CN114507674B

CN114507674B - 茶树昼夜节律基因lux在提高植物抗寒性上的应用

Info

Publication number: CN114507674B
Application number: CN202210351493.8A
Authority: CN
Inventors: 夏恩华; 王艳丽; 童伟; 黄锦
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2022-04-02
Filing date: 2022-04-02
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2042-04-02
Also published as: CN114507674A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了茶树昼夜节律基因LUX在提高植物抗寒性上的应用。茶树昼夜节律基因LUX的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；茶树昼夜节律基因LUX编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。茶树CsLUX的表达模式与茶树应答低温胁迫相关，将其在模式植物拟南芥中超量表达，能显著提高拟南芥的低温耐受性。通过反义寡核苷酸技术抑制CsLUX的表达，茶树叶片在低温条件下的抗寒能力显著降低。该基因的克隆不仅有助于深入认识昼夜节律参与茶树低温胁迫调控的分子机理，丰富茶树抗寒理论，而且亦为今后通过分子设计育种实现茶树抗寒育种夯实数据和理论基础。

Description

茶树昼夜节律基因LUX在提高植物抗寒性上的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为茶树昼夜节律基因LUX在提高植物抗寒性上的应用。

背景技术

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是我国重要的经济作物。茶叶富含氨基酸、生物碱、茶多糖、多酚类和挥发类等物质，这些内含物含量和组分的不同，共同赋予了茶叶色、香、味等品质特征。中国茶区主要分为西南茶区、华南茶区、江南茶区、江北茶区，北方地区鲜有分布。近年来，越冬期及初春茶树频繁遭遇“霜冻”或“倒春寒”等低温伤害，茶树新稍受到损伤，影响茶叶的产量和品质，严重时甚至导致死亡。低温已逐渐成为制约茶树南种北移、茶叶产能增效的主要因素，影响产业的健康可持续发展。

昼夜节律作为植物调控领域的关键因子，已被证实在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥重要作用。昼夜节律是目前研究最为深入的一种生物自发的、内源性的计时调控系统，以24小时左右为周期协调自身代谢稳态、抗逆反应及生长等过程，从而赋予植物能够根据所处的昼夜环境发生相应生理生化反应的能力。MYB转录因子是转录因子中最大的家族之一，在植物生长发育和抗逆调控网络中扮演重要角色。作为维持昼夜节律稳定的MYB类转录因子之一，生物钟核心基因LUX(LUX ARRHYTHMO)在植物抗逆调控研究中取得了一定的进展。然而，目前茶树中LUX基因仍未得到克隆，其在调控茶树低温耐受性中的作用也尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于：提供茶树昼夜节律基因LUX在提高植物抗寒性上的应用，丰富茶树抗寒理论研究，为茶树抗寒育种和低温防治提供理论和实际参考基础。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种茶树昼夜节律基因LUX，所述茶树昼夜节律基因LUX为茶树MYB类转录因子基因，所述茶树昼夜节律基因LUX的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述茶树昼夜节律基因LUX编码的蛋白序列，如序列表SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述茶树昼夜节律基因LUX，应用于植物响应低温胁迫过程中的调控作用，提高其抗寒性。

本发明的有益效果在于：

本发明中，首次克隆并验证了调控茶树响应低温胁迫的茶树昼夜节律核心基因LUX(即CsLUX)，证明了茶树昼夜节律参与调控低温应答过程的初步机理，丰富了茶树抗寒理论基础。本发明还提供了含有CsLUX基因的重组质粒、转基因工程菌。本发明为茶树抗寒机制研究提供了新思路，为茶树抗寒育种提供了理论和实际参考。

附图说明

图1为茶树不同组织以及低温处理下CsLUX基因的表达变化图；

图2：为CsLUX在烟草叶片中的亚细胞定位图；

图3：为CsLUX在拟南芥过表达株系和野生型中的半定量验证、及其经低温处理后的表型、存活率和干重分析图；

图4：为体外反义寡核苷酸抑制CsLUX表达和空白对照植株分别在低温处理后叶片的叶绿素荧光图以及过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛含量及Fv/Fm值分析图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1：

1、CsLUX基因的克隆与序列结构分析

茶树昼夜节律基因CsLUX为茶树MYB类转录因子基因，其克隆与序列结构分析，具体如下：

采集国家级茶树良种“舒茶早”的健康幼嫩叶片立即于液氮中速冻，用于RNA的提取。总RNA的提取流程按照RNAprep Pure Plant Kit(Tiangen,Beijing,China)试剂盒说明书操作，利用分光度计及凝胶电泳检测其RNA含量和质量，取1000ng RNA根据PrimeScriptII1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara Biotech,China)反转录试剂盒说明，反转录为cDNA。

基于业已发表的模式植物拟南芥昼夜节律核心基因LUX的序列信息在茶树基因组中(http://tpia.teaplant.org/)鉴定茶树中的同源基因CsLUX，并根据其基因编码序列设计CsLUX的克隆引物，其中上游引物为：5’-ATGGGGGAAGAAGTGAGGATG-3’，下游引物为：5’-CTACTTATCATTAGGAGTAACATGTTC-3’，然后进行目的片段扩增。PCR扩增反应体系如下：灭菌去离子水8.5ul，12.5ul 5×Buffer，0.5ul DNTP，上下游引物各1ul，上述获得的cDNA模板1ul，DNA聚合酶0.6ul。PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性10sec，57℃退火15sec，72℃延伸1min，72℃彻底延伸10min，35个循环。使用2×Phanta Super-FidelityDNA Polymerase进行扩增得到相应目的片段；PCR产物经胶回收纯化后连接到中间载体pGEX4T-1，转化到大肠杆菌感受态DH5α后，挑取单克隆进行菌落PCR验证目的基因是否连接到载体转入感受态，并通过Sanger测序验证，得到的CsLUX基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.1所示，具体如下：

ATGGGGGAAGAAGTGAGGATGAGTGAGTACGATGGCGGCGGTGGTGGCCGTGGCGGAGAAGATGACAGAGTGTTGGAGTGGGAGGTAGGGTTGCCGAGCGCCGACGATCTGACGCCGTTGTCTCAGCCGTTGATTCCTCACGAGCTGGCGTCGGCGTTCAGCATCTCGCCGGAGCCCTCCCGGAGCATGATGGAGGTGAATCGCGCCTCTCAGAACACGCTCTCGACGATCCGAGCGCAGTTTAATGCGTTGTCCGCGTCGAATAATTTCAATTTCAAGTCGTTTAACGAAGATAGGGCTAAGGAAGGATTGGCTATGGATGTGGACGAGGCGGATCTGACTAGAGACGGTTCGGAATCAAGGAAATTGAGGAGGATCGACAGCGGTGTCGAAGAGGCCGACTCGGCGTTGAGGTCGGAGAACGGAAACGATGATCCATCGGCGAGGACGCTGAAGCGGCCGCGACTTGTCTGGACGCCTCAGCTGCACAAGCGATTCGTAGACGTTGTTGCGCATTTAGGTATCAAAAACGCGGTTCCGAAGACAATTATGCAGTTGATGAATGTCGAGGGATTGACTCGGGAAAACGTAGCGAGTCACTTGCAGAAGTATCGACTCTACTTGAAGAGGATGCAGGGGTTATCGAACGAAGGTCCTTCGTCATCTGATCATCTCTTCGCTTCGACGCCGGTGCCGCAGAGCCTACATGAATCCGGGAATGGGAGCGGGAACGGGAACGGACACGTGGCGATGCCGATTCCAATGCCGTATCCGCTGCAGATGATGCATATGCCGGTGATGGGGCATGGCCATATGGGGATGCCGGCTGCTCCTGGTCCTTATCATGGGTTTGACTCGCATCCGTATAATATGGTGCAGCAGAGGGACTGGTCTGGAAATAAGTTTGGCTCTGTTGCATCTTTTCAACATGTTACTCCTAATGATAAGTAG。

昼夜节律核心基因CsLUX编码的蛋白序列，如序列表SEQ ID NO.2所示具体如下：

MGEEVRMSEYDGGGGGRGGEDDRVLEWEVGLPSADDLTPLSQPLIPHELASAFSISPEPSRSMMEVNRASQNTLSTIRAQFNALSASNNFNFKSFNEDRAKEGLAMDVDEADLTRDGSESRKLRRIDSGVEEADSALRSENGNDDPSARTLKRPRLVWTPQLHKRFVDVVAHLGIKNAVPKTIMQLMNVEGLTRENVASHLQKYRLYLKRMQGLSNEGPSSSDHLFASTPVPQSLHESGNGSGNGNGHVAMPIPMPYPLQMMHMPVMGHGHMGMPAAPGPYHGFDSHPYNMVQQRDWSGNKFGSVASFQHVTPNDK。

2、茶树CsLUX基因在低温胁迫和不同组织中的表达模式分析

利用低温驯化处理半年生茶苗，然后进行取样，取样时间点分别在正常条件下(白天25℃、夜晚20℃)生长1周(CK)；白天10℃、夜晚4℃处理一周(CA1-7d)；白天4℃、夜晚0℃处理一周(CA2-7d)；白天25℃、夜晚20℃适应1周(DA-7d)。利用多糖多酚总RNA提取试剂盒提取样本RNA，分别使用琼脂糖凝胶电泳查看是否含有5S、18S和28S三种沉降系数条带检查提取质量；稀释RNA浓度至1000ng/uL，反转录为cDNA。使用CsActin作为内参基因并设计定量引物(上游引物:5’-GCCATATTTGATTGGAATGG-3’；下游引物:5’-GGTGCCACAACCTTGATCTT-3)，同时设计CsLUX的特异性定量引物(上游引物:5’-GTTGTCTCAGCCGTTGATTCCT-3’；下游引物:5’-ATAGCCAATCCTTCCTTAGCCC-3’)，使用HieffTM qPCR

Green Master Mix(NoRox)(Yeasen，Shanghai，China)，配制20ul反应体系：取上述稀释反转录产物2ul，上下游引物各0.4ul(10mM/L)，10ul HieffTM qPCR/>

Green Master Mix，7.2uL ddH₂0，每个反应设置为3个技术性重复。然后使用Bio-rad CFX-96仪器按照以下程序：①95℃变性5min；②95℃变性10sec，62℃退火30sec，72℃延申30sec，循环39次；③从65℃到95℃，以0.1℃/sec绘制熔解曲线；测定CsLUX基因相对管家基因CsActin的CT值计算其相对表达量。

同时，利用Bowtie2将茶树不同组织的RNA-Seq测序数据比对到茶树基因集上，然后利用RSEM计算CsLUX的表达值，表达值用FPKM表示。

图1为茶树不同组织以及低温处理下CsLUX基因的表达变化图。如图1所示，CsLUX在茶树根、茎、叶、花、果实等八个组织中表达水平就具有一定差异，在果实、幼叶及老叶中表达水平较高；CsLUX在茶树低温胁迫下发生显著上调表达，暗示着CsLUX可能在茶树低温应答中发挥作用。

3、CsLUX基因在烟草叶片中的亚细胞定位

通过设计重组引物构建CsLUX和pCAMBIA1305::GFP的过表达载体CsLUX-pCAMBIA1305::GFP，所使用的上游重组引物为：5’-aggacagcccagatcactagtATGGGGGAAGAAGTGAGGATG-3’；下游重组引物为：5’-gcccttgctcaccatggatccCTACTTATCATTAGGAGTAACATGTTGAAAA-3’。然后将过表达载体和空载pCAMBIA1305::GFP转化到农杆菌GV3101，分别挑单克隆于10mL含有利福平和卡纳抗性的LB培养基中，28～30℃200rpm震荡培养5-6h；然后转接到100mL含有同样抗性的LB液体培养基中，另外加入100uL高压灭菌的100uM乙酰丁香酮，以趋化和诱导农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢并激活农杆菌的Vir区(诱导)基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA中；过夜培养至菌液OD600为0.4-0.6，15分钟离心集菌，用重悬液清洗后重悬菌体；加入重悬液体积1‰的乙酰丁香酮趋化诱导、1％的DAPI染色，室温28度黑暗放置2～3h活化后注射烟草叶面背部；注射后暗培养8-12h左右，正常室温培养2天，利用激光共聚焦显微镜在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号以检测CsLUX蛋白的定位位置。

图2为CsLUX在烟草叶片中的亚细胞定位图。如图2所示，其中，DAPI为核定位蛋白；Fluorescence为绿色荧光蛋白；Bright Field：空载对照和CsLUX-pCAMBIA1305::GFP的亮场图片；Merged：CsLUX-pCAMBIA1305::GFP融合图片。结果显示，在空载对照中，GFP绿色荧光蛋白分布于整个细胞，包括细胞核和细胞膜等，而GFP-CsLUX融合蛋白仅在细胞核中发现，与DAPI染色结果一致，表明CsLUX蛋白定位在细胞核。

4、CsLUX基因在拟南芥体内功能验证

取约60粒拟南芥种子于1.5ml离心管中，加入1ml灭菌水于4度低温下春化3天，待拟南芥发芽长出2-3片子叶移栽，7-10天浇一次营养液，期间浇一次水，待其开花开始侵染。同上述亚细胞定位实验，将含有CsLUX-pCAMBIA1305及空载pCAMBIA1305的过夜培养GV3101菌液转入50mL离心管中，4℃5000rpm离心15min后将上清液倒出。用等体积5％蔗糖溶液重悬菌体沉淀，调吸光度OD600为0.4～0.6，形成均匀的农杆菌悬浮液，另外加入约0.1％Silwet77表面活性剂摇匀；将植株的花序和茎上的腋芽浸入侵染液，静置30-60s，黑暗培养18-22h后，继续正常培养7-10天进行第二次侵染。约4周后收取T0代种子于离心管中，在组织培养室超净工作台中进行无菌操作，先用1mL 75％乙醇消毒1min，再用10％NaClO消毒10min，最后用无菌水冲洗5-6遍，移液器吸取种子点播于含有潮霉素的MS固体培养基上，待拟南芥种子发芽长出2-3片子叶，移栽到16h光照/8h黑暗条件下培养，收获T1代种子，同样方法筛选T2代种子，待幼苗长大，选取少量叶片提取基因组DNA，进行PCR扩增验证是否侵染成功；而后分别对野生和过表达拟南芥进行-6℃低温处理5h，22℃恢复一周后观察其表型、存活率和干重测定。

图3为CsLUX在拟南芥过表达株系和野生型中的半定量验证、及其分别经过低温处理后的表型、存活率和干重分析图；如图3所示，所有提取植物基因组DNA完整，半定量结果显示拟南芥植株侵染成功，然后在-6℃下处理5h，22℃恢复一周后发现过表达拟南芥表型受损明显较弱，而野生拟南芥经低温胁迫后存活率显著降低，同时叶片干枯，干重减少。

5、CsLUX基因在茶树体内功能验证

CsLUX的干扰试验采用在茶树中已相对成熟的反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,AsODN)抑制方法进行；根据上述克隆测序获得的CsLUX序列，利用Soligo software(http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl)设计5条特异性的AsODNs引物来提高沉默效率，选用1.5mL离心管，加入1mL混合好并稀释为20uM的反义寡聚核苷酸引物溶液，插入长势一致、无病虫害的一芽二叶离体茶树嫩芽，用透气性封口膜密封管口，防止引物溶液挥发，对照为无菌水溶液；将离心管放入25℃光照培养箱中按光照16h/黑暗8h，70％湿度进行培养。分别取0h、6h、12h、24h、36h处理的对照组和反义寡核苷酸处理组样品进行液氮固样，提取样品总RNA，反转录后通过qRT-PCR进行表达量检测。对表达抑制的样品进行0℃处理1h，利用叶绿素荧光成像仪检测叶片的受损程度，并测定PSII最大光化学效率(Fv/Fm)；另外，利用丙二醛含量测定试剂盒、过氧化物和超氧化物酶测定试剂盒(南京建成，中国)分别测定抑制组和对照组经低温处理后的化合物含量。

图4为体外反义寡核苷酸抑制CsLUX表达和空白对照植株在低温处理下叶片的叶绿素荧光图、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛含量及Fv/Fm值分析图。结果如图4所示，CsLUX在沉默6h的表达水平显著降低，将成功抑制CsLUX表达的样品进行低温处理，测定主要生理指标，可以看到相对于对照组，CsLUX沉默后样品的叶片受损程度更严重，丙二醛含量升高，Fv/Fm值显著降低，过氧化物酶和超氧化物酶活显著降低，初步验证CsLUX基因的体内表达抑制可以显著降低茶树的低温耐受性。

综上所述，将茶树CsLUX基因在拟南芥中过量表达能够提高拟南芥的低温耐受性；而通过反义寡核苷酸技术抑制CsLUX的表达则明显加重了茶树叶片在低温下的受损程度，说明CsLUX参与茶树低温应答。该基因的克隆将有利于探究昼夜节律在调控茶树抗寒过程中的作用，具有较大的应用价值，可为实现栽培茶树的抗寒育种以促进茶产业的健康可持续发展提供理论和数据基础。

本发明首次克隆并验证了茶树昼夜节律核心基因CsLUX，并证实了其在提高茶树低温耐受性中的调控作用，揭示了茶树昼夜节律对茶树抗寒的潜在影响，为茶树抗寒机制提供了新思路，为实现茶树抗性性状育种提供了理论和实际参考基础。

上述是对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的这种非实质改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 茶树昼夜节律基因LUX在提高植物抗寒性上的应用

<130> NO

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> 茶树(Camellia sinensis L. O. Kuntze)

<400> 1

atgggggaag aagtgaggat gagtgagtac gatggcggcg gtggtggccg tggcggagaa 60

gatgacagag tgttggagtg ggaggtaggg ttgccgagcg ccgacgatct gacgccgttg 120

tctcagccgt tgattcctca cgagctggcg tcggcgttca gcatctcgcc ggagccctcc 180

cggagcatga tggaggtgaa tcgcgcctct cagaacacgc tctcgacgat ccgagcgcag 240

tttaatgcgt tgtccgcgtc gaataatttc aatttcaagt cgtttaacga agatagggct 300

aaggaaggat tggctatgga tgtggacgag gcggatctga ctagagacgg ttcggaatca 360

aggaaattga ggaggatcga cagcggtgtc gaagaggccg actcggcgtt gaggtcggag 420

aacggaaacg atgatccatc ggcgaggacg ctgaagcggc cgcgacttgt ctggacgcct 480

cagctgcaca agcgattcgt agacgttgtt gcgcatttag gtatcaaaaa cgcggttccg 540

aagacaatta tgcagttgat gaatgtcgag ggattgactc gggaaaacgt agcgagtcac 600

ttgcagaagt atcgactcta cttgaagagg atgcaggggt tatcgaacga aggtccttcg 660

tcatctgatc atctcttcgc ttcgacgccg gtgccgcaga gcctacatga atccgggaat 720

gggagcggga acgggaacgg acacgtggcg atgccgattc caatgccgta tccgctgcag 780

atgatgcata tgccggtgat ggggcatggc catatgggga tgccggctgc tcctggtcct 840

tatcatgggt ttgactcgca tccgtataat atggtgcagc agagggactg gtctggaaat 900

aagtttggct ctgttgcatc ttttcaacat gttactccta atgataagta g 951

<210> 2

<211> 316

<212> PRT

<213> 茶树(Camellia sinensis L. O. Kuntze)

<400> 2

Met Gly Glu Glu Val Arg Met Ser Glu Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Arg Gly Gly Glu Asp Asp Arg Val Leu Glu Trp Glu Val Gly Leu Pro

20 25 30

Ser Ala Asp Asp Leu Thr Pro Leu Ser Gln Pro Leu Ile Pro His Glu

35 40 45

Leu Ala Ser Ala Phe Ser Ile Ser Pro Glu Pro Ser Arg Ser Met Met

50 55 60

Glu Val Asn Arg Ala Ser Gln Asn Thr Leu Ser Thr Ile Arg Ala Gln

65 70 75 80

Phe Asn Ala Leu Ser Ala Ser Asn Asn Phe Asn Phe Lys Ser Phe Asn

85 90 95

Glu Asp Arg Ala Lys Glu Gly Leu Ala Met Asp Val Asp Glu Ala Asp

100 105 110

Leu Thr Arg Asp Gly Ser Glu Ser Arg Lys Leu Arg Arg Ile Asp Ser

115 120 125

Gly Val Glu Glu Ala Asp Ser Ala Leu Arg Ser Glu Asn Gly Asn Asp

130 135 140

Asp Pro Ser Ala Arg Thr Leu Lys Arg Pro Arg Leu Val Trp Thr Pro

145 150 155 160

Gln Leu His Lys Arg Phe Val Asp Val Val Ala His Leu Gly Ile Lys

165 170 175

Asn Ala Val Pro Lys Thr Ile Met Gln Leu Met Asn Val Glu Gly Leu

180 185 190

Thr Arg Glu Asn Val Ala Ser His Leu Gln Lys Tyr Arg Leu Tyr Leu

195 200 205

Lys Arg Met Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gly Pro Ser Ser Ser Asp His

210 215 220

Leu Phe Ala Ser Thr Pro Val Pro Gln Ser Leu His Glu Ser Gly Asn

225 230 235 240

Gly Ser Gly Asn Gly Asn Gly His Val Ala Met Pro Ile Pro Met Pro

245 250 255

Tyr Pro Leu Gln Met Met His Met Pro Val Met Gly His Gly His Met

260 265 270

Gly Met Pro Ala Ala Pro Gly Pro Tyr His Gly Phe Asp Ser His Pro

275 280 285

Tyr Asn Met Val Gln Gln Arg Asp Trp Ser Gly Asn Lys Phe Gly Ser

290 295 300

Val Ala Ser Phe Gln His Val Thr Pro Asn Asp Lys

305 310 315

Claims

1.茶树昼夜节律基因LUX在提高拟南芥和茶树抗寒性上的应用，其特征在于，所述茶树昼夜节律基因LUX为茶树MYB类转录因子基因，所述茶树昼夜节律基因LUX的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO.1所示；所述茶树昼夜节律基因LUX，应用于拟南芥和茶树响应低温胁迫过程中的调控作用，提高其抗寒性。