ES2390919T3 - Plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento mejorados y un método para elaborar las mismas - Google Patents

Abstract

Método para incrementar el rendimiento de semillas en plantas, con relación a plantas de control, que comprendeincrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 preferentemente en el vástago deuna planta, yopcionalmente, seleccionar plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado.

Description

Plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento mejorados y un método para elaborar las mismas

La presente invención se refiere generalmente al campo de la biología molecular y trata de un método para incrementar el rendimiento de semillas en plantas incrementando la expresión en vástagos de planta de una proteína de halotolerancia (HAL3). La presente invención también trata de plantas que tienen una expresión incrementada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3, plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado con relación a plantas silvestres u otras plantas de control. La invención también proporciona constructos útiles en los métodos de la invención.

La población mundial en continuo aumento y el suministro menguante de tierra cultivable disponible para combustibles agrícolas llevan a investigar el incremento de la eficacia de la agricultura. Medios convencionales para mejoras en cosechas y hortícolas utilizan técnicas de mejora genética selectivas para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas de mejora genética selectivas tienen varias desventajas, a saber, que estas técnicas típicamente emplean mucha mano de obra y dan como resultado plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden dar como resultado que el rasgo deseable se haga pasar desde las plantas progenitoras. Los avances en la biología molecular han permitido al hombre modificar el germoplasma de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas supone el aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en forma de DNA o RNA) y la introducción posterior de ese material genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de aportar cosechas o plantas que tienen rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados.

Un rasgo de particular interés económico es el rendimiento incrementado. El rendimiento se define normalmente como los productos medibles de valor económico de una cosecha. Esto puede definirse en cuanto a la cantidad y/o la calidad. El rendimiento depende directamente de varios factores, por ejemplo, el número y el tamaño de los órganos, la arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), la producción de semillas, la senescencia de las hojas y más. El desarrollo de las raíces, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor temprano también pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. Por lo tanto, optimizar los factores mencionados anteriormente puede contribuir a incrementar el rendimiento de una cosecha.

El rendimiento de semillas es un rasgo particularmente importante, ya que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición de seres humanos y animales. Cosechas tales como maíz, arroz, trigo, Canola y soja representan más de la mitad del aporte calórico total de los seres humanos, ya sea a través del consumo directo de las propias semillas o a través del consumo de productos alimenticios generados con semillas procesadas. También son una fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos usados en procedimientos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos vástagos y raíces) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas). El desarrollo de una nueva semilla implica muchos genes, y requiere la transferencia de metabolitos desde las raíces, las hojas y los tallos hasta la semilla en crecimiento. El endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza como macromoléculas de almacenamiento para engordar el grano.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor temprano. La mejora del vigor temprano es un importante objetivo de los modernos programas de mejora genética del arroz en cultivares de arroz tanto templados como tropicales. Las raíces largas son importantes para el anclaje apropiado al suelo en arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos anegados, y cuando las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, los vástagos más largos se asocian al vigor. Cuando se practica la siembra en línea, los mesocotilos y los coleóptilos más largos son importantes para una buena emergencia de las plántulas. La capacidad para genomanipular el vigor temprano en plantas sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, un vigor temprano escaso ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en el germoplasma de Corn Belt en la Europa atlántica.

Un rasgo importante adicional es el de la tolerancia mejorada al estrés abiótico. El estrés abiótico es una causa principal de pérdida de cosechas en todo el mundo, reduciendo los rendimientos medios para la mayoría de las plantas de cultivo principales en más de 50% (Wang et ál., Planta (2003) 218: 1-14). Los estreses abióticos pueden estar provocados por sequía, salinidad, extremos de temperatura, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico sería de un gran beneficio económico para los agricultores de todo el mundo y permitiría el cultivo de cosechas en condiciones adversas y en territorios en los que el cultivo de las cosechas no es posible de otro modo.

Por lo tanto, el rendimiento de las cosechas puede incrementarse optimizando uno de los factores mencionados anteriormente.

Dependiendo del uso final, la modificación de ciertos rasgos de rendimiento puede favorecerse sobre otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como producción de forraje o madera, o fuente de biocombustible, puede ser deseable un incremento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como producción de harina, almidón o aceite, puede ser particularmente deseable un incremento en los parámetros de las semillas. Incluso entre los parámetros de las semillas, algunos pueden ser favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a incrementar el rendimiento de las semillas, ya sea en forma de tamaño incrementado de las semillas o en el número incrementado de semillas.

Un enfoque para incrementar el rendimiento (rendimiento de semillas y/o biomasa) en plantas puede ser a través de la modificación de los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta, tales como el ciclo celular o diversas rutas de señalización implicadas en el crecimiento de las plantas o en mecanismos de defensa.

Se ha encontrado ahora que el rendimiento de las semillas puede incrementarse en plantas incrementando la expresión en una planta de un polipéptido de HAL3 en los vástagos de una planta.

ANTECEDENTES

Proteínas de Halotolerancia

Muchos procesos enzimáticos en una célula requieren la implicación de la coenzima A (CoA o CoASH). La propia coenzima A (CoASH) es una molécula muy polar, que consiste en 3’,5’-difosfato de adenosina conectado a ácido 4fosfopanteténico (vitamina B5) y de allí a �-mercaptoetilamina. El grupo SH libre puede estar esterificado, dependiendo del proceso en el que esté implicado la CoA. La ruta de síntesis de CoA se ha elucidado en bacterias, animales y plantas. En las plantas, la conversión del precursor de CoA 4’-fosfopantotenoilcisteína (PPC) en 4’fosfopanteteína es catalizada por la flavoproteína 4’-fosfopantotenoilcisteína descarboxilasa (PPCDC o HAL3, Kupke et ál. J. Biol. Chem. 276, 19190-19196, 2001). El gen que codifica proteínas de HAL3 puede ser parte de una pequeña familia de genes: el genoma de Arabidopsis comprende dos isoformas (AtHAL3a y AtHAL3b; Espinoza-Ruíz et ál. Plant J. 20, 529-539, 1999), en el tabaco están presentes 3 genes HAL3 (Yonamine et ál. J. Exp. Bot. 55, 387-395, 2004), aunque en el arroz HAL3 es un gen de una sola copia. Se sugiere que AtHAL3 y otras proteína de HAL3 funcionan como un trímero, teniendo cada monómero un mononucleótido de flavina (FMN) unido (Albert et ál. Structure 8, 961-969, 2000). Se postula que el cofactor FMN representa un papel en la reacción redox que genera 4’-fosfopanteteína.

La función molecular de las proteínas de HAL3 todavía no está completamente elucidada. Las proteínas de HAL3 muestran homología con la proteína SIS2 de levadura, que está implicada en la halotolerancia (Ferrando et ál., Mol. Cell. Biol. 15, 5470-5481). Las plantas o células vegetales que expresan ectópicamente HAL3 muestran una tolerancia mejorada al estrés salino, osmótico o por litio (Espinoza-Ruíz et ál., 1999; Yonamine et ál., 2004). La sobreexpresión de HAL3a de tabaco en células BY2, según se dice, provocaba un incremento en el contenido de prolina intracelular, que puede contribuir al fenotipo tolerante a la sal (Yonamine et ál., 2004). Por otra parte, las plantas de Arabidopsis que sobreexpresaban AtHAL3a presentaban una velocidad de crecimiento más rápida que las plantas silvestres (Espinoza-Ruiz et ál., 1999). Se observaba que la proteína de AtHAL3b interactuaba con la proteína del ciclo celular CDKB1;1 (WO 00/36124), por lo tanto, se postulaba que AtHAL3b es útil para conferir tolerancia al estrés salino a las plantas y para incrementar la velocidad de crecimiento de las plantas bajo condiciones de estrés salino. Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que, preferentemente, incrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en tejidos en expansión da plantas que tienen un rendimiento incrementado con relación a plantas de control, incremento de rendimiento que es al menos 10% en comparación con las plantas de control.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Sorprendentemente, se ha encontrado que incrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en los vástagos de una planta da plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado con relación a plantas de control, incremento del rendimiento de semillas que es al menos 10% en comparación con las plantas de control.

Según otra realización de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta, con relación a plantas de control, que comprende incrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en vástagos de planta.

DEFINICIONES

Polipéptido(s)/Proteína(s)

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en la presente memoria y se refieren a aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud.

Polinucleótido(s)/Ácido(s) nucleico(s)/Secuencia(s) de ácido nucleico/Secuencia(s) de nucleótidos

Los términos "polinucleótido(s)", "secuencia(s) de ácido nucleico", "secuencia(s) de nucleótidos", "ácido(s) nucleico(s)" se usan intercambiablemente en la presente memoria y se refieren a nucleótidos, bien ribonucleótidos o bien desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica de cualquier longitud.

Planta(s) de control

La elección de plantas de control adecuadas es una parte habitual de un sistema experimental y puede incluir plantas silvestres correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. Típicamente, la planta de control es de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que va a evaluarse. La planta

5 de control también puede ser un nulicigoto de la planta que va a evaluarse. Una "planta de control", según se usa en la presente memoria, se refiere no solo a plantas enteras, sino también a partes de plantas, incluyendo semillas y partes de semillas.

Homólogo(s)

Los "homólogos" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen

10 sustituciones, deleciones y/o inserciones con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen una actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la que se derivan.

Una deleción se refiere a la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a que uno o más residuos de aminoácido se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones N-terminales y/o C-terminales así como inserciones 15 intrasecuenciales de uno solo o múltiples aminoácidos. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más cortas que las fusiones N- o C-terminales, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión N- o C-terminales incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador de la transcripción que se usa en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de recubrimiento de fagos, etiqueta de (histidina)-6, etiqueta de glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de unión a

20 maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag0100, epítopode cmyc, epítopo FLAG®-, lacZ, CMP (péptido de unióna calmodulina), epítopo de HA, epítopo de proteína C y epítopo de VSV.

Una sustitución se refiere al cambio de aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como similares hidrofobia, hidrofilia, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras ahelicoidales o estructuras de lámina �. Típicamente, las sustituciones de aminoácidos son de residuos individuales,

25 pero pueden agruparse dependiendo de las restricciones funcionales impuestas al polipéptido; habitualmente las inserciones serán del orden de aproximadamente 1 a 10 aminoácidos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas. Tablas de sustituciones conservativas son muy conocidas en la especialidad (véanse, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company y la Tabla 1 posterior).

30 Tabla 1: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservativas

Residuo

Sustituciones Conservativas Residuo Sustituciones Conservativas

Ala

Ser Leu Ile; Val

Arg

Lys Lys Arg; Gln

Asn

Gln; His Met Leu; Ile

Asp

Glu Phe Met; Leu; Tyr

Gln

Asn Ser Thr; Gly

Cys

Ser Thr Ser; Val

Glu

Asp Trp Tyr

Gly

Pro Tyr Trp; Phe

His

Asn; Gln Val Ile; Leu

Ile

Leu, Val

Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos pueden realizarse fácilmente usando técnicas sintéticas para péptidos muy conocidas en la especialidad, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o mediante manipulación de DNA recombinante. Métodos para la manipulación de secuencias de DNA

35 para producir variantes de sustitución, inserción o deleción de una proteína son muy conocidas en la especialidad. Por ejemplo, técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados del DNA son muy conocidas por los expertos en la especialidad e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida.

4 Derivados

"Derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma presente en la naturaleza de la proteína, tal como la proteína de interés, comprender sustituciones de aminoácidos por residuos de aminoácido no presentes en la naturaleza, o adiciones de residuos de aminoácidos no presentes en la naturaleza. "Derivados" de una proteína también abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos alterados presentes en la naturaleza (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados etc.) o alterados no naturalmente en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma presente en la naturaleza del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno

o más sustituyentes o adiciones que no son de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que se deriva, por ejemplo una molécula indicadora u otro ligando, unido covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula indicadora que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácido no presentes en la naturaleza con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína presente en la naturaleza.

Ortólogo(s)/Parálogo(s)

Los ortólogos y los parálogos abarcan conceptos evolutivos usados para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestral y los ortólogos son genes procedentes de organismos diferentes que se han originado a través de especiación.

Dominio

El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservado en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de proteínas relacionadas evolutivamente. Aunque los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que están muy conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que probablemente son esenciales en la estructura, la estabilidad o la función de una proteína. Identificados por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteína, pueden usarse como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos identificada previamente.

Motivo/Secuencia de consenso/Distintivo

El término "motivo" o "secuencia de consenso" o "distintivo" se refiere a una región conservada corta en la secuencia de proteínas relacionadas evolutivamente. Los motivos son frecuentemente partes muy conservadas de dominios, pero también pueden incluir solo parte del dominio, o estar situados fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo están fuera de un dominio definido).

Hibridación

El término "hibridación", según se define en la presente memoria, es un procedimiento en el que secuencias de nucleótidos complementarias sustancialmente homólogas se reasocian entre sí. El procedimiento de hibridación puede producirse totalmente en solución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El procedimiento de hibridación también puede producirse con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado a una matriz tal como cuentas magnéticas, cuentas de Sepharose y cualquier otra resina. El procedimiento de hibridación puede producirse además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o nailon o inmovilizado, p. ej., mediante fotolitografía a, por ejemplo, un soporte vítreo silíceo (lo posteriormente conocido como matrices o micromatrices de ácidos nucleicos o como chips de ácidos nucleicos). A fin de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácido nucleico generalmente se desnaturalizan térmicamente o químicamente para fundir una doble hebra en dos hebras simples y/o para retirar horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios.

El término "restricción" se refiere a las condiciones bajo las que tiene lugar una hibridación. La restricción de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal, la fuerza iónica y la composición del tampón de hibridación. Generalmente, las condiciones de baja restricción se seleccionan para ser aproximadamente 30°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. Las condiciones de restricción media son cuando la temperatura es 20°C menor que Tm, y las condiciones de alta restricción son cuando la temperatura es 10°C menor que Tm. Las condiciones de hibridación de alta restricción se usan típicamente para aislar secuencias que se hibridan que tienen una gran similitud de secuencia con la secuencia de ácido nucleico buscada. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden desviarse en la secuencia y sin embargo codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. Por lo tanto, a veces pueden ser necesarias condiciones de hibridación de restricción media para identificar tales moléculas de ácido nucleico.

La Tm es la temperatura bajo una fuerza iónica y un pH definidos a la que el 50% de la secuencia buscada se hibrida a una sonda perfectamente concordante. La Tm depende de las condiciones de la solución y la composición de las bases y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas

superiores. El grado máximo de hibridación se obtiene de aproximadamente 16°C hasta 32°C por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos hebras del ácido nucleico promoviendo de ese modo la formación del híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para concentraciones superiores, este efecto puede ignorarse). La 5 formamida reduce la temperatura de fusión de dúplex de DNA-DNA y DNA-RNA con de 0,6 a 0,7°C para cada porcentaje de formamida, y la adición de formamida al 50% permite que la hibridación se realice a de 30 a 45°C, aunque el grado de hibridación se reducirá. Las discordancias de pares de bases reducen el grado de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. De media y para sondas grandes, la Tm disminuye aproximadamente 1°C por % de discordancia de bases. La Tm puede calcularse usando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de

10 híbridos:

1) Híbridos de DNA-DNA (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):

Tm = 81,5ºC + 16,6xlog10[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] - 500x[Lc]-1 - 0,61x% de formamida

2) Híbridos de DNA-RNA o RNA-RNA:

Tm = 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) +11,8 (%G/Cb)2 - 820/Lc

15 3) Híbridos de oligo-DNA u oligo-RNAd:

Para <20 nucleótidos: Tm= 2 (In)

Para 20-35 nucleótidos: Tm= 22 + 1,46 (In)

a o para otro catión monovalente, pero sólo exacto en el intervalo 0,01-0,4 M.

b sólo exacto para %GC en el intervalo de 30% a 75%.

20 c L = longitud del dúplex en pares de bases.

d Oligo, oligonucleótido; In, longitud efectiva de cebador = 2(nº de G/C)+(nº de A/T).

La unión no específica puede controlarse usando una cualquiera de un número de técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloquear la membrana con soluciones que contienen proteínas, adiciones de RNA, DNA heterólogos y SDS al tampón de hibridación, y tratamiento con Rnasa. Para sondas no homólogas, puede realizarse una serie de

25 hibridaciones al variar uno de (I) disminuir progresivamente la temperatura de reasociación (por ejemplo de 68°C a 42°C) o (II) disminuir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo de 50% a 0%). El experto conoce diversos parámetros que pueden alterarse durante la hibridación y que bien mantendrán o bien cambiarán las condiciones de restricción.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de la hibridación típicamente también depende de la

30 función de los lavados posteriores a la hibridación. Para eliminar el fondo resultante de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Factores críticos de tales lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: cuanto menor sean la concentración de sal y la temperatura de lavado, mayor será la restricción del lavado. Las condiciones de lavado se establecen típicamente en o por debajo de la restricción de hibridación. Una hibridación positiva da una señal que es al menos dos veces la del fondo.

35 Generalmente, condiciones restrictivas adecuadas para ensayos de hibridación de ácidos nucleicos o procedimientos de detección de amplificación génica son como se indican anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones más o menos restrictivas. El experto conoce diversos parámetros que pueden alterarse durante el lavado y que bien mantendrán o bien cambiarán las condiciones de restricción.

Por ejemplo, condiciones de hibridación de alta restricción típicas para híbridos de DNA más largos de 50

40 nucleótidos comprenden la hibridación a 65°C en 1 x SSC o a 42°C en 1 x SSC y formamida al 50%, seguido por lavado a 65°C en 0,3 x SSC. Ejemplos de condiciones de hibridación de restricción media para híbridos de DNA más largos de 50 nucleótidos comprenden la hibridación a 50°C en 4 x SSC o a 40°C en 6 x SSC y formamida al 50%, seguido por lavado a 50°C en 2 x SSC. La longitud del híbrido es la longitud anticipada para el ácido nucleico que se hibrida. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse

45 alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en la presente memoria. 1 x SSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM; la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente 5 x reactivo de Denhardt, SDS al 0,5-1,0%, 100 μg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado fragmentado, pirofosfato sódico al 0,5%.

Con el propósito de definir el nivel de restricción, puede hacerse referencia a Sambrook et ál. (2001) Molecular

50 Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 actualizaciones anuales).

Variante de empalme

El término "variante de empalme", según se usa en la presente memoria, abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la que intrones y/o exones seleccionados se han cortado, reemplazado, desplazado o añadido, o en la que los intrones se han acortado o alargado. Tales variantes serán unas en las que la actividad biológica de la proteína se retiene sustancialmente; esto puede alcanzarse reteniendo selectivamente segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser artificiales. Métodos para predecir y aislar tales variantes de empalme son muy conocidos en la especialidad (véase, por ejemplo, Foissac y Schiex, BMC Bioinformatics. 2005; 6: 25).

Variante alélica

Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen dado, situadas en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas abarcan polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), así como polimorfismos de inserción/deleción pequeña (INDEL). El tamaño de los INDEL es habitualmente menor de 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el mayor conjunto de variantes de secuencia en cepas polimórficas presentes en la naturaleza de la mayoría de los organismos.

Redistribución génica/Evolución dirigida

La redistribución génica o evolución dirigida consiste en iteraciones de redistribución de DNA seguidas por rastreo y/o selección apropiados para generar variantes de ácidos nucleicos o sus porciones que codifican proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle et ál., (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes de EE. UU.

5.811.238 y 6.395.547).

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor

Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se usan todos intercambiablemente en la presente memoria y han de tomarse en un contexto amplio para referirse a secuencias de ácido nucleico reguladoras capaces de afectar a la expresión de las secuencias a las que está ligada. El término "promotor" se refiere típicamente a una secuencia de control de ácido nucleico situada aguas arriba del inicio de la transcripción de un gen y que está implicada en el reconocimiento y la unión de RNA polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de ese modo la transcripción de un ácido nucleico conectado operativamente. Son abarcadas por los términos mencionados anteriormente secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen eucariótico clásico (incluyendo la "caja" TATA que se requiere para la iniciación exacta de la transcripción, con o sin una "caja" CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras, estimuladores y silenciadores aguas arriba) que alteran la expresión génica en respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o de un modo específico para un tejido. También se incluye dentro del término una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de "caja" -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de la "caja" -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula de fusión o derivado sintético que confiere, activa

o estimula la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, un tejido o un órgano.

Un "promotor de planta" comprende elementos reguladores, que median en la expresión de un segmento de secuencia codificante en células vegetales. De acuerdo con esto, un promotor de planta no necesita ser de origen vegetal, sino que puede originarse a partir de virus o microorganismos, por ejemplo a partir de virus que atacan células vegetales. El "promotor de planta" también puede originarse a partir de una célula vegetal, p. ej. procedente de la planta que se transforma con la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse en el procedimiento de la invención y se describe en la presente memoria. Esto también se aplica a otras señales reguladoras "de planta", tales como terminadores "de planta". Los promotores aguas arriba de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de la presente invención pueden modificarse mediante una o más sustitución o sustituciones, inserción o inserciones y/o deleción o deleciones de nucleótidos sin interferir con la funcionalidad o la actividad de cualquiera de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF) o la región reguladora 3’ tales como terminadores u otras regiones reguladoras 3’ que están situados más allá del ORF. Por otra parte, es posible que la actividad de los promotores se incremente mediante la modificación de su secuencia, o que se reemplacen completamente por promotores más activos, incluso promotores procedentes de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico, según se describe anteriormente, debe estar conectada operativamente a o comprender un promotor adecuado que expresa el gen en el punto temporal correcto y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato puede analizarse, por ejemplo, conectando operativamente el promotor a un gen indicador y ensayando el nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Genes indicadores muy conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, ß-glucuronidasa o ß-galactosidasa. La actividad del promotor se ensaya midiendo la actividad enzimática de la ß-glucuronidasa o ß-galactosidasa. La fuerza y/o el patrón de expresión del promotor pueden compararse a continuación con los de un promotor de referencia (tal como el usado en los métodos de la presente invención). Alternativamente, la fuerza del promotor puede ensayarse cuantificando los niveles de mRNA o comparando los niveles de mRNA del ácido nucleico usado en los métodos de la presente invención con los niveles de mRNA de genes constitutivos ("housekeeping genes"), tal como rRNA de 18S, usando métodos conocidos en la especialidad, tales como transferencia Northern con análisis densitométricos de autorradiogramas, PCR o RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Held et ál., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente, por "promotor débil" se entiende un promotor que conduce la expresión de una secuencia codificante a bajo nivel. Por "bajo nivel" se entiende a niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente

5 1/100.000 transcritos, hasta aproximadamente 1/500.0000 transcritos por célula. A la inversa, un "promotor fuerte" conduce la expresión de una secuencia codificante a alto nivel, o a de aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000 transcritos por célula.

Conectado operativamente

El término "conectado operativamente", según se usa en la presente memoria, se refiere a una conexión funcional

10 entre la secuencia promotora y el gen de interés, de modo que la secuencia promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo

Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es activo para la transcripción durante la mayoría de, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y bajo la mayoría de las condiciones ambientales, en al

15 menos una célula, tejido u órgano. La Tabla 2 posterior da ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2: Ejemplos de promotores constitutivos

Fuente del Gen

Referencia

Actina

McElroy et ál., Plant Cell, 2: 163-171, 1990

HMGB

WO 2004/070039

35S de CAMV

Odell et ál., Nature, 313: 810-812, 1985

19S de CaMV

Nilsson et ál., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997

GOS2

de Pater et ál., Plant J Nov; 2(6):837-44, 1992, WO 2004/065596

Ubiquitina

Christensen et ál., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992

Ciclofilina de arroz

Buchholz et ál., Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994

Histona H3 de maíz

Lepetit et ál., Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992

Histona H3 de alfalfa

Wu et ál.. Plant Mol. Biol. 11:641-649,1988

Actina 2

An et ál, Plant J. 10(1); 107-121, 1996

FMV de 34S

Sanger et ál., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443

Subunidad pequeña de Rubisco

US 4.962.028

OCS

Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1

Jain et ál., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2

Jain et ál., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

nos

Shaw et ál. (1984) Ácidos nucleicos Res. 12(20):7831-7846

V-ATPasa

WO 01/14572

Superpromotor

WO 95/14098

Proteínas de la "caja" G

WO 94/12015

Promotor ubicuo

Un promotor ubicuo es activo sustancialmente en todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado con respecto al desarrollo

5 Un promotor regulado con respecto al desarrollo es activo durante ciertas fases de desarrollo o en partes de la planta que sufren cambios del desarrollo.

Promotor inducible

Un promotor inducible tiene una iniciación de la transcripción inducida o incrementada en respuesta a un producto químico (para una revisión, véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), un estímulo

10 ambiental o físico, o puede ser "inducible por estrés", es decir activarse cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o "inducible por patógenos", es decir activarse cuando una planta se expone a diversos patógenos.

Promotor específico de un órgano/específico de un tejido

Un promotor específico de un órgano o específico de un tejido es uno que es capaz de iniciar preferentemente la

15 transcripción en ciertos órganos o tejidos, tales como las hojas, las raíces, el tejido seminal, etc. Por ejemplo, un "promotor específico de las raíces" es un promotor que es activo para la transcripción predominantemente en raíces de plantas, sustancialmente hasta la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, aunque sin embargo se permite alguna expresión con pérdidas ("leaky expression") en estas otras partes de la planta. Los promotores capaces de iniciar la transcripción en ciertas células se denominan en la presente memoria "específicos de una célula".

20 Un promotor específico del tejido verde, según se define en la presente memoria, es un promotor que es activo para la transcripción predominantemente en tejido verde, sustancialmente hasta la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, aunque sin embargo se permite alguna expresión con pérdidas en estas otras partes de la planta.

Ejemplos de promotores específicos del tejido verde que pueden usarse para realizar los métodos de la invención se muestran en la Tabla 3 a continuación.

25 Tabla 3: Ejemplos promotores específicos del tejido verde

Gen

Expresión Referencia

Ortofosfato dicinasa de maíz

Específica de las hojas Fukavama et ál., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa de maíz

Específica de las hojas Kausch et ál., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa de arroz

Específica de las hojas Llu et ál., 2003

Subunidad pequeña de Rubisco de arroz

Específica de las hojas Nomura et ál., 2000

EXBP9 de ß-expansina de arroz

Específica de los vástagos WO 2004/070039

Subunidad pequeña de Rubisco de guandú

Específica de las hojas Panguluri et ál., 2005

RBCS3A de guisante

Específica de las hojas

Otro ejemplo de un promotor específico de un tejido es un promotor específico del meristemo, que es activo para la transcripción predominantemente en tejido meristemático, sustancialmente hasta la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, aunque sin embargo se permite alguna expresión con pérdidas en estas otras partes de la

30 planta.

Terminador

El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de DNA al final de una unidad de transcripción que señaliza el procesamiento y la poliadenilación 3' de un transcrito primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede derivarse del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de T-DNA. 35 El terminador que va a añadirse puede derivarse de, por ejemplo, los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa,

o alternativamente de otro gen de planta, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariótico.

Modulación

El término "modulación" significa, en relación con la expresión o la expresión génica, un procedimiento en el que el nivel de expresión se cambia por dicha expresión génica en comparación con la planta de control, preferiblemente el nivel de expresión se incrementa. La expresión no modulada original puede ser de cualquier tipo de expresión de un RNA estructural (rRNA, tRNA) o mRNA con traducción posterior. El término "modular la actividad" significará cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácido nucleico o las proteínas codificadas de la invención, lo que conduce a un rendimiento incrementado y/o un crecimiento incrementado de las plantas.

Expresión incrementada/sobreexpresión

El término "expresión incrementada" o "sobreexpresión", según se usa en la presente memoria, significa cualquier forma de expresión que sea adicional al nivel de expresión del tipo silvestre original.

Métodos para incrementar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en la especialidad e incluyen, por ejemplo, sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de estimuladores de la transcripción o estimuladores de la traducción. Ácidos nucleicos aislados que sirven como promotor o estimulador pueden introducirse en una posición apropiada (típicamente aguas arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido a fin de regular al alza la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden alterarse in vivo mediante mutación, deleción y/o sustitución (véanse Kmiec, Pat. EE. UU. Nº 5.565.350; Zariing et ál., PCT/US93/03868), o pueden introducirse promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y la distancia adecuadas desde un gen de la presente invención a fin de controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión de un polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región codificante de un polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivarse del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de T-DNA. La secuencia del extremo 3’ que va a añadirse puede derivarse de, por ejemplo, los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente de otro gen de planta, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariótico.

Una secuencia intrónica también puede añadirse a la región no traducida 5’ (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha mostrado que la inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción en constructos de expresión tanto de plantas como de animales incrementa la expresión génica a niveles tanto de mRNA como de proteína hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et ál. (1987) Genes Dev 1:1183-1200). Tal estimulación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. El uso de los intrones de maíz intrón Adh1-S 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1 se conoce en la especialidad. Para una información general, véase: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Gen endógeno

La referencia en la presente memoria a un gen "endógeno" no solo se refiere al gen en cuestión según se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin que haya intervención humana), sino que también se refiere al mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada posteriormente (re)introducido en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene tal transgén puede encontrar una reducción sustancial de la expresión del transgén y/o una reducción sustancial de la expresión del gen endógeno.

Expresión disminuida

Se considera que la referencia en la presente memoria a "reducción o eliminación sustancial" significa una disminución en la expresión de un gen endógeno y/o los niveles de polipéptido y/o la actividad de un polipéptido con relación a plantas de control. La reducción o eliminación sustancial es en orden creciente de preferencia al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más reducida en comparación con la de plantas de control.

Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácido nucleico. A fin de realizar un silenciamiento génico, esto puede ser tan poco como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, alternativamente, esto puede ser tanto como todo el gen (incluyendo la UTR 5’ y/o 3’, bien en parte o bien en su totalidad). El tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos puede derivarse del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen diana), o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés. Preferiblemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen diana (hebra bien con sentido o bien antisentido), más preferiblemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden de preferencia creciente, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad de secuencias con el gen diana (hebra bien con sentido o bien antisentido). Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito para los diversos métodos analizados en la presente memoria para la reducción o la eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión puede alcanzarse usando herramientas y técnicas habituales. Un método preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno es introduciendo y expresando en una planta un constructo genético en el que el ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de una cualquiera de las proteínas de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separada por un espaciador (DNA no codificante).

En tal método preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o se elimina sustancialmente a través de silenciamiento mediado por RNA usando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferiblemente capaz de formar una estructura de horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia de ácido nucleico de DNA no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de enlace a la matriz (MAR), un intrón, un policonector, etc.) se sitúa entre los dos ácidos nucleicos invertidos formando la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un RNA quimérico con una estructura autocomplementaria (parcial o completa). Esta estructura de RNA bicatenario se denomina RNA de horquilla (hpRNA). El hpRNA es procesado por la planta en sIRNA que se incorporan a un complejo silenciador inducido por RNA (RISC). El RISC segmenta además los transcritos de mRNA, reduciendo sustancialmente de ese modo el número de transcritos de mRNA que van a traducirse en polipéptidos. Para detalles adicionales generales, véanse, por ejemplo, Grierson et ál. (1998) WO 98/53083; Waterhouse et ál. (1999) WO 99/53050).

El comportamiento de los métodos de la invención no se basa en introducir y expresar en una planta un constructo genético en el que el ácido nucleico se clona como una repetición invertida, sino que pueden usarse para alcanzar los mismos efectos uno cualquiera o más métodos de "silenciamiento génico" bien conocidos.

Uno de tales métodos para la reducción de la expresión de un gen endógeno es el silenciamiento mediado por RNA de la expresión del gen (regulación a la baja). El silenciamiento en este caso es activado en una planta por una secuencia de RNA bicatenario (dsRNA) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. Este dsRNA es procesado adicionalmente por la planta en de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos denominados RNA interferentes cortos (siRNA). Los siRNA se incorporan en un complejo silenciador inducido por RNA (RISC) que segmenta el transcrito de mRNA del gen diana endógeno, reduciendo sustancialmente de ese modo el número de transcritos de mRNA que van a traducirse en un polipéptido. Preferiblemente, la secuencia de RNA bicatenario corresponde a un gen diana.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento por RNA implica la introducción de secuencias de ácido nucleico o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés,

o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación con sentido en una planta. "Orientación con sentido" se refiere a una secuencia de DNA que es homóloga a un transcrito de mRNA de la misma introducido en una planta que por lo tanto sería al menos una copia de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico adicional reducirá la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como cosupresión. La reducción de la expresión génica será más pronunciada si se introducen en la planta varias copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico, ya que hay una correlación positiva entre los altos niveles de transcritos y la activación de la cosupresión.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento por RNA implica el uso de secuencias de ácido nucleico antisentido. Una secuencia de ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico "con sentido" que codifica una proteína, es decir complementaria a la hebra codificante de una molécula de cDNA bicatenario o complementaria a una secuencia de transcrito de mRNA. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico antisentido es complementaria al gen endógeno que va a silenciarse. La complementariedad puede estar situada en la "región codificante" y/o en la "región no codificante" de un gen. El término "región codificante" se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácido. El término "región no codificante" se refiere a secuencias 5’ y 3’ que franquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones no traducidas 5’ y 3’).

Las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden diseñarse según las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a toda la secuencia de ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), pero también puede ser un oligonucleótido que es antisentido a solo una parte de la secuencia de ácido nucleico (incluyendo la UTR 5’ y 3’ de mRNA). Por ejemplo, la secuencia oligonucleotídica antisentido puede ser complementaria a la región que circunda el sitio de comienzo de la traducción de un transcrito de mRNA que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia oligonucleotídica antisentido adecuada se conoce en la especialidad y puede comenzar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácido nucleico antisentido según la invención puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligación enzimáticas usando métodos conocidos en la especialidad. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico antisentido (p. ej., una secuencia oligonucleotídica antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos presentes en la naturaleza o nucleótidos diversamente modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácido nucleico antisentido y con sentido, p. ej., pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótido sustituido con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar las secuencias de ácido nucleico antisentido son muy conocidos en la especialidad. Modificaciones de nucleótidos conocidas incluyen metilación, ciclación y ’protecciones' y la sustitución de uno o más de los nucleótidos presentes en la naturaleza con un análogo tal como inosina. Otras modificaciones de nucleótidos son muy conocidas en la especialidad.

La secuencia de ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que una secuencia de ácido nucleico se ha subclonado en una orientación antisentido (es decir, el RNA transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico de interés diana). Preferiblemente, la producción de secuencias de ácido nucleico antisentido en plantas se produce por medio de un constructo de ácido nucleico integrado establemente que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido conectado operativamente y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico usadas para el silenciamiento en los métodos de la invención (ya se introduzcan en una planta o se generen in situ) se hibridan con o se unen a transcritos de mRNA y/o DNA genómico que codifica un polipéptido para inhibir de ese modo la expresión de la proteína, p. ej., inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de DNA, a través de interacciones específicas en la hendidura principal de la doble hélice. Las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden introducirse en una planta mediante transformación o inyección directa en una zona de tejido específica. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden modificarse para células diana seleccionadas y a continuación administrarse sistémicamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden modificarse de modo que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, p. ej., conectando la secuencia de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de la superficie celular. Las secuencias de ácido nucleico antisentido también pueden aportarse a las células usando los vectores descritos en la presente memoria.

Según un aspecto adicional, la secuencia de ácido nucleico antisentido es una secuencia de ácido nucleico aanomérica. Una secuencia de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con RNA complementario en el que, contrariamente a las unidades b habituales, las hebras van paralelas entre sí (Gaultier et ál. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625-6641). La secuencia de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2’o-metilribonucleótido (Inoue et ál. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131-6148) o un análogo de RNA-DNA quimérico (Inoue et ál. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

La reducción o la eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno también se puede realizar usando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de RNA catalíticas con actividad de ribonucleasa que son capaces de segmentar una secuencia de ácido nucleico monocatenaria, tal como un mRNA, con la que tienen una región complementaria. Así, las ribozimas (p. ej., ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591)) pueden usarse para segmentar catalíticamente transcritos de mRNA que codifican un polipéptido, reduciendo de ese modo sustancialmente el número de transcritos de mRNA que ha de traducirse en un polipéptido. Puede diseñarse una ribozima que tenga especificidad para una secuencia de ácido nucleico (véanse, por ejemplo: la Patente de EE. UU. Nº 4.987.071 de Cech et ál. y la Patente de EE. UU. Nº 5.116.742 de Cech et ál.). Alternativamente, pueden usarse transcritos de mRNA correspondientes a un secuencia de ácido nucleico para seleccionar un RNA catalítico que tiene una actividad de ribonucleasa específica de un conjunto de moléculas de RNA (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas se conoce en la especialidad (p. ej., WO 94/00012 de Atkins et ál. (1994); WO 95/03404 de Lenne et ál. (1995); WO 00/00619 de Lutziger et ál. (2000); WO 97/13865 de Prinsen et ál. (1997) y WO 97/38116 de Scott et ál. (1997)).

El silenciamiento génico también puede alcanzarse mediante mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de T-DNA o inserción de un transposón) o mediante estrategias como las descritas por, entre otros, Angell y Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (WO 98/36083 de Amplicon VIGS) o Baulcombe (WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede producirse si hay una mutación sobre un gen/ácido nucleico aislado introducido posteriormente en una planta. La reducción o la eliminación sustancial pueden estar provocadas por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, un polipéptido puede unirse a diversas proteínas interactivas; una o más mutaciones y/o truncamientos pueden proporcionar por lo tanto un polipéptido que todavía es capaz de unirse a proteínas interactivas (tales como proteínas receptoras) pero que no puede exhibir su función normal (tal como ligando de señalización).

Un enfoque adicional para el silenciamiento génico es orientando secuencias de ácido nucleico complementarias a la región reguladora del gen (p. ej., el promotor y/o los estimuladores) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen en células diana. Véanse Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene et ál., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros métodos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que está implicado un polipéptido, serán muy conocidos para el experto. En particular, puede preverse que moléculas artificiales puedan ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana, o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicado el polipéptido diana.

Alternativamente, puede establecerse un programa de rastreo para identificar en una población de plantas variantes naturales de un gen, variantes que codifican polipéptidos con actividad reducida. Tales variantes naturales también pueden usarse, por ejemplo, para realizar recombinación homóloga.

Pueden usarse microRNA (mIRNA) artificiales y/o naturales para desactivar la expresión génica y/o la traducción de mRNA. Los mIRNA endógenos son RNA pequeños monocatenarios típicamente de 19-24 nucleótidos de largo. Funcionan principalmente para regular la expresión génica y/o la traducción de mRNA. La mayoría de los microRNA (mIRNA) de planta tienen una complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana. Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco discordancias. Se procesan a partir de RNA no codificantes más largos con estructuras replegadas características mediante RNasas bicatenarias específicas de la familia Dicer. Durante el procesamiento, se incorporan en el complejo silenciador inducido por RNA (RISC) uniéndose a su componente principal, una proteína Argonauta. Los mIRNA sirven como los componentes de especificidad de RISC, ya que tienen apareamiento de bases con ácidos nucleicos diana, principalmente mRNA, en el citoplasma. Episodios reguladores posteriores incluyen segmentación y destrucción de mRNA diana y/o inhibición de la traducción. Los efectos de la sobreexpresión de miRNA se reflejan así a menudo en niveles de mRNA disminuidos de los genes diana.

MicroRNA artificiales (amIRNA), que tienen típicamente 21 nucleótidos de longitud, pueden manipularse genéticamente de forma específica para regular negativamente la expresión génica de genes de interés individuales

o múltiples. Determinantes de la selección como diana de microRNA de planta son muy conocidos en la especialidad. Se han definido parámetros empíricos para el reconocimiento de dianas y pueden usarse para ayudar en el diseño de amIRNA específicos, Schwab R, 2005. También están disponibles para el público herramientas convenientes para el diseño y la generación de amIRNA y sus precursores, Schwab et ál., 2006.

Para un comportamiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico usadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácido nucleico procedentes de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y procedentes de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferiblemente, una secuencia de ácido nucleico procedente de cualquier especie de planta dada se introduce en la misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico procedente de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácido nucleico que va a introducirse se origine de la misma especie de planta que la planta en la que se introduce. Es suficiente que haya una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico que va a introducirse.

Se describen anteriormente ejemplos de diversos métodos para la reducción o la eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la especialidad sería capaz de adaptarse fácilmente a los métodos mencionados anteriormente para el silenciamiento a fin de alcanzar la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta entera o en partes de la misma a través del uso de un promotor apropiado, por ejemplo.

(Gen) Marcador seleccionable/Gen indicador

"Marcador seleccionable", "gen marcador seleccionable" o "gen indicador" incluye cualquier gen que confiera un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o la selección de células que se transfectan o se transforman con un constructo de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia satisfactoria de las moléculas de ácido nucleico a través de una serie de diferentes principios. Marcadores adecuados se pueden seleccionar de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptII que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporcionan resistencia contra glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tales como manA que permiten que las plantas usen manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo glucuronidasa, GUS o �-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tal como el sistema luciferina/luciferasa) o fluorescencia (proteína fluorescente verde, GFP, y sus derivados). Esta lista representa solo un pequeño número de posibles marcadores. El trabajador experto está familiarizado con tales marcadores. Se prefieren marcadores diferentes, dependiendo del organismo y el método de selección.

Se sabe que con la integración estable o transitoria de ácidos nucleicos en células vegetales, solo una minoría de las células recoge el DNA extraño y, si se desea, se integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión usado y la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (tal como los descritos anteriormente) se introduce habitualmente en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, deleción por métodos convencionales. Por otra parte, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable se pueden introducir en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o se pueden usar en los métodos de la invención, o también en un vector separado. Las células que se han transfectado establemente con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, células que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras células mueren).

Puesto que los genes marcadores, particularmente genes para resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no se requieren más o no se desean en la célula huésped transgénica una vez que los ácidos nucleicos se han introducido satisfactoriamente, el procedimiento según la invención para introducir los ácidos nucleicos ventajosamente emplea técnicas que permiten la retirada o la escisión de estos genes marcadores. Uno de tales métodos es el que se conoce como cotransformación. El método de cotransformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, portando un vector el ácido nucleico según la invención y portando un segundo el gen o los genes marcadores. Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacteria, los transformantes reciben habitualmente solo una parte del vector, es decir la secuencia flanqueada por el T-DNA, que habitualmente representa el casete de expresión. Los genes marcadores pueden retirarse posteriormente de la planta transformada realizando cruces. En otro método, se usan genes marcadores integrados en un transposón para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como la tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con un constructo de ácido nucleico que confiere la expresión de una transposasa, transitoriamente o estable. En algunos casos (aprox. 10%), el transposón salta fuera del genoma de la célula huésped una vez que la transformación ha tenido lugar satisfactoriamente y se pierde. En un número adicional de casos, el transposón salta a una posición diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse realizando cruces. En microbiología, se desarrollaron técnicas que hacen posible, o facilitan, la detección de tales episodios. Un método ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; cuya ventaja es que puede prescindirse de la eliminación mediante cruce. El sistema más conocido de este tipo es lo que se conoce como el sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que retira las secuencias situadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador está integrado entre las secuencias loxP, se retira una vez que la transformación ha tenido lugar satisfactoriamente, mediante la expresión de la recombinasa. Sistemas de recombinación adicionales son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et ál., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et ál., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Es posible una integración específica para el sitio en el genoma de la planta de las secuencias de ácido nucleico según la invención. Naturalmente, estos métodos también se pueden aplicar a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

Transgénico/Transgén/Recombinante

Para los propósitos de la invención, "transgénico", "transgén" o "recombinante" significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión, un constructo génico o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, casetes o vectores de expresión según la invención, todas esas construcciones realizadas mediante métodos recombinantes en los que bien

(a)

las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas útiles en los métodos de la invención, o bien

(b)

una secuencia o secuencias de control genéticas que están conectadas operativamente con la secuencia de ácido nucleico según la invención, por ejemplo un promotor, o bien

(c)

a) y b)

no están situadas en su ambiente genético natural o se han modificado mediante métodos recombinantes, siendo posible que la modificación tome la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótido. Se entiende que el ambiente genético natural significa el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se retiene preferiblemente, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferiblemente al menos 500 pb, de forma especialmente preferible al menos 1000 pb, lo más preferiblemente al menos 5000 pb. Un casete de expresión presente en la naturaleza - por ejemplo la combinación presente en la naturaleza del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica un polipéptido útil en los métodos de la presente invención, según se define anteriormente - se convierte en un casete de expresión transgénico cuando este casete de expresión es modificado mediante métodos sintéticos no naturales ("artificiales") tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Métodos adecuados se describen, por ejemplo, en US 5.565.350 o WO 00/15815.

Se entiende así que una planta transgénica para los propósitos de la invención significa, como anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el método de la invención no están en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen homólogamente o heterólogamente. Sin embargo, según se menciona, transgénico también significa que, mientras que los ácidos nucleicos según la invención o usados en el método de la invención están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Se entiende que transgénico significa preferiblemente la expresión de los ácidos nucleicos según la invención en un locus no natural en el genoma, es decir tiene lugar la expresión homóloga o, preferiblemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. Plantas transgénicas preferidas se mencionan en la presente memoria.

Transformación

El término "introducción" o "transformación", según se menciona en la presente memoria, abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método usado para la transferencia. Tejido de planta capaz de una propagación clonal posterior, ya sea mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con un constructo genético de la presente invención y regenerarse a partir de este. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y más adecuados para, la especie particular que se transforma. Dianas tisulares ejemplares incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (p. ej., meristemo apical, yemas axilares y meristemos radiculares), y tejido meristemático inducido (p. ej., meristemo de cotiledones y meristemo de hipocótilos). El polinucleótido puede introducirse transitoriamente o establemente en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede integrarse en el genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante puede usarse a continuación para regenerar una planta transformada de un modo conocido para los expertos en la especialidad.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de una especie de planta es ahora una técnica bastante habitual. Ventajosamente, puede usarse cualquiera de varios métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos de planta o células vegetales pueden utilizarse para la transformación transitoria o estable. Métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que incrementan la captación de DNA libre, inyección del DNA directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Los métodos pueden seleccionarse de los métodos de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et ál., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et ál. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et ál. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material vegetal (Crossway A et ál., (1986) Mol. Gen Genet

202: 179-185); bombardeo de partículas revestidas con DNA o RNA (Klein TM et ál., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integradores) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo plantas de cultivo transgénicas, se producen preferiblemente a través de transformación mediada por Agrobacterium. Un método de transformación ventajoso es la transformación en plantas. A este fin, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen sobre las semillas de planta o inocular el meristemo de la planta con agrobacterias. Ha resultado particularmente conveniente según la invención permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe sobre la planta intacta o al menos sobre los primordios de las flores. La planta se hace crecer posteriormente hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Métodos para la transformación mediada por Agrobacterium de arroz incluyen métodos muy conocidos para la transformación de arroz, tales como los descritos en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et ál. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiel et ál. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), divulgaciones que se incorporan mediante referencia en la presente memoria como si se expusieran en su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como el descrito en cualquiera de Ishida et ál. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et ál. (Plant Physiol 129(1): 1322, 2002), divulgaciones que se incorporan mediante referencia en la presente memoria como si se expusieran en su totalidad. Dichos métodos se describen adicionalmente a modo de ejemplo en B. Jenes et ál., Techniques for Gene Transfer, en: Plantas transgénicas, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o el constructo que van a expresarse se clonan preferiblemente en un vector, que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et ál., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por tal vector pueden usarse a continuación de manera conocida para la transformación de plantas, tales como plantas usadas como un modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana dentro del alcance de la presente invención no se considera una planta de cultivo), o plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo sumergiendo hojas machacadas u hojas cortadas en una solución de agrobacterias y a continuación cultivándolas en un medio adecuado. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens es descrita, por ejemplo, por Höfgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Además de la transformación de células somáticas, que a continuación tienen que regenerarse en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemos de planta y en particular aquellas células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Así, por ejemplo, semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y se obtienen semillas de plantas en desarrollo de las que una cierta porción se transforma y así son transgénicas [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, pp. 274-289]. Métodos alternativos se basan en la retirada repetida de las inflorescencias y la incubación de la zona de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, con lo que pueden obtenerse asimismo semillas transformadas en un punto temporal posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente eficaz es el método de infiltración a vacío con sus modificaciones, tal como el método del "baño floral". En el caso de la infiltración a vacío de Arabidopsis, plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras que en el caso del método del "baño floral" el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con tensioactivo [Clough, SJ und Bent, AF (1998). The Plant J. 16, 735-743]. Una cierta proporción de semillas transgénicas se recoge en ambos casos, y estas semillas pueden distinguirse de semillas no transgénicas al crecer bajo las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además, la transformación estable de plastidios es ventajosa debido a que los plastidios son hereditarios materialmente en la mayoría de las cosechas reduciendo o eliminando el riesgo de flujo de transgenes a través del polen. La transformación del genoma de los cloroplastos se alcanza generalmente mediante un procedimiento que ha sido presentado esquemáticamente en Klaus et ál., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Brevemente, las secuencias que van a transformarse se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre secuencias de flanqueo homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias de flanqueo homólogas dirigen la integración específica para el sitio en el plastoma. La transformación plastídica se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y una visión de conjunto se da en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 21 sept 2001; 312 (3):42538 o Malign, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Se ha presentado recientemente un avance biotecnológico adicional en forma de transformantes plastídicos libres de marcador, que pueden producirse mediante un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus et ál., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

Marcaje de activación con T-DNA

El marcaje de activación con T-DNA (Hayashi et ál. Science (1992) 1350-1353) implica la inserción de T-DNA, que contiene habitualmente un promotor (también puede ser un estimulador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb aguas arriba o abajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirija la expresión del gen elegido como diana. Típicamente, la regulación de la expresión del gen elegido como diana mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor recientemente introducido. El promotor está embebido típicamente en un T-DNA. Este T-DNA está insertado aleatoriamente en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección con Agrobacterium, y conduce a una expresión modificada de genes próximos al T-DNA insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de genes cerca del promotor introducido.

TILLING

TILLING (lesiones locales inducidas orientadas en genomas) es una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificadas. TILLING también permite la selección de plantas que portan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir una expresión modificada, bien en fuerza o bien en localización o bien en cronología (si las mutaciones afectan al promotor, por ejemplo). Estas variantes mutantes pueden exhibir una actividad superior que la exhibida por el gen en su forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de rastreo de alta productividad. Las etapas seguidas típicamente en TILLING son: (a) mutagénesis con EMS (Redel GP y Koncz C (1992) en Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapur, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et ál., (1994) en Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J y Caspar T (1998) en J Martínez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparación de DNA y reunión de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y reasociación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heterodúplex en un conjunto se detecta como un pico adicional en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciación del producto de PCR mutante. Métodos para TILLING son muy conocidos en la especialidad (McCallum et ál., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinación homóloga

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología estándar usada habitualmente en la ciencia biológica para organismos inferiores tales como levaduras o el moho Physcomitrella. Métodos para realizar la recombinación homóloga en plantas se han descrito no solo para plantas modélicas (Offringa et ál. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et ál. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8).

Rendimiento

El término "rendimiento" significa en general un producto agrícola medible de valor económico, típicamente relacionado con una cosecha especificada, con un área y con un período de tiempo. Partes de plantas individuales contribuyen directamente al rendimiento basándose en su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por área para una cosecha y año, que se determina dividiendo la producción total (incluye tanto producción recogida como evaluada) por áreas plantadas.

Vigor temprano

El vigor temprano (crecimiento bien equilibrado sano activo, especialmente durante las fases tempranas de crecimiento de la planta) puede resultar de una salud incrementada de la planta debido a, por ejemplo, que las plantas se adapten mejor a su ambiente (es decir optimizar el uso de recursos energéticos y repartir entre vástagos y raíces). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran una supervivencia incrementada de las plástulas y un mejor establecimiento de la cosecha, lo que a menudo da como resultado campos muy uniformes (con la cosecha creciendo de un modo uniforme, es decir con la mayoría de las plantas alcanzando las diversas fases de desarrollo sustancialmente en el mismo momento), y a menudo un rendimiento mejor y superior. Por lo tanto, el vigor temprano puede determinarse midiendo diversos factores, tales como peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de las plántulas, altura de las plántulas, longitud de las raíces, biomasa de raíces y vástagos y muchos más.

Incrementar/Mejorar/Estimular

Los términos "incrementar", "mejorar" o "estimular" son intercambiables y significarán en el sentido de la solicitud al menos un 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%, preferiblemente al menos 15% o 20%, más preferiblemente 25%, 30%, 35%

o 40% más rendimiento y/o crecimiento en comparación con las plantas de control según se definen en la presente memoria.

Rendimiento de semillas

Un rendimiento de semillas incrementado puede manifestarse como uno o más de los siguientes: a) un incremento en la biomasa de semillas (peso total de las semillas) que pueden ser sobre una base de semillas individuales y/o por planta y/o por hectárea o área; b) número incrementado de flores por planta; c) número incrementado de semillas (llenas); d) grado incrementado de llenado de semillas (que se expresa como la relación entre el número de semillas llenas dividido por el número total de semillas); e) índice de recolección incrementado, que se expresa como la relación del rendimiento de partes recolectables, tales como semillas, dividido por la biomasa total; y f) peso de mil granos (TKW) incrementado, que se extrapola del número de semillas llenas contadas y su peso total. Un TKW incrementado puede resultar de un tamaño de semillas y/o un peso de las semillas incrementado, y también puede resultar de una incremento en el tamaño de los embriones y/o los endospermos.

Un incremento en el rendimiento de las semillas también puede manifestarse como un incremento en el tamaño de las semillas y/o el volumen de las semillas. Por otra parte, un incremento en el rendimiento de las semillas también puede manifestarse como un incremento en el área de las semillas y/o la longitud de las semillas y/o la anchura de las semillas y/o el perímetro de las semillas. Un rendimiento incrementado también puede dar como resultado una arquitectura modificada, o puede producirse debido a la arquitectura modificada.

Planta

El término "planta", según se usa en la presente memoria, abarca plantas enteras, antecesores y progenie de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, vástagos, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores y tejidos y órganos, donde cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca células vegetales, cultivos en suspensión, tejido calloso, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, donde de nuevo cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo legumbres para pasto

o forraje, plantas ornamentales, cosechas alimenticias, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende especies de Acer, especies de Actinidia, especies de Abalmoschus, Agave sisatana, especies de Agropyron, Agrostis stolonifera, especies de Allium, especies de Amaranthus, Ammophlia arenaria, Ananas comosus, especies de Annona, Apium graveolens, especies de Arachis, especies de Artocarpus, Asparagus officinalis, especies de Avena (p. ej. Avena sativa, Avena fatua, Arena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, especies de Bambusa, Benincasa hispida, Bertholletia exceisea, Beta vulgaris, especies de Brassica (p. ej. Brassica napus, especies de Bressica repa [Canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, especies de Capsicum, Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, especies de Carya, Carthamus tinctorius, especies de Castanea, Ceiba pentandra, Cichorium endivia, especies de Cinnamomum, Citrulius lanatus, especies de Citrus, especies de Cocos, especies de Coffea, Colocasia esculenta, especies de Cola, especies de Corchorus, Coriandrum sativum, especies de Corylus, especies de Crataegus, Crocus sativus, especies de Cucurbita, especies de Cucumis, especies de Cynara, Daucus carota, especies de Desmodium, Dlmocarpus longan, especies de Dioscorea, especies de Diospyros, especies de Echinochioa, Elaeis

(p.

ej. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, una especie de Erianthus, Eriobotrya japonica, una especie de Eucalyptus, Eugenia uniflora, especies de Fagopyrum, especies de Fagus, Festuca arundinacea, Ficus carica, especies de Fortunella, especies de Fragaria, Ginkgo biloba, especies de Glycine (p. ej. Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossyplum hirsutum, especies de Helianthus (p. ej. Hellanthus annuus), Hemerocallis fulva, especies de Hibiscus, especies de Hordeum (p. ej. Hordeum vulgare), ipomoea batatas, especies de Juglans, Lactuca sativa, especies de Lathyrus, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, especies de Lotus, Luffa acutangula, especies de Lupinus, Luzula sylvatica, especies de Lycopersicon (p. ej. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), especies de Macroyloma, especies de Malus, Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, especies de Manlhot, Manlikara zapota, Medicago sativa, especies de Melilotus, especies de Mentha, Miscanthus sinensis, especies de Momordica, Morus nigra, especies de Musa, especies de Nicotiana, especies de Olea, especies de Opuntia, especies de Omithopus, especies de Oryza

(p.

ej. Oryza sativa, Oryza latitblia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, una especie de Pennisetum, especies de Persea, Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, especies de Phaseolus, Phleum pratense, especies de Phoenix, Phragmites australis, especies de Physalis, especies de Pinus, Pistacis vera, especies de Pisum, especies de Poa, especies de Populus, especies de Prosopis, especies de Prunus, especies de Psidium, Punica granatum, Pyrus communis, especies de Quercus, Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, especies de Ribes, Ricinus communis, especies de Rubus, especies de Saccharum, una especie de Salix, especies de Sambucus, Secale cereale, especies de Sesamum, una especie de Sinapis, especies de Solanum

(p.

ej. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum tycopersicum), Sorghum bicolor, especies de Spinacia, especies de Syzygium, especies de Tagetes, Tamarindus indica, Theobroma cacao, especies de Trifolium, Triticosecals rimpaui, especies de Triticum (p. ej. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, especies de Vaccinium, especies de Vicia, especies de Vigna, Viola odorata, especies de Vitis, Zea mays, Zizania palustris, especies de Ziziphus, entre otras.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Según una primera realización de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas de planta con relación a plantas de control, que comprende incrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en vástagos de planta.

Se considera que cualquier referencia posteriormente en la presente memoria a una "proteína útil en los métodos de la invención" significa un polipéptido de HAL3 según se define en la presente memoria. Se considera que cualquier referencia posteriormente en la presente memoria a un "ácido nucleico útil en los métodos de la invención" significa un ácido nucleico capaz de codificar tal polipéptido de HAL3. El ácido nucleico que va a introducirse en una planta (y por lo tanto es útil para realizar los métodos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifique el tipo de proteína que se describirá ahora, en lo sucesivo también llamado aquí "ácido nucleico de HAL3" o "gen de HAL3".

Una "referencia", "planta de referencia", "control", "planta de control", "tipo silvestre" o "planta silvestre" es en particular una célula, un tejido, un órgano, una planta o una de sus partes que no se producía según el método de la invención. De acuerdo con esto, los términos "tipo silvestre", "control" o "referencia" son intercambiables y pueden ser una célula o una parte de la planta tal como un orgánulo o tejido, o una planta, que no se modificaba o se trataba según el método descrito en la presente memoria según la invención. De acuerdo con esto, la célula o una parte de la planta tal como un orgánulo o una planta usados como tipo silvestre, control o referencia corresponde a la célula, planta o parte de la misma tanto como sea posible y es en cualquier otra propiedad excepto en el resultado del procedimiento de la invención tan idéntica a la materia de la invención como sea posible. Así, el tipo silvestre, el control o la referencia se trata de forma idéntica o tan idéntica como sea posible, indicando que solo podrían ser diferentes las condiciones o propiedades que no influyen en la calidad de la propiedad probada. Esto significa en otras palabras que el tipo silvestre indica (1) una planta, que porta la forma inalterada o no modulada de un gen o alelo o (2) el material de partida/la planta a partir de los cuales se derivan las plantas producidas mediante el procedimiento o método de la invención.

Preferiblemente, cualquier comparación entre las plantas silvestres y las plantas producidas mediante el método de la invención se lleva a cabo bajo condiciones análogas. El término "condiciones análogas" significa que todas las condiciones, tales como, por ejemplo, las condiciones de cultivo o crecimiento, las condiciones de ensayo (tales como composición del tampón, temperatura, sustratos, cepa de patógeno, concentraciones y similares) se mantienen idénticas entre los experimentos que van a compararse.

La "referencia", el "control" o el "tipo silvestre" es preferiblemente un sujeto, p. ej. un orgánulo, una célula, un tejido, una planta, que no estaba modulado, modificado o tratado según el procedimiento de la invención descrito en la presente memoria y es en cualquier otra propiedad tan similar como sea posible a la materia de la invención. La referencia, el control o el tipo silvestre es en su genoma, transcriptoma, proteoma o metaboloma tan similar como sea posible al sujeto de la presente invención. Preferiblemente, el término orgánulo, célula, tejido o planta de "referencia", de "control" o "silvestre" se refiere a un orgánulo, una célula, un tejido o una planta que es casi genéticamente idéntico al orgánulo, la célula, el tejido o la planta de la presente invención o una de sus partes, preferiblemente 95%, se prefiere más 98%, aún se prefiere más 99,00%, en particular 99,10%, 99,30%, 99,50%, 99,70%, 99,90%, 99,99%, 99,999% o más. Lo más preferiblemente, la "referencia", el "control" o el "tipo silvestre" es preferiblemente un sujeto, p. ej. un orgánulo, una célula, un tejido, una planta, que es genéticamente idéntico a la planta, la célula o el orgánulo usado según el método de la invención, excepto que las moléculas de ácido nucleico o el producto génico codificado por ellas están cambiados, modulados o modificados según el método de la invención.

En caso de que no pueda proporcionarse un control, una referencia o un tipo silvestre que difiera del sujeto de la presente invención sólo por no estar sometido al método de la invención, un control, una referencia o un tipo silvestre puede ser una planta en la que la causa de la modulación de la actividad que confiere el incremento de los metabolitos se describe bajo los ejemplos.

El incremento referido a la actividad de las cantidades de polipéptido en una célula, un tejido, un orgánulo, un órgano o un organismo o una de sus partes es preferiblemente hasta al menos 5%, preferiblemente hasta al menos 10% o al menos 15%, de forma especialmente preferible hasta al menos 20%, 25%, 30% o más, de forma muy especialmente preferible es hasta al menos 40%, 50% o 60%, lo más preferiblemente es hasta al menos 70% o más en comparación con el control, la referencia o el tipo silvestre.

En particular, se considera que el término "rendimiento de semillas incrementado" significa un incremento en la biomasa (peso) de semillas.

Preferiblemente, el incremento en el rendimiento de las semillas es al menos 10% mayor que el rendimiento de plantas silvestres correspondientes.

En particular, las partes cosechables de una planta son semillas, y el comportamiento de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado con relación al rendimiento de semillas de las plantas de control.

El término "expresión" o "expresión génica" significa la aparición de un rasgo fenotípico como consecuencia de la transcripción de un gen específico o genes específicos. El término "expresión" o "expresión génica" significa en particular medios para la transcripción de un gen o genes en RNA estructural (rRNA, tRNA) o mRNA con la traducción posterior del último en una proteína. El procedimiento incluye la transcripción de DNA, el procesamiento del producto de mRNA resultante y su traducción en una proteína activa.

La realización de los métodos de la invención da plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado con relación a las plantas de control. Los términos "rendimiento" y "rendimiento de semillas" se describen con más detalle en la sección de "definiciones" en la presente memoria.

Se considera que la referencia en la presente memoria a rasgos relacionados con el rendimiento estimulados significa un incremento en la biomasa (peso) de semillas. En particular, las partes cosechables de una planta son las semillas, y la realización de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado con relación al rendimiento de semillas de plantas de control adecuadas.

Tomando el maíz como un ejemplo, un incremento en el rendimiento (de semillas) puede manifestarse a través de uno o más de los siguientes: incremento en el número de plantas por hectárea o área, un incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el número de surcos, el número de granos por surco, el peso del grano, el peso de mil granos, la longitud/diámetro de las espigas, un incremento en el grado de llenado de las semillas (que es el número de semillas llenas dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como un ejemplo, un incremento del rendimiento (de semillas) puede manifestarse a través de un incremento en uno o más de los siguientes: número de plantas por hectárea o área, número de panículos por planta, número de espiguillas por panículo, número de flores (flósculos) por panículo (que se expresa como una relación del número de semillas llenas al número de panículos primarios), incremento en el grado de llenado de semillas (que es el número de semillas llenas dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100), incremento en el peso de mil granos, entre otros.

Según la presente invención, la realización de los métodos de la invención da plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado con relación a plantas de control. Por lo tanto, según la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas en plantas con relación al rendimiento de semillas de plantas de control, comprendiendo el método incrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en tejidos de vástago, preferiblemente en tejido en expansión de un vástago de planta.

Puesto que las plantas transgénicas según la presente invención tienen un rendimiento de semillas incrementado, es probable que estas plantas exhiban una velocidad de crecimiento incrementada (durante al menos parte de su ciclo vital), con relación a la velocidad de crecimiento de plantas de control en una fase correspondiente de su ciclo vital.

La velocidad de crecimiento incrementada puede ser específica para una o más partes de una planta (incluyendo las semillas), o puede ser sustancialmente en toda la planta. Las plantas que tienen una velocidad de crecimiento incrementada pueden tener un ciclo vital más corto. Puede considerarse que el ciclo vital de una planta significa el tiempo necesario para que crezca desde una semilla madura seca hasta la fase en la que la planta ha producido semillas maduras secas, similares al material de partida. Este ciclo vital puede estar influenciado por factores tales como el vigor temprano, la velocidad de crecimiento, el índice de verdor, la época de floración y la velocidad de maduración de las semillas. El incremento en la velocidad de crecimiento puede tener lugar en una o más fases del ciclo vital de una planta o sustancialmente durante todo el ciclo vital de la planta. La velocidad de crecimiento incrementada durante las fases tempranas del ciclo vital de una planta puede reflejar un vigor estimulado. El incremento en la velocidad de crecimiento puede alterar el ciclo de recolección de una planta permitiendo que las plantas se siembren más tarde y/o se recolecten antes de lo que sería posible de otro modo (un efecto similar puede obtenerse con una época de floración más temprana). Si la velocidad de crecimiento se incrementa suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo la siembra y la recolección de plantas de arroz seguida por la siembra y la recolección de plantas de arroz adicionales todo dentro de un período de crecimiento convencional). De forma similar, si la velocidad de crecimiento se incrementa suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de especies de plantas diferentes (por ejemplo la siembra y la recolección de plantas de maíz después de, por ejemplo, la siembra y la recolección opcional de soja, patata o cualquier otra planta adecuada). También son posibles épocas adicionales de recolección del mismo patrón en el caso de algunas plantas de cultivo. Alterar el ciclo de recolección de una planta puede conducir a un incremento en la producción de biomasa anual por área (debido a un incremento en el número de veces (pongamos por caso en un año) que cualquier planta particular puede desarrollarse y recolectarse). Un incremento en la velocidad de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus homólogos silvestres, ya que las limitaciones territoriales para desarrollar una cosecha a menudo están determinadas por condiciones ambientales adversas bien en la época de plantación (principio de temporada) o bien el la época de recolección (final de temporada). Tales condiciones adversas pueden evitarse si se acorta el ciclo de recolección. La velocidad de crecimiento se puede determinar derivando diversos parámetros de las curvas de crecimiento, tales parámetros pueden ser: T-Medio (el tiempo empleado por las plantas para alcanzar 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo empleado por las plantas para alcanzar 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Un incremento en el rendimiento de semillas y/o la velocidad de crecimiento se produce si la planta no está bajo condiciones de estrés o si la planta se expone a diversos estreses en comparación con plantas de control. Típicamente, las plantas responden a una exposición a estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés riguroso, la planta puede incluso detener totalmente el crecimiento. Por otra parte, el estrés suave se define en la presente memoria como cualquier estrés al que se expone una planta que no da como resultado que la planta deje de crecer totalmente sin la capacidad de reanudar el crecimiento. El estrés suave en el sentido de la invención conduce a una reducción en el crecimiento de las plantas estresadas de menos de 40%, 35% o 30%, preferiblemente menos de 25%, 20% o 15%, más preferiblemente menos de 14%, 13%, 12%, 11% o 10% o memos en comparación con la planta de control bajo condiciones libres de estrés. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con plaguicidas) no se encuentras estreses rigurosos en plantas cultivadas. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés suave a menudo es una característica no deseable para la agricultura. Los estreses suaves son los estreses bióticos y/o abióticos (ambientales) diarios a los que está expuesta una planta. Los estreses abióticos pueden deberse a sequía o exceso de agua, estrés anaerobio, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y temperaturas cálidas, frías o de congelación. El estrés abiótico puede ser un estrés osmótico provocado por un estrés hídrico (particularmente debido a la sequía), estrés salino, estrés oxidativo o un estrés iónico. Los estreses bióticos son típicamente los estreses provocados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos.

En particular, los métodos de la presente invención pueden realizarse bajo condiciones libres de estrés o bajo condiciones de sequía leve para dar plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado con relación a plantas de control. Según se presenta en Wang et ál. (Planta (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan adversamente al crecimiento y la productividad de las plantas. Se sabe que la sequía, la salinidad, las temperaturas extremas y el estrés oxidativo están interconectados y pueden inducir daño al crecimiento y celular a través de mecanismos similares. Rabbani et ál. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente alto de "réplica" entre el estrés por sequía y el estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, dando como resultado la ruptura de la homeostasis y la distribución iónica en la célula. El estrés oxidativo, que con frecuencia acompaña a la temperatura alta o baja, el estrés por salinidad o sequía, puede provocar la desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos estreses ambientales a menudo activan rutas de señalización celulares y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas de estrés, la regulación al alza de antioxidantes, la acumulación de solutos compatibles y la interrupción del crecimiento. El término condiciones "libres de estrés", según se usa en la presente memoria, se refiere a las condiciones ambientales que permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Los expertos en la especialidad conocen las condiciones del suelo y las condiciones climáticas normales para una zona dada.

La realización de los métodos de la invención da plantas desarrolladas bajo condiciones libres de estrés o bajo condiciones de sequía leve con rendimiento de semillas incrementado con relación a plantas de control adecuadas desarrolladas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, según la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas en plantas desarrolladas bajo condiciones libres de estrés o bajo condiciones de sequía leve, método que comprende incrementar la expresión en vástagos de planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3.

La realización de los métodos de la invención da plantas desarrolladas bajo condiciones de deficiencia de nutrientes, particularmente bajo condiciones de deficiencia de nitrógeno, con rendimiento de semillas incrementado con relación a plantas de control desarrolladas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, según la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas en plantas desarrolladas bajo condiciones de deficiencia de nutrientes, método que comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3. La deficiencia de nutrientes puede resultar de una falta o un exceso de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, cadmio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

La realización de los métodos de la invención da plantas que tienen un vigor de la planta incrementado con relación a plantas de control, particularmente durante las fases tempranas de desarrollo de la planta (típicamente tres, cuatro semanas después de la germinación en el caso del arroz y el maíz, pero esto puede variar de especie a especie) conduciendo a un vigor temprano.

El vigor temprano también puede resultar de una salud incrementada de la planta debido a, por ejemplo, que las plantas se adapten mejor a su ambiente (es decir optimizando el uso de recursos energéticos y repartiendo entre vástagos y raíces). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran una supervivencia incrementada de las plántulas y un mejor establecimiento de la cosecha, que a menudo da como resultado campos muy uniformes (creciendo la cosecha de modo uniforme, es decir alcanzado la mayoría de las plantas las diversas fases de desarrollo sustancialmente al mismo tiempo), y a menudo un rendimiento (de semillas) mejor y superior. Por lo tanto, el vigor temprano puede determinarse midiendo diversos factores, tales como peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de plántulas, peso de las plántulas, longitud de las raíces, biomasa de raíces y vástagos y muchos más.

Ventajosamente, los métodos de la invención son aplicables a cualquier planta.

Plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo legumbres para pasto

o forraje, plantas ornamentales, cosechas alimenticias, árboles o arbustos. Según una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, Canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata y tabaco. Más preferiblemente, la planta es una planta monocotiledónea. Ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Más preferiblemente, la planta es un cereal. Ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada mijo, centeno, triticale, sorgo y avena.

Otras plantas ventajosas se seleccionan del grupo que consiste en Asteraceae tales como los géneros Helianthus, Tagetes, p. ej. las especies Helianthus annus [girasol], Tagetes lucida, Tagetes erecta o Tagetes tenuifolia [caléndula], Brassicaceae tales como los géneros Brassica, Arabidopsis, p. ej. la especie Brassica napus, especies de Brassica rapa [Canola, colza, nabo] o Arabidopsis thaliana. Fabaceae tales como los géneros Glycine p. ej. las especies Glycine max, Soja hispida o Soja max [soja]. Linaceae tales como los géneros Linum, p. ej. las especies Linum usitatissimum, [lino, linaza]; Poaceae tales como los géneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Oryza, Zea, Triticum, p. ej. las especies Hordeum vulgare [cebada]; Secale cereale [centeno], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [avena], Sorghum bicolor [sorgo, mijo], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz]. Zea mays [maíz] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare [trigo, trigo candeal, trigo común]; Solanaceae tales como los géneros Solanum, Lycopersicon, p. ej. las especies Solanum tuberosum [patata], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme. Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum [tomate].

El término "polipéptido de HAL3", según se define en la presente memoria, se refiere a una flavoproteína perteneciente a la superfamilia HFCD (flavina homooligomérica que contiene Cys descarboxilasas; Kupke J. Biol.Chem. 276, 27597-27604, 2001). Estas proteínas comparten un motivo de unión a flavina, residuos de sitio activo conservados y son enzimas triméricas o dodecaméricas. Las proteínas de HAL3 comprenden preferiblemente desde el extremo N al extremo C (i) una hélice de unión al sustrato, (ii) un motivo His de inserción, (iii) un motivo PXMNXXMW y (iv) una pinza de reconocimiento del sustrato (Figura 1). Se predice que estos cuatro dominios están implicados en la unión al sustrato, el motivo His de inserción comprende un residuo de His conservado que está implicado en el sitio activo mientras que la secuencia en la pinza de reconocimiento del sustrato puede ser algo variable en secuencia y longitud (Blaesse et ál., EMBO J. 19, 6299-6310, 2000). Las características estructurales (i) a (iv) también se describen en Kupke et ál. (2001), cuya divulgación se incorpora en la presente memoria mediante referencia. Típicamente, los polipéptidos de HAL3 son capaces de la unión de cofactores de FMN.

Típicamente, la hélice de unión al sustrato está comprendida por un motivo de secuencia 1 con la siguiente secuencia de consenso (SEQ ID NO: 6):

El motivo His de inserción, el motivo PXMNXXMW y la pinza de reconocimiento del sustrato son parte del motivo de secuencia 2 con la siguiente secuencia de consenso (SEQ ID NO: 7):

donde x1 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente x1 es uno de L, V, E, H, D, M, I o Q y donde X2 puede ser 5 cualquier aminoácido, preferiblemente X2 es uno de S, L, T, A o V.

Estos motivos forman parte de una región conservada mayor en la proteína, como un ejemplo, la región conservada de HAL3a de Arabidopsis se da como SEQ ID NO: 8. Los polipéptidos de HAL3 útiles en los métodos de la presente invención tienen en orden de preferencia creciente al menos 65%, 70%, 76%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencias con la región conservada representada por SEQ ID NO: 8.

10 La región conservada en proteína de HAL3, según se ejemplifica en SEQ ID NO: 8 y que comprende las características descritas anteriormente (i) a (iv), abarca un dominio de flavoproteína que puede identificarse usando bases de datos especializadas, p. ej. SMART (Schultz et ál. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et ál. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), interPro (Mulder et ál., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher y Balroch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in

15 automatic sequence interpretation. (En) ISMB-94; Proceedings 2nd international Conference on intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp 53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et ál., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)) o Pfam (Bateman et ál., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)). Este dominio de unión a FMN (entrada Pfam PF02441, entrada interPro IPR003382) se encuentra típicamente en enzimas de flavoproteína. Los términos "dominio" y "motivo" se definen en la sección de definiciones

20 anteriormente.

La región conservada en SEQ ID NO: 2, que se representa por SEQ ID NO: 8, también puede identificarse en otras proteínas de HAL3, usando métodos para el alineamiento de secuencias para comparación según se describe anteriormente en la presente memoria. En algunos casos, los parámetros por defecto pueden ajustarse para modificar la restricción de la búsqueda. Por ejemplo, usando BLAST, el umbral de significación estadística (llamado

25 valor "experto") para informar de concordancias frente a secuencias de la base de datos puede incrementarse para mostrar concordancias menos restrictivas. De este modo, pueden identificarse concordancias cortas casi exactas, incluyendo los motivos conservados 1 y 2 (SEQ ID NO: 6 y 7), o concordancias con uno o más cambios conservativos en cualquier posición.

Los polipéptidos de HAL3 (al menos en su forma natural) y sus homólogos típicamente catalizan la descarboxilación

30 de 4’-fosfopantotenoilcisteína hasta 4’-fosfopanteteína, una etapa en la biosíntesis de la coenzima A, reacción que puede probarse en un ensayo bioquímico; alternativamente, la actividad de HAL3 puede ensayarse mediante una prueba de complementación con una cepa de E. coli mutante dfp (Kupke et ál 2001; Yonamine et ál 2004). La enzima también es capaz de descarboxilar pantotenoilcisteína hasta pantotenoilcisteamina. Por otra parte, la proteína está implicada en conferir tolerancia al estrés salino y osmótico a las plantas, característica que puede ser

35 útil en un bioensayo para HAL3.

El SEQ ID NO: 2 (codificado por SEQ ID NO: 1) es un ejemplo de un polipéptido de HAL3 que comprende desde el extremo N hasta el extremo C las características (i) una hélice de unión al sustrato, (ii) un motivo His de inserción,

(iii) un motivo PXMNXXMW y (iv) una pinza de reconocimiento del sustrato; y que tiene en orden de preferencia

creciente al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencias con la región conservada 40 representada por SEQ ID NO: 8. Ejemplos adicionales de polipéptidos de HAL3 que comprenden las características

(i) a (iv) se dan en la Tabla A en la sección de ejemplos posteriormente:

También se pueden usar homólogos de un polipéptido de HAL3 para realizar los métodos de la invención.

Los homólogos (o las proteínas homólogas) pueden identificarse fácilmente usando técnicas habituales muy conocidas en la especialidad, tales como alineamiento de secuencias. Métodos para el alineamiento de 45 secuencias para comparación son muy conocidos en la especialidad, tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximice el número de concordancias y minimice el número de huecos. El algoritmo BLAST (Altschul et ál. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencias y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos 50 secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible al público a través del National Centre for Biotechnology Information. Los homólogos pueden identificarse fácilmente usando, por ejemplo, el algoritmo de alineamiento de secuencias múltiple ClustalW (versión 1.83), con los parámetros de alineamiento por parejas por defecto, y un método de puntuación en porcentaje. Los porcentajes generales

de similitud e identidad también se pueden determinar usando uno de los métodos disponible en el paquete de software MatGAT (Campanella et ál., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Puede realizarse una pequeña edición manual para optimizar el alineamiento entre motivos conservados, como será evidente para un experto en la especialidad.

Los valores de identidad de secuencias pueden determinarse a lo largo de todo el dominio conservado (según se indica anteriormente) o a lo largo del ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos de longitud completa usando los programas mencionados anteriormente usando los parámetros por defecto.

Los homólogos también incluyen ortólogos y parálogos. Los ortólogos y los parálogos pueden encontrarse fácilmente realizando la llamada búsqueda blast recíproca. Esto se realiza mediante una primera BLAST que implica someter una secuencia de consulta ("query sequence") (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) a una búsqueda BLAST contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos de NCBI disponible al público. Pueden usarse BLASTN o TBLASTX (usando valores por defecto estándar) cuando se parte de una secuencia de nucleótidos y pueden usarse BLASTP o TBLASTN (usando valores por defecto estándar) cuando se parte de una secuencia de proteína. Los resultados de BLAST pueden filtrarse opcionalmente. Las secuencias de longitud completa bien de los resultados filtrados o bien de los resultados no filtrados se someten a continuación a una segunda búsqueda BLAST (nueva BLAST) frente a secuencias procedentes del organismo del que se deriva la secuencia de consulta (cuando la secuencia de consulta es SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 la segunda BLAST sería por lo tanto frente a secuencias de Arabidopsis). Los resultados de las búsquedas por BLAST primera y segunda se comparan entonces. Un parálogo se identifica si un acierto de alto grado procedente de la primera BLAST es de la misma especie de la que se deriva la secuencia de consulta; un ortólogo se identifica si un acierto de alto grado no procede de la misma especie que de la que se deriva la secuencia de consulta. Los ortólogos preferidos son ortólogos de AtHAL3a (SEQ ID NO: 2), AtHAL3b (SEQ ID NO: 10) o de la forma larga de AtHAL3b (SEQ ID NO: 40). Los aciertos de alto grado son los que tienen un valor E inferior. Cuanto menor sea el valor E, más significativa será la puntuación (o, en otras palabras, menor será la posibilidad de que el acierto se encuentre por azar). La computación del valor E es muy conocida en la especialidad. En el caso de familias grandes, puede usarse ClustalW, seguido por un árbol filogenético, para ayudar a visualizar el agrupamiento de genes relacionados y para identificar ortólogos y parálogos. Además de los valores E, las comparaciones también se puntúan mediante porcentaje de identidad. Porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácido nucleico (o polipéptido) comparadas a lo largo de una longitud particular. Preferiblemente, los homólogos de polipéptidos de HAL3 tienen en orden creciente de preferencia al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad o similitud de secuencias (identidad funcional) con un polipéptido de HAL3 no modificado como el representado por SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, los homólogos de polipéptidos de HAL3 son según se representan por las secuencias mencionadas en la Tabla A.

El polipéptido de HAL3 útil en los métodos de la presente invención puede ser un derivado dSEQ ID NO: 2. "Derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma de la proteína presente en la naturaleza, tal como la presentada en SEQ ID NO: 2, comprender sustituciones de aminoácidos por residuos de aminoácido no presentes en la naturaleza, o adiciones de residuos de aminoácido no presentes en la naturaleza. Derivados de las proteínas como los representados por las secuencias listadas en la Tabla A son ejemplos adicionales que pueden ser adecuados para el uso en los métodos de la invención

Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3 incluyen pero no se limitan a los representados por las secuencias listadas en la Tabla A. Variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3 pueden ser adecuadas para el uso en los métodos de la invención. Variantes adecuadas incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3 y/o ácidos nucleicos capaces de hibridarse con ácidos nucleicos/genes que codifican polipéptidos de HAL3. Variantes adecuadas incluyen variantes de empalme y variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3.

El término "porción", según se define en la presente memoria, se refiere a un trozo de DNA que codifica un polipéptido que comprende del extremo N al extremo C las características (I) una hélice de unión al sustrato, (II) un motivo His de inserción, (III) un motivo PXMNXXMW y (IV) una pinza de reconocimiento del sustrato; y que tiene en orden de preferencia creciente al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencias con la región conservada representada por SEQ ID NO: 8.

Una porción puede prepararse, por ejemplo, realizando una o más deleciones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3. Las porciones pueden usarse en forma aislada o pueden fusionarse a otras secuencias codificantes (o no codificantes) a fin de, por ejemplo, producir una proteína que combina varias actividades. Cuando se fusiona con otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido durante la traducción puede ser mayor que el predicho para la porción de HAL3. Preferiblemente, la porción codifica un polipéptido sustancialmente con la misma actividad biológica que el polipéptido de HAL3 de SEQ ID NO: 2. La porción tiene típicamente al menos 50, 100, 150 o 200 nucleótidos de longitud, preferiblemente al menos 250, 300, 350 o 400 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos 450, 500, 550, 600 o 650 nucleótidos de longitud.

Preferiblemente, la porción es una porción de un ácido nucleico como la representada por las secuencias listadas en la Tabla A. Lo más preferiblemente, la porción es una porción de un ácido nucleico como la representada por SEQ ID NO: 1.

Los términos "fragmento", "fragmento de una secuencia" o "parte de una secuencia", "porción" o " porción de la misma" significan una secuencia truncada de la secuencia original mencionada. La secuencia (secuencia de ácido nucleico o de proteína) truncada puede variar ampliamente en longitud; siendo el tamaño mínimo una secuencia de tamaño suficiente para proporcionar una secuencia con al menos una función y/o actividad comparable de la secuencia original mencionada o hibridarse con la molécula de ácido nucleico de la invención o usarse en el procedimiento de la invención bajo condiciones restrictivas, aunque el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo habitualmente no es sustancialmente mayor que el requerido para proporcionar la actividad y/o la función o funciones deseadas de la secuencia original. Una función comparable significa al menos 40%, 45% o 50%, preferiblemente al menos 60%, 70%, 80% o 90% o más de la secuencia original.

Otra variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3, útil en los métodos de la presente invención, es un ácido nucleico capaz de hibridarse bajo condiciones de restricción reducida, preferiblemente bajo condiciones restrictivas, con una sonda derivada del ácido nucleico según se define anteriormente en la presente memoria, secuencia hibridante que codifica un polipéptido que comprende del extremo N al extremo C las características (i) una hélice de unión al sustrato, (ii) un motivo His de inserción, (iii) un motivo PXMNXXMW y (iv) una pinza de reconocimiento del sustrato; y tiene en orden de preferencia creciente al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencias con la región conservada representada por SEQ ID NO: 8.

Preferiblemente, la secuencia hibridante es una que es capaz de hibridarse a un ácido nucleico como el representado por (o a sondas derivadas de) las secuencias listadas en la Tabla A, o a una porción de cualquiera de estas secuencias (la secuencia diana). Lo más preferiblemente, la secuencia hibridante es capaz de hibridarse a SEQ ID NO: 1 (o a sondas derivadas de la misma). Las sondas son generalmente menores de 700 pb o 600 pb de longitud, preferiblemente menores de 500, 400 pb, 300 pb 200 pb o 100 pb de longitud. Comúnmente, las longitudes de las sondas para hibridaciones de DNA-DNA tales como una transferencia Southern varían entre 100 y 500 pb, mientras que la región hibridante en sondas para hibridaciones de DNA-DNA tales como en la amplificación por PCR son generalmente más cortas de 50 pero más largas de 10 nucleótidos, preferiblemente tienen 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 pb de longitud.

El polipéptido de HAL3 puede codificarse mediante una variante de empalme. El término "variante de empalme", según se usa en la presente memoria, abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en las que intrones y/o exones seleccionados se han escindido, reemplazado, desplazado o añadido, o en las que los intrones se han acortado o alargado. Tales variantes serán unas en las que se retiene la actividad biológica sustancial de la proteína, lo que puede alcanzarse reteniendo selectivamente segmentos funcional de la proteína. Tales variantes de empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser artificiales. Métodos para elaborar tales variantes de empalme son muy conocidos en la especialidad.

Variantes de empalme preferidas son variantes de empalme del ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 que comprende del extremo N al extremo C (I) una hélice de unión al sustrato, (ii) un motivo His de inserción, (iii) un motivo PXMNXXMW y (iv) una pinza de reconocimiento del sustrato; y que tiene en orden de preferencia creciente al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencias con la región conservada representada por SEQ ID NO: 8.

Variantes de empalme preferidas adicionales de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3 que comprenden características como las definidas anteriormente en la presente memoria son variantes de empalme de un ácido nucleico como las representadas por una cualquiera de las secuencias listadas en la Tabla A. La más preferida es una variante de empalme de una secuencia de ácido nucleico como la representada por SEQ ID NO: 1.

El polipéptido de HAL3 también puede ser codificado por una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende desde el extremo N hasta el extremo C (i) una hélice de unión al sustrato, (ii) un motivo His de inserción, (iii) un motivo PXMNXXMW y (iv) una pinza de reconocimiento del sustrato; y que tiene en orden de preferencia creciente al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencias con la región conservada representada por SEQ ID NO: 8.

Variantes alélicas preferidas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3 que comprenden las características que se definen anteriormente en la presente memoria son variantes alélicas de un ácido nucleico como las representadas por una cualquiera de las secuencias listadas en la Tabla A. La más preferida es una variante alélica de una secuencia de ácido nucleico como la representada por SEQ ID NO: 1.

También puede usarse evolución dirigida (o redistribución génica) para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3. Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3. Están disponibles varios métodos para alcanzar la mutagénesis dirigida al sitio, siendo los más comunes los métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3 pueden derivarse de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico puede modificarse desde su forma natural en composición y/o ambiente genómico a través de una manipulación humana deliberada. Preferiblemente el ácido nucleico de HAL3 procede de una planta, más preferiblemente de una planta dicotiledónea, más preferiblemente de la familia Brassicaceae, lo más preferiblemente el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.

La expresión incrementada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3, preferentemente en vástagos de una planta, puede realizarse introduciendo una modificación genética (preferiblemente en el locus de un gen de HAL3). Se considera que el locus de un gen, según se define en la presente memoria, significa una región genómica, que incluye el gen de interés y 10 KB aguas arriba o aguas abajo de la región codificante.

La modificación genética puede introducirse, por ejemplo, mediante uno cualquiera (o más) de los siguientes métodos: activación con TDNA, TILLING y recombinación homóloga (según se describe en la sección de definiciones) o introduciendo e incrementando la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en tejidos en expansión de una planta. Después de la introducción de la modificación genética, sigue una etapa opcional de seleccionar la expresión incrementada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor HAL3 en tejidos en expansión, expresión incrementada que da plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado.

El marcaje de activación con T-DNA da como resultado plantas transgénicas que muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de genes cercanos al promotor introducido. El promotor que va a introducirse puede ser cualquier promotor capaz de incrementar la expresión del ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en tejidos en expansión de una planta.

Una modificación genética también puede introducirse en el locus de un gen que codifica un polipéptido de HAL3 usando la técnica de TILLING (lesiones locales inducidas orientadas en genomas). Las plantas que soportan tales variantes mutantes tienen una expresión incrementada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en tejidos de planta en expansión.

La activación con T-DNA y TILLING son ejemplos de tecnologías que permiten la generación de modificaciones genéticas que comprenden preferentemente incrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en tejidos en expansión de plantas.

Los efectos de la invención también pueden reproducirse usando recombinación homóloga. El ácido nucleico que va a elegirse es preferiblemente la región que controla la expresión natural de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en una planta. Un promotor débil específico para la expresión en vástagos se introduce en esta región, reemplazándola parcialmente o sustancialmente en su totalidad.

Uno de tales métodos para introducir una modificación genética (que en este caso no necesita estar en el locus de un gen de HAL3) es introducir y expresar en el vástago de una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3, según se define anteriormente en la presente memoria. El ácido nucleico que va a introducirse en una planta puede ser un ácido nucleico de longitud completa o puede ser una porción de una secuencia hibridante u otra variante de ácido nucleico según se define anteriormente en la presente memoria.

Los métodos de la invención se basan en la expresión incrementada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en tejido de vástago de una planta, preferiblemente en la zona de expansión celular de vástagos vegetativos.

La invención también proporciona constructos genéticos y vectores para facilitar la introducción y/o la expresión de las secuencias de ácido nucleico útiles en los métodos según la invención, en vástagos, preferiblemente en tejidos en expansión de vástagos de planta.

Por lo tanto, se proporciona un constructo génico que comprende:

un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 según se define anteriormente en la presente memoria;

una o más secuencias de control, de las que al menos una es un promotor específico de los vástagos, conectadas operativamente al ácido nucleico de (i).

Los constructos útiles en los métodos según la presente invención pueden construirse usando tecnología de DNA recombinante muy conocida para los expertos en la especialidad. Los constructos génicos se pueden insertar en vectores, que pueden estar disponibles comercialmente, adecuados para transformarse en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. Por lo tanto, la invención proporciona el uso de un constructo génico según se define anteriormente en la presente memoria en los métodos de la invención.

Las plantas se transforman con un vector que comprende la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3). El experto conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector a fin de transformar, seleccionar y propagar satisfactoriamente células huésped que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés está conectada operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor).

Promotores adecuados, que son funcionales en plantas, se conocen generalmente. Pueden tomar la forma de promotores constitutivos o inducibles. Los promotores adecuados pueden permitir la expresión específica del desarrollo y/o de un tejido en eucariotas multicelulares; así, promotores específicos de hojas, raíces, flores, semillas, estomas, tubérculos o frutos pueden usarse ventajosamente en plantas.

Promotores de plantas diferentes utilizables en plantas son promotores tales como, por ejemplo, el promotor USP, el LegB4, el DC3 o el promotor de ubiquitina procedente de perejil.

Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico, según se describe anteriormente, puede estar conectada operativamente a o comprender un promotor adecuado que expresa el gen en el punto temporal correcto y de un modo específico de células o tejidos. Promotores utilizables son promotores constitutivos (Benfey et ál., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), tales como los que se originan a partir de virus de planta, tales como CAMV de 35S (Franck et ál., Cell 21 (1980) 285-294), CaMV de 19S (véanse, además, US 5352605 y WO 84/02913), FMV de 34S (Sanger et ál., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443), el promotor de ubiquitina de perejil, o promotores de planta tales como el promotor de la subunidad pequeña de Rubisco descrito en US 4.962.028 o los promotores de planta PRP1 [Ward et ál., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, PGEL1, OCS [Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 25532557], lib4, usp, mas [Comal (1990) Plant Mol Biol 15 (3):373-381], STLS1, ScBV (Schenk (1999) Plant Mol Biol 39(6):1221-1230), B33, SAD1 o SAD2 (promotores de lino, Jain et ál., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696-1701) o nos [Shaw et ál. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831-7846]. Ejemplos adicionales de promotores de planta constitutivos son los promotores de V-ATPasa de remolacha azucarera (WO 01/14572). Ejemplos de promotores constitutivos sintéticos son el promotor Super (WO 95/14098) y promotores derivados de "cajas" de G (WO 94/12015). si es apropiado, también pueden usarse promotores inducibles por productos químicos, compárense EP-A 388186, EP-A 335528, WO 97/06268. La expresión constitutiva estable de las proteínas según la invención en una planta puede ser ventajosa. Sin embargo, la expresión inducible del polipéptido de la invención es ventajosa si es beneficiosa una expresión tardía antes de la recolección, ya que la manipulación metabólica puede conducir al retardo del crecimiento de la planta.

La expresión de genes de planta también puede facilitarse a través de un promotor inducible por productos químicos (para una revisión, véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Los promotores inducibles químicamente son particularmente adecuados cuando se desea expresar el gen de un modo específico para el tiempo. Ejemplos de tales promotores son promotor inducible por ácido salicílico (WO 95/19443) y promotor inducible por ácido abscísico (EP 335 528), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et ál. (1992) Plant J. 2, 397404), un promotor inducible por ciclohexanol o etanol (WO 93/21334) u otros como los descritos en la presente memoria.

Otros promotores adecuados son los que reaccionan a condiciones de estrés biótico o abiótico, por ejemplo el promotor del gen PRP1 inducido por patogenicidad (Ward et ál., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), el promotor de hsp80 de tomate inducible por calor (US 5,187,267), el promotor de a-amilasa de patata inducible por frío (WO 96/12814) o el promotor de pinII inducible por lesiones (EP-A-0 375 091) u otros que se describen en la presente memoria.

Los promotores pueden provocar expresión génica en tejidos y órganos, en células de semillas, tales como células de endospermo y células del embrión en desarrollo. Tales promotores son el promotor de gen de napina de colza (US 5.608.152), el promotor de USP de Vicia faba (Baeumlein et ál., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), el promotor de Bce4 de Brassica (WO 91/13980), el promotor de arc5 de judía, el promotor de DcG3 de zanahoria, o el promotor de B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et ál., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9), y promotores que llevan a cabo la expresión específica de semillas en plantas monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y similares. Promotores específicos de semillas ventajosos son el promotor de proteína que se une a sacarosa (WO 00/26388), el promotor de faseolina y el promotor de napina. Promotores adecuados que deben considerarse son el promotor del gen lpt2 o Ipt1 de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230), y los promotores descritos en WO 99/16890 (promotores procedentes del gen de hordeína de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de orizina de arroz, el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, el gen de glutelina de trigo, el gen de zeína de maíz, el gen de glutelina de avena, el gen de kasirina de sorgo y el gen de secalina de centeno). Promotores adecuados adicionales son Amy32b, Amy 6-6 y aleuraína [US 5.677.474], Bce4 (colza) [US 5.530.149], glicinina (soja) [EP 571 741], fosfoenolpiruvato carboxilasa (soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (soja) [WO 98/08962], isocitrato liasa (colza) [US 5.689.040] o a-amilasa (cebada) [EP 781 849]. Otros promotores que son adecuados para la expresión de genes en plantas son promotores específicos de las hojas tales como los descritos en DE-A 19644478 o promotores regulados por la luz tales como, por ejemplo, el promotor de petE de guisante.

Además, tales promotores de planta son el promotor de FBPasa citosólico o el promotor de ST-LSI de patata (Stockhaus et ál., EMBO J. 8, 1989, 2445), el promotor de fosforribosilpirofosfato amidotransferasa de Glycine max (Nº de Registro de GenBank U87999) o el promotor específico de los nudos descrito en EP-A-0 249 676.

En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 está conectada operativamente a un promotor específico de los vástagos. Un promotor específico de las vástagos se refiere a cualquier promotor capaz de conducir la expresión del gen de interés en tejidos vegetativos de vástagos de planta. Preferiblemente, el promotor específico de los vástagos es capaz de conducir la expresión del gen de interés en tejidos en expansión de vástagos vegetativos, esto es en la zona de expansión celular de vástagos vegetativos. Se considera que la referencia en la presente memoria a conducir la expresión en el vástago significa conducir la expresión de cualquier secuencia conectada operativamente en la zona de expansión celular de vástagos vegetativos sustancialmente hasta la exclusión de conducir la expresión en cualquier lugar de la planta, aparte de cualquier expresión residual debida a la expresión del promotor con fuga. El promotor específico de los vástagos puede ser un promotor bien natural o bien sintético.

Preferiblemente, el promotor específico de vástagos es un promotor aislado de un gen de ß-expansina, tal como un promotor EXBP9 de ß-expansina de arroz (WO 2004/070039), según se representa mediante SEQ ID NO: 5 o un promotor de fuerza similar y/o un promotor con un patrón de expresión similar que el promotor de ß-expansina de arroz (es decir un promotor funcionalmente equivalente).

Estará claro que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 representado por SEQ ID NO: 1, ni la aplicabilidad de la invención se restringe a la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 cuando se conduce mediante un promotor de ß-expansina.

Opcionalmente, pueden usarse una o más secuencias terminadoras (también una secuencia de control) en el constructo introducido en una planta. Elementos reguladores adicionales pueden incluir estimuladores de la transcripción así como de la traducción. Los expertos en la especialidad conocerán las secuencias terminadoras y estimuladoras que pueden ser adecuadas para el uso en la realización de la invención. Tales secuencias serían conocidas o pueden ser obtenidas fácilmente por un experto en la especialidad.

Los constructos genéticos de la invención pueden incluir además una secuencia de origen de replicación que se requiere para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de célula específico. Un ejemplo es cuando se requiere que un constructo genético se mantenga en una célula bacteriana como un elemento genético episómico (p. ej. una molécula de plásmido o cósmido). Orígenes de replicación preferidos incluyen, pero no se limitan a, el f1-ori y colE1.

Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, estimuladoras, silenciadoras, intrónicas, las regiones 3’UTR y/o 5’UTR) pueden ser elementos estabilizantes de proteínas y/o RNA.

Para la detección y/o la selección de la transferencia satisfactoria de las secuencias de ácido nucleico que se representan en el protocolo de secuencias y se usan en el procedimiento de la invención, es ventajoso usar genes marcadores (= genes indicadores). Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia satisfactoria de las moléculas de ácido nucleico a través de una serie de principios diferentes, por ejemplo a través de la identificación visual con la ayuda de fluorescencia, luminiscencia o en el intervalo de longitud de onda de luz que es discernible para el ojo humano, mediante una resistencia a herbicidas o antibióticos, a través de lo que se conoce como marcadores nutritivos (marcadores de auxotrofismo) o marcadores antinutritivos, a través de ensayos enzimáticos o a través de fitohormonas. Ejemplos de tales marcadores que pueden mencionarse son GFP (= proteína fluorescente verde); el sistema luciferina/luciferasa, la �-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo X-Gal, las resistencias a herbicidas, a, por ejemplo, imidazolinona, glifosato, fosfinotricina o sulfonilurea, las resistencias a antibióticos, a, por ejemplo, bleomicina, higromicina, estreptomicina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina, por mencionar solo unos pocos, marcadores nutritivos tales como la utilización de manosa o xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa. Esta lista es un pequeño número de posibles marcadores. El trabajador experto está muy familiarizado con tales marcadores. Se prefieren diferentes marcadores, dependiendo del organismo y el método de selección.

La presente invención también abarca plantas obtenibles mediante los métodos según la presente invención. Por lo tanto, la presente invención proporciona plantas, partes de planta o células vegetales de las mismas obtenibles mediante el método según la presente invención, plantas o partes o células de las mismas que comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 bajo el control de un promotor específico de los vástagos.

La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen un rendimiento incrementado con relación a plantas de control, que comprende la introducción y la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en el vástago de una planta.

Plantas huésped para los ácidos nucleicos o el vector usados en el método según la invención, el casete o constructo o vector de expresión, en principio, son ventajosamente todas las plantas que sean capaces de sintetizar los polipéptidos usados en el método de la invención.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen un rendimiento incrementado, método que comprende:

(i)

introducir y expresar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en el vástago de una planta; y

(ii)

cultivar la célula vegetal bajo condiciones que promueven el crecimiento y el desarrollo de la planta.

El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula vegetal o en la propia planta (incluyendo la introducción en un tejido, un órgano o cualquier otra parte de una planta). Según una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce preferiblemente en una planta mediante transformación.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. Al hacer esto, los métodos descritos para la transformación y la regeneración de plantas a partir de tejidos de planta o células vegetales se utilizan para la transformación transitoria o estable. Para seleccionar plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación, como norma, se somete a condiciones selectivas de modo que las plantas transformadas puedan distinguirse de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas del modo descrito anteriormente pueden plantarse y, después de un período de crecimiento inicial, someterse a una selección adecuada mediante pulverización. Una posibilidad adicional consiste en hacer crecer las semillas, si es apropiado después de la esterilización, sobre placas de agar usando un agente de selección adecuado de modo que solo las semillas transformadas puedan crecer como plantas. Métodos de transformación ventajosos adicionales, en particular para plantas, son conocidos por el experto y se describen en la presente memoria posteriormente.

Generalmente después de la transformación, las células o los agrupamientos de células vegetales se seleccionan con respecto a la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables en plantas cotransferidos al gen de interés, después de lo cual el material transformado se regenera como una planta entera.

Según se menciona, agrobacterias transformadas con un vector de expresión según la invención también pueden usarse del modo conocido de por sí para la transformación de plantas tales como plantas experimentales como Arabidopsis o de cultivo, tales como, por ejemplo, cereales, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, Canola, girasol, lino, cáñamo, patata, tabaco, tomate, zanahoria, pimientos morrones, colza, tapioca, mandioca, arrurruz, tagete, alfalfa, lechuga y las diversas especies de árboles, frutos secos y vides, en particular plantas de cultivo tales como soja, cacahuete, higuereta, girasol, maíz, algodón, lino, colza, coco, palma, cártamo (Carthamus tinctorius) o granos de cacao, por ejemplo bañando hojas o segmentos de hoja escarificados en una solución agrobacteriana y posteriormente haciéndolos crecer en un medio adecuado.

Además de la transformación de células somáticas, que a continuación tienen que regenerarse en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemos de planta y en particular aquellas células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de las plantas, dando lugar a plantas transgénicas. Así, por ejemplo, semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y se obtienen semillas de las plantas en desarrollo de las que una cierta proporción se transforma y así son transgénicas [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, pp. 274-289]. Métodos alternativos se basan en la retirada repetida de las inflorescencias e incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, con lo que asimismo pueden obtenerse semillas transformadas en un punto temporal posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente eficaz es el método de infiltración a vacío con sus modificaciones, tales como el método del "baño floral". En el caso de la infiltración a vacío de Arabidopsis, plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras que en el caso del "baño floral" el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con tensioactivo [Clough, SJ und Bent, AF (1998). The Plant J. 16, 735-743]. Una cierta proporción de semillas transgénicas se recolecta en ambos casos, y estas semillas pueden distinguirse de semillas no transgénicas haciéndolas crecer bajo las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además, la transformación estable de plástidos es beneficiosa debido a que los plástidos son heredados maternalmente en la mayoría de las cosechas reduciendo o eliminando el riesgo de flujo de transgenes a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto se alcanza generalmente mediante un procedimiento que se ha presentado esquemáticamente en Klaus et ál., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Brevemente, las secuencias que van a transformarse se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre secuencias de flanqueo homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias de flanqueo homólogas dirigen la integración específica del sitio en el plastoma. La transformación plastídica se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y una visión general puede tomarse de Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 21 sep. 2001; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards comercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20

28. Recientemente, se ha presentado un avance biotecnológico adicional en forma de transformantes plastídicos libres de marcadores, que pueden producirse mediante un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus et ál., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

Las células vegetales genéticamente modificadas pueden regenerarse a través de todos los métodos con los que está familiarizado el experto. Métodos adecuados pueden encontrarse en las publicaciones mencionadas anteriormente de S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Höfgen y Willmitzer.

Después de la transferencia y la regeneración de DNA, pueden evaluarse plantas transformadas putativamente, por ejemplo usando análisis Southern, con respecto a la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del DNA recientemente introducido pueden verificarse usando análisis Northern y/o Western, o PCR cuantitativa, técnicas todas que son muy conocidas para los expertos normales en la especialidad.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante una variedad de medios, tales como propagación clonal o técnicas de mejora genética clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1) puede autofecundarse para dar transformantes de segunda generación homocigóticos (o T2), y las plantas T2 pueden propagarse adicionalmente a través de técnicas de mejora genética clásicas.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clonales (p. ej., todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (p. ej., en plantas, un patrón transformado injertado en un esqueje no transformado).

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, y a todas las partes de planta y sus propágulos. La presente invención se extiende además a abarcar la progenie de una célula, un tejido, un órgano o una planta entera transformados o transfectados primarios que se han producido mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, siendo el único requisito que la progenie exhiba la misma característica o características genotípicas y/o fenotípicas que las producidas por el progenitor en los métodos según la invención.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de HAL3. Células huésped preferidas según la invención son células vegetales.

La invención también se extiende a partes recolectables de una planta tales como, pero no limitadas a, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, rizomas, tubérculos y bulbos. La invención se refiere además a productos derivados, preferiblemente derivados directamente, de una parte recolectable de tal planta, tales como pellas o polvos secos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3 y el uso de polipéptidos de HAL3 para incrementar el rendimiento de plantas según se define anteriormente en la presente memoria en los métodos de la invención.

Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de HAL3, o polipéptidos de HAL3, pueden encontrar uso en programas de mejora genética en los que se identifica un marcador de DNA que puede estar genéticamente conectado a un gen de HAL3. Los ácidos nucleicos/genes o los polipéptidos de HAL3 pueden usarse para definir un marcador molecular. Este marcador de DNA o proteína puede usarse a continuación en programas de mejora genética para seleccionar plantas que tienen un rendimiento incrementado según se define anteriormente en la presente memoria en los métodos de la invención.

Variantes alélicas de un ácido nucleico/gen de HAL3 también pueden encontrar uso en programas de mejora genética asistidos por marcadores. A veces, tales programas de mejora genética requieren la introducción de variación alélica mediante el tratamiento mutagénico de las plantas, usando por ejemplo mutagénesis con EMS; alternativamente, el programa puede comenzar con una recolección de variantes alélicas del denominado origen "natural" producida involuntariamente. La identificación de variantes alélicas tiene lugar a continuación, por ejemplo, mediante PCR. Esto es seguido por una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que dan un rendimiento incrementado. La selección se lleva a cabo típicamente verificando el comportamiento de crecimiento de plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El comportamiento de crecimiento puede verificarse en un invernadero o en el campo. Etapas opcionales adicionales incluyen cruzar plantas en las que la variante alélica superior se identificaba con otra planta. Esto podría usarse, por ejemplo, para realizar una combinación de características fenotípicas interesantes.

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 también puede usarse como una sonda para cartografiar genéticamente y físicamente los genes de los que es parte, y como marcadores para rasgos conectados a esos genes. Tal información puede ser útil en la mejora genética de plantas a fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de ácidos nucleicos de HAL3 requiere sólo una secuencia de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos de HAL3 pueden usarse como marcadores de polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLP). Transferencias Southern (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de DNA genómico de planta digerido por restricción pueden sondarse con los ácidos nucleicos de HAL3. Los patrones de bandeo pueden someterse a continuación a análisis genéticos usando programas informáticos tales como MapMaker (Lander et ál. (1987) Genomics 1: 174-181) a fin de construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos pueden usarse para sondar transferencias Southern que contienen DNA genómicos tratados con endonucleasas de restricción de un grupo de individuos que representan el progenitor y la progenie de un cruce genético definido. La segregación de los polimorfismos de DNA se apunta y se usa para calcular la posición del ácido nucleico de HAL3 en el mapa genético previamente obtenido usando esta población (Botstein et ál. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes de planta para el uso en cartografía genética se describen en Bernatzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen la cartografía genética de clones de cDNA específicos usando la metodología esbozada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, poblaciones entrecruzadas F2, poblaciones retrocruzadas, poblaciones cruzadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros grupos de individuos pueden usarse para la cartografía. Tales metodologías son muy conocidas para los expertos en la especialidad.

Las sondas de ácido nucleico también pueden usarse para la cartografía física (es decir, disposición de secuencias en mapas físicos; véanse Hoheisel et ál. En: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y las referencias citadas en la misma).

En otra realización, las sondas de ácido nucleico pueden usarse en la cartografía por hibridación in situ con fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Aunque los métodos actuales de cartografía por FISH favorecen el uso de clones grandes (de varias kb a varios cientos de kb; véase Laan et ál. (1995) Genome Res. 5:13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización de la cartografía por FISH usando sondas más cortas.

Puede llevarse a cabo una variedad de métodos basados en amplificación de ácidos nucleicos para la cartografía genética y física usando los ácidos nucleicos. Ejemplos incluyen la amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), el polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et ál. (1993) Genomics 96:325-332), la ligación específica de alelos (Landegren et ál. (1988) Science 241:1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), la cartografía de híbridos por radiación (Walter et ál. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y la cartografía Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, la secuencia de un ácido nucleico se usa para diseñar y producir pares de cebadores para el uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores es muy conocidos para los expertos en la especialidad. En métodos que emplean cartografía genética basada en PCR, puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de DNA entre los progenitores del cruce cartográfico en la región correspondiente a la presente secuencia de ácido nucleico. Sin embargo, esto generalmente no es necesario para los métodos cartográficos.

Los métodos según la presente invención dan como resultado plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado, según se describe anteriormente en la presente memoria. Este rendimiento de semillas incrementado también puede combinarse con otros rasgos económicamente ventajosos, tales como otros rasgos que estimulan el rendimiento, la tolerancia a otros estreses abióticos y bióticos, rasgos que modifican diversas características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras

La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguiente figuras, en las que:

La Fig. 1 representa la estructura esquemática del polipéptido de AtHAL3a que comprende desde el extremo N al extremo C (I) la hélice que se une al sustrato (subrayado simple), (II) el motivo His de inserción (doble subrayado), (III) el motivo PXMNXXMW (línea de puntos) y (IV) la pinza de reconocimiento del sustrato (onda subrayada). Los extremos N-terminal y C-terminal de las proteínas de HAL3 no están muy conservados.

La Fig. 2 muestra un vector binario pEXP::HAL3, para la expresión incrementada en Oryza sativa de un ácido nucleico de HAL3 de Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor de ß-expansina.

La Fig. 3 muestra un alineamiento múltiple de un número de secuencias de HAL3 procedentes de AtHAL3b de Arabidopsis thaliana (At_NP_ 973994), Sorghum bicolor (Sb), AtHAL3a de Arabidopsis thaliana (Ath0218), Gossipium hirsutum (Cg), Hordeum vulgare (Hv), Oryza sativa (Os), Vitis vinifera (Vv), Glycine max (Gm), Solanum tuberosum (St), Zea mays (Zm) y una especie de Pinus (Pg).

La Fig. 4 detalla ejemplos de secuencias útiles para realizar los métodos según la presente invención: SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 representan la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de proteína de AtHAI3s. SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 son las secuencias de los cebadores directo e inverso usados para aislar el gen de AtHAL3. SEQ ID NO: 5 es la secuencia del promotor de ß-expansina usada en los métodos de la presente invención. SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 42 representan ejemplos de secuencias de DNA/proteína de longitud total o parcial, útiles en los métodos de la invención o para aislar secuencias de longitud completa correspondientes. En algunos casos, se ensamblaron secuencias a partir de secuencias de EST, con una secuenciación de menor calidad. Como consecuencia, pueden esperarse pocas sustituciones de ácidos nucleicos.

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que solo están a modo de ilustración. Los siguiente ejemplos no están destinados a definir completamente o limitar de otro modo el alcance de la invención.

Manipulación de DNA: a menos que se indique otra cosa, las técnicas de DNA recombinante se realizan según protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et ál. (1994), Current Protocols In Molecular Biology, Current Protocols. Materiales y métodos estándar para el trabajo molecular de las plantas se

5 describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications (Reino Unido).

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con la secuencia de ácido nucleico usada en los métodos de la invención

Se identificaron secuencias (cDNA de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con la secuencia de ácido

10 nucleico usada en los métodos de la presente invención entre las mantenidas en la base de datos Entrez Nucleotides en the National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando herramientas de búsqueda de secuencias en bases de datos, tales como la Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et ál. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul et ál. (1997) Nucleic Acid Res. 25:3389-3402). El programa se usa para encontrar regiones de similitud local entre secuencias comparando secuencias de ácido nucleico o polipéptido con bases de datos de

15 secuencias y calculando la significación estadística de las concordancias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de la presente invención se usó para el algoritmo TBLASTN, con establecimientos por defectos y el filtro para ignorar secuencias de baja complejidad exploradas. Los resultados del análisis se observaron mediante comparación por pares, y se valoraron según la puntuación de probabilidad (valor E), donde la puntuación refleja la probabilidad de que se produzca un alineamiento particular por casualidad (cuanto menor es el valor de E, más

20 significativo es el acierto). Además de los valores de E, las comparaciones también se puntuaron mediante el porcentaje de identidad. Porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácido nucleico (o polipéptido) comparadas a lo largo de una longitud particular. En algunos casos, los parámetros por defecto pueden ajustarse para modificar la restricción de la búsqueda. Por ejemplo, el valor de E puede incrementarse para mostrar concordancias menos restrictivas. De este modo, pueden identificarse

25 concordancias casi exactas cortas.

La Tabla A proporciona una lista de secuencias de ácido nucleico relacionadas con la secuencia de ácido nucleico usada en los métodos de la presente invención.

Tabla A: Ejemplos de polipéptidos de HAL3:

Fuente de Planta

SEQ ID NO del ácido nucleico: SEQ ID NO de la Proteína:

Arabidopsis thaliana

9 10

Oryza sativa

11 12

Triticum aestivum

13 14

Zea mays

15 16

Picea abies

17 18

Brassica napus

19 20

Brassica oleracea

21 22

Nicotiana tabacum

23 24

Solanum tuberosum

25 26

Glycine max

27 28

Vitis vinifera

29 30

Hordeum vulgare

31 32

Gossyplum hirsutum

33 34

Sorghum bicolor

35 36

Lycopersicon esculentum

37 38

Arabidopsis thaliana

39 40

Especie de Pinus

41 42

En algunos casos, secuencias relacionadas, tentativamente, se han ensamblado y divulgado públicamente por instituciones de investigación, tales como The Institute for Genomic Research (TIGR). La base de datos de ortólogos de genes eucarióticos (EGO) se pueden usar para identificar tales secuencias relacionadas, bien mediante búsqueda por palabras clave o bien usando el algoritmo BLAST con la secuencia de ácido nucleico o polipéptido de interés.

Ejemplo 2: Clonación de la secuencia de ácido nucleico usada en los métodos de la invención

La secuencia de ácido nucleico usada en los métodos de la invención se amplificó mediante PCR usando como plantilla una biblioteca de cDNA de plántulas de Arabidopsis thaliana hecha a medida (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Reino Unido). La PCR se realizó usando DNA polimerasa de Taq Hifi en condiciones estándar, usando 200 ng de plantilla en una mezcla de PCR de 50 μl. Los cebadores usados eran prm00957 (SEQ ID NO: 3; sentido, codón de iniciación en negrita:

5’ aaaaagcaggctcacaatggagaatgggaaaagagac 3’)

y prm00958 (SEQ ID NO: 4; inversa, complementaria:

5’ agaaagctgggttggttttaactagttccaccg 3’),

que incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway. El fragmento de PCR amplificado se purificó además usando métodos estándar. La primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción de BP, se realizó a continuación, durante la cual el fragmento de PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, según la terminología Gateway, un "clon de entrada", pHAL3. El plásmido pDONR201 se adquirió de Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

Ejemplo 3: Construcción de Vectores de Expresión

El clon de entrada pHAL3 se usó posteriormente en una reacción LR con pEXP, un vector de destinación usado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites del T-DNA: un marcador seleccionable de planta; un casete de expresión del marcador rastreable; y un casete Gateway destinado a la recombinación in vivo por LR con la secuencia de ácido nucleico de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor de ß-expansina de arroz (SEQ ID NO: 5) para la expresión específica para vástagos se situó aguas arriba de este casete Gateway.

Después de la etapa de recombinación por LR, el vector de expresión resultante pEXP::HAL3 (Figura 2) se transformó en la cepa de Agrobacterium LBA4044 y posteriormente en plantas de Oryza sativa.

Ejemplo 4: Transformación de cosechas

Las Agrobacterium transformadas que contiene los vectores de expresión se usaron independientemente para transformar plantas de Oryza sativa. Semillas secas maduras del arroz Japonica cultivar Nipponbare se descascararon. La esterilización se llevó a cabo incubando durante un minuto en etanol al 70%, seguido por 30 minutos en HgCl2 al 0,2%, seguido por un lavado de 15 minutos 6 veces con agua destilada estéril. A continuación, las semillas estériles se germinaron en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callos). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, callos embriogénicos derivados del escutelo se cortaron y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o se propagaron mediante subcultivo en el mismo medio durante otras dos semanas. Trozos de callos embriogénicos se subcultivaron en medio reciente 3 días antes del cocultivo (para reforzar la actividad de división celular).

Cepa de Agrobacterium LBA4404 que contenía el vector de expresión se usó para el cocultivo. La Agrobacterium se inoculó en medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28°C. A continuación, las bacterias se recogieron y se suspendieron en medio de cocultivo líquido hasta una densidad (OD600) de aproximadamente 1. La suspensión se transfirió a continuación a una placa Petri y los callos se sumergieron en la suspensión durante 15 minutos. A continuación, los tejidos callosos se secaron sobre un papel de filtro y se transfirieron a un medio de cocultivo solidificado y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25°C. Los callos cocultivados se hicieron crecer sobre medio que contenía 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28°C en presencia de un agente de selección. Durante este período, se desarrollaron islotes callosos resistentes que crecen rápidamente. Después de la transferencia de este material a un medio de regeneración y la incubación a la luz, el potencial embriogénico se liberó y se desarrollaron vástagos en las siguientes cuatro a cinco semanas. Los vástagos se cortaron de los callos y se incubaron durante de 2 a 3 semanas sobre un medio que contenía auxina desde el que se transfirieron a la tierra. Se hicieron crecer vástagos endurecidos bajo alta humedad y días cortos en un invernadero.

Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo tisular a un invernadero. Después de un análisis de PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de T-DNA, solo las plantas transgénicas de una sola copia que exhiben tolerancia al agente de selección se mantuvieron para la recolección de semillas T1. A continuación, las semillas se recolectaron de tres a cinco meses después del trasplante. El método daba transformantes de un solo locus en un grado de más de 50% (Aldemita y Hodges 1996, Chan et ál. 1993, Hiel et ál. 1994).

Transformación de maíz

La transformación de maíz (Zea mays) se realiza con una modificación del método descrito por Ishida et ál. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación depende del genotipo del maíz y solo genotipos específicos son susceptibles de transformación y regeneración. La línea endogámica A188 (University of Minnesota) o híbridos con A188 como un progenitor son buenas fuentes de material donante para la transformación, pero también pueden usarse satisfactoriamente otros genotipos. Las espigas se recolectan de la planta de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando la longitud del embrión inmaduro es de aproximadamente 1 a 1,2 mm. Los embriones inmaduros se cocultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión, y se recuperaron plantas transgénicas a través de organogénesis. Los embriones cortados se hicieron crecer sobre medio de inducción de callos, y a continuación medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, aunque pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas Petri se incuban a la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollan los vástagos. Los vástagos verdes se transfieren desde cada embrión a medio de enraizamiento de maíz y se incuban a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan raíces. Los vástagos con raíz se trasplantan a tierra en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Transformación de trigo

La transformación de trigo se realiza con el método descrito por Ishida et ál. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. El cultivar Bobwhite (disponible de CIMMYT, México) se usa comúnmente en la transformación. Embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contienen el vector de expresión, se recuperan plantas transgénicas a través de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se hacen crecer in vitro sobre medio de inducción de callos, y a continuación medio de regeneración, que contiene el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, aunque pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas Petri se incuban a la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollan los vástagos. Los vástagos verdes se transfieren desde cada embrión a medio de enraizamiento y se incuban a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan raíces. Los vástagos con raíz se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Transformación de soja

La soja se transforma según una modificación del método descrito en la patente de Texas A&M US 5.164.310. Diversas variedades de soja comerciales son susceptibles de transformación mediante este método. El cultivar Jack (disponible de the Illinois Seed foundation) se usa comúnmente para la transformación. Se esterilizan semillas de soja para la siembra in vitro. El hipocótilo, la radícula y un cotiledón se cortan de plántulas jóvenes de siete días. El epicótilo y el cotiledón restante se hacen crecer adicionalmente hasta desarrollar nudos axilares. Estos nudos axilares se cortan y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren a medio de selección. Los vástagos regenerados se cortan y se ponen sobre un medio de elongación de vástagos. Los vástagos no mayores de 1 cm se ponen sobre medio de enraizamiento hasta que se desarrollan raíces. Los vástagos con raíz se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Transformación de colza/Canola

Peciolos e hipocótilos cotiledonares de plántulas jóvenes de 5-6 días se usan como explantes para cultivo tisular y se transforman según Babic et ál. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). El cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) es la variedad estándar usada para la transformación, pero también pueden usarse otras variedades. Semillas de Canola se esterilizan superficialmente para la siembra in vitro. Los explantes de peciolo cotiledonar con el cotiledón unido se cortan de las plántulas in vitro, y se inoculan con Agrobacterium (que contienen el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante de peciolo en la suspensión bacteriana. Los explantes se cultivan a continuación durante 2 días en medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, 3% de sacarosa, 0,7% de Phytagar a 23°C, 16 h de luz. Después de dos días de cocultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolo se transfieren a medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días, y a continuación se cultivan en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración de vástagos. Cuando los vástagos tienen 5 - 10 mm de longitud, se cortan y se transfieren a medio de elongación de vástagos (MSBAP-0.5, que contiene 0,5 mg/l de BAP). Vástagos de aproximadamente 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de las raíces. Los vástagos con raíz se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Transformación de alfalfa

Un clon regenerador de alfalfa (Medicago sativa) se transforma usando el método de (McKersie et ál., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). La regeneración y la transformación de la alfalfa dependen del genotipo y por lo tanto se requiere una planta regenerativa. Se han descrito métodos para obtener plantas regenerativas. Por ejemplo, estas pueden seleccionarse del cultivar Rangelander (Agriculture Canada) o cualquier otra variedad de alfalfa comercial según se describe por Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, la variedad RA3 (University of Wisconsin) se ha seleccionado para el uso en el cultivo tisular (Walker et ál., 1978 Am J Bot 65:654-659). Se cocultivan explantes de peciolo con un cultivo nocturno de pMP90 de Agrobacterium tumefaciens C58C1 (McKersie et ál., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se cocultivan durante 3 d en la oscuridad sobre medio de inducción SH que contiene 288 mg/l de Pro, 53 mg/l de tioprolina, 4,35 g/l de K2SO4 y 100 μm de acetosiringinona. Los explantes se lavan en medio de Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige y Skoog, 1962) y se cultivan en placa sobre el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y un antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, embriones somáticos se transfieren a medio de desarrollo BOi2Y que no contiene reguladores del crecimiento, ni antibióticos, y 50 g/l de sacarosa. Posteriormente, los embriones somáticos se germinan sobre medio de Murashige-Skoog de fuerza media. Las plántulas con raíz se trasplantan a macetas y se hacen crecer en un invernadero. Se producen semillas T1 a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-DNA.

Ejemplo 5: Procedimiento de evaluación

5.1 Sistema de evaluación

Se generaron aproximadamente 30 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo tisular hasta un invernadero para el crecimiento y la recolección de semillas T1. Se retuvieron siete casos, de los que la progenie T1 segregaba 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos casos, aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (hetero-y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotos) se seleccionaron verificando la expresión de marcadores visuales. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes se hicieron crecer en paralelo en posiciones aleatorias. Las condiciones de invernadero eran de días cortos (12 horas de luz), 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad, y una humedad relativa de 70%.

Cuatro casos T1 se evaluaron adicionalmente en la generación T2 después del mismo procedimiento de evaluación que para la generación T1 pero con más individuos por caso. Desde la fase de siembra hasta el estado de madurez las plantas se hicieron pasar varias veces a través de una cabina de obtención de imágenes digitales. En cada punto temporal se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

5.2 Análisis estadístico: prueba de la t y prueba de la F

Se usó un ANOVA (análisis de variantes) de dos factores como un modelo estadístico para la evaluación general de las características fenotípicas de plantas. Se llevó a cabo una prueba de la F sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los casos transformados con el gen de la presente invención. La prueba de la F se llevó a cabo para comprobar un efecto del gen sobre todos los casos de transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como efecto global del gen. El umbral de significación para un efecto global del gen se estableció en un nivel de probabilidad del 5% para la prueba de la F. Un valor de la prueba de la F significativo apunta a un efecto del gen, significando que no es solo la mera presencia o posición del gen lo que está provocando las diferencias en el fenotipo.

Para comprobar un efecto de los genes dentro de un caso, es decir, para un efecto específico de una línea, se realizó la prueba de la t dentro de cada caso usando conjuntos de datos procedentes de las plantas transgénicas y las plantas nulas correspondientes. "Plantas nulas" o "segregantes nulos" o "nulicigotos" son las plantas tratadas del mismo modo que la planta transgénica, pero de las que se ha segregado el transgén. Las plantas nulas también pueden describirse con las plantas transformadas negativas homocigóticas. El umbral de significación para la prueba de la t se establece a un nivel de probabilidad del 10%. Los resultados para algunos casos pueden estar por encima

o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que un gen podría tener sólo un efecto en ciertas posiciones del genoma, y que la presencia de este efecto dependiente de la posición no es infrecuente. Este tipo de efecto génico también se denomina en la presente memoria "efecto del gen sobre una línea". El valor de p se obtiene comparando el valor de la t con la distribución de la t o, alternativamente, comparando el valor de la F con la distribución de la F. El valor de la p da a continuación la probabilidad de que la hipótesis nula (es decir, que no haya efecto del transgén) sea correcta.

Ejemplo 6: Resultados de la evaluación

Los panículos primarios maduros se recolectaron, se contaron, se introdujeron en bolsas, se marcaron con códigos de barras y a continuación se secaron durante tres días en un horno a 37°C. A continuación, los panículos se trillaron y todas las semillas se recogieron y se contaron. Las cáscaras llenas se separaron de las vacías usando un dispositivo de soplado de aire. Las cáscaras vacías se descartaron y la fracción restante se contó de nuevo. Las cáscaras llenas se pesaron en una balanza analítica. El número de cáscaras llenas se determinó contando el número de cáscaras llenas que permanecían después de la etapa de separación. El rendimiento total de semillas (peso total de las semillas) se midió pesando todas las cáscaras llenas recolectadas de una planta. El número total de semillas por planta se midió contando el número de cáscaras recolectadas de una planta. El índice de recolección (HI) en la presente invención se define como la relación entre el rendimiento total de semillas y el área de las partes aéreas (mm2), multiplicado por un factor 106. El número total de flores por panículo según se define en la presente invención es la relación entre el número total de semillas y el número de panículos primarios maduros. El grado de

5 llenado de las semillas, según se define en la presente invención, es la proporción (expresada como un %) del número de semillas llenas sobre el número total de semillas (o flósculos).

Según se presenta en la Tabla B, el rendimiento de semillas, el número de semillas llenas y el índice de recolección se incrementan en las plantas transgénicas que expresan preferentemente un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 en el vástago, en comparación con plantas de control. La Tabla B muestra el incremento de

10 rendimiento medio (peso total de semillas), el incremento en el número de semillas llenas y el incremento en el índice de recolección en porcentaje, calculados a partir de los casos transgénicos en comparación con plantas de control, en la generación T1.

Tabla B

parámetros

% de incremento valor de p

Peso total de semillas

14 0,0072

Número de semillas llenas

15 0,0052

Índice de recolección

10 0,0093

15 Ejemplo 7: Resultados de la evaluación del vigor temprano

El vigor temprano se determinó contando el número total de píxeles a partir de partes aéreas de plantas discriminadas con respecto al fondo. Este valor se promedió para las fotografías tomada en el mismo punto temporal desde diferentes ángulos y se convirtió en un valor de superficie física expresado en mm cuadrados mediante calibración. Los resultados descritos posteriormente son para plantas tres semanas después de la germinación.

20 Se observó vigor temprano de la planta (según se determinaba por el área de las partes aéreas) en seis de siete casos de la generación T1, con un incremento general en el área de las partes aéreas para plántulas transgénicas de 27% en comparación con plantas de control. Cuatro de estos casos T1 se evaluaron adicionalmente en la generación T2, y los cuatro casos daban un incremento en el área de las partes aéreas para las plántulas transgénicas en comparación con plantas de control, con un incremento general en el área de las partes aéreas para

25 las plántulas transgénicas de 33% en comparación con plantas de control. También se muestra que los resultados son estadísticamente significativos con el valor de p procedente de la prueba de la F que es inferior a 0,0001 (generación T2) indicando que el efecto observado se debe probablemente al transgén más que a la posición del gen o un efecto sobre la línea, véase la tabla C.

Tabla C

parámetros

% de incremento valor de p

Vigor temprano

33 0,0000

LISTA DE SECUENCIAS

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento mejorados y un método para elaborar las mismas 5 <130> PF58328

<160> 301

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 630 10 <212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

15 <210> 2

<211> 209

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

20 <400> 2

<210> 3

<211> 37

5

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm00957

10

<400> 3

aaaaagcagg ctcacaatgg agaatgggaa aagagac 37

<210> 4

<211> 33

15

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm00958

20

<400> 4

agaaagctgg gttggtttta actagttcca ccg 33

<210> 5

<211> 1243

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 5

<210> 6 10 <211> 34

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> motivo conservado 1

<220>

<221> VARIANTE

<222>

(1)..(1) 20 <223> /sustitución = "Arg"

<220>

<221> VARIANTE

<222>

(4) .. (4) 25 <223> /sustitución = "Ile"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (9) .. (9)

<223> /sustitución = "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (14) .. (14)

<223> /sustitución = "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (15) .. (15)

<223> /sustitución = "Met" /sustitución = "Val"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (18) .. (18)

<223> /sustitución = "Glu" /sustitución = "Ala" /sustitución = "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (21)..(21)

<223> /sustitución = "Val"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (22)..(22)

<223> /sustitución = "Arg" /sustitución = "Gly"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (23)..(23)

<223> /sustitución = "Ser" /sustitución = "Ile"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (25)..(25)

<223> /sustitución = "Ser"

5

<220>

<221> VARIANTE

<222> (26)..(26)

<223> /sustitución = "Asp"

10

<220>

<221> VARIANTE

<222> (29)..(29)

<223> /sustitución = "Asp"

15

<220>

<221> VARIANTE

<222> (31)..(31)

<223> /sustitución = "Lys"

20

<220>

<221> VARIANTE

<222> (34) .. (34)

<223> /sustitución = "Ala"

25

<400> 6

<210> 7

<211> 98 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo conservado 2 <220>

<221> VARIANTE

<222> (8)..(8)

<223> /sustitución = "Lys" /sustitución = "Gln"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (12)..(12)

<223> /sustitución = "Ile"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (13) .. (13)

<223> /sustitución = "Met"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (19) .. (19)

<223> /sustitución = "Ile"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (24) .. (4)

<223> /sustitución = "Ala"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (30)..(30)

<223> /sustitución = "Met"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (38)..(38)

<223> /sustitución = "Val"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (39)..(39)

<223> /sustitución = "Val"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (44)..(44)

<223> /sustitución = "Phe"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (55 .. (45)

<223> /sustitución = "Ser" /sustitución = "Asn" /sustitución = "Asp" /sustitución = "Lys"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (48).. 48)

<223> /sustitución = "Phe" /sustitución = "Met" /sustitución = "Ile"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (50)..(50)

<223> /sustitución = "Ala"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (57)..(57)

<223> /sustitución = "Phe"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (60)..(60)

<223> /sustitución = "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (65)..(65)

<223> /sustitución = "Ser" /sustitución = "Gln" /sustitución = "Ala"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (66)..(66)

<223> /sustitución = "Lys"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (68)..(68)

<223> /sustitución = "Phe" /sustitución = "Ile"

<220>

<221> INCIERTO

<222> (69) .. (70)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido presente en la naturaleza

<220>

<221> VARIANTE

<222> (71)..(71)

<223> /sustitución = "Ile" /sustitución = "Met"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (72) .. (72)

<223> /sustitución = "Asn" /sustitución = "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (73)..(73)

<223> /sustitución = "Leu" /sustitución = "Gln"

<220>

<221> VARIANTE <222> (74)..(74)

<223> /sustitución = "Met"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (76).. (76)

<223> /sustitución = "Val"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (77) .. (77)

<223> /sustitución = "Ser" /sustitución = "Ala" /sustitución = "Ile"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (79)..(79)

<223> /sustitución = "Val"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (82)..(82)

<223> /sustitución = "Val" /sustitución = "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (83) .. (83)

<223> /sustitución = "Thr" /sustitución = "Ser"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (85) .. (85)

<223> /sustitución = "Thr" /sustitución = "Lys"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (91)..(91)

<223> /sustitución = "His"

<220>

<221>

VARIANTE 5 <222> (93)..(93)

<223> /sustitución = "Thr"

<220>

<221>

VARIANTE 10 <222> (97)..(97)

<223> /sustitución = "Ser"

<400> 7

15 <210> 8

<211> 171

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

20 <400> 8

<210> 9

<211> 606

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 9

<210> 10 10 <211> 201

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 10

<210> 11

<211> 1128

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 11

10 <210> 12

<211> 220

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 12

<210> 13

<211> 1164

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 13

<210> 14

<211> 220

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 14

<210> 15 10 <211> 1165

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 15

<210> 16

<211> 220

<212> PRT

<213> Zea mays 10

<400> 16

<210> 17

<211> 631

<212> DNA 5 <213> Picea abies

<220>

<221> característica misc_

<222> (546) .. (546) 10 <223> n es a, c, g, or t

<400> 17

<210> 18 <211> 120

<212> PRT

<213> Picea abies

<400> 18

<210> 19

<211> 769

<212> DNA 10 <213> Brassica napus

<400> 19

15 <210> 20

<211> 209

<212> PRT

<213> Brassica napus

20 <400> 20 <210> 21

<211> 636

<212> DNA 5 <213> Brassica oleracea var. alboglabra

<220>

<221> característica misc_

<222> (622)..(622) 10 <223> n es a, c, g, or t

<400> 21

15 <210> 22 <211> 198

<212> PRT

<213> Brassica oleracea var. alboglabra

5 <220>

<221> INCIERTO

<222> (194)..(194)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido presente en la naturaleza

10 <400> 22

<210> 23

<211> 958

<212> DNA 15 <213> Nicotiana tabacum

<400> 23

<210> 24

<211> 207

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 24

10 <210> 25

<211> 1016

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<400> 25

5 <210> 26

<211> 206

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

10 <400> 26

<210> 27 <211> 967

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 27

<210> 28

<211> 214 10 <212> PRT

<213> Glycine max

<400> 28

<210> 29

<211> 1067

<212> DNA

<213> Vitis vinifera

<400> 29

10 <210> 30 <211> 214

<212> PRT

<213> Vitis vinifera

<400> 30

<210> 31

<211> 1081

<212> DNA 10 <213> Hordeum vulgare

<400> 31

<210> 32

<211> 215

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 32

10 <210> 33 <211> 1175

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 33

<210> 34

<211> 208 10 <212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 34

<210> 35

<211> 1119

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor

<400> 35

10 <210> 36

<211> 225

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor

<400> 36

<210> 37

<211> 975

<212> DNA

<213> Lycopersicon esculentum

<400> 37

<210> 38

<211> 206

<212> PRT 5 <213> Lycopersicon esculentum

<220>

<221> INCIERTO

<222> (74) .. (74) 10 <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido presente en la naturaleza

<400> 38

<210> 39 15 <211> 1395

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 39

<210> 40

<211> 464

<212> PRT 10 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 40

<210> 41

<211> 1182

<212> DNA

<213> Especie de Pinus

<400> 41

<210> 42

<211> 215 10 <212> PRT

<213> Especie de Pinus

<400> 42

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método para incrementar el rendimiento de semillas en plantas, con relación a plantas de control, que comprende

   incrementar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3 preferentemente en el vástago de una planta, y opcionalmente, seleccionar plantas que tienen un rendimiento de semillas incrementado.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que dicha expresión incrementada se efectúa introduciendo una modificación genética, preferiblemente en el locus de un gen que codifica un polipéptido de HAL3.

3. 3.

   Método según la reivindicación 2, en el que dicha modificación genética se efectúa mediante una cualquiera o más de: activación con T-DNA, TILLING y recombinación homóloga.

4. 4.

   Método según la reivindicación 1, en el que dicha expresión incrementada se efectúa introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3.

5. 5.

   Método según la reivindicación 4, en el que dicho ácido nucleico que codifica una proteína de HAL3 se representa mediante uno cualquiera de los SEQ ID NO de ácido nucleico dados en la Tabla A, o una porción de los mismos, o una secuencia capaz de hibridarse con uno cualquiera de los SEQ ID NO de ácido nucleico dados en la Tabla A.

6. 6.

   Método según la reivindicación 4, en el que dicho ácido nucleico que codifica una proteína de HAL3 codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los SEQ ID NO de ácido nucleico dados en la Tabla A.

7. 7.

   Método según la reivindicación 1, en el que dicho rendimiento de semillas incrementado es uno o más de: a) biomasa de semillas incrementada; b) índice de recolección incrementado; y c) número incrementado de semillas (llenas).

8. 8.

   Método según la reivindicación 1, en el que dicho incremento en el rendimiento de semillas es al menos 10% con relación a plantas de control.

9. 9.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que dicho ácido nucleico que codifica una proteína de HAL3 está conectado operativamente a un promotor específico de vástagos, preferiblemente a un promotor de ßexpansina.

10. 10.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que dicho ácido nucleico que codifica una proteína de HAL3 es de origen vegetal, preferiblemente de una planta dicotiledónea, además, preferiblemente de la familia Brassicaceae, más preferiblemente del género Arabidopsis, lo más preferiblemente de Arabidopsis thaliana.

11. 11.

    Planta o parte de la misma, incluyendo semillas, obtenible mediante un método según cualquier reivindicación precedente, donde dicha planta o parte de la misma comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de HAL3 capaz de expresarse preferentemente en tejido de vástago.

12. 12.

    Constructo que comprende:

    (a)

    un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3;

    (b)

    una o más secuencias de control capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de

    (a)

    preferentemente en tejido de vástago de una planta; y opcionalmente

    (c)

    una secuencia de terminación de la transcripción.

13. 13.

    Constructo según la reivindicación 12, en el que dicha una o más secuencias de control son al menos un promotor específico de vástagos, preferiblemente un promotor de ß-expansina.

14. 14.

    Uso de un constructo según la reivindicación 12 o 13, para incrementar el rendimiento de semillas en plantas con relación a plantas de control.

15. 15.

    Planta, parte de planta o célula vegetal transformada con un constructo según la reivindicación 12 o 13.

16. 16.

    Método para la producción de una planta transgénica que tiene rendimiento de semillas incrementado con relación a plantas de control, método que comprende:

    (i)

    introducir e incrementar la expresión, preferentemente en tejido de vástago de una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3; y

    (ii)

    cultivar la célula vegetal bajo condiciones que promueven el crecimiento y el desarrollo de la planta.

17. 17.

    Planta transgénica que tiene un rendimiento de semillas estimulado con relación a plantas de control, resultando dichos rasgos relacionados con el rendimiento estimulado de incrementar la expresión de un polipéptido de HAL3 preferentemente en el vástago.

    5 18. Planta transgénica según la reivindicación 11, 15 o 17, donde dicha planta es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo y avena.
18. 19. Partes recolectables de una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 11, 15, 17 o 18, donde dichas partes recolectables son preferiblemente semillas, partes recolectables que comprenden el constructo de la reivindicación 12 o 13.

    10 20. Productos derivados de una planta según la reivindicación 18 y/o de partes recolectables de una planta según la reivindicación 19, productos que comprenden el constructo de la reivindicación 12 o 13.
19. 21. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HAL3, ácido nucleico que está conectado operativamente a un promotor específico de vástagos, para incrementar el rendimiento de semillas en plantas.