CN102131934A - 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节编码RHL1(无根毛1)的核酸在植物中的表达而增强多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码RHL1的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的多种植物产量相关性状。本发明也提供了在本发明方法中有用的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法
本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节编码RHL1(无根毛(Root Hairless)1)的核酸在植物中的表达而增强多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码RHL1的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的多种植物产量相关性状。本发明也提供了在本发明方法中有用的构建体。
本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过增加编码转谷氨酰胺酶(TGase)多肽的核酸序列在植物中的表达而增加多种植物种子产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码TGase多肽的核酸序列的增加表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增加的种子产量相关性状。本发明还涉及包含该核酸序列的核酸序列、核酸构建体、载体和植物。
本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节编码TRY-样(Tryptichon)多肽的核酸在植物中的表达而改良多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码TRY-样多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有改良的生长特征。本发明也提供了在本发明方法中有用的构建体。
本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于增加植物中种子产量的方法。更具体地，本发明涉及用于通过调节编码BZR(BRASSINAZOLE-RESISTANT(抗性))多肽的核酸在植物中的表达而增加植物中种子产量的方法。本发明还涉及具有编码BZR多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增加的种子产量。本发明还提供用于实施本发明方法的迄今未知的BZR-编码核酸，和包含此核酸的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特征的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有可能并不总导致受欢迎性状从亲代植物传递下去的异源遗传组分。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
具有特殊经济意义的性状是提高的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入、胁迫耐受性和早期生长势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以有助于提高作物产量。
种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对人和动物营养是重要的。作物如谷物、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用许多类型代谢物的来源。种子含有胚(新茎干(shoot)和新根的来源)和胚乳(萌发期间和幼苗早期生长期间用于胚生长的养分来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
植物生物量是饲料作物如苜蓿、饲用谷物和干草的产量。产量的许多代用物已经用于谷物作物。它们当中主要是对植物尺寸的估计。植物尺寸可以根据物种和发育阶段以多种方式测量，不过包括总植物干重、地上部分干重、地上部分鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座丛直径、叶长度、根长度、根质量、分蘖数和叶数。许多物种维持在给定发育阶段上植物不同部分的尺寸之间的保守比率。这些异速增长关系用来从这些尺寸量值之一外推至另一种尺寸量值(例如Tittonell等，2005Agric Ecosys & Environ 105：213)。在发育早期的植物尺寸一般与发育中稍后的植物尺寸相关。具有较大叶面积的较大植物通常可以比较小的植物吸收更多光线和二氧化碳并且因而可能会在相同的时段期间获得更大重量(Fasoula和Tollenaar 2005 Maydica 50：39)。此外，这也是植物应当初始实现较大尺寸的微环境优势或遗传优势的潜在延续。存在针对植物尺寸和生长速率的强遗传组分(例如ter Steege等，2005Plant Physiology139：1078)，并且因而对于一系列各异遗传表型，在一种环境条件下的植物尺寸很可能关联于另一种环境条件下的尺寸(Hittalmani等，2003Theoretical Applied Genetics 107：679)。以这种方式，使用标准环境作为作物在田间于不同位置及时间所遭遇的多样且动态环境的代用物。
对于许多作物的另一个重要性状是早期生长势。改良早期生长势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种方面的重要目标。长根对于水栽稻中正确土壤固定是重要的。在稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与生长势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对良好出苗是重要的。将早期生长势人工改造到植物内的能力在农业中将是极重要的。例如，不良的早期生长势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)在欧洲大西洋地区引种玉米(Zea mayes L.)杂种。
收获指数即种子产量对地上部分干重的比率在许多环境条件下是相对稳定的并且因而可以经常获得植物尺寸与谷物产量之间的强相关(例如Rebetzke等，2002 Crop Science 42：739)。这些过程是内在联系的，因为谷物生物量的主要部分取决于植物叶和茎的现有和储备光合生产率(Gardener等，1985Physiology of Crop Plants.Iowa State UniversityPress，第68-73页)。因此，选择植物尺寸(甚至在发育的早期)已经用作未来潜在产能的指示物(例如Tittonell等，2005Agric Ecosys & Environ105：213)。当检验遗传差异对胁迫耐受性的影响时，使土壤属性、温度、水和养分有效性和光强度标准化的能力是温室或植物生长室环境与田间相比的固有优势。然而，产量因不良授粉所致的人为限制可能限制这些受控环境检验产量差异的用途，其中所述的不良授粉因缺少风和昆虫或成熟根或根冠生长的足够空间引起。因此，在标准化条件下在生长室或温室测量发育早期的植物尺寸是提供潜在遗传产量优势指示的标准操作。
另一个重要性状是改良的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言平均产量降低超过50％(Wang等，Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性养分和氧化胁迫引起。改良植物的非生物胁迫耐受性能力将在世界范围对农民是巨大的经济优势并且将允许在不利条件期间及在本来不可能栽培作物的陆地上栽培作物。
因而可以通过优化前述因素之一提高作物产量。
取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其他产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其他参数，这取决于用途。多种机制可以有助于提高种子产量，无论其形式为提高的种子尺寸或提高的种子数目。
提高植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过改良植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号传导途径。
关于BZR，取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其他产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其他参数，这取决于用途。多种机制可以有助于提高种子产量，无论其形式为提高的种子尺寸或提高的种子数目或提高的花序数。
现在已经发现可以通过调节编码RHL1(无根毛1)的核酸在植物中的表达而改良植物中的多种植物产量相关性状。
另外，现在已经发现可以通过增加编码转谷氨酰胺酶(TGase)多肽的核酸序列在植物中的表达而相对于对照植物增强植物中的多种种子产量相关性状。增强的种子产量相关性状包含以下一项或多项：提高的每株植物总种子产量、提高的饱满种子数和提高的收获指数。
另外，现在已经发现可以通过调节编码TRY-样(Tryptichon)的核酸在植物中的表达而改良植物中的多种生长特征。
此外，现在已经发现可以通过调节编码BZR(BRASSINAZOLE-RESISTANT(抗性))多肽的核酸在植物中的表达而改良植物中的种子产量。
背景技术
1.无根毛1(RHL1)
RHL1多肽首先由Schneider等(Genes Dev.12，2013-2021)于1998年描述为拟南芥(Arabidopsis thaliana)中根毛发生(initiation)所需的核靶向蛋白质。RHL1对植物界(Viridiplantae)是遍在的。源自不同组织的RHL1的序列比较显示RHL1多肽具有约30-80％同一性的全序列相似性。RHL1多肽包含大量推定的核定位信号、磷酸化位点和PEST序列，PEST序列是推定的蛋白酶体依赖性蛋白降解基序。据报导此类基序的出现可通过调节topos的亚细胞定位和/或它们与其他蛋白的相互作用赋予一些调节性功能。RHL1蛋白质的C端与哺乳动物Topo II-α蛋白质具有弱的但显著的序列类似性(Sugimoto-Shirasu等，2005PNAS 102，18736-17741)。真核topo II蛋白质属于解旋复制双螺旋DNA所需要的II型topo(IIA型)的子类。在TOP6B，RHL1多肽与植物topo VI蛋白质间的物理相互作用已有报导(Sugimoto-Shirasu等，2005)。已建议RHL1多肽在植物细胞的有丝分裂细胞周期和内周期(endocycle)内对植物topo VI活性复合体起作用。在RHL1基因中携带突变的拟南芥hyp7在核内再复制中展示出极端drawf表型和缺陷(Sugimoto-Shirasu等，2005)。
2.转谷氨酰胺酶(TGase)
转谷氨酰胺酶(TGase，EC 2.3.2.13；蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰转移酶)是具有一定钙(Ca)-依赖催化活性范围的酶家族，其中大部分涉及蛋白质的翻译后修饰。它们催化与一系列含有伯胺基团的物质的蛋白质和多肽的共价结合，例如他它们通常以Ca-依赖模式促进在胺供体底物的伯胺和作为胺受体的蛋白质或多肽中肽键内源谷氨酰胺残基的y-羧酰胺基团间的酰胺键的形成：
蛋白谷氨酰胺+烷基胺＝蛋白N5-烷基谷氨酰胺+NH3。
已显示多胺用作TGases的生理学底物。多胺在动物、微组织和植物的生长和细胞分裂过程中呈现出重要作用。多胺的作用之一是它们的调节作用，这通过酶和结构蛋白的翻译后修饰(增加多胺部分)的TGase-介导过程。
TGases酶在细胞内和细胞外发现，且广泛分布在细菌、动物和植物中。植物中，在叶绿体中发现TGase活性。已显示天线复合物的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶和脱辅基蛋白质为TGase活性的底物，从而暗示这些酶在光合作用有关过程中的作用，例如光合系统天线蛋白的保护(Villalobos等，(2004)Gene 336：93-104)。
在玉米组成型启动子的调控下表达编码大鼠前列腺钙依赖转谷氨酰胺酶多肽的基因的转基因稻植物(Claparols等，(2004)TransgenicResearch 13：195-199)在非活性形式下积累重组酶。
国际专利申请WO 2003/102128描述了编码包含此类核酸序列的谷物TGas多肽、载体、微生物和植物的核酸序列，和在食物操控、加工和转化中具有此类TGase活性的多肽的用途。
出人意料地，现在已经发现：增加编码如本文定义的TGase多肽的核酸序列在植物中的表达产生了相对于对照植物具有增强的种子产量相关性状的植物。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物增强植物中种子产量相关性状的方法，其包括增加编码如本文定义的TGase多肽的核酸序列在植物中的表达。增强的种子产量相关性状包含以下一项或多项：提高的每株植物总种子产量、提高的饱满种子数和提高的收获指数。
3.Tryptich on(TRY-样)
拟南芥基因Tryptichon编码据报导负调节trychome发育并正调节根毛发育的蛋白质。拟南芥中的Trichome图示发育是用于从初始等价细胞中产生空间模式的模型。Schellmann等(EMBO J.21，5036-5046，2002)表示对侧抑制起作用的Tryptichon基因编码缺乏可识别活性结构域的单重复MYB相关转录因子。其与基因Caprice的根毛图示发育有高度序列相似性。两种基因都在trichomes中表达并一起在侧抑制中起作用。它们又表示Tryptichon和Caprice丰余性作用于根表皮中位置依赖的细胞命运决定。这样，从头图示发育和位置依赖的细胞决定似乎都涉及同一种侧抑制机制(Schellmann等，2002)。
4.BRASSINAZOLE抗性1(BZR1)
基因表达的调节是任何细胞存活的关键。几百种蛋白质参与基因转录的调节。尤其转录因子具有主要作用并直接作用于基因启动子。植物基因组将它们的约7％编码序列是转录因子(TF；Rushton等，2008PlantPhysiology 147：280-295(2008))。
植物编码特定类的转录因子，BES或BZR蛋白，其调节基因对植物类固醇激素如油菜素类固醇(BR)的变动的响应。BZR转录因子(BZRTF)由一般在蛋白质的N端发现并参与与靶定基因启动子结合的保守BZR1阻抑物结构域的出现来表征。植物一般编码少数BZR TF。例如，拟南芥基因组只包含6个编码BZR TF基因，而烟草植物中这类TF的家族扩大至编码19个BZR TF。所有TF包含保守BZR1阻抑物结构域并预测在BR信号传导的调节中起作用。
拟南芥中，BR信号传导中的级联事件在引起BK11释放的BR与BRASSINOSTEROID不敏感1(BRI1)/BKI1受体复合物在质膜处的结合时触发。随后BRI1和BRI1相关受体激酶1(BAK1)的二聚化激活导向BRI1EMS抑制子1(BES1)和BRASSINAZOLE抗性1(BZR1)的下游信号传导途径。由激酶磷酸化的BES1和BZR1会通过对蛋白质的亚细胞定位和稳定的作用调控它们的信号传导活性。由激酶BIN2脱磷后的BZR1积累在作为执行转录作用的位点的细胞核中(Wang等，2006Cell Res.16：427-434)。机械地，BZR1家族的转录因子直接与靶定基因的启动子结合并可起激活或抑制表达的作用。
用于调节油菜素类固醇响应途径以修饰植物中大量性状的方法已公开(US6,921,848)。如US6,921,848中所定义的性状包括提高的生长和多种器官和组织中的细胞伸长。然而，这些效果并不导致诸如产生的种子数量的器官数量的增加，和/或植物种子产量的提高。
发明概述
1.无根毛1(RHL1)
出人意料地，现在已经发现：调节编码RHL1多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码RHL1多肽的核酸在植物中的表达。增强的产量相关性状包含植物的提高的早期生长势、种子产量、种子数量和收获指数。
2.Tryptich on(TRY-样)
出人意料地，现在已经发现：调节编码TRY-样多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状，尤其是提高的出苗生长势和/或提高的产量的植物。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改良产量相关性状的方法，其包括调节编码TRY-样多肽的核酸在植物中的表达。改良的产量相关性状包含提高的种子产量，包括总种子重。
3.BRASSINAZOLE RESISTANT1(BZR1)
出人意料地，现在已经发现：调节编码BZR多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有提高的种子产量的植物。
根据本发明一个实施方案，提供了用于相对于对照植物提高植物种子产量的方法，其包括调节编码BZR多肽的核酸在植物中的表达。
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可相互交换地使用并且指由肽键连接起来的任意长度聚合物形式的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可相互交换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
对照植物
选择合适的对照植物是实验设计的例行部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是因分离而丢失转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与衍生它们的非修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基被引入蛋白质中的预定位点。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。通常，在氨基酸序列内部的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小约1至10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、
Figure BDA0000047895990000091
-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
取代指以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替代蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，但是根据给予多肽的功能性约束条件，可以是簇集的；插入通常是约1至10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著)和下表1)。
表1：保守性氨基酸取代的实例
  残基   保守性取代   残基   保守性取代
  Ala   Ser   Leu   Ile；Val
  Arg   Lys   Lys   Arg；Gln
  Asn   Gln；His   Met   Leu；Ile
  Asp   Glu   Phe   Met；Leu；Tyr
  Gln   Asn   Ser   Thr；Gly
  Cys   Ser   Thr   Ser；Val
  Glu   Asp   Trp   Tyr
  Gly   Pro   Tyr   Trp；Phe
  His   Asn；Gln   Val   Ile；Leu
  Ile   Leu，Val
氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作轻易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，用于在DNA的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比较，它们包含非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然存在的改变的氨基酸残基。与衍生出衍生物的氨基酸序列相比较，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加物(例如报道分子或其他配体)，如所结合旨在促进检测该衍生物的报道分子，和相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言，包含非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式的蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对标签肽的综述，见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的融合物。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包括用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内因祖先基因复制而起源的基因；直向同源物是来自不同生物的因物种形成而起源的基因，并且也衍生于共同的祖先基因。
结构域
术语“结构域”指在进化相关性蛋白质的序列比对结果上的特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质结构、稳定性或功能方面很可能是必需的氨基酸。结构域因其在蛋白质同源物家族的比对序列中高程度保守而鉴定，故它们可以用作鉴定物来确定所讨论的任意多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
基序/共有序列/标签
术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区域。基序往往是结构域的高度保守部分，但是也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若该基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
杂交
如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处在溶液中。杂交过程也可以用固定至基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的互补性核酸之一进行。杂交过程也可以用固定至固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)的互补性核酸之一进行。为使杂交发生，核酸分子通常被热变性或化学变性，以将双链解链成两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。
术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受诸条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。通常，将低严格条件选择成在定义的离子强度和pH处，低于特定序列的热解链温度(Tm)约30℃。中等严格条件是当所述温度在Tm以下20℃时，并且高严格条件是当所述温度在Tm以下10℃时。高严格杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离且依旧编码基本上相同的多肽，原因是遗传密码的简并性。因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴定此类核酸分子。
Tm是在定义的离子强度和pH处的下述温度，其中50％的靶序列在所述温度与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在更高温度上特异性杂交。最大杂交速率从低于Tm约16℃直至32℃获得。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥作用，因而促进杂交体形成；这种作用对于直到0.4M的钠浓度是显而易见的(对于更高浓度而言，可以忽略这种作用)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数的甲酰胺降低0.6至0.7℃，且添加50％甲酰胺允许在30至45℃杂交，尽管杂交速率会降低。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均且对于大的探针而言，Tm下降约1℃/每％碱基错配。根据杂交体的类型，Tm可以使用以下等式计算：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6×log10[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×Lc]-1-0.61×％甲酰胺
2)DNA-RNA杂交体或RNA-RNA杂交体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA杂交体或寡RNAd杂交体：
对少于20个核苷酸而言：Tm＝2(ln)
对20-35个核苷酸而言：Tm＝22+1.46(ln)
a或者用于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
b仅对于在30％-75％范围内的％GC是精确的。
cL＝双链体的碱基对长度。
d Oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以使用许多已知技术中任意一种技术控制非特异性结合，例如将膜以含有蛋白质的溶液封闭、添加异源RNA、异源DNA和SDS至杂交缓冲液，并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，可以通过变换以下条件之一：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)进行一系列杂交。技术人员了解可以在杂交期间变更并且会维持或改变所述严格条件的多个参数。
除了杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗液的功能。为除去因非特异性杂交引起的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。此类洗液的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于所述杂交严格性进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交测定法或基因扩增检测方法的适宜严格条件如上所述。也可以选择严格性更高或更低的条件。技术人员了解可以在洗涤期间变更并且会维持或改变所述严格条件的多个参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在50℃于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
出于定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等，(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版Cold SpringHarbor Laboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和年度更新版)。
剪接变体
如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、取代、置换或添加所选内含子和/或外显子或其中已经缩短或加长内含子的核酸序列的变体。此类变体将是基本上保留蛋白质的生物学活性的一类变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能片段实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制备。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域熟知的(见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics.6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因位于相同染色体位置处的备选形式。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL形成大部分生物的天然存在多态性株系中的序列变体的最大集合。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化由反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体而组成(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
调节元件/调控序列/启动子
术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”均在本文中可相互交换地使用并且在广泛含义上意指能够实现与它们相连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸调控序列。前述术语包括从经典真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA框，具有或没有CCAAT框序列)衍生的转录调节序列和应答发育性刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式而改变基因表达的其他调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括一个-35框序列和/或一个-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的人工融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导植物细胞中编码序列节段表达的调节元件。因此，植物启动子不必须是植物来源的，但可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用本发明方法中待表达的并在本文中描述的核酸序列转化的植物。这也适用于其他“植物”调节信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，但不影响启动子、可读框(ORF)或3’调节区如终止子或远离ORF存在的其他3’调节区的功能性或活性。还有可能所述启动子的活性因修饰其序列或它们被更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底取代而提高。为了在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效地连接至或包含在正确的时间点并以所需空间表达模式表达基因的合适启动子。
为鉴定功能性等同启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以例如通过将此启动子有效连接至报道基因并分析该报道基因在植物的多种组织中的表达水平和模式进行分析。合适的熟知报道基因包括例如β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式可以随后与参考启动子(如在本发明方法中使用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如RNA印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996Genome Methods 6：986-994)，通过量化mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较进行分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或以每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1000转录物表达。通常，“中等强度启动子”意指驱动编码序列以低于强启动子水平、尤其在一切情况下以低于受35S CaMV启动子控制时所获得的水平表达的启动子。
有效地连接
如本文中所用的术语“有效地连接”指启动子序列与目的基因之间的功能连接，从而该启动子序列能够启动该目的基因转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在生长和发育的大部分期间但不是必需在全部期间，以及在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。
表2a：组成型启动子的实例
Figure BDA0000047895990000161
Figure BDA0000047895990000171
遍在启动子
遍在启动子是在生物的全部组织或细胞中基本上有活性的。
发育调节型启动子
发育调节型启动子在某些发育阶段期间或在经历发育变化的植物的部分中有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子在应答化学刺激(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有诱导的或提高的转录启动作用，或可以是“胁迫诱导的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时其激活，或是“病原体诱导的”，即当植物暴露于多种病原体时其激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够偏好地启动某些器官或组织如叶、根、种子组织等中转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是这样的启动子，该启动子优势地在植物根中具有转录活性，在植物的任何其他部分中基本上无活性，尽管在该植物的这些其他部分中仍允许任意泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异性的”。
根特异性启动子的实例列于下表2b中。
表2b：根特异性启动子的实例
Figure BDA0000047895990000181
Figure BDA0000047895990000191
种子特异性启动子是能够在种子组织中优势地具有转录活性的启动子，但无需排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异的。种子特异性启动子的实例(胚乳/糊粉/胚特异的)示于下表2c至2f中。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，所述文献的公开内容如完整所述那样通过引用方式并入本文。
表2c：种子特异性启动子的实例
Figure BDA0000047895990000192
Figure BDA0000047895990000211
表2d：胚乳特异性启动子的实例
Figure BDA0000047895990000212
Figure BDA0000047895990000231
表2e：胚特异性启动子的实例
  基因来源   参考文献
  稻OSH1   Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，93：8117-8122，1996
  KNOX   Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
  PRO0151   WO 2004/070039
  PRO0175   WO 2004/070039
  PRO005   WO 2004/070039
  PRO0095   WO 2004/070039
表2f：糊粉特异性启动子的实例
Figure BDA0000047895990000232
如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是优势地在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在该植物的这些其他部分中仍允许任意泄露表达。
可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例示于下文表2g中。
表2g：绿色组织特异性启动子的实例
Figure BDA0000047895990000241
组织特异性启动子的另一个实例是分生组织特异性启动子，其优势地在分生组织中具有转录活性，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在该植物的这些其他部分中仍允许任意泄露表达。可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例示于下文表2h中。
表2h：分生组织特异性启动子的实例
Figure BDA0000047895990000242
终止子
术语“终止子”包含作为转录单元末端处DNA序列的调控序列，其产生初级转录物的3’加工和多腺苷酸化及转录终止的信号。终止子可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的终止子可以从例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较次优选从任何其他真核基因衍生。
调节
就表达或基因表达而言，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比较，表达水平因所述基因的表达而改变，优选地，表达水平可以提高或降低。原始、未调节的表达可以是结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型的表达，随后是翻译。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何改变，这引起植物产量提高和/或生长增加。
表达
术语“表达”或“基因表达”意指某个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或某些基因或基因构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，所述RNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
增加的表达/过量表达
如本文中所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平为额外的任何形式的表达。
用于提高基因或基因产物表达的方法在本领域内被充分报道并且包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以引入在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般在上游)中引入充当启动子或增强子元件的分离的核酸，从而上调编码目的多肽的核酸表达。例如，可以在体内通过突变、缺失和/或取代而改变内源性启动子(见Kmiec，US 5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的恰当方向及距离引入植物细胞，从而控制该基因的表达。
若需要多肽表达，通常希望的是在多核苷酸编码区的3’末端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的3’末端序列可以从例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较不优选从任何其他真核基因衍生。
内含子序列也可以添加至5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列以提高细胞质中聚集的成熟信使的量。已经显示在植物和动物表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子提高了mRNA水平及蛋白质水平上的基因表达高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等，(1987)Gens Dev 1：1183-1200)。此类内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5’末端附近时最强烈。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途是本领域已知的。对于总体信息，见：Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编著，Springer，N.Y.(1994)。
内源基因
本文中对“内源性”基因的称谓不仅指如植物中以其天然形式(即没有人类任何干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后(再)被引入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达的相当大程度地度降低和/或内源基因表达的实质降低。分离的基因可以从生物分离或可以是人造的，例如通过化学合成法。
降低的表达
本文中提及的“降低的表达”或“降低或基本消除表达”意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的下降。与对照植物相比较，所述降低或基本上消除以增加的优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多降低。降低表达的方法是本领域已知的并且技术人员能容易地应用已知的用于沉默的方法以通过使用例如合适的启动子，实现内源基因在整株植物或其部分的表达的降低。
为了降低或基本消除植物中内源基因的表达，需要核酸序列的基本上连续的核苷酸的足够长度。为进行基因沉默，该长度可以短至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少核苷酸，或者该长度可以长至整个基因(包括部分或完整的5’和/或3’UTR)。基本上连续的核苷酸片段可以从编码目的蛋白的核酸(靶基因)或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸衍生。优选地，基本上连续的核苷酸的片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以增加的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本消除内源基因表达的多种方法的前提。
降低或基本消除内源基因在植物中表达或用于降低蛋白质的水平和/或活性的多种方法的实例是本领域技术人员已知的。技术人员能容易地应用已知的用于沉默的方法以通过使用例如合适的启动子实现内源基因在整株植物或其部分的表达的降低。
可以使用常规工具和技术完成表达的这种降低或基本消除。用于降低或基本消除内源基因表达的优选方法是在植物中引入并表达基因构建体，其中将核酸(在此情况下，从目的基因或从能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)克隆至所述基因构建体，(部分或完全地)作为被间隔序列(非编码性DNA)隔开的反向重复序列。
在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下，所述部分是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)的反向重复序列(其优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用降低或基本上消除内源基因的表达。在包含调控序列的表达载体中克隆该反向重复序列。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成所述反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自我互补性结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成siRNA，该siRNA被掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)。该RISC进一步切开所述mRNA转录物，从而相当大程度地降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其他一般细节，见例如Grierson等，(1998)WO 98/53083；Waterhouse等，(1999)WO 99/53050。
本发明方法的实施不取决于在植物中引入并表达将所述核酸作为反向重复序列克隆到其中的基因构建体，不过可以使用几种熟知“基因沉默”方法中任何一种或多种方法来实现相同效果。
用于降低内源基因表达的一种这样的方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在这种情况下，沉默作用由植物中与内源性靶基因实质相似的双链RNA序列(dsRNA)触发。这种dsRNA进一步被植物加工成约20个至约26个核苷酸的所谓短干扰RNA(siRNA)。所述siRNA被掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)，其中所述RISC切割内源靶基因的mRNA转录物，从而相当大程度地将降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，所述双链RNA序列与靶基因对应。
RNA沉默方法的另一个实例涉及将核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)以有义方向引入植物。“有义方向”是指与自身mRNA转录物同源的DNA序列。因而将所述核酸序列的至少一个拷贝引入植物。这个额外核酸序列会降低内源基因表达，从而产生已知为共抑制作用的现象。将一个核酸序列的几个额外拷贝引入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与触发共抑制作用之间存在正相关。
RNA沉默方法的另一个实例涉及使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选互补于待沉默的内源基因。这种互补性可以存在于基因的“编码区”中和/或其“非编码区”中。术语“编码区”指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。术语“非编码区”指分布在编码区侧翼的被转录但不翻译成氨基酸的5’和3’序列(也称作5’和3’非翻译区)。
反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以互补于整个核酸序列(在此情况下是从目的基因或从能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸)，不过也可以是仅对所述核酸序列的部分(包括mRNA 5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以互补于编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域。合适反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更小的核苷酸长度开始。本发明的反义核酸序列可以使用化学合成反应和酶连接反应，利用本领域已知的方法构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在核苷酸或以多种方式修饰的核苷酸化学地合成，其中所述的修饰核苷酸设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义与有义核酸序列之间所形成的双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域熟知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和‘加帽’及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在核苷酸。对核苷酸的其他修饰作用是本领域熟知的。
反义核酸序列可以使用表达载体以生物学方式产生，其中一种核酸序列已经以反义方向亚克隆(即从插入的核酸转录出的RNA会对目的靶核酸为反义方向)到所述表达载体中。优选地，植物中反义核酸序列的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。
用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论被引入植物中或原位(insitu)地产生)与mRNA转录物和/或编码多肽的基因组DNA杂交或结合以因而抑制蛋白质的表达，例如通过抑制转录和/或翻译做到这一点。杂交可以因形成稳定双链体的常规核苷酸互补性引起，或例如，在与DNA双链体结合的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内的特异性相互作用引起。反义核酸序列可以通过在特定组织部位转化或直接注射引入植物。备选地，反义核酸序列可以被修饰以靶向所选的细胞并且随后全身性施用。例如，对于全身性施用，可以修饰反义核酸序列，从而它们与表达在所选细胞表面上的受体或抗原特异性地结合，例如通过将所述反义核酸序列连接至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体连接而做到这一点。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体递送至细胞。
根据又一个方面，反义核酸序列是α-端基异构核酸序列。α端基异构核酸序列与互补RNA形成特定的双链杂交体，在所述双链杂交体中与常见的b-单元相反，所述链彼此平行(Gaultier等，(1987)Nucl Ac Res15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
内源基因表达的降低或基本上消除也可以使用核酶进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与之具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头状核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)可以用来催化地切割编码多肽的mRNA转录物，因而相当大程度地降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具有专一性的核酶(见例如：Cech等，美国专利号4,987,071；和Cech等，美国专利号5,116,742)。备选地，与核酸序列相对应的mRNA转录物可以用来从RNA分子的汇集物中选出具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261，1411-1418)。核酶在植物中用于基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等，(1994)WO 94/00012；Lenne等，(1995)WO 95/03404；Lutziger等，(2000)WO 00/00619；Prinsen等，(1997)WO 97/13865和Scott等，(1997)WO 97/38116)。
基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGSWO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其他人描述的策略实现。
如果内源基因中存在突变和/或在随后引入植物的分离基因/核酸中存在突变，基因沉默也可能发生。所述降低或基本上消除可以由无功能的多肽引起。例如，该多肽可以与多种相互作用的蛋白质结合；一种或多种突变和/或截短作用因而可以产生仍能够结合相互作用的蛋白质(如受体蛋白)但不能展示正常功能的多肽(如信号传导配体)。
基因沉默的又一种方法是瞄准互补于基因调节区(例如启动子和/或增强子)的核酸序列以形成阻止靶细胞中基因转录的三重螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992；和Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。
技术人员会熟知其他方法，如使用针对内源多肽的抗体以抑制该多肽在植物中(in planta)的功能，或干扰涉及某多肽的信号传导途径。特别地，可以考虑人造分子可能用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰涉及所述靶多肽的信号传导途径。
备选地，可以建立筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低的活性的多肽。也可以使用此类天然变体，例如来进行同源重组。
人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们主要发挥调节基因表达和/或mRNA翻译的功能。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶。它们从具有特征性折返结构的较长非编码性RNA由Dicer家族的双链特异性RNA酶加工得来。加工后，它们通过与RNA诱导的沉默复合体(RISC)的主要组分-Argonaute蛋白结合被掺入该复合体。miRNA充当RISC的特异性组分，因为它们与胞浆中的靶核酸(大多是mRNA)发生碱基配对。后续调节事件包括靶mRNA切割和摧毁和/或翻译抑制。miRNA过量表达的影响因此往往反映为靶基因的mRNA水平降低。
可以专门地遗传工程化一般21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNA)以负向地调节单个或多个目的基因的基因表达。选择植物的微RNA靶的决定因素是本领域熟知的。用于靶识别的经验参数已经被定义并可以用来辅助具体amiRNA的设计(Schwab等，Dev.Cell 8，517-527，2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等，2006Plant Cell.200618(5)：1121-33)。
为了最佳性能，用于降低植物中内源基因表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，并使用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选地，将来自任意的给定植物物种的核酸序列引入相同的物种。例如，将来自稻的核酸序列转化到稻植物中。然而，不绝对要求待引入的核酸序列来自与待引入该核酸序列的植物相同的植物物种。只要内源靶基因与待引入的核酸之间存在实质同源性即可。
上文描述了用于降低或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的实例。例如，本领域技术人员将能够轻易调整用于沉默的前述方法，从而通过利用合适的启动子在完整植物中或其部分中实现内源基因表达的降低。
选择性标记(基因)/报道基因
“选择性标记”、“选择性标记基因”或“报道基因”包括对细胞赋予表型的任何基因，其中在所述细胞中表达该“选择性标记”、“选择性标记基因”或“报道基因”以促进鉴定和/或选择用本发明核酸构建体转染或转化的细胞。这些标记基因能够借助一系列不同原理而鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择性标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予针对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予针对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或利用木糖的木糖异构酶，或抗营养性标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致颜色(例如β-葡糖醛酸酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-GaI)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP和其衍生物)的形成。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅少数细胞摄取外来DNA，并且根据需要，将其整合至细胞的基因组中，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码选择性标记的基因(如上文所述的基因)连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以在这些基因例如通过常规方法缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择性标记的核酸分子可以在包含编码本发明多肽或在本发明方法中使用的序列的相同载体上，或在独立的载体上引入宿主细胞。已经用所引入核酸稳定转染的细胞可以通过选择加以鉴定(例如具有整合的选择性标记的细胞存活而其他细胞死亡)。一旦不需要它们，可将标记基因从转基因细胞中移除或切除。用于标记基因移除的技术是本领域熟知的，上文定义部分描述了有用的技术。
因为一旦已经成功地引入所述标记基因、尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，则这些核酸不再是转基因宿主细胞中需要的或是不想要的，故而，用于引入核酸的本发明方法有利地使用能够移除或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是所谓共转化法。共转化法同时使用两种载体以转化，一种载体携带本发明的核酸而第二种载体携带标记基因。大比例的转化体接受或在植物情况下包含(多达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的部分，即侧翼存在T-DNA的序列，该序列通常代表表达盒。标记基因随后可以通过实施杂交从转化植物中移除。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用于随目的核酸一起转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源物杂交，或转化体用引起转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化。在一些情况下(大约10％)，一旦转化已经成功发生，则转座子从宿主细胞的基因组跳出并丢失。在其他许多情况下，转座子跳到一个不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过实施杂交来消除。在微生物学中，开发了有可能或促进检测这类事件的技术。又一种有利方法依赖于所谓重组系统；所述方法的优势在于杂交消除作用可以用该重组系统实行。最知名的该类型系统称作Cre/lox系统。Cre1是移除位于loxP序列之间序列的重组酶。如果标记基因整合于loxP序列之间，一旦转化已经成功发生，则它因重组酶的表达被移除。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。位点特异性地整合本发明核酸序列至植物基因组是可能的。自然，这些方法也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”例如就核酸序列而言，意指包含所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体，或用本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建体均通过重组方法产生，其中
(a)编码在本发明方法中有用的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的基因调控序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
并不位于它们的天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，所述的修饰有可能采取例如取代、添加、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指原初植物中的天然基因组位点或染色体位点或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，优选保留，至少部分地保留该核酸序列的天然遗传环境。该环境分布在该核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp序列长度。当通过非天然、合成性(“人工”)方法(例如诱变处理)修饰天然存在表达盒时，该表达盒-例如所述核酸序列的天然启动子与编码如上文所定义在本发明方法中有用的多肽的相应核酸序列的天然存在组合-变成转基因表达盒。合适的方法例如在US 5,565,350或WO00/15815中描述。
为了本发明的目的，如上所述，将转基因植物因而理解为意指在本发明方法中使用的核酸不处于它们在所述植物基因组中的天然基因座处，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而，如所提及，转基因还意指尽管本发明的或在本发明方法中使用的核酸处在植物基因组中它们的天然位置处，然而相对于天然序列而言，其序列已经被修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经被修饰。转基因优选理解为意指本发明核酸在基因组中非天然基因座处表达，即所述核酸的同源表达或优选异源表达发生。在本文中提及优选的转基因植物。
转化
如本文中提及的术语“引入”或“转化”包括转移外源多核苷酸至宿主细胞中，无论转化所用的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发生)的植物组织可以用本发明的基因构建体转化并且可完整植物以从中再生。所选的具体组织根据可用于并且最好适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统变化。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，它可以整合至宿主基因组中。所得的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
外来基因转移至植物基因组的过程称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，可以使用几种转化方法中的任意方法将目的基因引入合适的祖先细胞。描述用于转化并从植物组织或植物细胞再生出植物的方法可以用于瞬时转化或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和微量投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu I等，(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet202：179-185)；DNA或RNA包被粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature 327：70)、用(非整合性)病毒感染等。包括转基因作物植物在内的转基因植物优选通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是植物原位(in planta)转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。随后培育该植物直至获得已处理植物的种子(Clough和Bent，PlantJ.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导稻转化的方法包括用于稻转化的熟知方法，如在以下任意文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等，(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等，(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容如充分所述那样通过引用的方式并入本文。在谷物转化的情况下，优选的方法如Ishida等，(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等，(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容如充分所述那样通过引用的方式并入本文。所述方法例如还由B.Jenes等，Techniques for Gene，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。通过这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物如拟南芥属植物(拟南芥在本发明范围不视为作物植物)，或作物植物，例如烟草植物，所述方式例如是通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后在合适培养基中培育它们。借助根癌农杆菌转化植物例如由
Figure BDA0000047895990000371
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，用于高等植物中基因转移的载体(Vectors for Gene Transfer inHigher Plants)；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
除了转化随后必需再生成完整植物的体细胞之外，也可以转化植物分生组织的细胞，并且尤其那些发育成配子的细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，从而产生转基因植物。因此，例如用农杆菌处理拟南芥属植物的种子并且从正在发育的植物中获得种子，其中一定比例的所述植物被转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol Gen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992)，在：CKoncz，N-H Chua和J Shell编著，Methods in Arabidopsis Research.WordScientific，Singapore，第274-289页]。备选方法基于反复移除花序并将莲座丛中心内的切除部位与转化的农杆菌孵育，因而同样可以在较晚的时间点获得转化的种子(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)MolGen Genet，245：363-370)。然而，特别有效的方法是改良真空渗入法，如“浸花”法。在拟南芥属植物真空浸润法的情况下，用农杆菌悬液在减低的压力下处理完整植物[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“浸花”法的情况下，将正在发育的花组织与表面活性剂处理过的农杆菌悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在这两种情况下均收获某个比例的转基因种子，并且这些种子可以通过生长在如上所述的选择条件下与非转基因种子区分开。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母系方式遗传，这降低或消除了借助花粉的转基因流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已经在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示意性展示的方法实现。简而言之，将待转化的序列连同选择性标记基因一起克隆至同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导向原质体系的位点特异性整合。已经对许多不同的植物物种描述质体转化法并且在Bock(2001)基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastid transformationtechnology)，Trends Biotechnol.21，20-28中给出综述。其他的生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式报道，其中可以通过瞬时共整合的标记基因产生所述无标记质体转化体(Klaus等，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229)。
T-DNA活化标签技术(T-DNA activation tagging)
T-DNA活化标签技术(Hayashi等，Science(1992)1350-1353)涉及以如此方式在目的基因的基因组区域内或基因的编码区上游或下游10kb处插入通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA，从而该启动子指导所靶向基因的表达。一般，目标基因的天然启动子对该基因表达的调节作用被破坏，并且该基因受新引入的启动子控制。该启动子一般嵌入T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如借助农杆菌感染，并且引起在所插入T-DNA附近的基因表达受到调节。所得的转基因植物表现显性表型，原因在于所引入启动子附近的基因受修饰的表达。
TILLING
术语“TILLING”是“基因组中定向诱导的局部损伤法”的缩写并且指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述核酸编码表达和/或活性改良的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以展示在强度或在位置或在时间方面改良的表达(例如，如果所述突变影响启动子)。这些突变变体可以展示比其天然形式基因所表现活性更高的活性。TILLING联合了高密度诱变法与高通量筛选法。TILLING中一般所遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编著，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编著，Methods onMolecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)DNA制备和汇集个体DNA；(c)PCR扩增目的区域；(d)变性和复性以允许异双链体形成；(e)DHPLC，其中汇集物中异双链体的存在被检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)将突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum等，(2000)NatBiotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许在基因组中限定选择的位置处引入所选择的核酸。同源重组是在生物科学中例行用于低等生物如酵母或展叶剑叶藓属(Physcomitrella)苔藓的标准技术。已经对模式植物(Offringa等，(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)和作物植物例如稻(Terada等，(2002)NatBiotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)描述了用于植物中进行同源重组的方法，并且存在与靶生物无关而通常适用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
产量
术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并且与时间间隔有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接有助于对产量，或实际产量是某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。术语植物的“产量”可以涉及该植物的营养生物量(根和/或茎干生物量)、涉及繁殖器官和/或涉及繁殖体(如种子)。
早期生长势
“早期生长势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期期间，并且可以因提高的植物适应性所致，其中所述提高的植物适的原因是例如该植物更好地适应环境(即优化能量资源的用途和在茎干与根之间的分配)。具有早期生长势的植物也显示提高的幼苗存活和更佳的作物建立，这往往产生高度均一的田块(作物以均一方式生长，即大多数植物在基本上相同的时间达到各个发育期)和往往更好及更高的产量。因而，早期生长势可以通过测量多种因素如千粒重(Thousand KernelWeight)、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和茎干生物量和许多其他因素等确定。
提高/改良/增强
术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可交换的并且在应用含义上应当意指与如本文中定义的对照植物相比较，至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。
种子产量
提高的种子产量自身可以表现为以下一个或多个指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子基础和/或每株植物和/或每平方米；b)提高的每株植物花数目；c)提高的(饱满)种子数；d)提高的种子饱满率(其表述为饱满种子数与种子总数之间的比率)；e)提高的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物量的比率；和f)提高的千粒重(TKW)，和g)增加的初生穗数，这从计数的饱满种子数及其总重量中外推出来。提高的TKW可以因增加的种子尺寸和/或种子重量引起，并且也可以因胚尺寸和/或胚乳尺寸增加引起。
种子产量的提高也可以表现为种子尺寸和/或种子体积的增加。此外，种子产量的提高自身也可以表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的提高。提高的种子产量也可以产生改良的构造，或可以因改良的构造而出现。
绿度指数
从植物的数字图像计算如本文中所用的“绿度指数”。对属于图像上植物目标的每个像素计算绿色值与红色值的比率(在编码颜色的RGB模式中)。绿度指数表述为绿色/红色比超过给定阈值的像素百分数。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和在养分可利用性降低的生长条件下，植物的绿度指数在开花前的最后成像中测量。相反，在干旱胁迫生长条件下，植物的绿度指数在干旱后的首次成像中测量。
植物
本文中所用的术语“植物”包括完整植物、植物的祖先及子代和包括种子、苗、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织、器官在内的植物部分，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中每种前述对象包含目的基因/核酸。
在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的名单：槭树属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(abelmosch us spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananascomosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、蜘蛛兰属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatuavar.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油籽油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamustinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthusannuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoeabatatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotylomaspp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihotspp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musaspp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、鸡蛋果(Passifiora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、欧芹(Petroselinumcrispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmitesaustralis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunusspp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、鸭毛状磨擦禾(Tripsacum dactyloides)、黑麦属(Triticale sp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticumsativum)、(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、Zizaniapalustris、枣属物种(Ziziph us spp.)及其他。
发明详述
令人惊讶地，现在已经发现：调节编码RHL1多肽的核酸在植物中的表达产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据第一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节编码RHL1多肽的核酸在植物中的表达。
另外，令人惊讶地，现在已经发现：增加编码如本文定义的TGase多肽的核酸序列在植物中的表达产生了相对于对照植物具有增强的种子产量相关性状的植物。根据第一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物中种子产量相关性状的方法，其包括增加编码TGase多肽的核酸序列在植物中的表达。
另外，令人惊讶地，现在已经发现：调节编码TRY-样多肽的核酸在植物中的表达产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据第一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节编码TRY-样多肽的核酸在植物中的表达和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
另外，令人惊讶地，现在已经发现：调节编码BZR多肽的核酸在植物中的表达产生相对于对照植物具有提高的种子产量的植物。根据第一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物提高植物中种子产量的方法，其包括调节编码BZR多肽的核酸在植物中的表达。
用于调节(优选增加)编码RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY-样多肽或BZR多肽的核酸序列表达的优选方法是通过在植物中引入并表达编码RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY-样多肽或BZR多肽的核酸序列。
关于BZR多肽，在本发明的又一优选实施方案中，本发明提供了用于相对于对照植物提高植物中种子产量的方法，其包括调节编码BZR多肽的核酸在植物中的表达，其中所述调节通过引入在植物来源启动子调控下的编码BZR多肽的核酸实施。
关于RHL1多肽，下文任何对“在本发明方法中有用的蛋白质”的谈及意指如本文中定义的RHL1多肽。下文任何对“在本发明方法中有用的核酸”的谈及意指能够编码这种RHL1多肽的核酸。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“RHL1核酸”或“RHL1基因”。
如本文中所定义的“RHL1多肽”指这样的任意多肽，其包含以增加的优选顺序与表A1的任意多肽的氨基酸序列具有25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的序列。
用于本发明方法的优选RHL1多肽包含这样的序列，该序列以增加的优选顺序与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10的任意多肽的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，更优选该序列包含SEQ ID NO：2。
RHL1多肽中发现多种保守蛋白基序。在相关序列组中发现保守蛋白结构域的方法是本领域熟知的。实施例4详述了一种此类方法的使用，MEME系统，以识别RHL1多肽中的保守蛋白基序。
用于本发明方法的又一优选RHL1多肽包含一个或多个以下基序：
(i)以增加的优选顺序与基序1：[IV]R[RK][KG][SG]QRK[NS][RK][FY]L FSFPGLLAP(SEQ IDNO：29)的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(ii)以增加的优选顺序与基序2：SGG[KR][IV]G[ED]L[KA]DL[GD]TKNP[ILV]LYLDFPQG[RQ]MKL](SEQ ID NO：30)的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(iii)以增加的优选顺序与基序3：TP[VS]RQSARTAGKK[FL][KN][FY][AT]ExSS(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(iv)以增加的优选顺序与基序4：GTK[ED]ENPEE[LA][RK]L[DE]FPKE[LF]Q[ENQ][GD](SEQID NO：32)的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(v)以增加的优选顺序与基序5：[SN][GN][NL]L[LQV][SR][EDG]xP[AS][KA]PR[SA][APS]LAPSK[TAG]VL[KR][HL][HQ]G[KR]D(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(vi)以增加的优选顺序与基序6：HA[ED][CY]DFKGGAGAA[CS]D[ES][KA]Q(SEQ ID NO：34)的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(vii)以增加的优选顺序与基序7：[KSN][KEP]P[GEK][EKT][KTE][YT][VT][EG][EPST][ELQ]SP[KE][IT][ED][SLV][ED][DI][DV][LS]S[ED][DE][SD][NDS][LD]K[DK](SEQ ID NO：35)的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(viii)以增加的优选顺序与基序8：KG[PA]AAKKQRASP[EM][EA]K[HQ]P[TA]G[KI]K(SEQ IDNO：36)的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序。
其中方括号内的氨基酸是备选的。
备选地，用于本发明方法的优选RHL1多肽包含：
A.以增加的优选顺序与一个或多个下述基序的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序：
(i)基序9：(SN)VMC(ED)D(YV)F(DE)(NS)(ML)(IV)VFS(DE)AWWIG(TR)K(ED)ENPEE(SEQ ID NO：37)；
(ii)基序10：L(AILV)A(PA)(IVA)(SA)GG(KR)(IVF)G(ED)L(KA)DL(GDS)(TS)KNP(IVL)LYLDFPQ(SEQ ID NO：38)；
(iii)基序11：G(RQ)(ML)KLFGTI(VL)YPKN(RK)Y(LI)TLQF(SEQ ID NO：39)；
其中方括号内的氨基酸(在该位置的备选氨基酸)是备选的；或
B.任意一个或多个下述基序：
(i)基序9：(SN)VMC(ED)D(YV)F(DE)(NS)(ML)(IV)VFS(DE)AWWIG(TR)K(ED)ENPEE(SEQ ID NO：37)；
(ii)基序10：L(AILV)A(PA)(IVA)(SA)GG(KR)(IVF)G(ED)L(KA)DL(GDS)(TS)KNP(IVL)LYLDFPQ(SEQ ID NO：38)；
(iii)基序11：G(RQ)(ML)KLFGTI(VL)YPKN(RK)Y(LI)TLQF(SEQ ID NO：39)；
其中方括号内的氨基酸是备选的(在该位置的备选氨基酸)，且其中以增加的优选顺序由任意其他氨基酸，优选保守氨基酸取代0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸。
用于本发明方法的又一优选RHL1多肽是表A的任意多肽的旁系同源或直向同源蛋白。
备选地，RHL1蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的全序列同一性，条件是同源蛋白包含上文概括出的保守基序之一。使用总体比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选采用默认参数，确定全序列同一性。与全序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。
优选地，多肽序列在构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)中使用时，与源自包含SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的双子叶植物的任意RHL1多肽聚类，而不与任何其他组聚类。
关于TGase，下文任何对“在本发明方法中有用的蛋白质”的谈及意指如本文中定义的TGase多肽。下文任何对“在本发明方法中有用的核酸序列”的谈及意指能够编码这种TGase多肽的核酸序列。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸序列是编码现在将描述的多肽类型的任意核酸序列，下文也称作“TGase核酸序列”或“TGase基因”。
如本文中所定义的“TGase多肽”指这样的任意多肽，其包含：(i)质体转运肽；(ii)与SEQ ID NO：70代表的至少包含一个卷曲螺旋的结构域以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性；(iii)和用于蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰转移酶的综合相关酶数据库登录号EC2.3.2.13。
备选地或额外地，如本文中定义的“TGase多肽”指这样的任意多肽序列，其包含：(i)质体转运肽；(ii)以增加的优选顺序与SEQ ID NO：45代表的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性。
备选地或额外地，如本文中定义的“TGase多肽”指这样的任意多肽，其以增加的优选顺序与如SEQ ID NO：2所代表的TGase多肽或与本文表A中给出的任意多肽序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性。
备选地或额外地，如本文中定义的“TGase多肽”指这样的任意多肽序列，其在构建TGase进化系统树(如图1中所绘制的一个进化系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：2所代表的多肽序列的TGase多肽进化枝聚类(图44中箭头标出的；来自植物的Tgases在图1中是由括号界定的)，而不与任何其他进化枝聚类。
备选地或额外地，“TGase多肽”是具有酶活性的多肽，其活性在于通常在Ca-依赖模式下催化在胺供体底物的伯胺和作为胺受体的蛋白质或多肽中肽键内源谷氨酰胺(endo-glutamine)残基的y-羧酰胺基团间的酰胺键的形成。
关于ny，下文任何对“本发明方法中有用的蛋白质”的谈及意指如本文中定义的TRY样多肽。下文任何对“在本发明方法中有用的核酸”的谈及指能够编码这种TRY样多肽的核酸。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“TRY样核酸”或“TRY样基因”。
如本文中定义的“TRY样多肽”指包含Myb样DNA结合结构域的任意多肽(PFam结构域PF00249.17，SMART结构域SM00717，ProfileScan结构域PS50090，Panther PTHR10641：SF26)。
优选地，TRY样多肽包含一个或多个以下基序：
基序12：[FM][ST]E[DQ]EE[DT]LIIRM[YHF][NKR]LVG[EDN]RW[SE]LIAGRI
基序13：PGR[TK]AEEIE[KR][YF]WT[SM][RK]
基序14：EEVSS[QT][ED][SW][EK][FL][IE]
基序15：E[ED][DET][LI][IV]X[RK][LFM][HY]XL[LFV]G[NED][RK]WX[LI]IA[GRK]R[LIV][PV]GR[TKEQ][DAP][NEKG][EQ][IVQ]其中位点6处的X可以是任意氨基酸，但优选为I、V、L、Y、S、F、C、或T之一；且其中位点10处的X可以是任意氨基酸，但优选为R、K、E、S、T、或N之一；且其中位点17处的X可以是任意氨基酸，但优选为S、D、A、E、P、或T之一。.
优选基序15为EE[DT][LI][IV]XRM[HY][RKN]LVG[NED]RWX[LI]IA[GR]R[IV][PV]GR[TKEQ][AP][NEKG]E[IVQ]，其中位点6处的X可以是任意氨基酸，但优选为Y、S、F、C、或T之一；且其中位点17处的X可以是任意氨基酸，但优选为D、A、E、P、或T之一。
更优选地，TRY样多肽以增加的优选顺序包含至少2个、至少3个，或全部4个基序。
备选地，TRY样蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：76所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的全序列同一性，条件是同源蛋白包含上文概括出的保守基序。使用总体比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选采用默认参数并优选采用成熟蛋白的序列(即未考虑分泌信号或转运肽)，确定全序列同一性。与全序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。优选TRY样多肽中的基序以增加的优选顺序与SEQ ID NO：229至SEQ ID NO：232(基序12至15)所代表的基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
优选地，多肽序列在构建进化系统树(由表3的多肽序列构建)中使用时，与包含SEQ ID NO：76(At5g53200)所代表的氨基酸序列的TRY样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
关于BZR多肽，下文任何对“在本发明方法中有用的蛋白质”的谈及意指如本文中定义的BZR多肽。下文任何对“在本发明方法中有用的核酸”的谈及意指能够编码这种BZR多肽的核酸。待引入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“BZR核酸”或“BZR基因”。
如本文中定义的“BZR多肽”指包含BZR1转录阻抑物结构域(Interpro登录号：IPR008540)的任意转录因子多肽。通常BZR多肽的N端包含一个或多个细胞核定位信号和bHLH样DNA结合结构域(Yin等，(2008)Plant Physiology 147：280-295)。
BZR转录阻抑物是本领域熟知的。BZR多肽属于植物来源的蛋白质的小家族，其作为参与调控对油菜素内酯(BR)的响应的转录调节子发挥作用。
用于本发明方法的BZR多肽包含这样的结构域，该结构域以增加的优选顺序与位于SEQ ID NO：238中氨基酸位点(定位(coordinate))10至157的SEQ ID NO：238中的BZR1转录阻抑物结构域或与包含于表A4的任意多肽的BZR转录阻抑物结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
通常，用于本发明方法的BZR多肽具有位于蛋白质N端的保守bHLH样结构域，例如此结构域对应于位于SEQ ID NO：238的位点27至76的序列RERRRRAIAAKIFTGLRSQGNYKLPKHCDNNEVLKALCLEAGWIVHEDGT：(SEQ ID NO：326)。
额外地，用于本发明方法的BZR多肽包含这样的结构域，该结构域以增加的优选顺序与SEQ ID NO：326所代表的bHLH样结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
额外地，用于本发明方法的BZR多肽可包含一个或多个以下基序：
(i)基序16：SAPVTPPLSSP(SEQ ID NO：323)，其中1、2、3或4残基可由任意氨基酸替代。
(ii)基序17：VKPWEGERIHE(SEQ ID NO：324)，其中1、2、3或4残基可由任意氨基酸替代。
(iii)基序18：DLELTLG(SEQ ID NO：325)，其中1、2、3或4残基可由任意氨基酸替代。
备选地，BZR蛋白的同源物以增加的优选顺序与SEQ ID NO：238所代表的氨基酸具有至少20％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的全序列同一性，条件是该同源蛋白包含如上概述的保守BZR结构域。使用总体比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的NeedlemanWunsch算法，优选采用默认参数并优选采用成熟蛋白的序列(即未考虑分泌信号或转运肽)，确定全序列同一性。与全序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。
术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文的“定义”部分中定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等，(2002)Nucleic Acids Res30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax forbiomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation).(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服务器(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis)，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))上获得。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。
关于TGase多肽，术语“结构域”和“基序”在本文的“定义”部分中定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic等，(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalizedprofile syntax for biomolecular sequences motifs and its function inautomatic sequence interpretation).(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAIPress，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002)。一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服务器(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis)，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))上获得。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域。图6中显示了本文表A2的多肽的比对。此比对用于鉴定如本文定义的TGase多肽间的最保守结构域或基序。一种此类结构域是包含至少一个卷曲螺旋的结构域，图6中由X’s标出，并由SEQ ID NO：70代表。
关于TGase多肽，卷曲螺旋对鉴定相同蛋白质，或同家族蛋白质或不相关蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用，如聚合是重要的。最近在从序列数据计算性预测卷曲螺旋方面取得长足进展。在瑞士生物信息研究所维护的ExPASy蛋白质组工具COILS、PAIRCOIL、PAIRCOIL2、MULTICOIL或MARCOIL上可获得本领域技术人员熟知的算法。在实施例4和图5中分别显示了按COILS算法分析产生的SEQ ID NO：45的数值和图形结果。在SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽序列中鉴定包含至少一个卷曲螺旋的结构域，并由SEQ ID NO：70代表。
用于比对序列以做比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等，(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分数并开展两个序列之间相似性的统计分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定。相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中可用的方法之一确定(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/identitymatrices using protein or DNA sequences))。如本领域技术人员会显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定完整核酸或氨基酸序列范围或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，所述Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
关于TGase多肽，本文实施例3在表B2中说明了SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽和表A2中列出的TGase多肽间的百分比同一性，其可以是低至26％的氨基酸序列同一性。
蛋白质亚细胞定位预测的任务是重要的并且得到充分研究。知晓蛋白质的定位有助于阐明其功能。用于蛋白质定位的实验方法的范围从免疫定位至使用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡糖醛酸酶(GUS)对蛋白质加标签。虽然此类方法与计算性方法相比繁琐费累，然而它准确。最近在从序列数据计算性预测蛋白质定位方面取得长足进展。在瑞士生物信息研究所维护的ExPASy蛋白质组工具上可获得本领域技术人员熟知算法当中的例如PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP、TMHMM等。用于实施本发明方法的多肽亚细胞定位之前已在文献(Villalobos等，(2004)Gene 336：93-104)中描述。尤其本发明的SEQ ID NO：45被指定到植物细胞的质体(叶绿体)区室。
靶向至质体的方法为本领域所熟知，包括使用转运肽。表3显示了可用于将任何TGase多肽靶向至质体的转运肽实例，其中天然形式的TGase多肽通常不靶向至质体，或者其中天然形式的TGase多肽通过不同的转运肽(例如，其天然转运肽)靶向至质体。克隆编码上游转运肽的核酸序列和符合读框的编码多肽(例如，缺乏其自身转运肽的TGase多肽)的核酸序列涉及本领域熟知的标准分子技术。
表3：用于将多肽靶向至质体的转运肽序列的实例
Figure BDA0000047895990000561
Figure BDA0000047895990000571
TGase多肽靶向至叶绿体并在其中有活性，即TGase多肽能够在于通常在Ca-依赖模式下催化在胺供体底物的伯胺和作为胺受体的蛋白质或多肽中肽键内源谷氨酰胺残基的y-羧酰胺基团间的酰胺键的形成。(Villalobos等，(2004)Gene 336：93-104)。
另外，RHL1多肽通常具有DNA结合活性。测试DNA结合活性的工具和技术为本领域所熟知。其他细节在本文的实施例部分中提供。
另外，当RHL1多肽在稻中根据如实施例部分概述的本发明方法表达时，产生这样的植物，其具有增强的产量相关性状，尤其是早期生长势、提高的每株植物总种子重量、提高的种子数、提高的饱满种子数和提高的收获指数中任一项。
另外，TRY样多肽(至少以其天然形式)通常具有DNA结合活性。测试DNA结合活性的工具和技术为本领域所熟知。
另外，当TRY样多肽在稻中根据如实施例部分概述的本发明方法表达时，产生这样的植物，其具有增强的产量相关性状，尤其是提高的出苗生长势、提高的饱满率、提高的收获指数、提高的总种子数、提高的千粒重、提高的第一圆锥花序数、提高的饱满种子数和/或提高的总种子重量中任一项或多项。
另外，BZR多肽(至少以其天然形式)通常具有DNA结合活性和可选的蛋白质结合活性。测试DNA结合活性的工具和技术为本领域所熟知。例如可以使用EMSA技术，该技术是基于这样的发现，即蛋白质：DNA复合物在非变性聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳条件下比自由DNA分子迁移的慢(He等，Science 307，134-138(2005))。用于确定多肽间的相互作用的技术包括但不限于酵母双杂交、免疫沉淀反应或靶蛋白质的亲和纯化如用于TAP(串联亲和纯化)技术Rigaut等，Nat Biotechnol.1999年10月；17(10)：1030-2。
优选地，用于本发明方法的BZR多肽具有DNA结合活性并且优选且以增加的优选顺序与至少20、30、40、50、75、100、150、200、250、300个核苷酸长的DNA片段结合，该核苷酸包括SEQ ID NO：327所表示的BRRE元件(油菜素内酯响应元件)和SEQ ID NO：328所表示的E-框元件。BRRE元件和E-框元件是本领域熟知的(He等，2005；Yin等，2008)。优选BRRE元件和E-框元件包含这样的序列，其与序列CGTGC(T/C)G(BRRE元件：SEQ ID NO：90)和CANNTC(E-框：SEQID NO：328)分别具有至少70％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。更优选地，与BZR多肽结合的DNA片段选自如He等，2005所描述的CPD、DWF4、UBC和CNX5启动子。
另外，BZR多肽，当其在稻中根据如实施例部分概述的本发明方法表达时，产生具有提高的种子产量、尤其是提高的饱满种子数的植物。
关于RHL1多肽，本发明通过用SEQ ID NO：1所代表的核酸序列转化植物进行说明，该核酸序列编码SEQ ID NO：2的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的编码RHL1的任意核酸或RHL1多肽实施。
关于RHL1多肽，编码RHL1多肽的核酸的实例在本文实施例1的表A1中给出。此类核酸在实施本发明的方法中有用。在实施例1的表A1中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：2所代表的RHL1多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例1的表A1中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，第二BLAST因而将针对拟南芥序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选产生属于最高命中的该查询序列。
关于TGase多肽，本发明通过用SEQ ID NO：44所代表的核酸序列转化植物进行说明，该核酸序列编码SEQ ID NO：45的TGase多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的编码TGase多肽的任意核酸序列实施。
关于TGase多肽，编码TGase多肽的核酸序列的实例在本文实施例1的表A2中给出。此类核酸序列在实施本发明的方法中有用。在实施例1的表A2中给出的多肽序列是由SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例1的表A中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(查询序列是SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45，第二BLAST因而将针对稻序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选产生属于最高命中的该查询序列。
关于TRY样多肽，本发明通过用SEQ ID NO：75所代表的核酸序列转化植物进行说明，该核酸序列编码SEQ ID NO：76的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的编码TRY样的任意核酸或TRY样多肽实施。
关于TRY样多肽，编码TRY样多肽的核酸的实例在本文实施例1的表A3中给出。此类核酸在实施本发明的方法中有用。在实施例1的表A3中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：76所代表的TRY样多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例1的表A3中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(查询序列是SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76，第二BLAST因而将针对拟南芥序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选产生属于最高命中的该查询序列。
关于BZR多肽，本发明通过用SEQ ID NO：238所代表的核酸序列转化植物进行说明，该核酸序列编码SEQ ID NO：239的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的编码BZR的任意核酸或BZR多肽实施。
关于BZR多肽，编码BZR多肽的核酸的实例在本文实施例1的表A4中给出。此类核酸在实施本发明的方法中有用。在实施例1的表A4中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：239所代表的BZR多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例1的表A4中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(查询序列是SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：239，第二BLAST因而将针对拟南芥序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选产生属于最高命中的该查询序列。
高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较结果也由同一性百分数评价。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间的特定长度范围内相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类并鉴定直向同源物和旁系同源物。
关于BZR多肽，优选地，用于本发明方法的BZR多肽编码这样的多肽，其以增加的优选顺序与表A4的任意多肽的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
核酸变体也可以用于实施本发明的方法中。此类变体的实例包括编码在实施例1的表A1至A4中所给出任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸序列，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。还在本发明方法中有用的是这样的核酸序列，其编码在实施例1的表A1至A4中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与其衍生自的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。在实施本发明方法中有用的其他变体是这样的变体，在其中优化了密码子使用或在其中移动了miRNA靶位点。
在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的核酸序列的部分；与编码RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的核酸序列杂交的核酸序列；编码RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的核酸序列的剪接变体；编码RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的核酸序列的变体。术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中所述。
编码RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的核酸不必须是全长核酸，因为本发明方法的实施不取决于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A1至A4中给出的任一核酸序列的部分、或编码实施例1表A1至A4中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。
核酸的部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生联合有几种活性的蛋白质。当融合至其他编码序列时，翻译后产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。
关于RHL1多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的RHL1多肽，并且基本上与实施例1的表A1中所给出氨基酸序列具有相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例1的表A1中给出的任一核酸的部分，或是在实施例1的表A1中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的部分。优选地，该部分的长度至少是500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个连续核苷酸，该连续核苷酸具有实施例1的表A1中给出的任一核酸序列或具有在实施例1的表A1中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：1的核酸的部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，该氨基酸序列在构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)中使用时，与源自双子叶植物的包含如SEQ IDNO：2所代表的氨基酸序列的RHL1多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
关于TGase多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的TGase多肽，并且基本上与实施例1的表A2中所给出多肽序列具有相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例1的表A2中给出的任一核酸序列的部分，或是在实施例1的表A2中所给出任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸序列的部分。优选地，该部分的长度以增加的优选顺序至少是600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200或更多个连续核苷酸，该连续核苷酸具有实施例1的表A2中给出的任一核酸序列或具有在实施例1的表A2中所给出任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸序列。优选地，该部分是多肽序列的编码核酸序列的部分，该多肽序列与如SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽或与本文表A中给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多氨基酸序列同一性。最优选地，该部分是SEQ ID NO：44的核酸序列的部分。
关于TRY样多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的TRY样多肽，并且基本上与实施例1的表A3中所给出氨基酸序列具有相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例1的表A3中给出的任一核酸的部分，或是在实施例1的表A3中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的部分。优选地，该部分的长度是至少150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500个连续核苷酸，该连续核苷酸具有实施例1的表A3中给出的任一核酸序列或具有在实施例1的表A3中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：75的核酸的部分。优选地，该部分编码包含Myb样DNA结合结构域(PFam结构域PF00249.17，SMART结构域SM00717，ProfileScan结构域PS50090，Panther PTHR10641：SF26)的多肽的片段。
关于BZR多肽，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的BZR多肽，并且基本上与实施例1的表A4中所给出氨基酸序列具有相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例1的表A4中给出的任一核酸的部分，或是在实施例1的表A4中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的部分。优选地，该部分的长度至少是20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、550、600、700、800、900个连续核苷酸，该连续核苷酸具有实施例1的表A4中给出的任一核酸序列或具有在实施例1的表A4中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：238的核酸的部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，该氨基酸序列包含与如SEQ ID NO：326所代表的bHLH样结构域以增加的优选顺序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性的蛋白质结构域。
在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与如本文中定义的RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸序列。
关于RHL1多肽或TRY样多肽，根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达能够与实施例1的表A1或A3中给出的任一核酸杂交的核酸，或包含在植物中引入并表达核酸，该核酸能够与在实施例1的表A1或A3中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸杂交。
关于TGase多肽，根据本发明，提供了用于增强植物中种子产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达能够与实施例1的表A2中给出的任一核酸序列杂交的核酸序列，或包含在植物中引入并表达核酸序列，该核酸序列能够与在实施例1的表A2中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸序列杂交。
关于BZR多肽，根据本发明，提供了用于提高植物中种子产量的方法，其包括在植物中引入并表达能够与实施例1的表A4中给出的任一核酸杂交的核酸，或包含在植物中引入并表达核酸，该核酸能够与在实施例1的表A4中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸杂交。
关于RHL1多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的RHL1多肽，其基本上与实施例1的表A1中所给出氨基酸序列具有相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例1的表A1中给出的任一核酸或与这些序列中任意序列的部分杂交，该部分如上文定义，或该杂交序列能够与在实施例1的表A1中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸杂交。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：1所代表的核酸或与其部分杂交。
关于TGase多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的TGase多肽，并且基本上与实施例1的表A2中所给出多肽序列具有相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例1的表A2中给出的任一核酸序列、或与其互补序列、或与这些序列中任意序列的部分杂交，该部分如上文定义，或其中该杂交序列能够与在实施例1的表A2中给出的任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸序列、或与其互补序列杂交。优选地，该杂交序列能够与多肽序列的编码核酸序列杂交，该多肽序列与如SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽、或与本文表A中给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多氨基酸序列同一性。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：44所代表的核酸序列或与其部分杂交。
关于TRY样多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的TRY样多肽，其基本上与实施例1的表A3中所给出的氨基酸序列具有相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例1的表A3中给出的任一核酸的互补序列、或与这些序列中任意序列的部分杂交，该部分如上文定义，或该杂交序列能够与在实施例1的表A3中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的互补序列杂交。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：75所代表的核酸的互补序列或与其部分杂交。
关于BZR多肽，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的BZR多肽，其基本上与实施例1的表A4中所给出氨基酸序列具有相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例1的表A4中给出的任一核酸的互补序列、或与这些序列中任意序列的部分杂交，该部分如上文定义，或该杂交序列能够与在实施例1的表A4中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的互补序列杂交。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：238所代表的核酸的互补序列或与其部分杂交。
关于RHL1多肽，优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，当该氨基酸序列是全长的并且在构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)中使用时，该氨基酸序列与源自双子叶植物包含SEQID NO：2所代表的氨基酸序列的任意RHL1多肽聚类，而不与任何其他组聚类。
关于TRY样多肽，优选地，该杂交序列编码包含Myb样DNA结合结构域的多肽(PFam结构域PF00249.17、SMART结构域SM00717、ProfileScan结构域PS50090、Panther PTHR10641：SF26)。
关于BZR多肽，优选地，该杂交序列包含蛋白质结构域或编码具有下述氨基酸序列的多肽，当该氨基酸序列是全长时，其包含蛋白质结构域，该蛋白质结构域以增加的优选顺序与SEQ ID NO：326所表示的bHLH样结构域具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是编码如上文中所定义的RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
关于RHL1多肽或TRY样多肽，根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A1或A3中所给出任一核酸序列的剪接变体、或实施例1表A1或A3中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的剪接变体。
关于TGase多肽，根据本发明，提供了用于增强种子产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A2中所给出任一核酸序列的剪接变体、或实施例1表A2中所给出任意多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸序列的剪接变体，其与SEQ ID NO：45所代表的多肽序列和实施例1的表A2中所示的任意多肽序列具有基本上相同的生物学活性。
关于BZR多肽，根据本发明，提供了用于提高植物中种子产量的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A4中所给出任一核酸序列的剪接变体、或实施例1表A4中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的剪接变体。
关于RHL1多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：1所代表的核酸的剪接变体，或是SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的剪接变体。优选地，当由该剪接变体编码的氨基酸序列用于构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)时，与源自双子叶植物的包含如SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的任意RHL1多肽聚类，而不与任何其他组聚类。
关于TGase多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：44所代表的核酸序列的剪接变体，或是SEQ ID NO：45的直向同源物或旁系同源物的编码核酸序列的剪接变体。优选地，该剪接变体是编码下述多肽序列的核酸序列的剪接变体，该多肽序列与SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽或与本文表2中给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
关于TRY样多肽，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：75所代表的核酸的剪接变体，或是SEQ ID NO：76的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的剪接变体。优选地，由剪接变体编码的氨基酸序列包含Myb样DNA结合结构域的多肽(PFam结构域PF00249.17、SMART结构域SM00717、ProfileScan结构域PS50090、Panther PTHR10641：SF26)。
关于BZR多肽，优选的剪接变体是SEQ ID NO：238所代表的核酸的剪接变体，或是SEQ ID NO：239的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的剪接变体。优选地，由剪接变体编码的氨基酸序列包含蛋白质结构域，该蛋白质结构域以增加的优选顺序具有与SEQ ID NO：326所表示的bHLH样结构域50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
在实施本发明方法中有用的另一种核酸序列变体是如上文所定义RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸序列的等位变体，等位变体如本文中定义。
关于RHL1多肽或TRY样多肽，根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A1或A3中给出的任一核酸的等位变体，或包括在植物中引入并表达在实施例1的表A1或A3中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的等位变体。
关于TGase多肽，根据本发明，提供了用于增强种子产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A2中给出的任一核酸序列的等位变体，或包含在植物中引入并表达在实施例1的表A2中给出的任意多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸序列的等位变体。
关于BZR多肽，根据本发明，提供了用于提高植物中种子产量的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A4中给出的任一核酸的等位变体，或包含在植物中引入并表达在实施例1的表A4中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的等位变体。
关于RHL1多肽，由在本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上与SEQ ID NO：2的RHL多肽和实施例1的表A1中所述任意氨基酸具有相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然等位基因。优选地，等位变体是SEQ ID NO：1的等位变体，或是SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的等位变体。优选地，当由该等位变体编码的氨基酸序列用于构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)时，与源自双子叶植物的包含如SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的任意RHL1多肽聚类，而不与任何其他组聚类。
关于TGase多肽，在本发明方法中有用的等位变体基本上与SEQ IDNO：45的TGase多肽和实施例1的表A2中所述任意多肽序列具有相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然等位基因。优选地，等位变体是SEQ ID NO：44的等位变体，或是SEQ ID NO：45的直向同源物或旁系同源物的编码核酸序列的等位变体。优选地，该等位变体是下述多肽序列的等位变体，该多肽序列与SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽或与本文表2中给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
关于TRY样多肽，由在本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上与SEQ ID NO：76的TRY样多肽和实施例1的表A3中所述任意氨基酸具有相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然等位基因。例如SEQ ID NO：76的等位变体在Schellmann等，(2002)中描述。优选地，等位变体是SEQ ID NO：75的等位变体，或是SEQ ID NO：76的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的等位变体。优选地，由等位变体编码的氨基酸序列，多肽包含Myb样DNA结合结构域的多肽(PFam结构域PF00249.17、SMART结构域SM00717、ProfileScan结构域PS50090、Panther PTHR10641：SF26)。
关于BZR多肽，由在本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上与SEQ ID NO：239的BZR多肽和实施例1的表A4中所述任意氨基酸具有相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然等位基因。优选地，等位变体是SEQ ID NO：238的等位变体，或是SEQ ID NO：239的直向同源物或旁系同源物的编码核酸的等位变体。优选地，由等位变体编码的氨基酸序列包含蛋白质结构域，该蛋白质结构域与SEQ ID NO：326所表示的bHLH样结构域以增加的优选顺序具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
基因改组或定向进化也可以用来生成如上文所定义的RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸序列的变体，术语“基因改组”如本文中定义。
关于RHL1多肽或TRY样多肽，根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达在实施例1的表A1或A3中给出的任一核酸序列的变体，或包含在植物中引入并表达在实施例1的表A1或A3中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的变体，该变体核酸通过基因改组获得。
关于TGase多肽，根据本发明，提供了用于增强种子产量相关性状的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A2中给出的任一核酸序列的变体，或包含在植物中引入并表达在实施例1的表A2中给出的任意多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸序列的变体，该变体核酸序列通过基因改组获得。
关于BZR多肽，根据本发明，提供了用于提高植物中种子产量的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A4中给出的任一核酸序列的变体，或包含在植物中引入并表达在实施例1的表A4中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸的变体，该变体核酸通过基因改组获得。
关于RHL1多肽，优选地，当由基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列用于构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)时，与源自双子叶植物的包含SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列的任意RHL1多肽聚类，而不与任何其他组聚类。
关于TGase多肽，优选地，由基因改组获得的变体核酸序列编码多肽序列，该多肽序列与SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽或与本文表2中给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。
关于TRY样多肽，优选地，由基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列包含Myb样DNA结合结构域(PFam结构域PF00249.17、SMART结构域SM00717、ProfileScan结构域PS50090、PantherPTHR10641：SF26)。
关于BZR多肽，优选地，由基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列包含蛋白质结构域，该蛋白质结构域与SEQ ID NO：326所表示的bHLH样结构域以增加的优选顺序具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。
编码RHL1多肽的核酸可以从任何天然来源或人工来源衍生。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。优选地，编码RHL1多肽的核酸来自植物，进一步优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科(Brassicaceae)，该核酸最优选来自拟南芥。
编码TGase多肽的核酸序列可以从任何任何天然或人工来源衍生。该核酸序列可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。优选地，编码TGase多肽的核酸序列来自植物，进一步优选来自双子叶植物，更优选来自禾本科(Poaceae)，该核酸序列最优选来自稻。
编码TRY样多肽的核酸可以从任何天然来源或人工来源衍生。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。优选地，编码TRY样多肽的核酸来自植物，进一步优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科，该核酸序列最优选来自拟南芥。
编码BZR多肽的核酸也可以从任意天然或人工来源衍生。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。优选地，编码BZR多肽的核酸来自植物，进一步优选来自异源植物，更优选来自双子叶植物，甚至更优选来自十字花科，该核酸序列最优选来自拟南芥。
有利地，本发明提供了迄今未知的BZR核酸和多肽序列。
根据本发明的又一实施方案，提供了分离的核酸分子，其包括：
(i)SEQ ID NO：13、15、17、19中任一个所代表的核酸；
(ii)与SEQ ID NO：13、15、17、19中任一个互补的核酸或其片段；
(iii)BZR多肽的编码核酸，其与SEQ ID NO：14、16、18、20中任一个以增加的优选顺序具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高的序列同一性；
(iv)能够在严格条件下与上述(i)、(ii)或(iii)中给出的任一核酸杂交的核酸。
根据本发明的又一实施方案，从而提供了分离的多肽，其包括：
(i)氨基酸序列，其与SEQ ID NO：14、16、18、20中任一个以增加的优选顺序具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高的序列同一性；
(ii)(i)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
关于RHL1多肽，本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。特别地，本发明方法的实施产生这样的植物，其相对于对照植物具有提高的产量、尤其提高的种子产量。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
关于TGase多肽，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增强的种子产量相关性状的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
关于TRY样多肽，本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。特别地，本发明方法的实施产生这样的植物，其相对于对照植物具有提高的早期生长势(出苗生长势)和提高的产量、尤其提高的种子产量。术语“早期生长势”、“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
关于BZR多肽，本发明方法的实施产生了具有提高的种子产量的植物。
关于RHL1多肽，本文中对增强的产量相关性状的谈及意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，该部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。特别地，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量而言，具有提高的种子产量的植物。
关于TRY样多肽，本文中对增强的产量相关性状的谈及意指植物的一个或多个部分的早期生长势的增加和/或生物量(重量)增加，该部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。特别地，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量而言，具有提高的种子产量的植物。
关于BZR多肽，本文中对提高的种子产量的谈及意指以下种子参数中任一项或多项：提高的种子重量、总种子数、饱满种子数、种子饱满率、饱满种子比例、种子尺寸、收获种子体积。本领域技术人员将认识到上文提及的种子产量参数可以不同的单位表达，包括但不限于每穗和/或每株植物和/或每次收获。发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量而言，具有提高的种子产量的植物。
以谷物为例，产量提高可以表现为以下一个或多个指标：每平方米建立的植物的数目提高、每株植物穗数提高、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、花序长度/直径的提高、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。以稻为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每平方米植物数、每株植物的花序数、每个花序的小穗数、每花序的花(小花)数目(其表述为饱满种子数对原生花序数的比率)、种子饱满率(即饱满种子数除以种子总数并乘以100)提高、千粒重提高及其他。
本发明提供了用于相对于对照植物提高植物的产量尤其是种子产量的方法，该方法包含调节如本文中所定义的RHL1多肽或TRY样多肽的编码核酸在植物中的表达。
本发明还提供了用于相对于对照植物增强植物的种子产量相关性状的方法，该方法包含增加如本文中定义的TGase多肽的编码核酸序列在植物中的表达。
本发明进一步提供了用于相对于对照植物提高植物的种子产量的方法，该方法包含调节如本文中定义的BZR多肽的编码核酸在植物中的表达。
由于本发明的转基因植物具有提高的产量和/或增强的种子产量相关性状和/或产量，故这些植物有可能在其生活周期的对应阶段(在其生活周期的至少部分期间)上相对于对照植物的生长速率表现出提高的生长速率。
提高的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整株植物。具有提高的生长速率的植物可以具备更短的生活周期。植物的生活周期可以意指从干燥成熟种子生长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受诸因素如早期生长势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度影响。生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶段上或基本上在植物整个生活周期期间发生。提高的生长速率在植物生活周期的早期期间可以反映增强的生长势。生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。如果大幅提高生长速率，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，如果大幅提高生长速率，则可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植物的实例中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许将转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件决定。如果缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线衍生多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有提高的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于提高植物生长速率的方法，该方法包含调节如本文中定义的RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸序列在植物中的表达。
与相当条件下生长的对照植物相比较，无论该植物是否处于非胁迫条件下或无论该植物是否暴露于多种胁迫，增强的种子产量相关性状均出现。植物一般通过生长得更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选小于25％、20％或15％、更优选小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培作物植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
特别地，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻度干旱条件开展以产生相对于对照植物具有提高的产量的植物。如Wang等，(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知相互联系并可以通过相似的机制诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等，(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。在最佳生长条件下的植物(在非胁迫条件下生长)通常以增加的优选顺序产出至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的在给定环境下此类植物的平均生产量。可以依据收获和/或季节来计算平均生产量。本领域的技术人员知道作物的平均产量。
如本文中定义的术语“非生物胁迫”意指以下任意一项或多项：水胁迫(因干旱或过量的水所致)、缺氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(因热、寒冷或冰冻温度所致)、化学毒性胁迫和氧化胁迫。根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选地，水胁迫是干旱胁迫。术语“盐胁迫”不限于普通盐(NaCl)，不过可以是由以下一种或多种盐：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等引起的任意胁迫。
相对于可比较胁迫条件下培育的对照植物，本发明方法的实施产生在非生物胁迫条件下具有增强的种子产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供了用于增强非生物胁迫条件下生长的植物中种子产量相关性状的方法，该方法包含增加TGase多肽的核编码酸序列在植物中的表达。根据本发明的一个方面，所述非生物胁迫是渗透胁迫，其选自以下一种或多种胁迫：水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。
非生物的环境胁迫的另一个实例是需要被所述植物同化用于生长和发育的一种或多种养分的可利用性降低。因为养分利用效率强烈影响植物产量和产品品质，故向田地倾注大量肥料以优化植物生长和产品品质。植物的生产量通常受3种主要养分磷、钾和氮限制，这3种养分中，氮通常是是植物生长的限速性元素。因此，植物生长所需的主要营养元素是氮(N)。氮是活细胞中存在的许多重要化合物的组成成分，所述的重要化合物包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸和叶绿素。1.5％至2％的植物干物质是氮而大约16％的植物总蛋白是氮。因此，氮可利用性是作物植物生长和生产的主要限制性因素(Frink等，(1999)Proc Natl Acad Sci USA96(4)：1175-1180)，并且也对蛋白质积累和氨基酸组成产生重大影响。因此，在氮限制性条件下生长时具有增强的种子产量相关性状的植物是意义重大的。
本发明方法的实施产生在养分可利用性降低、尤其氮可利用性降低的条件下培育的植物，该植物相对于可比较条件下培育的对照植物具有增强的种子产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增强在降低的养分可用性、优选降低的氮可用性条件下生长的植物中种子产量相关性状的方法，该方法包含增加TGase多肽的编码核酸序列在植物中表达。降低的养分可利用性可以因养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼及其他养分匮乏或过多所致。优选地，降低的养分可利用性是降低的氮可利用性。
关于RHL1多肽，相对于相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下生长的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下生长的植物中提高产量的方法，该方法包括调节RHL1多肽的编码核酸序列在植物中的表达。
关于TGase多肽，相对于相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度胁迫下生长的植物增强的种子产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在轻度胁迫条件下生长的植物中增强种子产量相关性状的方法，该方法包括增加TGase多肽的编码核酸序列在植物中的表达。
关于TRY样多肽，相对于相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下生长的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下生长的植物中提高产量的方法，该方法包含调节TRY样多肽的编码核酸在植物中的表达。
关于BZR多肽，相对于相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下生长的植物提高的种子产量。因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下生长的植物中提高种子产量的方法，该方法包含调节BZR多肽的编码核酸在植物中的表达。
关于RHL1多肽，相对于相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施在一个实施方案中赋予在养分缺乏条件下、尤其在缺氮条件下生长的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于在营养缺乏条件下生长的植物中提高产量的方法，该方法包含调节RHL1多肽的编码核酸在植物中的表达。养分缺乏可以因养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼及其他元素缺少所致。
关于TRY样多肽，相对于相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施在一个实施方案中赋予在养分缺乏条件下、尤其在缺氮条件下生长的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于提高在营养缺乏条件下生长的植物中产量的方法，该方法包含调节TRY样多肽的编码核酸在植物中的表达。养分缺乏可以因养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼及其他元素缺少所致。在本发明的另一实施方案中，在缺氮条件下获得改良的产量相关性状。
关于BZR多肽，相对于相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施在一个实施方案中赋予在养分缺乏条件下、尤其在缺氮条件下生长的植物提高的种子产量。因此，根据本发明，提供了用于在营养缺乏条件下生长的植物中提高种子产量的方法，该方法包含调节BZR多肽的编码核酸在植物中的表达。养分缺乏可以因养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼及其他元素缺少所致。
关于TRY样多肽，相对于在相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施赋予在盐胁迫条件下生长的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于提高在盐胁迫条件下生长的植物中产量的方法，该方法包含调节TRY样多肽的编码核酸在植物中的表达。术语盐胁迫不限于普通盐(NaCl)，不过可以是以下一种或多种盐：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等。
关于BZR多肽，相对于在相当条件下生长的对照植物，本发明方法的实施赋予在盐胁迫条件下生长的植物提高的种子产量。因此，根据本发明，提供了用于提高在盐胁迫条件下生长的植物中种子产量的方法，该方法包含调节BZR多肽的编码核酸在植物中的表达。术语盐胁迫不限于普通盐(NaCl)，不过可以是以下一种或多种盐：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等。
本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)或其细胞。该植物或其部分包含如上文所定义RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸转基因，该核酸转基因与在植物中起作用的启动子有效连接。
本发明也提供了基因构建体和载体以促进RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸序列在植物中的引入和/或表达。基因构建体可以插入适于转化到植物中并适于在转化细胞中表达目的基因的载体中，所述载体可以是市售的。本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更具体地，本发明提供了构建体，其包含：
(a)如上文定义的RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽或BZR多肽的编码核酸；
(b)能够驱动、或增加(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽或BZR多肽的编码核酸序列如上文定义。术语“调控序列”和“终止序列”如本文中定义。
关于TGase多肽，优选地，构建体的调控序列之一是从植物基因组分离的种子特异性启动子。种子特异性启动子的实例是α-球蛋白启动子，优选是稻α-球蛋白启动子，更优选是如SEQ ID NO：72所代表的α-球蛋白启动子。备选地，调控序列是组成型启动子，例如GOS2启动子，优选是来自稻的GOS2启动子，最优选是如SEQ ID NO：71所代表的GOS2序列。
植物用包含任意上述核酸的载体转化。技术人员非常了解必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。此目的序列有效地与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
关于RHL1多肽，有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，可以用来驱动核酸序列的表达，但优选启动子具有植物来源的。组成型启动子在本方法中特别有用。优选组成型启动子也是遍在启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文中的“定义”部分。也在本发明方法中有用的是根特异性启动子。
关于TGase多肽，有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，可以用来增加核酸序列的表达。组成型启动子是在本方法中特别有用的，优选从植物基因组分离的组成型启动子。该植物组成型启动子驱动编码序列在全部情况低于受35S CaMV病毒启动子控制时所获得水平的水平上表达。此启动子的一个实例是SEQ ID NO：71所代表的GOS2启动子。器官特异性启动子，例如用于叶、茎、块茎、分生组织中优先表达的器官特异性启动子，在实施本发明的方法中有用。发育调节启动子和诱导型启动子也在实施本发明方法中有用。优选地，种子特异性启动子在本发明方法中特别有用。对于多种启动子类型的定义，见本文中的“定义”部分。
关于TRY样多肽，有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，可以用来驱动核酸序列的表达，但优选启动子是植物来源的。组成型启动子在本方法中特别有用。优选组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文中的“定义”部分。也在本发明方法中有用的是根特异性启动子。
关于BZR多肽，有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或合成的，可以用来驱动核酸序列的表达，但优选启动子是植物来源的。组成型启动子在本方法中特别有用。优选组成型启动子也是中等强度的遍在组成型启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文中的“定义”部分。
关于RHL1多肽，应当明白本发明的应用不限于SEQ ID NO：1所代表的RHL1多肽的编码核酸，本发明的应用也不限于被组成型启动子驱动时或被根特异性启动子驱动时的RHL1多肽的编码核酸的表达。
组成型启动子优选是中等强度的启动子，如GOS2启动子，优选的启动子是来自稻的GOS2启动子。进一步优选地，该组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：39相似的核酸序列代表，最优选该组成型启动子是如SEQ ID NO：39所代表。对于组成型启动子的其他实例，见本文“定义”部分中的表2。
根据本发明的另一优选特征，多肽的编码核酸与根特异性启动子有效连接。根特异性启动子优选为RCc3启动子(Plant Mol Biol.1995年1月；27(2)：237-48)，更优选RCc3启动子来自稻，又优选RCc3启动子由与SEQ ID NO：43基本相似的核酸序列所代表，最优选该启动子由SEQ IDNO：43所代表。也可用于实施本发明方法的其他根特异性启动子的实例见在上文“定义”部分的表3。
关于TGase多肽，应当明白本发明的应用不限于SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽的编码核酸序列，本发明的应用也不限于被种子特异性启动子驱动时TGase多肽的编码核酸序列的表达。
关于TRY样多肽，应当明白本发明的应用不限于SEQ ID NO：75所代表的TRY样多肽的编码核酸，本发明的应用也不限于被组成型启动子驱动时或被根特异性启动子驱动时TRY样多肽的编码核酸的表达。
组成型启动子优选是中等强度的启动子，更优选选自植物，如GOS2启动子，更优选的是来自稻的GOS2启动子。进一步优选地，该组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：237相似的核酸序列代表，最优选该组成型启动子如SEQ ID NO：237所代表。对于组成型启动子的其他实例，见本文“定义”部分。
根据本发明的另一优选特征，编码TRY样多肽的核酸与根特异性启动子有效地连接。该根特异性启动子优选为RCc3启动子(Plant Mol Biol.1995年1月；27(2)：237-48)，更优选RCc3启动子来自稻，又优选RCc3启动子由与SEQ ID NO：235基本相似的核酸序列所代表，最优选该启动子由SEQ ID NO：235所代表。也可用于实施本发明方法的其他根特异性启动子的实例表示在上文“定义”部分的表2中。
关于TRY样多肽，可选地，一个或多个终止子序列可用于被引入植物中的构建体。优选地，该构建体包括表达盒，该表达盒与SEQ ID NO236基本上相似或相同，包含RCc3启动子和编码TRY样多肽的核酸、或表达盒，该表达盒中的编码TRY样多肽的核酸有效地连接到与SEQID NO：237基本相似的稻GOS2启动子。
关于BZR多肽，应当明白本发明的应用不限于SEQ ID NO：238所代表的BZR多肽的编码核酸，本发明的应用也不限于被组成型启动子驱动时BZR多肽的编码核酸的表达。
组成型启动子优选是中等强度的启动子，更优选选自植物衍生的启动子，如GOS2启动子，更优选是来自稻的GOS2启动子。进一步优选地，该组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：322相似的核酸序列代表，最优选该组成型启动子如SEQ ID NO：322所代表。对于植物衍生的启动子和组成型启动子的其他实例，见本文“定义”部分。植物衍生的启动子优选是植物起源的。植物衍生的启动子可由任意本领域熟知技术从植物中分离或可通过使用任意本领域熟知的合适技术的其他方法，如化学合成获得。植物衍生的启动子优选与植物起源的植物启动子具有基本上相同的表达模型和强度。植物衍生的启动子的序列和元件结构与植物起源的启动字相似。优选植物衍生的启动子包含序列，该序列与植物起源的启动子具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。
任选地，可以在被引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区(UTR)或编码序列中，以提高细胞质中积累的成熟信使的量。(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易地获得。
本发明的基因构建体可以还包括对于特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。一个实例是当需要将基因构建体在细菌细胞中作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中有用的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因此，所述基因构建体可以任选地包含选择性标记基因。选择性标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于标记移除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
为检测如在本发明方法中有用的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因此，所述基因构建体可以任选地包含选择性标记基因。选择性标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于标记移除的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
已知当核酸序列稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅少数细胞摄取外来DNA，并且根据需要，将外来DNA整合至细胞基因组中，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码选择性标记的基因(如上文所述的基因)连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以在这些基因例如通过常规方法缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择性标记的核酸序列分子可以在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列的相同载体上，或在独立的载体上引入宿主细胞。已经用所引入核酸序列稳定转染的细胞可以例如通过选择作用鉴定(例如具有整合的选择性标记的细胞存活而其他细胞死亡)。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中移除或切除它们。用于移除标记基因的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
关于RHL1多肽或TRY样多肽，本发明还提供了用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括在植物中引入并表达如上文定义的RHL1多肽或TRY样多肽的任意编码核酸。
关于TGase多肽，本发明还提供了用于产生相对于对照植物具有增强的种子产量相关性状的转基因植物的方法，其包括在植物中引入并表达如上文定义的TGase多肽的任意编码核酸序列。
关于BZR多肽，本发明还提供了用于产生相对于对照植物具有提高的种子产量的转基因植物的方法，其包括在植物中引入并表达如上文定义的BZR多肽的任意编码核酸。
关于RHL1多肽，更具体地，本发明提供了用于产生具有增强的增强产量相关性状、尤其是提高的(种子)产量的转基因植物的方法，该方法包含：
(i)在植物或植物细胞中引入并表达RHL1多肽的编码核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育该植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的RHL1多肽的任意核酸。
关于TGase多肽，更具体地，本发明提供了用于产生相对于对照植物具有增强的种子产量相关性状的转基因植物的方法，该方法包含：
i)在植物、植物部分、或植物细胞中引入并表达TGase多肽的编码核酸序列；和
ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞、植物部分或植物。
(i)的核酸序列可以是能够编码如本文中定义的TGase多肽的任意核酸序列。
关于TRY样多肽，更具体地，本发明提供了用于产生具有增强的产量相关性状、尤其是提高的早期生长势和/或提高的种子产量的转基因植物的方法，该方法包含：
(i)在植物或植物细胞中引入并表达TRY样多肽的编码核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的TRY样多肽的任意核酸。
关于BZR多肽，更具体地，本发明提供了用于产生具有提高的种子产量的转基因植物的方法，该方法包含：
i)在植物或植物细胞中引入并表达BZR多肽的核编码酸；和
ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的BZR多肽的任意核酸。
核酸序列可以直接引入植物细胞或引入植物自身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，该核酸优选通过转化引入植物。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或
Figure BDA0000047895990000881
和Willmitzer的出版物中找到。
通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整植物。为了选择转化的植物，转化中获得的植物材料一般经历选择条件，从而转化植物可以与非转化植物区分开。例如，以上文所述方式获得的种子可以播种，并且在初始培育时间后，通过喷洒经受合适的选择。另一种可能性在于种子根据需要消毒后，在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，筛选所述转化植物的选择性标记(如上文所述的选择性标记)的存在。
在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析就目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析监测新引入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。
产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化接穗嫁接的转化根状茎)。
本发明明确地扩展至由本文中所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出与如本发明方法中的亲本相同的基因型和/或表型特征。
本发明也包括这样的宿主细胞，其含有编码如上文定义的TGase多肽的分离核酸序列。优选的本发明宿主细胞是植物细胞。相对于本发明方法中所用核酸序列或载体、表达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中使用的多肽的全部植物。
本发明的方法有利地适用于任意植物。在本发明中特别有用的植物包括属于植物界超家族、尤其属于单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的优选实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜籽、亚麻籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。更优选地，该植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，该植物是谷物植物。谷物植物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、稷、黑麦、小黑麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
本发明也扩展至植物的可收获部分，如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，其中该可收获部分包含编码BZR多肽的重组核酸。本发明进一步涉及衍生自、优选直接衍生自此种植物的可收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的优选特征，受调节的表达是增加的表达。在本领域中充分报道了用于增加核酸或基因或基因产物表达的方法并且在定义部分中提供了实例。
关于RHL1多肽或TRY样多肽，如上文提及的，调节RHL1多肽的编码核酸序列的表达的优选方法是在植物中引入并表达RHL1多肽或TRY样多肽的编码核酸序列；然而实施本方法的效果即增强产量相关性状也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签技术、TILLING、同源重组在内的其他熟知技术实现。在定义部分中提供了对这些技术的描述。
关于TGase多肽，如上文提及的，调节TGase多肽的编码核酸序列的表达的优选方法是在植物中引入并表达TGase多肽的编码核酸序列；然而实施本方法的效果即增强种子产量相关性状也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签技术、TILLING、同源重组在内的其他熟知技术实现。在定义部分中提供了对这些技术的描述。
关于BZR多肽，如上文提及的，提高BZR多肽的编码核酸序列表达的优选方法是在植物中引入并表达BZR多肽的编码核酸序列；然而实施本方法的效果即提高的种子产量也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签技术、TILLING、同源重组在内的其他熟知技术实现。在定义部分中提供了对这些技术的描述。
本发明也包含如本文中所述RHL1多肽的编码核酸序列的用途，和这些RHL1多肽的用途，其用于增强植物中任意前述产量相关性状。
此外，本发明还包含如文中所述TGase多肽的编码核酸序列的用途，和这些TGase多肽的用途，其用于在正常生长条件下、在非生物胁迫生长条件(优选在渗透胁迫生长条件)下和在养分可利用性降低的条件下、优选在氮可利用性降低的生长条件下增强植物中任意前述种子产量相关性状。
此外，本发明还包含如本文中所述TRY样多肽的编码核酸的用途，和这些TRY样多肽的用途，其用于增强植物中任意前述产量相关性状。
此外，本发明也包含如本文中所述BZR多肽的编码核酸的用途，和这些BZR多肽的用途，其用于提高植物中任意前述种子产量参数。
关于RHL1多肽，本文所述的RHL1多肽的编码核酸序列或RHL1多肽自身可以用于其中鉴定到下述DNA标记的育种程序中，该DNA标记可能遗传地与RHL1多肽的编码基因连锁。该核酸序列/基因、或RHL1多肽自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来在本发明方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
关于TGase多肽，本文所述的TGase多肽的编码核酸序列或TGase多肽自身可以用于其中鉴定到下述DNA标记的育种程序中，该DNA标记可能遗传地与编码TGase多肽的基因连锁。该核酸序列/基因、或TGase多肽自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来在本发明方法中选择具有如上文所定义的增强的种子产量相关性状的植物。
关于TRY样多肽，本文所述的TRY样多肽的编码核酸序列或TRY样多肽自身可以用于其中鉴定到下述DNA标记的育种程序中，该DNA标记可能遗传地与编码TRY样多肽的基因连锁。该核酸序列/基因、或TRY样多肽自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来在本发明方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
关于BZR多肽，本文所述的BZR多肽的编码核酸序列或BZR多肽自身可以用于其中鉴定到下述DNA标记的育种程序中，该DNA标记可能遗传地与编码BZR多肽的基因连锁。该核酸序列/基因、或BZR多肽自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来在本发明方法中选择具有如上文所定义的提高的种子产量的植物。
RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而引入等位变异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“天然”来源的等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论的和产生提高的产量的序列的优异等位变体。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能实施选择。可以在温室中或在田间监测生长性能。其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可能用来例如产生感兴趣的表型特征的组合。
RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸序列也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针形成其部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以开发具有所希望表型的品系。RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸序列的此种用途仅需要至少15个核苷酸长度的核酸序列。RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸序列可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A LaboratoryManual)可以用RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸序列探测。所得的结合模式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等，(1987)Genomics 1：174-181)开展遗传分析以构建遗传图。此外，所述核酸序列可以用来探测含有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表具有定义的遗传杂交的亲本和子代。DNA多态性的分离是明显的并用来计算RHL1多肽，或TGase多肽，或TRY样多肽，或BZR多肽的编码核酸序列在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等，(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用上文概述的方法学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员熟知的。
该核酸序列探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，所述核酸序列探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等，(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。方法实例包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等，(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等，(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等，(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)Nucleic AcidRes.17：6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸序列的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲本之间的DNA序列差异。然而，这对作图法而言通常不是必需的。
如前文所述，本发明方法产生了具有增强的产量相关性状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对其他非生物胁迫和生物胁迫耐受性、改良多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
此外，如前文所述，本发明方法还产生了具有增强的种子产量相关性状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对非生物胁迫和生物胁迫耐受性、对杀虫剂耐受性、除草剂、改良多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
此外，如前文所述，本发明方法还产生了具有提高的种子产量的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对其他非生物胁迫和生物胁迫的耐受性、改良多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
项
1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码无根毛多肽的核酸表达，和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
2.根据项1的方法，其中所述的无根毛多肽包含任一个或多个如下基序：
(i)基序9：(SN)VMC(ED)D(YV)F(DE)(NS)(ML)(IV)VFS(DE)AWWIG(TR)K(ED)ENPEE(SEQ ID NO：37)；
(ii)基序10：L(AILV)A(PA)(IVA)(SA)GG(KR)(IVF)G(ED)L(KA)DL(GDS)(TS)KNP(IVL)LYLDFPQ(SEQ ID NO：38)；
(iii)基序11：G(RQ)(ML)KLFGTI(VL)YPKN(RK)Y(LI)TLQF(SEQ ID NO：39)；
其中方括号内的氨基酸是在该位置备选的，且其中以增加的优选顺序由任意其他氨基酸、优选保守氨基酸取代0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸。
3.根据项1或2的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中引入和表达编码无根毛多肽的核酸实施。
4.根据任意前述项的方法，其中所述无根毛多肽的编码核酸编码表A1中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的部分或是能够与这种核酸或其互补序列杂交的核酸。
5.根据任意前述项的方法，其中所述的核酸序列编码表A1中给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
6.根据任意前述项的方法，其中所述的增强的产量相关性状包含相对于对照植物提高的种子产量。
7.根据任意前述项的方法，其中所述的增强的产量相关性状是在缺氮的培育条件下获得的。
8.根据项3至7任一项的方法，其中所述的核酸有效连接至组成型启动子，优选有效连接至GOS2启动子，最优选有效连接至来自稻的GOS2启动子。
9.根据任意前述项的方法，其中所述的编码无根毛多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，最优选来自拟南芥。
10.根据任意前述项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码无根毛多肽的重组核酸。
11.构建体，其包含：
(i)如项1、2或3中定义的无根毛多肽的编码核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
12.根据项11的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
13.根据项11或12的构建体在用于制备相对于对照植物具有提高的产量，特别具有提高的种子产量的植物的方法中的用途。
14用根据项11或12的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
15.用于产生相对于对照植物具有提高的产量、尤选提高的种子产量的转基因植物的方法，其包括：
(a)在植物中引入并表达如项1或2中定义的无根毛多肽的编码核酸；和
(b)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞；和可选地
(c)选择具有增强的产量相关性状的植物。
16.转基因植物，其相对于对照植物具有由如项l或2中所定义的无根毛多肽的编码核酸的受调节表达引起的提高的产量、尤其提高的生物量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
17.根据项10、14或16的转基因植物，或从其中衍生的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物植物，如稻、玉米、小麦、大麦、稷(millet)、黑麦、小黑麦(triticale)、高粱和燕麦。
18.根据项17的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选是茎干生物量和/或种子。
19.产物，其来自根据项17的植物和/或从根据项18的植物的可收获部分。
20.无根毛多肽的编码核酸在相对于对照植物提高植物中产量、尤其提高茎干和/或生物量中的用途。
21.用于相对于对照植物增强植物中种子产量相关性状的方法，其包括增加转谷氨酰胺酶(TGase)多肽的编码核酸序列在植物中表达，其中所述TGase多肽包含(i)质体转运肽；(ii)与如SEQ ID NO：27所代表的包含至少一个卷曲螺旋的结构域以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多氨基酸序列同一性；(iii)和用于蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰转移酶的综合相关酶数据库登录号EC 2.3.2.13。
22.根据项21的方法，其中所述的TGase多肽具有：(i)质体转运肽；(ii)与如SEQ ID NO：45所代表的多肽以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多氨基酸序列同一性。
23.根据项21或22的方法，其中所述TGase多肽与如SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽或与本文表A2中给出的任意多肽序列以增加的优选顺序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多氨基酸序列同一性。
24.根据项21至23中任一项的方法，其中所述TGase多肽是这样的任意多肽，当其在构建TGase进化系统树(如图5中所绘制的一个进化系统树)中使用时，与包含SEQ ID NO：45所代表的多肽序列的TGase多肽进化枝聚类，而不与任何其他进化枝聚类。
25.根据项21至24中任一项的方法，其中所述TGase多肽是具有酶活性的多肽，其活性在于通常在Ca-依赖模式下催化在胺供体底物的伯胺和作为胺受体的蛋白质或多肽中肽键内源谷氨酰胺残基的y-羧酰胺基团间的酰胺键的形成。
26.根据项21至25中任一项的方法，其中所述的编码TGase多肽的核酸序列由表A中给出的任一核酸序列SEQ ID NO或其部分、或由能够与表A2中给出的任一核酸序列SEQ ID NO或其互补序列杂交的序列代表。
27.根据项21至26中任一项的方法，其中所述的核酸序列编码表A2中给出的任意多肽序列SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
28.根据项21至27中任一项的方法，其中所述增加的表达由以下任意一种或多种方法实现：T-DNA活化标签技术、TILLING或同源重组。
29.根据项21至28中任一项的方法，其中所述增加的表达通过在植物中引入并表达编码TGase多肽的核酸序列实现。
30.根据项21至29中任一项的方法，其中所述增强的种子产量相关性状是以下一项或多项：提高的每株植物总种子产量、提高的饱满种子数，和提高的收获指数。
31.根据项21至30中任一项的方法，其中所述核酸序列有效地连接种子特异性启动子。
32.根据项31的方法，其中所述的种子特异性启动子是α-球蛋白启动子，优选是稻α-球蛋白启动子，更优选是如SEQ ID NO：72所代表的α-球蛋白启动子。
33.根据项21至32中任一项的方法，其中所述编码TGase多肽的核酸序列来自植物，进一步优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，该核酸序列最优选来自稻。
34.由根据项21至33中任一项的方法可获得的植物、其部分(包括种子)或植物细胞，其中所述的植物、其部分或细胞包含编码TGase多肽的分离的核酸转基因。
35.构建体，其包含：
(a)编码如项21至27任一项中定义的TGase多肽的核酸序列；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(c)转录终止序列。
36.根据项35的构建体，其中所述的调控序列是种子特异性启动子。
37.根据项35的方法，其中所述的种子特异性启动子是α-球蛋白启动子，优选是稻α-球蛋白启动子，更优选是如SEQ ID NO：72所代表的α-球蛋白启动子。
38.根据项35至37中任一项的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增强的种子产量相关性状，其中所述增强的种子产量相关性状是以下一项或多项：提高的每株植物总种子产量、提高的饱满种子数和提高的收获指数。
39.用根据项35至37中任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
40.用于产生相对于对照植物具有增强的种子产量相关性状的转基因植物的方法，其包括：
(i)在植物、植物部分或植物细胞中引入并表达的编码如项1至7任一项中定义的TGase多肽的核酸序列；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育所述植物细胞、植物部分或植物。
41.转基因植物，其相对于对照植物具有因编码如项21至27任一项中所定义的TGase多肽的分离核酸序列表达增加引起的增强的产量相关性状，或者从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞或转基因植物部分。
42.根据项34、39或41的转基因植物，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物植物，如稻、玉米、小麦、大麦、稷、黑麦、小黑麦、高粱和燕麦，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
43.包含分离的核酸序列的可收获部分，所述分离的核酸序列编码根据项42的植物的TGase多肽，其中所述的可收获部分优选是种子。
44.产物，其来自根据项42的植物和/或从根据项43的植物的可收获部分。
45.编码如项21至27任一项中所定义TGase多肽的核酸序列在增强种子产量相关性状中的用途，其中所述的产量相关性状包含以下一项或多项：提高的每株植物总种子产量、提高的饱满种子数和提高的收获指数。
46.相对于对照植物在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码TRY样多肽的核酸的表达，其中所述TRY样多肽包含Myb样DNA结合结构域(Panther PTHR10641：SF26；Gene3DG3DSA：1.10.10.60)。
47.根据项46的方法，其中所述TRY样多肽包含基序12至15中的一个或多个(SEQ ID NO：229至SEQ ID NO：232)。
48.根据项46或47的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入和表达编码TRY样多肽的核酸来实现。
49.根据项46至48任一项的方法，其中所述编码TRY样多肽的核酸编码表A3中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的部分、或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
50.根据项46至49任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A3中所给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
51.根据项46至50任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的出苗生长势和/或提高的产量。
52.根据项46至51任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下或在缺氮条件下获得。
53.根据项48至52任一项的方法，其中所述核酸有效连接至根特异性启动子，优选至RCc3启动子，最优选至来自稻的RCc3启动子，或其中所述核酸与组成型启动子，优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
54.根据项46至53任一项的方法，其中所述编码TRY样多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。
55.通过根据项46至48任一项的方法可获得的植物或其部分，其包括种子，其中所述植物或其部分包含编码TRY样多肽的重组核酸。
56.构建体，其包含
(a)编码在项1或2中定义的TRY样多肽的核酸；
(b)一个或多个调控序列，其能够驱动(a)的核酸序列的表达；以及任选地
(c)转录终止序列。
57.根据项56的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选RCc3启动子，最优选来自稻的RCc3启动子，或所述调控序列之一是组成型启动子，优选RCc3启动子，最优选来自稻的RCc3启动子。
58.根据项56或57的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状，特别是提高的出苗生长势和/或提高的种子产量的植物。
59.用根据项56或57的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
60.用于产生转基因植物的方法，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，特别是提高的出苗生长势和/或提高的种子产量，所述方法包括：
(i)在植物中引入和表达编码如项1或2中所定义的TRY样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
61.相对于对照植物具有提高的出苗生长势和/或提高的产量的转基因植物，所述转基因植物获得自编码如项46或47所定义的TRY样多肽的核酸的受调节表达，或来自所述转基因植物的转基因植物细胞。
62.根据项55、59或61的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、稷、裸麦(rye)、黑小麦、高粱、二粒小麦(emmer)、斯佩尔特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
63.根据62的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是种子。
64.产物，其来自根据项62的植物和/或来自根据项63的植物可收获部分。
65.编码TRY样多肽的核酸在相对于对照植物在植物中提高出苗生长势和/或提高产量中的用途。
66.相对于对照植物在植物中提高种子产量的方法，其包括在植物中调节编码BZR、BRASSINAZOLE-抗性多肽的核酸的表达和任选地选择具有提高的种子产量的植物。
67.根据项66的方法，其中所述BZR多肽包含：
(i)以增加的优选顺序与SEQ ID NO：239中位于氨基酸定位10-157间的结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性的结构域和/或
(ii)以增加的优选顺序与SEQ ID NO：326所代表的bHLH样结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性的结构域和/或
(iii)与表A4的任意多肽的氨基酸序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性；和/或
(iv)由SEQ ID NO：323、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：325中任一个代表的基序，其中1、2、3或4残基可由任意氨基酸取代。
68.根据项66或67的方法，其中所述调节的表达通过在植物中引入和表达编码BZR多肽的核酸来实现。
69.根据项66至68任一项的方法，其中所述编码BZR多肽的核酸编码表A4中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸。
70.根据任何前述项的方法，其中所述核酸序列编码表A4中所给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
71.根据项66至70任一项的方法，其中所述提高的种子产量选自总种子重、饱满种子数和千粒重。
72.根据项66至71任一项的方法，其中所述提高的种子产量在非胁迫条件下获得。
73.根据项66至72中任一项的方法，其中所述核酸有效连接至衍生自组成型启动子的植物，优选至GOS2启动子，最优选至来自稻的GOS2启动子。
74.根据项66至73中任一项的方法，其中所述编码BZR多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，最优选来自拟南芥。
75.植物或其部分，其包括种子，通过根据项66至74中任一项的方法可获得，其中所述植物或其部分包含编码BZR多肽的重组核酸。
76.分离的核酸分子，其包括任一以下特征：
(i)SEQ ID NO：250、252、254、256中任一个所代表的核酸；
(ii)与SEQ ID NO：250、252、254、256中任一个互补的核酸或其片段；
(iii)编码与SEQ ID NO：250、252、254、256中之一项以增加的优选顺序具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高的序列同一性的BZR多肽的核酸；
(iv)能够在严格条件下与上文(i)、(ii)或(iii)中给出的任一核酸杂交的核酸。
77.分离的多肽，其包括：
(i)氨基酸序列，其与SEQ ID NO：250、252、254、256中之一项以增加的优选顺序具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高的序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)(i)中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
78.构建体，其包含
(i)编码在项66、67或77中定义的BZR多肽的核酸、或根据项76的核酸；
(ii)一个或多个调控序列，其能够驱动(a)的核酸序列的表达；以及任选地
(iii)转录终止序列。
79.根据项78的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
80.根据项13或14的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备相对于对照植物具有提高的种子产量的植物。
81.用根据项78或79的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
82.用于产生相对于对照植物具有提高的种子产量的转基因植物的方法，其包括：
(i)在植物中引入和表达编码如项66、67或77所定义的BZR多肽的核酸、或根据项11的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞；和任选地
(iii)选择具有种子产量的植物。
83.具有提高的种子产量的转基因植物，其产生自如项66、67或77所定义的BZR多肽的编码核酸的受调节表达，或来自所述转基因植物的转基因植物细胞。
84.根据项75、81或83的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、稷、裸麦、黑小麦、高粱和燕麦。
85.根据项84的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是茎干生物量和/或种子。
86.产物，其来自根据项85的植物和/或来自根据项85的植物可收获部分。
87.编码BZR多肽的核酸在相对于对照植物在植物中提高种子产量中的用途。
附图简述
本发明现在将参考以下图进行描述，其中：
图1代表具有保守推定核定位信号的SEQ ID NO：2的序列。
图2代表RHL1多肽的多重比对。
图3显示RHL1多肽的进化系统树。
图4显示用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)调控下编码RHL1的核酸表达的双元载体。
图5显示根据Villalobos等，(2004；Gene 336：93-104)的来自多种来源生物的TGase多肽的进化系统树。用于实施本发明方法的TGase(尤其来自植物)用括号标出，进化枝用圆圈出，箭头指向由SEQ ID NO：45代表的稻TGase多肽。
图6显示在由SEQ ID NO：45代表的多肽中预测至少一个卷曲螺旋结构域的COILS算法的图形结果。X轴代表氨基酸残基定位，Y轴代表卷曲螺旋结构域出现的概率(范围从0到1)，及检测的三条线、三个窗口(14、21、28)。
图7显示来自表2的TGase多肽的AlignX(来自Vector NTI 10.3，Invitrogen Corporation)的多序列比对。N端质体转运肽由垂直条分离自其余多肽(成熟多肽)。推定的钙结合区用被框出，并用在共有序列下的X’s标出。用Coils算法预测到至少一个卷曲螺旋的结构域(和如SEQ IDNO：70所代表的)用在共有序列下的X’s标出。
图8显示用于稻植物中增加在植物中起作用的启动子调控下编码TGase多肽的核酸序列表达的双元载体。
图9代表具有保守基序或结构域的SEQ ID NO：76的序列：如HMMPfam(PF00249.17)鉴定的Myb样DNA结合结构域以粗体表示，由基序12涵盖德序列加下划线。
图10代表多种TRY样多肽序列的多重比对。点表示保守残基，冒号表示高度保守残基并且星号代表最佳保守残基。最高程度的序列保守在DNA结合结构域中发现。
图11代表用于稻中增加在稻RCc3启动子(pRCc3)控制下编码TRY样的核酸表达的双元载体。
图12代表BZR多肽的多重比对。
图13代表用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下编码BZR的核酸表达的双元载体。
实施例
本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是示意性的。以下实施例不意图完全限定或限制本发明的范围。
DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等，(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中描述的标准方案进行。用于植物分子研究工作的标准材料和方法在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS Scientific Publications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell Scientific Publications)(英国)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
实施例1：鉴定与本发明方法中所用核酸序列相关的序列
1.1无根毛1(RHL1)
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由用于本发明的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤程序以略去低复杂性序列启动。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以提高E-值以显示严格性更低的匹配。以这种方式，可以鉴定到短的近乎完全的匹配。
表A1提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A1：RHL1核酸和多肽的实例：
Figure BDA0000047895990001061
在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(TIGR)初步地汇编并且公开披露。可以使用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列进行。
1.2.转谷氨酰胺酶(TGase)
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由本发明核酸序列编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤程序以略去低复杂性序列启动。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以提高E-值以显示严格性更低的匹配。以这种方式，可以鉴定到短的近乎完全的匹配。
表A2提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A2：TGase多肽序列和编码性核酸序列的实例：
Figure BDA0000047895990001081
在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(TIGR；以TA开始)初步地汇编并且公开披露。可以使用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列进行。在其他情况下，已经对特定生物创建了专用核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(JointGenome Institute)。
1.3.Tryptichon(TRY样)
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altsehul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由用于本发明的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤程序以略去低复杂性序列启动。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以提高E-值以显示严格性更低的匹配。以这种方式，可以鉴定到短的近乎完全的匹配。
表A3提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A3：TRY样多肽的实例：
在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(TIGR；以TA开始)初步地汇编并且公开披露。可以使用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列进行。在其他情况下，已经对特定生物创建了专用核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(JointGenome Institute)。此外，登录专利数据库允许新核酸和多肽序列的鉴定。
1.4.BRASSINAZOLE抗性1(BZR1)
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与BZR核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。SEQ NO：2用于TBLASTN算法，在默认设置和没有略去低复杂性序列的过滤程序下。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。
表A4提供了BZR核酸序列和编码其蛋白质名单。
表A4：BZR多肽的实例：
Figure BDA0000047895990001121
实施例2：涉及用于本发明方法的核酸序列的序列比对
2.1.无根毛1(RHL1)
使用渐进比对Clustal W算法(Larking等，Bioinformatics.2007Nov1；23(21)：2947-8.Thompson等，(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等，(2003)，Nucleic Acids Res 31：3497-3500)进行表A的RHL1多肽序列的比对。空位开口罚分的默认值是10，空位延伸罚分是0.1并且所选的权重矩阵是Blosum 62。蛋白质比对在图2a中给出。
使用如Clustal W程序中所提供的邻接法聚类算法构建表A的RHL1多肽序列的进化系统树(图2b)。
2.2.转谷氨酰胺酶(TGase)
使用(来自Invitrogen公司Vector NTI 10.3的)AlignX算法进行表A中全部TGase多肽序列的多序列比对。在本申请的图7中显示比对结果。N端质体转运肽由垂直条分离自其余多肽。推定的钙结合区被框出，并用在共有序列下的X’s标出。用Coils算法预测到至少一个卷曲螺旋的结构域(且如SEQ ID NO：70所代表的)用在共有序列下的X’s标出。
2.3.Tryptichon(TRY样)
使用渐进比对Clustal W2.0算法(Thompson等，(1997)Nucleic AcidsRes 25：4876-4882；Chenna等，(2003)，Nucleic Acids Res 31：3497-3500)进行多肽序列的比对，采用标准设定(慢比对，相似矩阵：Gonnet，空位开口罚分10，空位延伸罚分：0.2)。进行少许手工编辑以优化该比对。TRY样多肽之间的序列保守性基本上在该多肽的DNA结合结构域中，C端和N端通常在序列长度和组成上更为多变。该TRY样多肽在图10中比对。
此比对可用于确定长度为约5到10个氨基酸的保守标签序列。优选使用该蛋白质的保守区域，由星号(同一残基)、冒号(高度保守取代)和点(保守取代)标记出。
2.4.BRASSINAZOLE抗性1(BZR1)
使用来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序进行多肽序列的比对，其中所述AlignX程序基于流行的渐进比对Clustal W算法(Thompson等，(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等，(2003)，Nucleic Acids Res 31：3497-3500)。默认值如下：空位开口罚分10，空位延伸罚分0.1并且所选的权重矩阵是Blosum 62(若比对多肽)。BZR多肽的比对显示在图12中。比对中的序列Pp172161在N和C端中被截短。标出了共有序列中高度保守的氨基酸残基。
在BZR多肽中序列保守基本上是在沿BZR1的N端部分，转录阻抑物结构域。有BZR多肽特征的高度保守的bHLH样DNA结合结构域在图12中突出显示。鉴定到保守氨基酸基序如SAPVTPPLSSP(SEQ IDNO：323：位于共有序列中位点405-415)和VKPWEGERIHE(SEQ ID NO：324：位于共有序列中位点634-644)和DLELTLG(SEQ ID NO：325：位于共有序列中位点656-662)。
实施例3：计算在实施本发明方法中有用的多肽序列之间的总体同一性百分数
3.1.无根毛1(RHL1)
使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需预先比对数据。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。在分割线下半部分显示序列相似性，并且在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
表B1中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线上方以粗体字给出同一性百分数而在对角线下方给出相似性百分数(正常字体)。
与SEQ ID NO：2相比较，在实施本发明方法中有用的RHL1多肽序列之间的同一性百分数可以低至31％氨基酸同一性。
Figure BDA0000047895990001161
3.2.转谷氨酰胺酶(TGases)
使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需预先比对数据。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。在分割线下半部分显示序列相似性，并且在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
表B2中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果(不包括部分多肽序列)。
与SEQ ID NO：44相比较，在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的同一性百分数可以低至26％氨基酸同一性。
表B：在表A的多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的MatGAT结果。
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13
  1.Arath_TGase   36   41   26   31   33   30   24   24   21   23   18   16
  2.Horvu_TGase   49   40   29   61   30   26   28   27   26   27   22   21
  3.Lyces_TGase   58   51   29   36   30   26   28   28   27   28   21   21
  4.Orysa_TGase   42   46   45   28   26   29   67   62   57   62   40   36
  5.Orysa_TGase\H   43   69   47   42   25   23   27   27   26   25   20   20
  6.Picsi_TGAse   49   41   42   43   34   32   24   22   20   21   17   16
  7.Poptr_TGase   50   40   39   45   35   51   31   29   26   28   23   22
  8.Sacof_TGase   40   45   45   75   42   41   44   88   75   81   48   44
  9.Sorbi_TGase   40   46   46   70   41   38   41   91   81   87   49   45
  10.Zeama_TGase\H   34   43   42   64   42   34   37   77   82   93   49   47
  11.Zeama_TGase\III   38   46   44   70   41   37   39   83   88   93   50   46
  12.Zeama_tgz15   32   37   38   49   37   29   34   56   56   58   57   91
  13.Zeama_tgz21   29   34   35   45   34   27   32   52   51   55   53   91
如果比较多肽的最保守区域，可显著提高氨基酸序列同一性百分数。例如，当将SEQ ID NO：2的卷曲螺旋结构域的氨基酸序列(如SEQID NO：27所代表的)与表A的多肽的卷曲螺旋结构域比较时，氨基酸同一性百分数增加到50％。
3.3.Tryptichon(TRY样)
使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需预先比对数据。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。在分割线下半部分显示序列相似性，并且在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
表B3中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线上方以粗体字给出针对全长序列和DNA结合结构域的At5g53200与TRY样多肽间的同一性百分数。
与SEQ ID NO：76相比较，在实施本发明方法中有用的TRY样多肽序列之间的同一性百分数可以低至12％序列同一性。然而当比较DNA结合时，序列保守性更高。表B2显示代表DNA结合结构域的序列(如图9所示与DNA结合结构域比对的序列(SEQ ID NO：76中的残基30-75))间的相似性和同一性。该序列同一性通常高于50％。
表B3A：在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的MatGAT结果。
表B3B：在多肽序列的DNA结合结构域范围内总体相似性和同一性的MatGAT结果。
Figure BDA0000047895990001211
3.4.BRASSINAZOLE抗性1(BZR1)
MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application that generates similarity/identity matrices using proteinor DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定全长BZR多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需预先比对数据。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。在分割线下半部分显示序列相似性，并且在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵：Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
表B中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线上方以粗体字给出同一性百分数而在对角线下方给出相似性百分数(正常字体)。
与SEQ ID NO：239相比较，表B4的BZR多肽序列之间的同一性百分数范围为22.5％至88.2％。
表B4：在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的MatGAT结果。
Figure BDA0000047895990001231
实施例4：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的结构域
4.1.无根毛1(RHL1)
采用MEME系统(Timothy等；1998.Journal of ComputationalBiology，第5卷，第211-221页，1998)；Timothy等，1998.Bioinformatics，第14卷，第48-54页)实施对表A的RHL1中的高度保守序列基序的鉴定。
表C1：如SEQ ID NO：2所代表的多肽序列的MEME扫描结果(主要登录号)
Figure BDA0000047895990001241
＊括号内给出的氨基酸表示在此给出的位点处的任意可能的氨基酸。
＊＊E-值：期望值。具有相当于或好于在随机数据库检索中期望出现的给定评分的评分的不同比对的数量。E-值越低，评分越显著
4.2.Tryptichon(TRY样)
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识(proteinsignatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
在表C2中呈现如SEQ ID NO：76所代表的多肽序列的InterPro扫描结果。
表C2：如SEQ ID NO：76所代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)
  方法   登录号   结构域   起点   终点   E值
  HMMPanther   PTHR10641：SF26   TRIPTYCHON和CPC   32   106   1.20E-60
  HMMPanther   PTHR10641   MYB-相关   32   106   1.20E-60
  Gene3D   G3DSA：1.10.10.60   未描述   31   79   3.60E-08
  HMMPfam   PF00249   Myb_DNA-结合   30   75   5.00E-07
  superfamily   SSF46689   同源域-样   26   79   6.90E-07
  HMMSmart   SM00717   SANT   29   77   3.10E-06
  ProfileScan   PS50090   MYB_样   34   71   6.307
4.3.BRASSINAZOLE抗性1(BZR1)
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多序列比对结果和隐匿马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
在表C3中呈现如SEQ ID NO：239所代表的多肽序列的InterPro扫描结果。与BZR多肽对应的InterPro家族是IPR008540。
表C3：如SEQ ID NO：239所代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。
  数据库   登录号   登录名称   E值   SEQ ID NO：239上的氨基酸定位
  Pfam   PF05687   DUF822   7.199xE-89   10-157
实施例5：TGase第二结构特征的预测
卷曲螺旋通常含有称为heptad重复的重复的七个氨基酸残基模式。卷曲螺旋对于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用，例如寡聚化是重要的，或者对于鉴定相同蛋白质家族是重要的，或对于鉴定不相关蛋白质的蛋白质是重要的。最近在从序列数据库计算性预测卷曲螺旋中取得了重大进展。本领域技术人员熟知的多种算法可获自ExPASy蛋白质工具。其中之一，COILS是比较序列与已知平行双链卷曲螺旋数据库的程序，得到相似性得分。通过比较该得分与得分在总体蛋白质和卷曲螺旋蛋白质中的贡献，然后该程序计算该序列将采用卷曲螺旋构象的可能性。
SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽在检查的所有三个窗口(14、21和28)中有很大可能性具有至少一个预测的卷曲螺旋结构域。在表D1中，显示了残基定位、残基、这三个窗口和对应的可能性值。在图6中是SEQ ID NO：45所代表的多肽上COILS算法的图形结果，其中至少一个预测的卷曲螺旋在所有三个窗口(三条线所代表的)中清楚可见。
表D1：EQ ID NO：45所代表的多肽上COILS算法的数字结果。显示残基定位(#)、残基、这三个窗口和对应的可能性值。大于0.9的可能性显示为粗体。
Figure BDA0000047895990001261
Figure BDA0000047895990001301
Figure BDA0000047895990001311
Figure BDA0000047895990001321
Figure BDA0000047895990001331
实施例6：在实施本发明方法中有用的多肽序列的拓扑结构预测
6.1.转谷氨酰胺酶(TGases)
许多算法可以用来进行多肽的亚细胞定位的预测，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的TargetP 1.1；
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
通过SEQ ID NO：45的多肽序列与亚细胞定位被鉴定到的其他植物物种的直向同源物的比较，有可能推导出SEQ ID NO：45所代表的多肽序列的亚细胞定位是叶绿体(Villalobos等，(2004)Gene 336：93-104)。
6.2Tryptichon(TRY-样)
TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。然而，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、临界值集合(无、预定义的临界值集合或用户指定的临界值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
在表E1中呈现如SEQ ID NO：76所代表的多肽序列的TargetP 1.1分析的结果。选择“植物”生物组别，未定义临界值，并且对转运肽的预测长度提出要求。如SEQ ID NO：76所代表的多肽序列的亚细胞定位可能是细胞质或细胞核，没有预测到转运肽。
表E1：如SEQ ID NO：76所代表的多肽序列的TargetP 1.1分析
  长度(AA)   106
  叶绿体转运肽   0.048
  线粒体转运肽   0.348
  分泌途径信号肽   0.046
  其他亚细胞靶向   0.822
  预测的位置   /
  可靠性级别   3
  预测的转运肽长度   /
当用PSort分析时，核定位的概率为0.700，所以蛋白质可能是核蛋白质。
许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM；
·PSORT(URL：psort.org)
·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
实施例7：与实施本发明方法中有用的多肽序列相关的测定法
7.1.无根毛1(RHL1)的功能测定法
基本上按照Sugimoto-Shirasu等，2005PNAS 102卷51期，18736-18741描述的体外测定法测定RHL1多肽的结合。简言之，在细菌系统中产生重组RHL1蛋白质并使用标准方法纯化。纯化的RHL1蛋白质用DNa片段温育并使用等离振子共振(SPR)探测RHL1蛋白质DNA片段的结合。
7.2.转谷氨酰胺酶(TGases)
用于实施本发明方法的多肽通常在Ca-依赖模式下催化在胺供体底物的伯胺和作为胺受体的蛋白质或多肽中肽键内源谷氨酰胺残基的y-羧酰胺基团间的酰胺键的形成。更具体地，可使用放射性标记腐胺方法、或γ-谷氨酰生物素尸胺方法测定TGases活性，如Villalobos等(2004；上文)所述。
本领域技术人员熟知此类测定TGases多肽酶活性的实验方案，包括如SEQ ID NO：45所代表的TGases多肽的活性。
7.3.Tryptichon(TRY-样)的功能测定法
TRY-样多肽一般具有DNA结合活性。在Xue(A CELD-fusionmethod for rapid determination of the DNA-binding sequence specificity ofnovel plant DNA-binding proteins.Plant Journal 41，638-649，2005)中描述了用于测定和表征多肽的DNA结合属性的一种方法。
实施例8：在本发明方法中使用的核酸序列克隆
8.1.无根毛1(RHL1)
使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增在本发明方法中使用的核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggtacgagcttcatcgtc-3’(SEQ ID NO：40；有义)和5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttctggaaaagatttct ttaagc-3’(SEQ ID NO：41；反义)，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pAath_RHL1。质粒pDONR201作为
Figure BDA0000047895990001361
技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择性标记、可筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于根特异表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：42)位于该Gateway盒上游。
在LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::Arath_RHL1(图3)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
8.2.转谷氨酰胺酶(TGase)
将使用来自不同发育阶段的稻植物的RNA构建的cDNA文库作为模板，通过PCR扩增编码SEQ ID NO：45所代表的TGases多肽序列的稻核酸序列。如下引物，其包括用于Gateway重组的AttB位点，prm02265(SEQ ID NO：73；有义)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggcataccatggacag-3’和prm02266(SEQ ID NO：74；反义，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatttcacctctggcctg-3’。使用HifiTaq聚合酶在标准条件进行PCR。也使用标准方法扩增并纯化预期长度的PCR片段(包括attB位点)。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”。质粒pDONR201作为
Figure BDA0000047895990001371
技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：44的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择性标记、可筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于种子特异性表达的α-球蛋白启动子(SEQ ID NO：72)位于该Gateway盒上游。
在LR重组步骤后，所得的用于种子特异性表达的表达载体pGlob::TGase(图4)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
8.3.Tryptichon(TRY样)
使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增在本发明方法中使用的核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是prm09014(SEQ ID NO：233；有义，起始密码子为粗体字)：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcagg cttaaaca
Figure BDA0000047895990001381
gataacactgaccgtcgt-3’
和prm09015(SEQ ID NO：234；反义，互补)：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttttttcgttggcttaaaaaca-3’，
其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pTRY样。质粒pDONR201作为
Figure BDA0000047895990001382
技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：75的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择性标记、可筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：237)位于该Gateway盒上游。在一备选实施方案中，根特异性启动子(RCc3启动子；SEQ ID NO：235)。
在LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::TRY样(图3)或pRCc3::TRY根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
8.4.BRASSINAZOLE抗性1(BZR1)
使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(在pCMV Sport 6.0内；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增在本发明方法中使用的核酸序列。使用Hifi Taq DNA聚合酶，在标准条件下利用在50μl PCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是：(SEQ ID NO：320；有义)5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgacggcatcaggagga-3’和(SEQ ID NO：321；反义，互补)5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaccacgatattaacctagccg-3’，其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pBZR。质粒pDONR201作为
Figure BDA0000047895990001391
技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQ ID NO：238的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择性标记、可筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：322)位于该Gateway盒上游。
在LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::BZR(图3)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
实施例9：植物转化
稻转化
使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。将粳稻栽培品种日本晴(Nipponbare)的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。无菌的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD600)约1。该混悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸入此混悬液中15分钟。将所述愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中孵育3日。共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下培育4周。在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。在转移这种材料至再生培养基并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且苗在随后4至5周内发育。将苗从愈伤组织切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中于高湿度和短日照下培育。
对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留显示所述选择剂抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移栽后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996，Chan等，1993，Hiei等，1994)。
谷物(corn)转化
玉米的转化用Ishida等，(1996).Nature Biotech 14(6)：745-50所述方法的改良形式进行。在谷物中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材料的良好来源，不过也可以成功地使用其他基因型。谷穗从授粉后大约11日(DAP)的谷物植物收获，此时不成熟的胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟的胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。将切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，不过可以使用不同的选择性标记)。培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至苗发育。将来自每个胚的绿色苗转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室中的土壤内。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
小麦转化
用Ishida等，(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行小麦的转化。栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化。将不成熟的胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育，并且通过器官发生过程回收转基因植物。与农杆菌孵育后，将所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后于再生培养基上体外培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但是可以使用多种选择性标记)。培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至苗发育。将来自每个胚的绿色苗转移至生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室中的土壤内。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
大豆转化
根据Texas A&M美国专利5,164,310中描述的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种适合通过这种方法转化。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。将大豆种子消毒用于体外播种。从7日龄的年幼幼苗切除下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和剩余的子叶以发育腋生结节。切下这些腋生结节并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养基。切下再生的苗并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室中的土壤内。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
油菜籽/卡诺拉油菜转化
使用5-6日龄的年幼幼苗的子叶柄和下胚轴作为组织培养用外植体并且根据Babic等，(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。商业品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，不过也可以使用其他品种。将卡诺拉油菜种子表面消毒用于体外播种。从所述体外幼苗切下带有子叶的子叶柄外植体，并且通过将该叶柄外植体的切口末端浸入细菌悬液用(含有表达载体的)农杆菌接种。所述外植体随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗的长度是5-10mm时，切下这些苗并且转移至苗伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室中的土壤内。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
苜蓿转化
使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。所述外植体在黑暗中于含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。所述外植体在半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺种在不含乙酰丁香酮而含有抑制农杆菌生长的合适选择剂和合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基。随后在半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发体细胞胚。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。T1种子从显示选择剂耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生。
棉花转化
使用根癌农杆菌，根据US 5159135中所述的方法转化棉花。棉花种子在3％次氯酸钠溶液中作20分钟表面消毒并在含500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。随后将种子转移至含有50μg/m苯菌灵的SH培养基用于萌发。取下4至6日龄幼苗的下胚轴，切成0.5cm小片并置于0.8％琼脂上。农杆菌混悬液(每毫升大约108个细胞，从含有用目的基因和合适选择性标记转化的过夜培养物稀释)用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3日后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l脱乙酰吉兰糖胶)，所述固体培养基含有具维生素B5的Murashige和Skoog盐(Gamborg等，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))、0.1mg/l 2，4-D、0.1mg/l 6-呋喃甲基氨基嘌呤和750μg/ml MgCL2以及杀死残留细菌的50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素。单个细胞系在2至3个月(每隔4至6周传代培养)后分离并且在用于组织增殖的选择培养基上进一步培育(30℃，16小时光周期)。转化的组织随后在非选择培养基上进一步培育持续2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长度的外观健康胚转移至含有精细蛭石中具SH培养基的管内，所述SH培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-呋喃甲基氨基嘌呤和赤霉酸。在30℃以16小时光周期培育胚，并且将处于2至3叶期的小植物转移至具有蛭石和养分的花钵。植物硬化并随后移至温室以进一步培育。
实施例10：表型评价方法
10.1评价建立
产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育并收获T1种子。留下6个事件，其中T1子代以3∶1比例对所述转基因的存在/不存在分离。对于这些事件中的每个事件，通过监测目视标记表达选出大约10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。以随机位置并排生长转基因植物和对应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。在非胁迫条件下培育的植物以规律的间隔期浇水，以确保水和养分不是限制性，以满足植物完全生长和发育的需要。
4个T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，但是每个事件采用更多个体。植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048×1536像素，1600万颜色)。
干旱胁迫
来自T2种子的植物在盆栽土壤中在正常条件下生长直至它们接近齐穗期。随后将它们转移至灌溉减少的“干燥”区。将湿度探测器插入随机选择的花钵内，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。栽培的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如对正常条件下详述那样记录生长和产量参数。
氮利用效率筛选
来自T2种子的稻植物在盆栽土壤中在除营养液之外的正常条件下生长。从移植至成熟期间用含有降低的、通常7至8倍之间更少的氮(N)含量的特定营养液浇灌所述花钵。栽培的剩余部分(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下培育的植物相同。如对正常条件下详述那样记录生长和产量参数。
盐胁迫筛选
植物在由椰子纤维和argex(3∶1比率)组成的基质上培育。在温室中移植小植物后，在头两周期间使用正常营养液。在这两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。随后测量种子相关参数。
10.2统计分析：F-检验
使用两因素ANOVA(变量分析)作为总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。对于该F检验而言，真实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。显著性F检验值指出了基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
因为实施了具有重叠事件的两个实验，故进行联合分析。这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且如果一致，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的可信度。所用的方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。通过比较似然比检验与卡方分布获得P-值。
10.3测量的参数
生物量相关的参数测量
植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048×1536像素，1600万颜色)。
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上与背景区别的像素总数而确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经达到其最大叶生物量的时间点处所测量的面积。早期生长势是萌发后3周的植物(幼苗)地上部分面积。根生物量的增加表述为总根生物量的增加(测量为植物寿命期间所观察到的根最大生物量)；或表述为根/冠比增加(测量为根和苗的活跃生长期间根质量与苗质量之间的比例)。
早期生长势通过计数来自植物地上部分的与背景区别的像素总数确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正转化成以平方mm表述的物理表面值。下述结果是针对萌发后3周的植物。
种子相关的参数测量值
将成熟的原发花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37°干燥3日。随后将所述花序脱粒，并且收集和计数全部种子。使用吹气装置将饱满粒与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。饱满粒在分析天平上称重。通过计数分离步骤后仍留下的饱满粒的数目确定饱满种子数。种子总产量通过称量从一株植物收获的全部饱满粒测量。每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的壳数测量。千粒重(TKW)从计数的饱满种子数及它们的总重量外推出来。本发明中的收获指数(HI)定义为种子总产量与地上部分面积(mm2)之间的比率乘以系数106。如本发明中定义的每花序总花数是种子总数与成熟原发花序数之间的比率。如本发明中定义的种子饱满率是饱满种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
实施例11：转基因植物的表型评价结果
11.1.无根毛1(RHL1)
下文呈现了在实施例8的氮限制生长条件下表达Arath RHL1核酸(SEQ ID NO：1)的编码区域的T2代中转基因稻植物的评价结果。观察到出苗生长势(早期生长势，EmerVigor)、总种子产量(totalweightseeds)、饱满种子数(Nr filled seeds)、收获指数(harvestindex)、根生物量(Rootmax)和植物上总种子数(nrtotalseed)提高至少5％(表F1)。
表F1.氮限制生长条件下表达Arath RHL1基因的转基因植物的评价
  参数   相对于对照植物，转基因植物中的提高％
  EmerVigor   19
  RootMax   7.6
  totalweightseeds   17
  Nr filled seeds   16
  harvestindex   12
  nrtotalseed   11
下文呈现了在非胁迫条件下表达来自组成型启动子GOS2(SEQ IDNO：39)的Orysa_RHL1核酸(SEQ ID NO：9)的编码区域的T1代中转基因稻植物的评价结果(表F2)。
表F2.非胁迫条件下表达Orysa_RHL1核酸的转基因植物的评价
  参数   相对于对照植物，转基因植物中的提高％
  AreaMax   8.1
  TimetoFlower   1.25
  RootMax   3.6
  totalwgseeds   16.19
  nrfilledseed   14.9
  fillrate   5.7
  harvestindex   10.0
  HeightMax   2.6
  GNbfFlow   7.4
  nrtotalseed   8.6
表F3中显示了表达由根特异性启动子Rcc3(SEQ ID NO：40)驱动的Orysa_RHL1核酸(SEQ ID NO：9)的编码区域的T1代转基因稻植物，在如上文中所述的氮限制条件下生长的氮利用效率筛选的评价结果。出苗生长势(也指早期生长势)是与植物，尤其在早期的发育出苗阶段的植物生长势直接关联的产量性状。
表F3.非胁迫条件下表达Orysa_RHL1核酸的转基因植物的评价
  参数   相对于对照植物，转基因植物中的提高％
  EmerVigor   16.6
  totalwgseeds   12
  nrfilledseed   15
11.2.转谷氨酰胺酶(TGases)
下文呈现了在种子特异性启动子的调控下表达编码如SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽的核酸序列且在正常生长条件下生长的T1和T2代转基因稻植物的评价结果。
与对应的失效合子(对照)相比，转基因植物在早期生长势、地上生物量、每株植物总种子产量、总种子数、饱满种子数、种子饱满率和转基因植物的收获指数方面有显著提高，如表F4所示。
表F4.在用于种子特异性表达的启动子的调控下表达编码如SEQ ID NO：45所代表的TGase多肽的核酸序列的T1和T2代转基因稻植物的评价结果
Figure BDA0000047895990001481
11.3.Tryptichon(TRY样)
在RCc3启动子的调控下表达TRY样核酸且在降低的氮可利用性条件下生长的转基因稻植物的评价结果显示了提高至少5％的出苗生长势(早期生长势)、饱满率、收获指数和总种子产量。在T1代植物及T2代植物中观察到这些提高。
下表E和F中分别呈现了在组成型启动子的调控下表达编码SEQ IDNO：76的TRY多肽的核酸且在非胁迫条件下生长的T1和T2代植物中转基因稻植物的评价结果。在非胁迫条件下生长时，在T1中观察到至少提高5％的种子产量(总种子重、饱满种子数、总种子数)。
表F5：用pGOS2::TRY构建体转化的转基因稻植物的数据摘要；对每个参数，针对T1代显示总体百分比提高，每个参数的p-值≤0.05。
  参数   总体百分比提高
  总种子数   8.7
  总种子重   17.3
  饱满种子数   14.5
在T2代中，发现地上生物量(AreaMax and firstpan)、早期生长势和种子产量方面有显著提高(≥5％)；详见表F：
表F6：用pGOS2::TRY构建体转化的转基因稻植物的数据摘要；对每个参数，针对T2代显示总体百分比提高，每个参数的p-值≤0.05。
  参数   总体百分比提高
  AreaMax   5.0
  EmerVigor   20.2
  firstpan   8.3
  总种子重   8.8
  饱满种子数   7.5
11.4.BRASSINAZOLE抗性1(BZR1)
下文呈现了在非胁迫条件下表达SEQ ID NO：1的BZR核酸的编码区域的转基因稻植物的评价结果。与对照(对应的失效合子)相比，观察到在总种子产量、每株植物饱满种子数、种子饱满率和收获指数方面至少5％的提高，和超过2.5％的提高的千粒重(表F7)。
表F7
Figure BDA0000047895990001491
Figure IDA0000047896070000011
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Figure IDA0000047896070003041

Claims (20)

1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，其包括调节植物中编码无根毛多肽的核酸的表达，和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述无根毛多肽包含以下一项或多项：
(i)与表A的任意多肽的氨基酸序列以增加的优选顺序具有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列；
(ii)与基序1：[IV]R[RK][KG][SG]QRK[NS][RK][FY]LFSFPGLLAP(SEQ ID NO：29)的氨基酸序列以增加的优选顺序具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(iii)与基序2：SGG[KR][IV]G[ED]L[KA]DL[GD]TKNP[ILV]LYLDFPQG[RQ]MKL](SEQ ID NO：30)的氨基酸序列以增加的优选顺序具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(iv)与基序3：TP[VS]RQSARTAGKK[FL][KN][FY][AT]ExSS(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列以增加的优选顺序具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(v)与基序4：GTK[ED]ENPEE[LA][RK]L[DE]FPKE[LF]Q[ENQ][GD](SEQ ID NO：32)的氨基酸序列以增加的优选顺序具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(vi)与基序5：[SN][GN][NL]L[LQV][SR][EDG]xP[AS][KA]PR[SA][APS]LAPSK[TAG]VL[KR][HL][HQ]G[KR]D(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列以增加的优选顺序具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(vii)与基序6：HA[ED][CY]DFKGGAGAA[CS]D[ES][KA]Q(SEQID NO：34)的氨基酸序列以增加的优选顺序具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(viii)与基序7：[KSN][KEP]P[GEK][EKT][KTE][YT][VT][EG][EPST][ELQ]SP[KE][IT][ED][SLV][ED][DI][DV][LS]S[ED][DE][SD][NDS][LD]K[DK](SEQ ID NO：35)的氨基酸序列以增加的优选顺序具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序；
(ix)与基序8：KG[PA]AAKKQRASP[EM][EA]K[HQ]P[TA]G[KI]K(SEQ ID NO：36)的氨基酸序列以增加的优选顺序具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的基序。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中引入并表达编码无根毛多肽的核酸实现。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码无根毛多肽的核酸编码表A1中所列的任一蛋白质，或是这种核酸的部分，或是能够与这种核酸或其互补序列杂交的核酸。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述的核酸序列编码表A1中给出的任意蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述的增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的种子产量。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述的增强的产量相关性状在缺氮的培育条件下获得。
8.根据权利要求3至7中任一项的方法，其中所述的核酸有效连接至组成型启动子，优选有效连接至GOS2启动子，最优选有效连接至来自稻的GOS2启动子。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述的编码无根毛多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，最优选来自拟南芥。
10.根据前述权利要求中任一项的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码无根毛多肽的重组核酸。
11.构建体，其包含：
(i)编码权利要求1、2或3中任一项中定义的无根毛多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
12.根据权利要求11的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选是GOS2启动子，最优选是来自稻的GOS2启动子。
13.根据权利要求11或12的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的种子产量。
14.植物、植物部分或植物细胞，其由根据权利要求11或12的构建体转化。
15.用于产生相对于对照植物具有提高的产量、尤其提高的种子产量的转基因植物的方法，其包括：
(a)在植物中引入并表达权利要求1或2中定义的无根毛多肽的编码核酸；和
(b)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞；和任选地
(c)选择具有增强的产量相关性状的植物。
16.转基因植物，其相对于对照植物具有提高的产量、尤其是提高的生物量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞，所述提高的产量、尤其是提高的生物量由权利要求1或2中所定义无根毛多肽的编码核酸的受调节表达引起。
17.根据权利要求10、14或16中任一项的转基因植物，或从其中衍生的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，或单子叶植物，或谷物植物，如稻、玉米、小麦、大麦、稷、黑麦、小黑麦、高粱和燕麦。
18.根据权利要求17的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选是茎干生物量和/或种子。
19.产物，其来自根据权利要求17的植物和/或从根据权利要求18的植物的可收获部分。
20.编码无根毛多肽的核酸在相对于对照植物提高植物中产量，尤其提高茎干和/或生物量中的用途。
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