callus)의 선택을 위한 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phophotransferase) 유전자; 그리고 RB(right border) 및 LB(left border), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-유래 Ti 플라스미드의 각각 오른쪽 및 왼쪽 인접서열(border sequences). 도 3b는 삽입된 OsDREB1D 유전자의 확인을 위한 트랜스제닉 식물체들의 게놈 DNA PCR 결과를 보여준다. 변형된 CTAB 방법을 이용하여 모든 트랜스제닉 식물체들로부터 게놈 DNA가 분리되었다. PCR은 유전자-특이적 프라이머 쌍을 이용하여 실시하였다. 야생형(wild-type) 식물은 음성 대조군으로 이용하였으며, OsDREB1D 유전자를 포함하는 플라스미드가 양성 대조군으로 이용하였다. 도 3c는 벼 게놈에 도입된 OsDREB1D 유전자의 과다발현 여부를 조사하기 위해 재분화된 식물체들의 RT-PCR 분석 결과를 보여준다. 모종으로부터 추출한 총 RNA를 이용하여 cDNA가 합성되어 OsDREB1D-특이적 프라이머 쌍으로 PCR 템플레이트로 이용하였다. 벼 액틴 유전자인 RAc1가 PCR 대조군으로 이용되었다. 약어: NT, 혈질전환을 통해 분리된 야생형; WT, 야생형; 및 +ve, OsDREB1D 유전자를 포함하는 벡터.
도 4는 OsDREB1D의 다운스트림 유전자들의 발현 분석 결과이다. OsDREB1D, OsDhn1, lip9, lip5, Oslti32/Oslti6b, OsEF1 -α 및 RAc1 프라이머 쌍을 이용하여 Ubi::OsDREB1D 라인에서 실시한 RT-PCR 분석 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

식물 재료, 성장 조건 및 스트레스 처리

벼(Oryza sativa cv. 동진) 씨앗을 표면-살균하고, 2일 동안 암 조건에서 발아시켰다. 모종(seedling)을 식물 재배 챔버(29℃/21℃, 16 시간 광주기)상의 흙에서 8일 동안 더 성장시킨 후, 상기 모종에 저온 스트레스(2℃, 40시간), 건조 스트레스(36시간) 및 염(100 mM NaCl, 6일) 스트레스를 가하였다.

플라스미드 구축 및 식물 형질전환

전체 OsDREB1D ORF(complete open reading frame)의 DNA 단편을 바이너리 벡터 pGA1611(Kang, at al., 1998) 및 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 가진 pSK349에 삽입하였다. 형질전환은 아그로박테리움-매개된 공동-배양 방법을 이용하였다(Hiei, et al ., 1994; Lee, et al ., 1999).

OsDREB1 유전자의 지노믹 DNA 분석 및 RT - PCR 분석

모든 형질전환체로부터 변형된 CTAB법을 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 간략하게는, 균질화(homogenization) 후 추출 완충액 조직 파우더에 첨가하였다. RNAse A(5 mg/ml)를 첨가하여 RNA 오염을 방지하였다. DNA는 이소프로판올을 사용하여 침전시킨 후, DNA 펠렛(pellet)을 70% 에탄올로 세척하였다. 상기 펠렛을 공기 중에서 건조시킨 후 멸균된 뉴클리아제-부재(free) 물에 현탁시켰다. 유전자 삽입의 확인은 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 실시하였다: 5'-GATGGGCACGTCTGACACCG-3' 및 3'-GTCCGCGCCTACCTCCTCCATT-5'. 야생형 식물체를 음성 대조군으로, OsDREB1D 유전자를 포함하고 있는 플라스미드를 양성 대조군으로 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 35 사이클; 및 63℃의 어닐링 온도.

전체 RNA는 트라이졸 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 추출하였으며, cDNA는 제조자의 지시에 따라 cDNA 합성 키트를 이용하여 합성하였다(Solgent, 대한민국). PCR은 유전자-특이적 프라이머인 5-GATGGGCACGTCTGACACCG-3 및 3-GTCCGCGCCTACCTCCTCCATT-5를 사용하여 30 사이클 및 63℃의 어닐링 온도 조건으로 실시하였다. 야생형 식물체를 음성 대조군으로, 게놈 DNA를 양성 대조군으로 사용하였다. 반-정량적(semi-quantitative) RT-PCR 분석을 위해, 본 발명자들은 대조군으로 벼 액틴 유전자인 RAc1과 연장인자 유전자인 OseEF-1(McElroy, et al., 1990; Jain, et al., 2006)에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하였다(표 1).

클로닝 및 RT-PCR 분석에 이용된 프라이머 서열들.

프라이머

뉴클레오타이드 서열

OsDREB1A -정방향
OsDREB1A-역방향
OsDREB1B-정방향
OsDREB1B-역방향
OsDREB1C-정방향
OsDREB1C-역방향
OsDREB1D-정방향
OsDREB1D-역방향
OsDREB1E-정방향
OsDREB1E-역방향
OsDREB1G-정방향
OsDREB1G-역방향
OsDREB1H-정방향
OsDREB1H-역방향
OsDREB1I-정방향
OsDREB1I-역방향
OsDREB1J-정방향
OsDREB1J-역방향
OsDREB2A-정방향
OsDREB2A-역방향
OsDREB1A-정방향(RT-PCR 분석용)
OsDREB1A-역방향(RT-PCR 분석용)
OsDREB1D-정방향(RT-PCR 분석용)
OsDREB1D-역방향(RT-PCR 분석용)
OsDREB1E-정방향(RT-PCR 분석용)
OsDREB1E-역방향(RT-PCR 분석용)
OsDREB1G-정방향(RT-PCR 분석용)
OsDREB1G-역방향(RT-PCR 분석용)
OsDREB1J-정방향(RT-PCR 분석용)
OsDREB1J-역방향(RT-PCR 분석용)
OsDhn1-정방향
OsDhn1-역방향
lip9-정방향
lip9-역방향
OseEF -1-정방향
OseEF -1-역방향
RAc1-정방향
RAc1-역방향

5'-CAAATACAGTTCAGGAATCAGGAGCAA-3'
5'-AACTTGTTCCATCACATTACCGAAAGTAG-3'
5'-AGAGAGTCATCCATGGAGGTGGA-3'
5'-AAATTTACAGGAATTCATTGACTGCAC-3'
5'-CAGCAACACACACTACTGACATGGA-3'
5'-ACTCCCTACCAGCTCAGCCATTTTAT-3'
5'-ACTGCTTGAGACGTCGCAC-3'
5'-GGTTCAGCTGCTGGACCG-3'
5'-CCAAGTCGGATAATTTCAAATCC-3'
5'-CTCATCAGGGCTGGTTCG-3'
5'-CTTACTCGTGTTTAGGCATGGACGTTTCT-3'
5'-GCCAAACCAAGTTGAGTTCAAACG-3'
5'-ACAAGCTCCTCCATCTCTCG-3'
5'-TGAAAACTGAGCTCTGAAAGTG-3'
5'-ACCACCACCTCCAAATTC C-3'
5'-TCTTTTATGTACAAGAGCATGACG-3'
5'-GCGACATGGAGAAGAACACC-3'
5'-ATTTGATGCTAGCTCCACAGC-3'
5'-CAACTCTGGCTGCACATCAG-3'
5'-GACAGAGTAAGCTCATTAAATATAG-3'
5'-AACTTCGCCGACTCCGCGTG-3'
5'-GGCATCGGAAGCCAGAAAAGAGAGA-3'
5'-GATGGGCACGTCTGACACCG-3'
5'-GTCCGCGCCTACCTCCTCCATT-3'
5'-CCTTGTCGAGTGAACTGATCCATCG-3'
5'-CCGTCCATCGGGTAGCAAGGG-3'
5'-CGCACGGCAAGCAGCGGATA-3'
5'-ACCTACGGCAGGATCACAGGC-3'
5'-CAGGAGACGAGGCACCCGGT-3'
5'-AAACCCTCAGCGGTGGTCGG-3'
5'-AGCTCAAACAAGTCAAGAGC-3'
5'-AAGCACCAAACTAACACACG-3'
5'-ATGGCCACTCCTGCTCCC-3'
5'-CCAGCCCAAAACCAATACAA-3'
5'-CCACACCTCCCACATTGCCGTC-3'
5'-ACGACACAGTGCACACAGCGAG-3'
5'-CATGCTATCCCTCGTCTCGACCT-3'
5'-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT-3'

실험결과

OsDREB1 유전자 패밀리의 동정

벼에서 CBF/DREB1 유전자 패밀리를 동정하기 위하여, 본 발명자들은 쿼리(query)로 OsDREB1A(Dubouzet, et al., 2003)의 보존된 아미노산 잔기를 이용하였다. 그 결과, 6e^-20의 E-값(value)으로 7개의 게놈 서열(genomic sequence)이 검색되었으며, 상기 서열들은 아노테이션 툴(annotation tool)에 따라 CBF/DREB1을 인코딩하는 잠재적 유전자를 포함하는 것으로 추정하였다. 본 연구를 통해 9개의 OsDREB1 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자는 모두 공지된 것이었다(Dubouzet, et al., 2003; Skinner, et al., 2005). 하지만, Skinner 등(2005)의 연구와는 달리, 본 발명자들은 OsDREB1F를 발견할 수 없었는데, 이는 사용된 쿼리 및 데이터베이스의 차이에서 기인하는 것으로 예상된다. 모든 추론된 아미노산 서열은 선행연구에서와 같이 CBF/DREB1-타입 단백질에서 특이적으로 발견되는 NLS 및 AP2와 같은 보존된 도메인을 포함하였다. 또한, 게놈 서열 검색 및 아노테이션 툴을 이용하여 OsDREB1 유전자의 게놈 구조를 동정하였다(도 1). OsDREB1D, OsDREB1J 및 OsDREB1I 유전자들은 이들의 코딩 서열을 가지지 않는 탠덤 어레이(tandem array)로 구성될 수 있는 것으로 알려졌다.

다양한 스트레스에 따른 OsDREB1 유전자의 발현 분석

다양한 무생물적 스트레스하의 OsDREB1 유전자의 발현을 분석하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다(도 2). OsDREB1A와 OsDREB1E는 모두 콜드-처리 3시간 후 발현이 크게 증가하였으며, 상기 발현은 24시간까지 점차 감소되었다. 하지만, 상기 유전자들의 발현은 24시간 동안의 건조(drought) 처리 및 염 처리에 의해 유도되지 않았다. 한편, OsDREB1D는 건조 스트레스 처리에 의해 현저하게 유도되었으며, 콜드 처리에 의해 매우 극소하게 유도되었다. OsDREB1J는 콜드 및 염 처리 3시간 후 일시적으로 유도되었다. OsDREB1D 및 OsDREB1J는 염 및 콜드 처리에 반응하지 않았다. 또한, 일과성 어세이(transient assay)에서 약한 OsDhn1 프로모터 활성을 보였던 OsDREB1G는 콜드 처리 및 건조 스트레스에 반응하였다(결과를 보이지 않음).

OsDRE1D 과발현( OX ) 라인의 구축

본 발명자들은 Ubi :: OsDREB1D(pSK349; 도 3a)를 구축하여 형질전환 식물체에서 OsDREB1D의 기능을 조사하였다. 4개의 Ubi::OsDREB1D 형질전환 식물체 라인들이 독립적으로 분화되어 성숙한 식물체로 성장시켜 종자를 수득하였다. 도 3b에서 보는 바와 같이, 유비퀴틴 프로모터 및 OsDREB1D 서열을 검출할 수 있는 특이적 프라이머를 사용하여 형질전환체로부터 추출한 게놈 DNA의 PCR을 실시하였을 때, Ubi::OsDREB1D 컨스트럭트의 트랜스유전자가 3개의 라인에서 검출되었다. OsDREB1D의 이상 발현(ectopic expression)은 모종(seedling)의 RT-PCR에서도 관찰되었다(도 3c). 야생형 또는 형질전환 후 분리된 야생형(NT)과 비교하였을 때, 상기 트랜스제닉 라인은 강한 OsDREB1D 발현을 나타내었는데, 이는 상기 라인이 트랜스제닉 식물체라는 것을 의미한다.

OsDREB1D OX 라인의 비생물적 스트레스-저항성 측정

OsDREB1D 과다발현이 아라비돕시스에서 스트레스 저항성을 증가시킨다는 보고가 있었지만(Zhang, et al ., 2009), OsDREB1D 과다발현이 벼에서 스트레스 저항성과 관련된 어떠한 변화를 초래하는 지 여부는 알려져 있지 않았다. 물이 제거된 건조(drought) 스트레스 저항성 실험에서, 74번 라인은 잎-시들음(leaf-wilting) 및 잎-재성장(leaf-regrowth; 표 2)로 판단했을 때, 야생형 또는 분리 야생형(NT) 식물체와 비교하여 강한 저항성을 나타내었다. 표 2의 염 스트레스 결과에서 보는 바와 같이, 상기 라인은 100 mM NaCl을 6일 동안 처리했을 때도 증가된 염 저항성을 나타내었다. 하지만 콜드 스트레스 저항성 실험에서는, 본 발명자들은 잎-시들음 및 잎-재성장에 있어 어떠한 중요한 차이점도 발견할 수 없었다(표 2의 콜드 스트레스 결과).

스트레스 저항성 테스트.

현상	Ubi :: OsDREB1D			WT	74 NT
현상	74	75	76	WT	74 NT
건조 스트레스
잎-시들음	25/43^*	30/41	40/40	38/45	40/43
잎-재성장	33/43^*	34/41^*	0/40	20/45	7/43
염 스트레스
잎-시들음	29/64^*	46/65	49/64	49/64	46/64
잎-재성장	3/64	1/65	10/64	10/64	17/64
콜드 스트레스
잎-시들음	45/64	60/64	52/64	49/62	50/64
잎-재성장	23/64	15/64	18/64	16/62	19/64

10일된 Ubi::OsDREB1D(7A130b, 7AA241 및 7A244) 식물체에 (a) 건조 스트레스(물 없이 36시간), (b) 염 스트레스(6일 동안 100 mM NaCl 처리) 및 (c) 콜드 스트레스(2℃에서 40시간)를 처리하여 3번째 잎-시들음(leaf-wilting) 및 5번째 잎-재성장(leaf-regrowth)에 대해 조사하였다. 표시: *, 카이 스퀘어(chi square) 분석에 의해 계산된 스트레스 저항성 결과에 대한 통계적 유의성(P > 0.05).

추가논의사항

CBF/DREB1 패밀리 유전자들은 많은 식물체에서 스트레스-반응 및 저항성에 중요한 것으로 보고되어 왔다. 따라서, 본 발명자들은 벼의 CBF/DREB1 유전자 패밀리를 조사하였고 상기 유전자들의 스트레스-반응을 분석하였다. 본 발명자들은 9개의 OsDREB1 유전자를 동정하였으며, 전사촉진 어세이(transactivation assay)를 통하여 OsDREB1의 전사촉진인자(trans-activator)로서의 기능을 연구하였다(결과를 보이지 않음).

본 연구에서, 비생물적 스트레스에 대해 중요한 역할을 하는 전사인자 중 하나로 벼에서 기능하는 OsDREB1D 유전자가 과다발현되었다. 그 결과, 트랜스제닉 식물체에서 건조 및 염 저항성이 향상되었다. 그러나, 본 발명의 트랜스제닉 식물체는 아라비돕시스에서 동일한 유전자의 지속적 과다발현(constitutive over-expression)을 통한 결과[(예컨대, OsDREB1D(Zhang, et al., 2009), CBF1(Jaglo, et al., 1998), CBF3(Gilmour, et al., 2000, Kasuga, et al., 1999 및 Liu, et al., 1998) 또는 OsDREB1A(Dubozet, et al., 2003 및 Ito, et al., 2006)]와는 달리 콜드 스트레스에 대한 저항성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 벼의 OsDREB1D 유전자가 아라비돕시스와 비교하여 다르게 작동할 수 있다는 가능성을 제시해 준다.

OsDREB1D는 콜드 또는 건조 스트레스에 의해 유도되고 OsDREB1J는 건조 또는 염 스트레스에 의해 유도되지만, OsDREB1A 및 OsDREB1E는 콜드 처리에 의해서만 강하게 유도되었다(도 2). 한편, OsDREB1G은 저온 및 건조 스트레스에 반응하였다. 이러한 결과들은 다양한 비생물적 스트레스 하에서 OsDREB1 유전자들 간에, 비록 하위 유전자들이 공통될 수 있을지라도, 기능적인 중복(redundancy) 및/또는 특이적 기능이 있음을 의미한다. 본 발명자들은 비생물적 스트레스에 대한 반응을 규명하기 위하여 OsDREB1D를 선택되었다.

트랜스제닉 연구들을 통해 CBF1 및 OsDREB1A가 OsDhn1 발현을 활성화시킨다고 보고되었지만, OsDREB1D가 벼에서 OsDhn1 발현을 활성화시킬 수 있는 지는 아직까지 알려져 있지 않다. 이를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 OsDREB1D를 과다발현하는 트랜스제닉 벼 식물체를 제조하였다. OsDREB1D OX(Ubi::OsDREB1D) 식물체들은 대조군과 비교하여 정상 성장 조건 하에서 높은 OsDhn1 발현을 나타내었으며, 이는 OsDREB1D가 벼에서 OsDhn1 발현을 활성화시킨다는 것을 의미한다(도 4). 또한, 스트레스-저항성 분석 실험에서, OsDREB1D OX 식물체는 건조 및 염을 포함하는 비생물적 스트레스에 대하여 증가된 저항성을 나타내었다(표 2). 상기 결과들은 OsDREB1D를 과다발현시킨 트랜스제닉 아라비돕시스를 분석한 Zhang 등(2009)의 연구에서와 마찬가지로, OsDREB1D가 벼에서 전사인자로서 기능하여 OsDhn1와 같은 다운스트림 유전자들을 활성화시킴으로써, 비생물적 스트레스에 의해 야기되는 해로운 성장 조건으로부터 식물체를 보호한다는 것을 의미한다.

본 연구에서, 본 발명자들은 OsDREB1E 및 OsDREB1J를 과발현시킨 트랜스제닉 벼 식물체를 얻지 못 했다. 하지만, 다른 연구에서 보고된 OsDREB1E OX 라인은 건조 스트레스에 대한 증가된 저항성을 나타냈다(Chen, et al., 2008). 따라서, OsDREB1E도 벼에서 OsDhn1 발현을 증가시킬 수 있을 것이다. 결론적으로, 상술한 본 발명자들의 결과들은 몇몇 OsDREB1 유전자들이 OsDhn1 발현을 증가시킴으로써 스트레스-저항성을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

Baker, S. S., Wilhelm, K. S., and Thomashow, M. F. (1994) The 5'-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting elements that confer cold-, drought- and ABA-regulated gene expression. Plant Mol. Biol. 24, 701-713.

Chen, J. Q., Dong, Y., Wang, Y. J., Liu, Q., Zhang, J. S., and Chen, S.Y. (2003) An AP2/EREBP-type transcription-factor gene from rice is cold-inducible and encodes a nuclear-localized protein. Theor. Appl. Genet. 107, 972-979

Chen, J.Q., Meng, X.P., Zhang, Y., Xia, M., Wang, X.P. (2008) Over-expression of OsDREB genes lead to enhanced drought tolerance in rice. Biotechnol. Lett. 30, 2191-2198.

Claes, B., Dekeyser, R., Villarroel, R., Van den Bulcke, M., Bauw, G., Van Montagu, M., and Caplan, A. (1990) Characterization of a rice gene showing organ-specific expression in response to salt stress and drought. Plant Cell 2, 19-27.

Dubouzet, J. G., Sakuma, Y., Ito, Y., Kasuga, M., Dubouzet, E. G., Miura, S., Seki, M., Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2003) OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold-responsive gene expression. Plant J. 33, 751-763.

Fowler, S., and Thomashow, M. F. (2002) Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway. Plant Cell 14,1675-1690.

Gilmour, S. J., Zarka, D. G., Stockinger, E. J., Salazar, M. P., Houghton, J. M., and Thomashow, M. F. (1998) Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activator as an early step in cold-induced COR gene expression. Plant J. 16, 433-442.

Goff, S. A., Ricke, D., Lan, T. H., Presting, G., Wang, R., Dunn, M., Glazebrook, J., Sessions, A., Oeller, P., Varma, H., Hadley, D., Hutchison, D., Martin, C., Katagiri, F., Lange, B. M., Moughamer, T., Xia, Y., Budworth, P., Zhong, J., Miguel, T., Paszkowski, U., Zhang, S., Colbert, M., Sun, W. L., Chen, L., Cooper, B., Park, S., Wood, T. C., Mao, L., Quail, P., Wing, R., Dean, R., Yu, Y., Zharkikh, A., Shen, R., Sahasrabudhe, S., Thomas, A., Cannings, R., Gutin, A., Pruss, D., Reid, J., Tavtigian, S., Mitchell, J., Eldredge, G., Scholl, T., Miller, R. M., Bhatnagar, S., Adey, N., Rubano, T., Tusneem, N., Robinson, R., Feldhaus, J., Macalma, T., Oliphant, A., and Briggs, S. (2002) A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science 5, 92-100.

Gutha L.R., and Reddy A.R., (2008) Rice DREB1B promoter shows distinct stress-specific responses, and the overexpression of cDNA in tobacco confers improved abiotic and biotic stress tolerance. Plant Mol. Biol. 68, 533-555

Haake, V., Cook, D., Riechmann, J. L., Pineda, O., Thomashow, M. F., and Zhang, J. Z. (2002) Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis. Plant Physiol. 130, 639-648.

Hattori, T,, Terada, T,, and Hamasuna, S.T. (1994) Sequence and functional analyses of the rice gene homologous to the maize Vp1. 24, 805-810.

Ingram, J., and Bartels, D. (1996) The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 277-403.

Ito Y., Katsura K., Maruyama K., Taji T., Kobayashi M., Seki M., Shinozaki K., and Yamaguchi-Shinozaki K. (2006) Functional analysis of rice DREB1/CBF-type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice. Plant Cell Physiol. 47,141-153

Jaglo-Ottosen, K. R., Gilmour, S. J., Zarka, D. G., Schabenberger, O., and Thomashow, M. F. (1998) Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science 280, 104-106.

Jaglo, K. R., Kleff, S., Amundsen, K. L., Zhang, X., Haake, V., Zhang, J. Z., Deits, T., and Thomashow, M. F. (2001) Components of the Arabidopsis C-repeat/Dehydration-responsive element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species. Plant Physiol. 127, 910-917.

Jiang, C., Iu, B., and Singh, J. (1996) Requirement of a CCGAC cis-acting element for cold induction of the BN115 gene from winter Brassica napus. Plant Mol Biol. 30, 679-684.

Kyzuka, J. and Shimamoto, K. (1991) Transformation and regeneration of rice protoplasts. In Plant Tissue Culture Manual B1 (Lindsey, K. ed.) Dordrecht: Kluwer Academic Publisher, pp. 1-16.

Lee, S. C., Huh, K. W., An, K., An, G., and Kim, S. R. (2004) Ectopic expression of a cold-inducible transcription factor, CBF1/DREB1b, in transgenic rice (Oryza sativa L.). Mol. Cells 18, 107-114.

Lee, S. C., Lee, M-Y., Kim, SJ., Jun, SH., An, G., and Kim, S-R. (2005) Characterization of a stress-inducible dehydrin gene, OsDhn1, from rice (Oryza sativa L.). Mol. Cells Accepted.

Liu, J. and Zhu, J. K. (1998) A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance. Science 280, 1943-1945.

Liu, Q., Kasuga, M., Sakuma, Y., Abe, H., Miura, S., Yamaguchi-Shinozaki, K., and Shinozaki, K. (1998) Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell 10, 1391-1406.

McElroy, D., Rothernberg, M. M., and Wu, R. (1990) Structural characterization of a rice actin gene. Plant Mol. Biol. 14, 163-171.

Medina, J., Bargues, M., Terol, J., Perez-Alonso, M., and Salinas, J. (1999) The Arabidopsis CBF gene family is composed of three genes encoding AP2 domain-containing proteins whose expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration. Plant Physiol. 119, 463-470.

Nakashima, K., Shinwari, Z. K., Sakuma, Y., Seki, M., Miura, S., Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2000) Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration- and high-salinity-responsive gene expression. Plant Mol. Biol. 42, 657-665.

Oh, S.J., Song, S.I., Kim, Y.S., Jang, H.J., Kim, S.Y., Kim, M., Kim, Y.K., Nahm, B.H., and Kim, J.K. (2005) Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant Physiol. 138, 341-351.

Qin, F., Sakuma, Y., Li, J., Liu, Q., Li, Y. Q., Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2004) Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L. Plant Cell. Physiol. 45, 1042-1052.

Rabbani, M. A., Maruyama, K., Abe, H., Khan, M. A., Katsura, K., Ito, Y., Yoshiwara, K., Seki, M., Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2003) Monitoring expression profiles of rice genes under cold, drought, and high-salinity stresses and abscisic acid application using cDNA microarray and RNA gel-blot analyses. Plant Physiol. 133, 1755-1767.

Riechmann, J. L. and Meyerowitz, E. M. (1998) The AP2/EREBP family of plant transcription factors. Biol. Chem. 379, 633-646.

Sakuma, Y., Liu, Q., Dubouzet, J. G., Abe, H., Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2002) DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration- and cold-inducible gene expression. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 998-1009.

Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2000) Molecular responses to dehydration and low temperature: Differences and cross-talk between two stress signaling pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223.

Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K., and Seki M. (2003) Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 410-417.

Shinwari, Z. K., Nakashima, K., Miura, S., Kasuga, M., Seki, M., Yamaguchi-Shinozaki, K., and Shinozaki, K. (1998) An Arabidopsis gene family encoding DRE/CRT binding proteins involved in low-temperature-responsive gene expression. Biochem. Biophys. Res. Commun. 250, 161-170.

Skinner J.S., von Zitzewitz J., Szucs P., Marquez-Cedillo L., Filichkin T., Amundsen K., Stockinger E.J., Thomashow M.F., Chen T.H., and Hayes P.M. (2005) Structural, functional, and phylogenetic characterization of a large CBF gene family in barley. Plant Mol Biol. 59, 533-551

Stockinger, E. J., Gilmour, S. J., and Thomashow, M. F. (1997) Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 1035-1040.

Takakura, Y., Ito, T., Saito, H., Inoue, T., Komari, T., and Kuwata, S. (2000) Flower-predominant expression of a gene encoding a novel class I chitinase in rice (Oryza sativa L.). Plant Mol. Biol. 42, 883-897.

Thomashow, M. F. (1999) Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50, 571-599.

Wang, Q., Guan, Y., Wu, Y., Chen, H., Chen, F., and Chu, C. (2008) Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt, drought, and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice. Plant Mol. Biol. 67, 589-602.

Xiong, L., Schumaker, K. S., and Zhu, J. K. (2002) Cell signaling during cold, drought, and salt stress. Plant Cell 14, Suppl. S165-183.

Yamaguchi-Shinozaki, K., and Shinozaki, K. (1994) A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature, or high-salt stress. Plant Cell 6, 251-264.

Yu, J., Hu, S., Wang, J., Wong, G.K., Li, S., Liu, B., Deng, Y., Dai, L., Zhou, Y., Zhang, X., Cao, M., Liu, J., Sun, J., Tang, J., Chen, Y., Huang, X., Lin, W., Ye, C., Tong, W., Cong, L., Geng, J., Han, Y., Li, L., Li, W., Hu, G., Huang, X., Li, W., Li, J., Liu, Z., Li, L., Liu, J., Qi, Q., Liu, J., Li, L., Li, T., Wang, X., Lu, H., Wu, T., Zhu, M., Ni, P., Han, H., Dong, W., Ren, X., Feng, X., Cui, P., Li, X., Wang, H., Xu, X., Zhai, W., Xu, Z., Zhang, J., He, S., Zhang, J., Xu, J., Zhang, K., Zheng, X., Dong, J., Zeng, W., Tao, L., Ye, J., Tan, J., Ren, X., Chen, X., He, J., Liu, D., Tian, W., Tian, C., Xia, H., Bao, Q., Li, G., Gao, H., Cao, T., Wang, J., Zhao, W., Li, P., Chen, W., Wang, X., Zhang, Y., Hu, J., Wang, J., Liu, S., Yang, J., Zhang, G., Xiong, Y., Li, Z., Mao, L., Zhou, C., Zhu, Z., Chen, R., Hao, B., Zheng, W., Chen, S., Guo, W., Li, G., Liu, S., Tao, M., Wang, J., Zhu, L., Yuan, L. and Yang, H. (2002) A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Science 296, 79-92.

Zhang, Y., Chen, C., Jin, X.F., Xiong, A.S., Peng, R.H., Hong, Y.H., Yao, Q.H., Chen, J.M. (2009) Expression of a rice DREB1 gene, OsDREB1D, enhances cold and high-salt tolerance in transgenic Arabidopsis. BMB Rep. 31, 486-492.

Zhang, X., Fowler, S. G., Cheng, H., Lou, Y., Rhee, S. Y., Stockinger, E. J., and Thomashow, M. F. (2004) Freezing-sensitive tomato has a functional CBF cold response pathway, but a CBF regulon that differs from that of freezing-tolerant Arabidopsis. Plant J. 39, 905-919.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Compositions for Enhancing Drought Stress Tolerance and Transgenic Plants Using the Same <130> PN120577 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 759 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggagaaga acaccgccgc cagcgggcaa ttgatgacct cctccgcgga ggcgacgccg 60 tcgtcgccga agcggccggc ggggcgaacc aagttccagg agacgaggca cctagtgttc 120 cgtggggtgc gatggcgtgg gtgcgcgggg cggtgggtgt gcaaggtgcg tgtcccgggc 180 agccgcggtg accgtttctg gataggcacg tctgacaccg ccgaggagac cgcgcgcacg 240 cacgacgccg ccatgctcgc cttgtgcggg gcctccgcca gcctcaactt cgccgactct 300 gcctggctgc tccacgtccc gcgcgccccc gtcgtctccg gactccggcc accagctgcc 360 cgatgtgcaa cgcgctgcct gcaaggccat cgccgagttc cagcgccggg ccgggggagc 420 accgccactg ccactgccac ctccggcgat gctgcatcga ccgctcctcc gtcggcaccc 480 gttctgtcag ccaaacaatg cgaattcatc tttctttctt cactagattg ttggatgtta 540 atgtcaaagc ttatcagcag tagcagagca aaaggatcgt tgtgcctgcg aaaaaatccc 600 atttcatttt gcatggttac aaattcttac actgctcttt tgctcgaata cattatattg 660 cagatgaatt caatgatcgt tttaatccac gaattatcaa aatatcaagt ctttctgcta 720 ctaaccatga taacacacca cctttttcaa tggaggagg 759 <210> 2 <211> 253 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Glu Lys Asn Thr Ala Ala Ser Gly Gln Leu Met Thr Ser Ser Ala 1 5 10 15 Glu Ala Thr Pro Ser Ser Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe 20 25 30 Gln Glu Thr Arg His Leu Val Phe Arg Gly Val Arg Trp Arg Gly Cys 35 40 45 Ala Gly Arg Trp Val Cys Lys Val Arg Val Pro Gly Ser Arg Gly Asp 50 55 60 Arg Phe Trp Ile Gly Thr Ser Asp Thr Ala Glu Glu Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80 His Asp Ala Ala Met Leu Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Ser Leu Asn 85 90 95 Phe Ala Asp Ser Ala Trp Leu Leu His Val Pro Arg Ala Pro Val Val 100 105 110 Ser Gly Leu Arg Pro Pro Ala Ala Arg Cys Ala Thr Arg Cys Leu Gln 115 120 125 Gly His Arg Arg Val Pro Ala Pro Gly Arg Gly Ser Thr Ala Thr Ala 130 135 140 Thr Ala Thr Ser Gly Asp Ala Ala Ser Thr Ala Pro Pro Ser Ala Pro 145 150 155 160 Val Leu Ser Ala Lys Gln Cys Glu Phe Ile Phe Leu Ser Ser Leu Asp 165 170 175 Cys Trp Met Leu Met Ser Lys Leu Ile Ser Ser Ser Arg Ala Lys Gly 180 185 190 Ser Leu Cys Leu Arg Lys Asn Pro Ile Ser Phe Cys Met Val Thr Asn 195 200 205 Ser Tyr Thr Ala Leu Leu Leu Glu Tyr Ile Ile Leu Gln Met Asn Ser 210 215 220 Met Ile Val Leu Ile His Glu Leu Ser Lys Tyr Gln Val Phe Leu Leu 225 230 235 240 Leu Thr Met Ile Thr His His Leu Phe Gln Trp Arg Arg 245 250

Claims

서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스(abiotic stress) 저항성 향상용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 (a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 향상용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 건조(drought) 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 향상용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 향상용 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물에 의해 형질전환된 형질전환식물세포.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물에 의해 형질전환된 형질전환식물체.
다음의 단계를 포함하는 비생물적 스트레스(abiotic stress) 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법:
(a) 식물 세포 또는 식물 조직을 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환하는 단계;
(b) 형질전환된 식물세포 또는 식물조직을 선별하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환된 식물세포 또는 식물조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
제 7 항에서 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 건조(drought) 스트레스인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 7 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스(abiotic stress)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체.
제 10 항에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 건조(drought) 스트레스인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.