CN113444731A - 一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1及其应用 - Google Patents

一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1及其应用。属于基因工程技术领域。本发明筛选克隆到了参与花青素合成的MYB转录抑制因子：LrETC1，其基因cDNA共240bp，编码79个氨基酸；通过蛋白序列数据库分析显示属于R3类MYB转录因子。多重序列比对和进化树分析表明其属于AtCPC‑like类转录抑制因子。是定位于细胞核中的没有激活功能的转录因子。通过农杆菌介导的遗传转化获得LrETC1转基因拟南芥株系，与野生型相比，种子的种皮呈现出浅棕色，在高蔗糖浓度胁迫条件下的拟南芥幼苗无色素积累且相关结构基因的表达水平显著下调。

Description

一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1及 其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1及其应用。
背景技术
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murry.)属茄科(Solanaceae)枸杞属落叶多棘刺灌木，其营养丰富，药食兼得，因其富含大量的花青素受到人们广泛关注。花青素具有较强的抗氧化活性，不仅可以帮助植物抵御胁迫环境，而且对促进人类健康也大有脾益。
转录因子，也称为反式作用因子，通常指由基因编码的一类蛋白质，能够与基因启动子区域的相关顺式作用元件特异性结合来激活或抑制基因的表达，从而提高植物对环境的适应性。在花青素的代谢调控中MYB转录因子起着重要的作用，虽然已有研究结果报道了黑果枸杞中几个正调控花青素合成的MYB转录因子，但是关于抑制其花青素合成的MYB转录因子还未见报道。
因此，如何提供一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。
本发明还提供了一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1的基因，基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了包含上述转录抑制因子LrETC1基因的重组载体。
本发明还提供了包含上述转录抑制因子LrETC1基因或上述重组载体的重组菌株。
本发明还提供了上述转录抑制因子LrETC1或上述的基因在枸杞育种中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1及其应用，相较于现有技术通过黑果枸杞的转录组数据，根据注释结果和MYB转录因子的表达量差异，筛选克隆到了参与花青素合成的MYB转录抑制因子：LrETC1，其基因cDNA共240bp，编码79个氨基酸；通过蛋白序列数据库分析显示含有1个保守的MYB-DNA-binding结构域，属于R3类MYB转录因子。多重序列比对和进化树分析表明其与其他物种中与花青素合成相关的MYB转录抑制因子聚在一类，属于AtCPC-like类转录抑制因子。
qRT-PCR分析显示LrETC1在黑果枸杞的各个组织中均有表达，并随着果实的成熟而表达水平逐渐升高。亚细胞定位和转录活性检测实验表明，LrETC1是定位于细胞核中的没有激活功能的转录因子。
构建植物过表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化获得LrETC1转基因拟南芥株系，与野生型相比，种子的种皮呈现出浅棕色，在高蔗糖浓度胁迫条件下的拟南芥幼苗无色素积累且相关结构基因的表达水平显著下调。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的目的基因LrETC1凝胶电泳结果图。
图2附图为本发明提供的LrETC1蛋白亲疏水性分析图。
图3附图为本发明提供的LrETC1蛋白的跨膜结构域图。
图4附图为本发明提供的LrETC1信号肽预测图。
图5附图为本发明提供的蛋白的三级结构预测图。
图6附图为本发明提供的LrETC1蛋白与其他物种中与花青素合成途径相关的MYB蛋白的系统发育树分析。
图7附图为本发明提供的LrETC1的氨基酸序列与其他物种中相似的MYB蛋白的多序列比对。
图8附图为本发明提供的LrETC1亚细胞定位载菌液PCR鉴定。
图9附图为本发明提供的LrETC1蛋白的亚细胞定位图，其中GFP：GFP荧光；DAPI：核酸染料；Bright：明场；Merged：明场、绿色荧光以及蓝色荧光的叠加。
图10附图为本发明提供的LrETC1的转录活性分析图，其中，由左至右依次为：一缺培养基、三缺培养基和涂有X-α-Gal染液的三缺培养基。
图11附图为本发明提供的LrETC1在黑果和白果枸杞果实的表达量分析图。
图12附图为本发明提供的转基因拟南芥T0代种子筛选图。
图13附图为本发明提供的野生型和转基因拟南芥T1代种子表型图。
图14附图为本发明提供的6％蔗糖胁迫拟南芥幼苗图。
图15附图为本发明提供的花青素合成中结构基因的表达水平。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1及其应用。
实施例中涉及的部分试剂和原料如下：
(1)植物材料：采集于宁夏回族自治区宁夏农林科学院枸杞资源苗圃的黑果枸杞和白果枸杞果实；本实验保存的普通烟草、本氏烟草以及拟南芥Col-0。
(2)载体：克隆载体5minTM TA/Blunt-Zero Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；亚细胞定位载体P1300-GFP，酵母PGBKT7载体，载体PCM1307。
(3)菌株：从北京擎科生物科技有限公司购入的大肠杆菌DH5α；酵母AH109，农杆菌GV3101。
主要试剂见下表1：
表1
Figure BDA0003122428560000031
Figure BDA0003122428560000041
溶液和培养基配方：
酶解液：将加入了1.5％(wt/vol)纤维素酶R10、0.4％(wt/vol)离析酶R10、0.4M甘露醇和20mM KCl的20mM MES(pH 5.7)溶液置于55℃的恒温水浴锅中水浴10min，以使得DNA酶和蛋白酶失活，并提高酶的溶解性。将加热完的酶液取出冷却至室温(25℃)，并加入10mMCaCl2和0.1％BSA。酶液现配现用。
WI溶液：将0.5M甘露醇和20mM KCl加入到4mM MES(pH 5.7)的溶液中即可。配置好的溶液可于室温下保存(22–25℃)。
W5溶液：将154mM NaCl、125mM CaCl2以及5mM KCl加入到2mM MES(pH 5.7)溶液中即可。配置好的溶液可于室温下保存。
MMG溶液：将0.4M甘露醇和15mM MgCl2加入到4mM MES(pH 5.7)溶液中即可。配置好的溶液可于室温下保存。
PEG-Ca转染液：将0.2M甘露醇和100mM CaCl2加入到ddH2O完全溶解的20–40％(wt/vol)PEG4000溶液中即可。
10×TE：0.1M Tris-HCl 10mL，10mM EDTA 2mL，加水至100mL。121℃，灭菌20分钟。
10×LiAC：1M LiAC(称取3.3g无水醋酸锂溶于40mL水中，调PH到7.5，定容至50mL，过滤灭菌)。
1×TE/LiAC：10×TE 0.1mL，10×LiAC 0.1mL，加水至1mL。
40％PEG转化液：50％PEG溶液0.8mL，10×TE 0.1mL，10×LiAC 0.1mL。
YPAD培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，40％葡萄糖溶液50mL(115℃，单独灭菌15分钟)，琼脂20g/L(固体培养基)，0.2％的Adenine溶液15mL(待培养基冷却至60℃左右时加入)，121℃，灭菌20分钟。
缺陷培养基：Nitrogenbase medium 26.7g/L，Amino acid mix Xg/L(试剂盒，根据配制培养基的体积加入相应的量)，调PH＝5.8，再加入琼脂20g/L，121℃，灭菌15分钟。待培养基冷却至60℃左右时加入0.2％的Adenine溶液15mL和40％葡萄糖溶液50mL。
LB培养基：氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂(固体)12.5g/L，121℃高压灭菌20min。
YEB培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，蔗糖5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，琼脂(固体)12.5g/L，121℃高压灭菌20min。
侵染液：MS粉末2.215g/L，蔗糖30g/L，乙酰丁香酮200μmol/L(待培养基冷却至60℃左右加入)，调PH＝5.2，121℃高压灭菌20min。
共培养基：MS粉末4.43g/L，蔗糖30g/L，6-BA 1mg/L，NAA 0.1mg/L，琼脂7g/L，乙酰丁香酮200μmol/L，调PH＝5.8，121℃高压灭菌20min。
诱导分化培养基：MS粉末4.43g/L，蔗糖30g/L，6-BA 1mg/L，NAA 0.1mg/L，琼脂7g/L，调PH＝5.8，121℃高压灭菌20min。待培养基冷却至不烫手时加入潮霉素5mg/L，cef300mg/L。
生根培养基：MS粉末4.43g/L，蔗糖30g/L，调PH＝5.8，121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至不烫手时加入潮霉素5mg/L，cef300 mg/L。
拟南芥花序侵染液配方：2.215g/L MS粉末，2％蔗糖，121℃灭菌20min，待培养基冷却至室温后加入终浓度为0.02％～0.03％的Silwet溶液。
在此，不再一一赘述。
实施例1
DNA的提取、RNA的提取参见试剂盒说明书，采用常规方式操作。
单链cDNA的合成：以黑果枸杞果实的总RNA为模板，利用Takara的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)给出的实验步骤进行单链cDNA合成。
LrETC1基因的克隆：扩增引物序列见表2，将引物稀释到10μM，以获得的cDNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系如下表3所示。
表2
Figure BDA0003122428560000051
表3
Figure BDA0003122428560000061
扩增完成后，将PCR产物取出进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳7min左右在紫外凝胶成像仪下进行观察，若目的条带单一且大小正确，将其凝胶块切下置于2mL的离心管中，用天根通用性DNA纯化回收试剂盒的操作步骤进行胶回收。
连接、转化大肠杆菌
将胶回收产物LrETC1的基因片段连接T克隆载体，反应体系如下表4：
表4
Figure BDA0003122428560000062
反应结束后，将离心管置于冰上，使用热激法转化大肠杆菌DH5α，步骤如下：
(1)将连接产物加入到装有50μl大肠杆菌感受态DH5α的1.5mL离心管中，用移液枪迅速轻柔吹打混匀，于冰上静30min。
(2)静置完成后，将离心管放入42℃水浴锅内，热激1min后，立即置于冰上2min。之后再加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，200rpm，37℃摇床中摇1h左右。
(3)取出，5500rpm离心2min，在超净工作台中弃掉大部分上清液，混匀剩余的菌液，涂布在含有相应抗生素的LB固体培养基上，倒置于37℃恒温培养箱中过夜。
(4)次日，取出平板，于超净工作台中挑取单菌落到已加入1mL的LB(含抗生素)液体培养基中，37℃摇床中摇1～2h。用T克隆载体的通用引物M13-F和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，反应体系如下表5：
表5
Figure BDA0003122428560000063
Figure BDA0003122428560000071
大肠杆菌质粒DNA的提取
将菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将条带大小正确的阳性菌液吸出200μl送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果与目的基因序列进行比对，无误后，再吸取20μl菌液到10ml的LB液体培养基中(含抗生素)，于37℃摇床中，200rpm过夜培养。
次日，待菌液有一定的浓度后，取出，于超净工作台中吸取1mL的菌液到1.5mL离心管中，加入甘油混匀，置于-80℃冰箱保存。将剩余的菌液按照天根的质粒小提试剂盒给出的步骤提取质粒。
实施例2
通过NCBI上的ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线搜索工具搜索LrETC1转录因子的开放阅读框和推导出的氨基酸序列。利用在线软件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对转录因子的氨基酸组成、蛋白的分子量、理论等电点和稳定性进行预测。利用在线软件ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白的疏水性和电荷分布情况。使用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)软件分析LrETC1蛋白的跨膜结构域。利用Cell-PLoc2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测蛋白的信号肽。利用Wolf Psort(https://www.genscript.com/wolf-psort.htmL)和在线软件(https://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)来预测蛋白质的亚细胞定位。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_aut omat.pl？page＝/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对蛋白质分别进行二级和三级结构预测。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL＝1)分析保守结构域。利用DNAMAN 8.0对LrETC1与其它物种的同源序列进行比对，并使用MEGA7.0软件以Neighbor-Joining method(NJ)法构建系统进化树。
重组载体的构建：
目的基因同源重组片段的克隆
以上述实施例中获得的cDNA溶液为模板，使用表2中的相应引物进行LrETC-GFP的同源重组片段扩增，扩增体系见下表6：
表6
Figure BDA0003122428560000072
Figure BDA0003122428560000081
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和胶回收，-20℃保存备用。
载体酶切反应
亚细胞定位载体使用实验室保存的pCAMBIA 1300-GFP，使用酶切位点BamHI和XbaI进行双酶切。酵母杂交载体使用本实验室保存的PGBKT7，使用酶切位点ECORI和BamHI进行双酶切。酶切体系见下表7：
表7
Figure BDA0003122428560000082
将酶切产物进行琼脂糖电泳验证载体是否切开，切下的条带是否是预计的大小以保证酶切的正确性。确保正确后切下载体胶块，利用通用型DNA纯化回收试剂盒回收，将回收的载体于-20℃保存备用。
同源重组连接片段和载体
将克隆的带有同源臂的目的片段与切开的相应载体进行同源重组连接，构建带有LrETC1-GFP的亚细胞定位载体以及带有GAL4BD-LrETC1的PGBKT7酵母重组BD载体。
同源重组连接反应体系见下表8：
表8
Figure BDA0003122428560000083
重组载体转化大肠杆菌DH5α
将构建好的带有目的片段的亚细胞定位载体：LrETC1-GFP以及带有目的片段的PGBKT7载体：GAL4BD-LrETC1从PCR仪中取出，立即置于冰上，转化大肠杆菌DH5α，转化方法同上述实施例。次日，待菌落长出后进行常规菌落PCR鉴定和测序，确认载体构建成功。
将GAL4BD-LrETC1的阳性菌液进行质粒小提(参见试剂盒说明书，常规处理)。
将LrETC1-GFP的阳性菌液100μl加入到含有200mL的LB(含卡那霉素)液体培养基中，摇24h，待菌液呈现出一定浓度后，使用天根的无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒大提，得到高浓度高纯度的质粒用于后续的原生质体转化实验。
原生质体的提取
(1)将生长3～4周(通常已具有5～7片真叶)的嫩绿、厚实、生长状态良好的烟草叶片剪下，置于干净的滤纸上，立即蘸取少量的金刚砂轻柔快速的摩擦叶片下表皮，直至叶片光滑并有轻微的组织液渗出，用锋利的刀片将叶片切成5×5mm的小块，立即快速而温和的将其平铺于配置好的新鲜酶解液中(使磨去下表皮的一面朝下)，以便叶片能充分接触酶解液而被充分消化。
(2)用锡纸包裹装有酶解液的培养皿，置于37℃恒温摇床中黑暗震荡培养2～3h。期间，每隔1h观察其消化的情况，可以轻轻旋转酶溶液，发现酶溶液逐渐变为绿色，表明原生质体已开始释放。
(3)待酶解溶液已经变为很浓的绿色且叶片也变得比较透明，用镊子轻轻的取出未被消化的叶片，吸取20μl于载玻片上，显微镜下检查原生质体的释放情况。
(4)确定原生质体的质量和浓度可用于后续实验时，将裂解完成的溶液轻轻转移至50mL的平底离心管中，用等体积的W5溶液稀释原生质体溶液。100g离心2min，尽可能多的去除上清液后，加入3～5mL左右的W5溶液，温和旋转离心管，重悬沉淀在管底的原生质体。
(5)吸取20μl重悬后的原生质体溶液于细胞计数器中观察原生质体的浓度，在100X镜下可观察到2×105个左右。将原生质体溶液于冰上静置30min。
(6)将离心管于100g离心1min，去除上清液(尽量不要接触原生质体)，加入2mLMMG溶液，温和旋转离心管，重悬并混匀原生质体。冰上放置用于后续的转化实验。
原生质体的转化步骤(DNA-PEG-Ca转化法)：
(1)向2mL离心管中加入10μl(10～20μg)的重组亚细胞定位质粒DNA，加入100μl重悬混匀于MMG溶液中的原生质体，温和旋转离心管混匀。
(2)向离心管中加入110μl新鲜的PEG-CaCl2溶液，轻敲离心管壁使其混合均匀。室温孵育6min。孵育结束后，加入440μl的W5溶液，温和颠倒离心管，终止转染过程。100g离心2min，去除上清液。加入1M W5溶液清洗原生质体，100g离心2min，去除上清液。
(3)向6孔细胞培养皿的表面涂上0.1％BSA(已灭菌)溶液，避免原生质体黏附在培养皿表面。将用WI溶液重悬的原生质体轻轻转移至培养皿中，裹上锡纸，25℃黑暗条件下过夜培养。
显微镜观察GFP荧光信号
(1)将过夜培养的原生质体从细胞培养皿中转移至2mL离心管中，100g离心2min，去掉大部分上清液，轻旋离心管重悬原生质体。
(2)吸取已转化的原生质体溶液于载玻片上，于荧光显微镜下观察下GFP荧光信号。
(3)为了确定细胞核的位置，对原生质体进行DAPI染色。即将等体积的原生质体溶液和即用型DAPI溶液混匀，避光于冰上染色5～10min，用1×磷酸缓冲液PBS稀释原生质体，终止染色。吸取已被DAPI染色的原生质体于载玻片上，于于荧光显微镜下观察下蓝色荧光信号。
酵母转化
(1)将酵母AH109菌株于YPAD培养基上划板，28℃恒温培养箱中倒置培养3天。待菌落长出后，于超净工作台中挑取单菌落至含有5mL YPAD液体培养基的锥形瓶中，置于28℃恒温摇床中过夜培养。
(2)次日上午，向锥形瓶中加入10倍体积的新鲜YPAD液体培养基，继续培养至OD为0.3～0.6。待培养至合适的浓度时，将其取出，于超净工作台中倒入50mL的离心管中，室温5000rpm离心5min。
(3)倒掉离心管中的液体，用20mL无菌水重悬，室温5000rpm离心5min。
(4)按需配制1×TE/LiAC溶液(现配现用)。倒掉离心管中的液体，用1mL 1×TE/LiAC溶液清洗至2mL离心管中，室温离心3min。用300μl～500μl 1×TE/LiAC溶液重悬。至此酵母感受态已制作完成。
(5)向2mL离心管中依次加入5μl的质粒DNA、10μl的鲑精DNA(用之前用沸水煮10min后置于冰上)和100μl酵母感受态，混匀。28℃摇床震荡培养30min。之后再将离心管置于42℃水浴锅中水浴15min，中间混匀一次。
(6)取出离心管，室温瞬时离心收集酵母沉淀，再用1mL无菌水重悬，5000rpm离心1min。弃上清，加入100μl的无菌水(视浓度而定)重悬，取50μl重悬液涂布于一缺培养基(SD/-Trp)上，28℃恒温培养箱中倒置培养3天。
(7)酵母菌点板：将长出的单菌落挑取至30μl的无菌水中，重悬，吸取2μl分别点在酵母一缺(SD/-Trp)和三缺培养基(SD/-Trp/-His/-Ade)上。28℃恒温培养箱中倒置培养3天后进行拍照。
实时荧光定量PCR分析
根据克隆得到的LrETC1基因序列，利用表2引物序列，将按照实施例1方法得到的各个组织的cDNA溶液稀释4倍，采用Vazyme高特异性SYBR染料法定量PCR检测试剂盒的步骤进行操作，在Bio-Rad CFX96TM实时PCR检测系统中进行PCR反应，反应体系如下表9：
表9
Figure BDA0003122428560000111
qPCR的结果采用2-ΔΔCt方法计算出基因的相对表达水平，每次实验设置3个生物学重复。
结果表明：
以cDNA为模板，进行PCR扩增，得到大小240bp的条带，连接T克隆载体，使用通用引物测序，测序结果与转录组得到的基因序列基本一致，确定为目的基因片段。凝胶电泳结果如图1所示：
LrETC1基因的生物信息学分析：LrETC1的基因开放阅读框(ORF)为240bp(ATGGCTGATTTGGACCGTTCAAGCACATCAGATAAATCCTTTATGGACTCGTCAGCCGCATTTGAGGCCAACAACGTAGAAACCTCGAAGCTTGAATTTTCAGAAGACGAGGAAATCCTCGTTACTAAAATGTTCAACTTGGTTGGTGAGAGGTGGTCATTAATTGCTGGAAGAATTCCAGGTAGAACTGCAGAGGAAATTGAGAAGTACTGGAACTCAAGACACTCTACCAGCCAGTAA，如SEQ ID No.1)，编码79个氨基酸(MADLDRSSTSDKSFMDSSAAFEANNVETSKLEFSEDEEILVTKMFNLVGERWSLIAGRIPGRTAEEIEKYWNSRHSTSQ*如SEQ ID No.2)。
LrETC1编码的蛋白的亲疏水性分析、跨膜分析和三级结构预测：
采用在线软件ProtParam和ProtScale分析显示理论分子量为8978.86D，理论等电点为4.64，蛋白质不稳定系数为61.61，表明该蛋白是一个不稳定蛋白，平均亲水性为(GRAVY)为-0.671(表10)，表明该蛋白为亲水性蛋白(图2)。
表10
Figure BDA0003122428560000121
采用TMHMM和SignalP 4.1预测LrETC1蛋白(图3、图4)都没有跨膜区域和信号肽，表明蛋白属于非跨膜蛋白和非分泌蛋白。
利用SOPMA预测LrETC1蛋白的次级结构包括50.63％的α螺旋，8.86％的β转角，7.59％的β片层和32.91％的无规卷曲(表11)。
表11
Figure BDA0003122428560000122
利用SWISS-MODEL构建LrETC1蛋白的三级结构模型与WER转录因子的相似性为40.74％(参见图5)。
(3)利用SMART进行蛋白的保守结构域分析，结果显示LrETC1仅具有一个从29位到77位的一段R3保守结构域，因此可以得出LrETC1蛋白属于R3亚家族。
利用Cell-PLoc 2.0在线工具对LrETC1进行亚细胞定位预测，结果显示定位于细胞核中。
利用软件MEGA-X将LrETC1蛋白与拟南芥、苹果、葡萄、草莓等物种中与花青素合成途径相关的MYB蛋白序列进行Clustalw比对，比对结果用Neighbor-Joining方法分析，设置Bootstrap为1000，构建系统发育树。分析表明LrETC1与R3-MYB亚群的AtCPC-like类转录因子聚在一起，如番茄的SlMYB-ATV，矮牵牛的PhMYBx以及拟南芥的AtETC1等(图6)。因此可以推测LrETC1属于R3-MYB类生物转录抑制因子，并且与AtCPC-like转录因子具有相似的功能。
LrETC1蛋白的多重序列比对
利用DNAMAN 8.0软件对LrETC1的氨基酸序列与其他物种中较同源的MYB蛋白进行多序列比对分析，结果表明，LrETC1只含有一个R3重复序列，没有任何的抑制性氨基酸基序，但具有与bHLH转录因子结合的基序，属于R3-MYB类的MYB转录因子(图7)。
LrETC1蛋白的亚细胞定位分析
在CaMV35S组成型启动子的驱动下，将重组载体LrETC1-GFP(图8)以及作为对照的空载体P1300-GFP转入到烟草的原生质体中。在荧光显微镜下观察发现，对照载体在整个细胞中都分布有绿色荧光，而LrETC1-GFP只在细胞核中发出强烈的荧光信号(图9)。由此可知，转录因子定位于细胞核并都在细胞核中作为转录调节因子来发挥其调控功能。
LrETC1的转录活性分析
为了验证LrETC1是否具有转录激活性，构建含有LrETC1的PGBKT7重组质粒，以空的PGBKT7为阴性对照，以连接有LrAN11(具有转录激活性)的PGBKT7为阳性对照。结果显示，在一缺培养基(SD/-Trp)上，对照和实验组都可以正常生长，表明质粒成功转入酵母中。而在三缺培养基(SD/-Trp/-His/-Ade)上除了阳性对照，其余的都不生长，表明LrETC1均不具有转录激活活性，并且在涂有X-α-Gal染液的三缺培养基中也没有变蓝，而阳性对照有较浅的蓝色(图10)。因此，我们初步得出结论，LrETC1在酵母细胞中没有转录激活活性，并猜测转录因子需要同其他转录因子结合形成复合物来调控基因的表达。
LrETC1在黑果和白果枸杞果实中的表达分析
为了验证转录组数据得出的LrETC1的表达量情况，在黑果和白果枸杞果实的不同发育阶段(S1-S5)中，利用qRT-PCR对LrETC1的表达量进行分析。结果显示，LrETC1在黑果枸杞中的表达量显著高于白果枸杞，并且随着在果实成熟过程中花青素含量的增加其表达量也呈现出逐渐上升的趋势，但在果实完全成熟的S5阶段表达量开始降低。然而在白果枸杞果实中，从果实开始发育的S1阶段到果实完全成熟的S5阶段，LrETC1几乎没有表达(图11)。
LrETC1在黑果枸杞中的组织特异性表达分析
以黑果枸杞不同组织的cDNA为模板进行qRT-PCR分析。结果表明，LrETC1在茎、叶、花和果实中均有表达，没有表达特异性，并且LrETC1只在果实中表达量最高。
qRT-PCR分析表明，LrETC1的表达量与花青素的积累呈正相关，并且在果实开始大幅积累花青素时具有高水平的表达，这表明LrETC1在花青素开始积累的时候被激活，表明R3-MYB转录抑制因子可以在花青素开始合成时被激活从而提供反馈调节，在平衡花青素积累的过程中起重要作用。
实施例3
植物过表达重组载体的构建
目的基因同源重组片段的克隆：
以上述实施例步骤中获得的cDNA溶液为模板，使用表12中的相应引物进行植物过表达载体的同源重组片段扩增，扩增体系、PCR产物检测和回收见同上述实施例部分。
表12
Figure BDA0003122428560000131
Figure BDA0003122428560000141
载体酶切反应
使用Xba I和KpnⅠ两个限制性内切酶对载体PCM1307进行双酶切；使用SmaⅠ和StuⅠ这两个限制性内切酶对载体pZYB9-pEAQ-HT进行双酶切。酶切体系和产物回收同上述实施例部分。
同源重组连接片段和载体、大肠杆菌DH5α转化、菌液PCR鉴定和质粒提取同上述实施例部分。
根癌农杆菌的转化
操作步骤如下：
(1)从-80℃中取出制备的感受态根癌农杆菌，于冰上放置。
(2)向预冷的1.5mL离心管中加入10μl重组质粒和100μl感受态农杆菌，冰上静置反应30min。
(3)将离心管放入液氮中速冻5min，随后取出放入37℃水浴锅中水浴加热5min，冰上放置2min。
(4)在超净工作台中向离心管中加入1mL无抗生素的LB液体培养基，于28℃摇床中培养4h左右。取出，涂布LB平板(加了抗生素卡那霉素和利福平)，28℃培养箱中倒置培养2天。
(5)待菌落长出后，挑取单菌落于LB抗性液体培养基中于28℃摇床过夜培养。次日取出进行菌落PCR验证。保存阳性菌液于-80℃冰箱。
拟南芥的遗传转化
农杆菌介导的拟南芥花序侵染法
(1)挑取新鲜的农杆菌单菌落至1mL LB抗性液体培养基中，28℃摇床过夜培养。次日，取出1:50稀释培养至OD600≈0.8～1.0，5500rpm离心5min，去除上清，用侵染液重悬至OD600≈0.8。
(2)野生型拟南芥植株在侵染前一天晚上浇透水，选取处于花期且生长状况良好的拟南芥植株进行转化，转化前将苗子的荚全部剪掉。将拟南芥所有的花序放入装有菌液的烧杯中侵染30s。
(3)将侵染后的植株用保鲜膜保湿，放在23℃温室中避光培养24h。
(4)避光培养24h后，去除保鲜膜后于正常光照条件下培养。为提高转化效率，10天后再重复侵染一次，侵染结束后正常培养至收取种子。
(5)收取T0代成熟的种子，利用含有潮霉素的抗性培养基进行阳性植株筛选。将筛选出的阳性植株培养至收取T1代种子，种子适当烘干后保存用于进行后续的实验。
转基因拟南芥的糖胁迫
将烘干后的拟南芥种子于超净工作台中消毒灭菌，播种在3％蔗糖浓度的1/2MS和6％蔗糖浓度的1/2MS，于4℃冰箱中春化3天，3天后取出于25℃的温室中正常培养。待2～3周后，观察花青素的积累。
花青素含量测定
(1)将0.1g左右的待测定材料于液氮中研磨至粉末，立即加入600μl 1％HCl甲醇溶液。于4℃中摇晃6h。
(2)6h过后取出，加入400μl水和400μl氯仿，于4℃冷冻离心机中14000rpm离心5min。
(3)将溶有花青素的上相溶液转移到干净的1.5mL离心管中，吸取200μl测定A530nm和A657nm的吸光值。利用公式计算出花青素含量(mg/g)＝A530nm-0.33×A657nm。每个样品进行三次生物学重复。
结果表明：
将获得的LrETC1转基因T0代植株收取种子后，播种在含有35mg/L潮霉素的1/2MS培养基中，阳性植株因为带有潮霉素抗性，所以其叶片嫩绿、生长发育正常、长势较好。而野生型拟南芥因其不含有抗性基因所以生长缓慢，且慢慢变黄停止生长(图12)。在培养基中生长10天左右，将生长状态良好且体型较大的植株挑选出来移至营养土中培养，2周之后进行PCR鉴定和测序，确定阳性植株后继续培养，收取成熟的T1代种子。结果如图13所示，与野生型拟南芥相比，LrETC1基因的转基因T1代拟南芥的种子种皮颜色较浅，呈现出浅棕色，而野生型种皮颜色为深棕色。表明LrETC1转基因株系的原花青素含量较少，推测转录因子可能参与抑制种皮中的原花青素积累。
已有研究表明，蔗糖可以促进花青素的积累，因此我们利用高浓度的蔗糖胁迫处理拟南芥，从而探究基因在花青素合成调控中发挥的作用。根据前人的研究，拟南芥在6％的蔗糖浓度下会积累花青素。因此，为了验证LrETC1是否可以抑制拟南芥在糖胁迫条件下花青素的积累，分别选取了3株(OE#1，OE#2，OE#3)转基因阳性植株进行了拟南芥高糖胁迫处理。结果显示，在6％蔗糖的1/2MS培养基上生长了2～3周的野生型拟南芥幼苗其在叶片、叶柄以及茎顶端部位都积累了部分的色素，而转基因LrETC1植株却几乎没有色素的积累(图14)。
对野生型和转基因幼苗株系进行了花青素含量测定，其色素含量与其表型变化相一致。
利用qRT-PCR对转基因植株中的LrETC1基因以及拟南芥花青素合成途径中结构基因(AtCHS，AtCHI，AtDFR，AtANS等)的表达水平进行了分析，转基因株系中与花青素合成相关的结构基因表达水平(显著)降低，表明LrETC1(图15)转录因子可以抑制拟南芥在高糖胁迫下的花青素积累。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 宁夏农林科学院枸杞科学研究所
<120> 一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctgatt tggaccgttc aagcacatca gataaatcct ttatggactc gtcagccgca 60
tttgaggcca acaacgtaga aacctcgaag cttgaatttt cagaagacga ggaaatcctc 120
gttactaaaa tgttcaactt ggttggtgag aggtggtcat taattgctgg aagaattcca 180
ggtagaactg cagaggaaat tgagaagtac tggaactcaa gacactctac cagccagtaa 240
<210> 2
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Asp Leu Asp Arg Ser Ser Thr Ser Asp Lys Ser Phe Met Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ala Phe Glu Ala Asn Asn Val Glu Thr Ser Lys Leu Glu
20 25 30
Phe Ser Glu Asp Glu Glu Ile Leu Val Thr Lys Met Phe Asn Leu Val
35 40 45
Gly Glu Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg Thr Ala
50 55 60
Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Trp Asn Ser Arg His Ser Thr Ser Gln
65 70 75
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggctgatt tggaccgttc aag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagacactc taccagccag taa 23
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagctcggta cccggggatc catggctgat ttggaccgtt caag 44
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctcaccatg tcgactctag actggctggt agagtgtctt gag 43
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tatggccatg gaggccgaat tcatggctga tttggaccgt tcaag 45
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgctgcagg tcgacggatc cttactggct ggtagagtgt ctt 43
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaccgttcaa gcacatcaga ta 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctggtaga gtgtcttgag tt 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcagcacct tccagcagat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
taacactgca accgcatttc 20
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accgtcgacg agctctctag aatggctgat ttggaccgtt caag 44
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tttgcggagt acccgggtac cttactggct ggtagagtgt cttg 44
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caccatcacc atcatcccgg gatggctgat ttggaccgtt caag 44
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgaaaccaga gttaaaggcc tttactggct ggtagagtgt cttg 44

Claims (5)

1.一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的一种黑果枸杞花青素合成相关的MYB转录抑制因子LrETC1的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.包含权利要求2所述转录抑制因子LrETC1基因的重组载体。
4.包含权利要求2所述转录抑制因子LrETC1基因或权利要求3所述重组载体的重组菌株。
5.权利要求1所述转录抑制因子LrETC1或权利要求2所述的基因在枸杞育种中的应用。
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