CN111454972B

CN111454972B - 枳抗寒基因PtrBADH及其在植物抗寒遗传改良中的应用

Info

Publication number: CN111454972B
Application number: CN202010303992.0A
Authority: CN
Inventors: 刘继红; 明如宏; 黄小三
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Zigui Yixin Agricultural Development Co ltd
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2040-04-17
Also published as: CN111454972A

Abstract

本发明公开了一种枳抗寒基因PtrBADH及其在植物抗寒遗传改良中的应用，PtrBADH基因为一种从极抗寒枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆出的一个甜菜碱合成关键基因，命名为PtrBADH，其序列为SEQ ID NO.1所示。将该基因构建超表达和RNAi载体，并通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入烟草、柠檬和枳中，获得的转基因植株经生物学功能验证，结果表明PtrBADH基因具有提高植物抗寒性的功能。该基因的发现，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

Description

枳抗寒基因PtrBADH及其在植物抗寒遗传改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到一个甜菜碱合成关键基因PtrBADH，还涉及该基因在植物抗寒遗传改良中的应用，将该基因在烟草、柠檬和枳中超表达，获得的转基因植物抗寒性明显提高。

背景技术

在整个生长发育过程中，植物经常遭受各种环境的挑战，例如，病虫害等生物胁迫以及温度、干旱、盐碱等非生物胁迫。由于植物不能像动物一样可以通过自我的移动来规避不利影响，因此，植物在遭受不利因素胁迫时，其自身会做出一系列分子、细胞和生理水平的变化，来抵御不利影响。

低温作为影响植物生存的主要的胁迫之一，经常造成农业的重大灾害。对于提高作物的抵御寒冷的能力，已成为广大研究人员的关注热点。低温胁迫通过影响植物的生长，发育和存活来限制植物的地理分布和农业产量。大多数温带植物，包括拟南芥，可以通过冷驯化而获得抗冻性(Zhu.,2007)，植物抵御低温胁迫主要通过自身生理及转录水平的改变。在许多温带植物，例如冬小麦，大麦，燕麦和油菜中都有冷驯化的迹象(Chinnusamy etal.,2007)。在植物处于低温环境中时，有关基因受到诱导表达量发生变化，从而调控植物对低温胁迫的抵御能力，这些基因既包括调控基因又包括功能基因。例如，Guy和其同事(1985)首次描述了低温调控基因(cold-regulated(COR)genes)在低温胁迫下存在功能。在拟南芥中CORs包括COR、低温诱导基因(LTI)、脱水应答基因(RD)和早期脱水诱导基因(ERD)。这些基因中存在一些编码渗透酶生物合成的关键酶，这些酶可通过防冻蛋白和可溶性糖的积累来提高冷冻耐受性。CBF转录因子作为脱水反应元件(DRE)结合因子1(DREB1)蛋白，对于高等植物的冷驯化至关重要(Liu et al.,1998；Jaglo-Ottosen and K.R..,1998)。在长期的进化过程中，植物己经形成了高效且复杂的抵御低温伤害的应答机制，即在分子、细胞和生理水平上做出一系列的调整，从而减少低温对植物造成的伤害(Nakashima et a1.,2009)。

甜菜碱((glycine betaine,GB)是维持细胞稳定的重要渗透调节物质。在逆境条件下，植物体内大量积累甜菜碱，以降低渗透胁迫对细胞膜的损伤，保护三梭酸循环的主要酶活性以及稳定光合作用中多肤的功能等(梁峥，骆爱玲.1995)，从而提高植物适应不良环境的能力。1975年，Storey等首次在植物中观察到盐分胁迫引起甜菜碱积累的现象。在高等植物叶，甜菜碱的合成在叶绿体中，胆碱经过两次酶催化反应(CMO和BADH)催化生成(Sakamoto et al.,1998)。甜菜碱醛脱氢酶(BADH)作为甜菜碱合成关键酶，调控甜菜碱合成与代谢的动态平衡(Fujiwara et al.,2008；Kopecny et al.,2011)。当植物受到干旱与盐碱胁迫时其酶活力显著提高，从而显著增加甜菜碱的积累(Arakawa et al.,1987)。已有研究人员将甜菜碱醛脱氢酶基因导入到玉米植株体内并验证在相同条件下，转badh基因植株抗旱性优于非转基因受体(王小丽等，2014；韩猛等2015，刘晓璐，2016)。

枳是柑橘产业中应用较为广泛的一种砧木，极抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有关抗寒基因克隆问题的理想材料。因此，克隆枳抗寒有关基因是抗寒基因工程的关键和基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种从极抗寒枳(Poncirustrifoliate)中分离、克隆的抗寒甜菜碱醛脱氢酶基因及其应用。

本发明的技术方案为：从枳(Poncirus trifoliate)中分离克隆得到一个新基因PtrBADH，其核苷酸序如SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其包含1785bp的开放阅读框，编码595个氨基酸，等电点为6.62，分子量为65.61KDa。

扩增PtrBADH基因的引物，其序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

利用qRT-PCR技术分析了在低温处理下植株PtrBADH基因的时间表达模式，结果表明PtrBADH基因受低温胁迫诱导，且随低温处理时间延长，PtrBADH基因的表达量也逐渐增加，72h表达量达到峰值，随后缓慢降低，说明PtrBADH对于低温胁迫有十分强烈的响应。

为进一步验证PtrBADH基因抗寒性功能，通过分析在低温处理前后PtrBADH转基因株系的表型及相关生理指标，结果表明：相对于非转PtrBADH基因株系，PtrBADH超表达株系具有明显抗寒的优势，然而PtrMYC2瞬时沉默株系则与之相反。综合表明PtrBADH基因是一个潜在的抗寒育种基因。

枳抗寒基因PtrBADH在植物抗寒中的应用，包括利用本领域的常规方式，将PtrBADH基因在植株中进行超表达，可获得抗寒的转基因植株；

以上所述的应用中，优选的，所述的植株为烟草、柠檬或枳。

以上所述的应用中，优选的，通过构建PtrBADH基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将PtrBADH基因导入植株中。

以上所述的应用中，优选的，通过构建PtrBADH基因的VIGS沉默载体，利用农杆菌介导瞬时转化方法将PtrBADH基因导入植株中。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

该基因的发现及鉴定，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

PtrBADH基因受低温胁迫诱导，且随低温处理时间延长，PtrBADH基因的表达量也逐渐增加，PtrBADH对于低温胁迫有十分强烈的响应。PtrBADH超表达株系具有明显抗寒的优势。

附图说明

图1是本发明的技术流程图。

图2是本发明PtrBADH、BADH酶活和GB含量响应低温胁迫时间表达模式示意图；A是PtrBADH相对表达量；B是BADH酶活检测；C是甜菜碱(GB)含量分析。

图3是本发明PtrBADH基因启动子活性分析示意图；图3中A是本发明的PtrBADH基因启动子调控元件模式图；B是对照及PtrBADH启动子不同功能区构建融合GUS报告基因载体模式图；C是低温处理前后，PtrBADH启动子功能区GUS染色分析；D是低温处理前后，相对染色分析；E是低温处理前后，PtrBADH启动子功能区烟草叶片GUS染色分析。

图4是本发明PtrBADH基因亚细胞定位示意图。

图5是转PtrBADH烟草鉴定及表达量分析示意图；图5中A是本发明的PtrBADH基因特异引物鉴定阳性烟草；图5中B是qRT-PCR分析烟草PtrBADH基因的相对表达量。

图6是低温处理转PtrBADH烟草株系成活率统计和叶绿素荧光测定；图6中A和B是烟草转基因系(#18、#26)与野生型烟草(WT)处理前(上)、处理后(中)以及处理后在常温下恢复7d(下)的成活率分析结果图；C是烟草转基因系(#18、#26)与野生型烟草(WT)处理前(上)、处理后(中)以及处理后在常温下恢复7d(下)的叶绿素荧光测定；D是烟草处理后Fv/Fm。

图7是低温处理转PtrBADH烟草株系表型和相关生理指标测定示意图；图7中A是低温处理前后及恢复后转基因烟草的表型；B是低温处理前后电导率分析；C是低温处理前后MDA含量分析；D和E分别是H2O2和O2·-实验结果。

图8是低温处理前后转PtrBADH烟草株系(#18、#26)BADH酶活(图8中A)和GB含量(图8中B)测定结果图。

图9是转PtrBADH柠檬鉴定及表达量分析示意图；图9中A是本发明的PtrBADH基因特异引物鉴定阳性柠檬；图9中B是qRT-PCR分析柠檬PtrBADH基因的相对表达量。

图10是低温处理前后转PtrBADH柠檬株系表型分析和生理指标测定结果示意图；图10中A是低温处理前后及常温恢复表型情况；B是低温处理前后及常温恢复叶绿素荧光结果；C是叶绿素荧光参数Fv/Fm值；D是电导率；E是MDA含量测定结果；F是H2O2和O2·-的染色结果。

图11是转PtrBADH柠檬株系(#4、#7)低温处理前后的BADH酶活分析(图11中A)及GB含量测定(图11中B)结果。

图12是本发明VIGS材料鉴定及相对表达定量分析示意图；其中，A是PtrBADH干涉材料(PtrBADH-TRV2)鉴定；B随机选取14株阳性材料鉴定PtrBADH和PtrBADH相对表达量

图13是枳干涉PtrBADH基因株系抗寒性分析示意图；图13中A是TRV、TRV-PtrBADH和TRV-PtrBADH(+GB)枳低温处理前(上)和处理后(下)的表型；B是电导率结果；C是MDA含量测定结果。

图14是枳干涉PtrBADH基因株系生理指标测定结果示意图；其中，图14中A是TRV、TRV-PtrBADH和TRV-PtrBADH(+GB)枳低温处理前(上)和处理后(下)的叶绿素结果图；B是Fv/Fm值；C是甜菜碱含量(GB)测定结果；D是H2O2和O2·-的DAB和NBT染色实验结果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例1：枳PtrBADH基因全长cDNA的克隆及超表达载体pBI121的构建

以甜菜碱基因PtrBADH启动子中的顺式元件为诱饵，筛选酵母单杂文库，筛选得到文献报道的抗寒基因PtrBADH的核苷酸序列，将该序列提交至梨基因组数据库进行BLAST，选择得分最高的核苷酸序列，并提交Pfam验证保守蛋白结构域。利用Primer Premier 5.0设计扩增该序列的特异引物为：

PtrBADH-F：5'-GCTCTAGAATGGCTTTTTTGTTTTCGTTGATCG-3'

PtrBADH-R：5'-CGGGATCCTCAATCATTCCTTCTACTGCTGACA-3'

以枳cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增体系见表1，扩增程序见表2。

表1 基因扩增体系

Table 1 Reaction system of gene amplification

表2 基因扩增PCR程序

Table 2 PCR program for gene amplification

采用AxyPrep-96 DNA凝胶回收试剂盒(Axygene,USA)对扩增得到产物进行纯化回收，利用DNA无缝克隆技术，将纯化产物连接到已线性化OE载体pBI121，然后将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板，摇菌，然后进行阳性鉴定。获得阳性克隆后，将阳性克隆送生工生物公司测序，根据测序结果，获得PtrBADH基因全长cDNA序列。OE载体双酶切体系见表3，重组体系见表4，阳性鉴定体系见表5。

表3 双酶切体系

表4 重组体系

将测序结果正确的大肠杆菌，用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen，USA)盒提取质粒，质粒命名为pBI121-PtrBADH。将构建好的测序正确的pBI121-PtrBADH重组载体转入农杆菌感受态细胞(GV3101)备用。

实施例2：低温胁迫处理PtrBADH基因的表达模式分析和启动子活性分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对PtrBADH基因的表达模式进行分析，定量试剂为QuantiNova^TM SYBRGreen PC(QIGEN，Germany)，方法参照说明书，反应体系见表5。

表5 定量PCR反应体系

以枳中Actin作为内参基因，反转录得到的cDNA为模板。每个样品重复四次。定量PCR反应在Applied Biosystems QuanStudio^TM 7Flex Real-Time PCR系统(ABI，USA)中完成，反应程序见表6。反应完之后采用2^-ΔΔCt算法对基因表达进行计算。内参基因qRT-PCR引物为：

Actin-F:5’-CCGACCGTATGAGCAAGGAAA-3'

Actin-R:5’-TTCCTGTGGACAATGGATGGA-3'

表6 定量PCR反应程序

本实验对其在低温下的表达模式进行了研究，并发现随低温处理时间延长，PtrBADH基因的表达量也逐渐增加，到72h时表达量达到了峰值(90倍)，随后缓慢降低(图2中A)。同时，随低温处理时间延长，BADH酶活和甜菜碱含量也逐渐增加，也在72h时含量达到了峰值，随后降低(图2中C)。

为进一步确认PtrBADH为低温应答的基因，我们扩增了该基因的启动子(1308bp)，并且Plant CARE、PLACE在线分析PtrBADH启动子序列，根据分析结果显示(图3中A)将其分为三段(-1～-213，-1～-786，-1～-1308)，然后构建GUS融合表达载体如图3中B所示。农杆菌介导瞬时转化甜橙愈伤，而后进行GUS染色。GUS染色发现，低温处理前p35S、EV、p1308、p786、p213瞬时转化的愈伤就有染色，低温处理后p1308、p786 GUS染色加深，p35S未变化。而EV空载对照和p213低温处理前后均未被染色(图3中C)，Image J量化后可进一步看出PtrBADH的启动子GUS相对染色密度结果低温处理前后p35S、EV空载对照和p213无显著变化，而p1308变化显著，p786变化极显著(图3中D)，与图3中C结果对应，进一步说明PtrBADH的启动子受低温胁迫应答的元件位于-214～-786区。图3中E为p35S、p1308、p786、EV瞬时转化烟草叶片不同区域，低温处理前后GUS染色结果与上图3中C/D结果一致，综上说明PtrBADH的启动子活性在低温处理后显著增强了，即该基因启动子响应低温，也表明PtrBADH基因具有一定抗寒性。

实施例3：PtrBADH基因亚细胞定位分析

扩增PtrBADH的ORF区域(不含终止密码子)，并构建到101LYFP载体上，YFP蛋白位于基因的3’端，表达由CaMV35S启动子驱动。35S::YFP-PtrBADH+35S::OFP-HDLE实验组和35S::YFP+35S::OFP-HDLE对照组分别瞬时转化到本氏烟草的叶片表皮细胞，激光共聚焦观察发现，转化了重组载体35S::YFP-PtrBADH的烟草表皮细胞在内质网膜中检测到荧光，且与内质网膜Marker荧光表达位置重叠，说明目的基因PtrBADH主要定位在内质网膜上(图4)。

实施例4：烟草遗传转化及阳性鉴定

1)菌株准备：从-80℃取出保存好的转化pBI121-PtrBADH载体的农杆菌，用枪头吸取少量农杆菌液，置于不含抗生素的MS液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD600值到0.6-0.8以备侵染用；

2)外植体准备：选取长势良好的无菌烟草，取最大的2-3片叶片，去掉主脉及叶边缘，切成0.5cm²左右大小的方块，放入无菌且加有少量MS液体培养基的三角瓶中，供侵染用；

3)侵染及共培养：将第一步中培养好的菌液倒入装有外植体的三角瓶中，侵染10min，侵染过程中不断轻摇。侵染后，用灭菌的滤纸吸干外植体带有的菌液,叶背面向下，放于铺有无菌滤纸的共培培养基(MS+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上，培养室中暗培养3d；

4)筛选培养：共培养3d后的全部外植体收集放入无菌的三角瓶中，加入含400mg/LCef的无菌水清洗2-3次，然后再用无菌水清洗2-3次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水，置于筛选培养基(MS+400mg/L Cef+100mg/L Km+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上培养；

5)生根培养：将长至1-2cm长的抗性芽切下来，置于MS+400mg/L培养基中生根培养。

上述培养基中均含有3.0％蔗糖和0.8％琼脂，且pH值调至5.9-6.0。培养基高温高压灭菌后，待其冷却至60℃以下时，加入已过滤灭菌的抗生素，分装备用。

当抗性芽生根后，且长出2-3片叶片时，取少量叶片进行DNA提取，DNA提取步骤如下：

1)取少量烟草叶片放入1.5mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600μL CATB提取液，CTAB提取液配制方法见表5；

2)充分混匀后放入65℃水浴锅水浴90min，期间每30min颠倒混匀一次；

3)水浴完成后，加入700μL 24:1(氯仿：异戊醇)混合抽提液，剧烈颠倒混匀，常温下12000r/min离心15min，吸取上层清液(约500μL)转移至新的1.5mL离心管中；

4)加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20℃冰箱沉淀(沉淀时间可延长)；

5)沉淀完成后取出，12000r/min离心10min。倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗2-3两次，弃酒精，于通风橱内风干；

6)每管加入20-30μL ddH2O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱。

浓度检测，每个样品取1μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo,USA)测量，其OD260/OD280比值为1.8-2.0范围内时，DNA纯度较高。同时也通过凝胶电泳检测。

表7 CTAB提取液配方

以上述所提取DNA为模板，通过PCR鉴定获得了多株阳性植株(图5中A)，随机选取阳性植株#18、#25、#26进行qRT-PCR分析发现该BADH基因确实超量表达(图5中B)，选取#18和#26超表达植株T2代种子用于后续分析。

实施例5：柠檬遗传转化及阳性鉴定

1)取柠檬种子，用l mol/L的NaOH浸泡15分钟后洗净，再在超净工作台上用2％(体积比)的次氯酸钠浸泡灭菌15-20min，无菌水洗涤3次再在无菌条件下剥去种皮，接种于MT固体培养基上，暗培养3-4周再光照培养3-5d用于转化。

2)从-80℃取出保存好的转化pBI121-PtrBADH载体的农杆菌，用枪头吸取少量农杆菌液，置于不含抗生素的MT液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD600值到0.6-0.8以备侵染用；

3)取实生苗上胚轴，于超净工作台斜切成1-1.5cm长茎段，切好的茎段暂时放于灭菌的空三角瓶中(加少量水保湿)。

4)将切好的外植体浸泡在已制备好的农杆菌菌液里，侵染20min，中间摇动几次。侵染完后用无菌吸水纸吸干外植体表面菌液，再接种到共培养基上21-23℃暗处共培养3天。

5)共培养3天后，用无菌水洗3-5次，再用无菌吸水纸吸干表面的农杆菌，转到加有卡那霉素50mg/L及头抱霉素400mg/L的筛选培养基上，25℃暗培养4周后再转到光照条件下培养。

6)筛选培养基上长出抗性芽>0.5cm时，转到伸长培养基上促其伸长。待芽有1.5cm长时，切下并转入生根培养基诱导生根。

柠檬阳性苗鉴定过程同实施例4中烟草鉴定过程。

提取柠檬DNA为模板，通过PCR鉴定获得了多株阳性植株(图9中A)，对阳性植株进行qRT-PCR分析发现该BADH基因较野生株系确实超量表达(图9中B)，选取#4和#7超表达植株T2代种子用于后续分析。

实施例6：转PtrBADH基因烟草抗寒性分析

取生长均一的一定数量的野生型(WT)和转基因系(#18、#26)于穴盆(含营养土)中生长10天，然后低温胁迫与常温恢复处理，低温处理前，超表达PtrBADH基因的烟草和野生型烟草表型无差异且叶绿素叶绿素荧光都呈现深蓝色，低温处理2天后，野生型受到伤害比转基因系更严重，绝大多数的叶片都呈水渍化状态，而转基因系只有部分烟草呈现水渍化，另外，叶绿素荧光蓝色部位面积，野生型和转基因株系都缩小，且WT蓝色部位的面积远远小于转基因系，常温恢复处理后，结果显示野生型叶绿素荧光面积未恢复至处理前水平，而转基因株系基本恢复至处理前水平(图6中A，C)，成活率统计显示两个转基因系的成活率显著高于野生型(图6中B)。叶绿素荧光参数Fv/Fm值用于表征PSⅡ反应中心光能的转化效率，在没有外界胁迫时该数值趋于稳定，变化极小，而当植物遭受外界胁迫时，该参数明显降低。因此，可以通过对植物叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm值的测定来评价植物的抗逆能力。通过测定发现，低温处理前转基因系与野生型的Fv/Fm值无明显差异，而低温处理后及常温恢复后转基因Fv/Fm值明显高于野生型(图6中D)，为进一步验证PtrBADH提高烟草的抗寒性，将苗龄20d的长势一致的烟草植株栽培至穴盆中，观察低温处理前、后及常温恢复的长势及表型变化，结果如图7中A显示，转PtrBADH株系长势优于WT。电导率测定发现野生型烟草在低温处理后的相对电导率更高(图7中B)，说明更严重的细胞膜伤害发生在了野生型烟草中，从而导致了更严重的电解质泄漏。此外，相对于WT烟草，转基因烟草积累的MDA含量更低(图7中C)。二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四哩(NBT)进行组织化学染色，测定H₂O₂和O₂ ^·-的积累量结果显示低温处理后，OE株系(#18、#26)H₂O₂和O₂ ^·-含量明显低于对照株系(图7中D/E)。显示PtrBADH参与了活性氧的清除，增强了植株对胁迫的耐受性。GB可以增强植物的抵御逆境胁迫的能力，因此对植株BADH酶活及GB含量进行测定，低温处理前后结果显示OE株系比WT酶活及GB含量显著升高(图8中A/B)，综上表明超表达PtrBADH使转基因烟草具有更高的耐寒抗冻能力。

实施例7：转PtrBADH基因柠檬抗寒性分析

为进一步探究PtrBADH是否也能提高柑橘的抗寒能力，我们将该基因在低温敏感的柠檬中进行超表达，并对盆栽土培的超表达柠檬(#7系和#4系)和野生型柠檬WT进行抗冻分析。低温处理前，超表达柠檬(#7系和#4系)和野生型柠檬WT长势基本一致，低温处理后，WT明显变弱，而超表达柠檬(#7系和#4系)较处理前无明显变化，常温恢复后，WT也未见明显恢复至处理前水平，而OE系几乎无明显变化(图10中A)，叶绿素荧光结果显示，低温处理前WT叶片呈深蓝色，而处理后，WT叶片蓝色近乎消失，常温恢复后结果显示WT叶片为未恢复，而超表达柠檬(#7系和#4系)叶片在低温处理前后及常温恢复后叶片着色为深蓝色，未发生明显变化(图10中B)。叶绿素荧光参数Fv/Fm值测定显示，低温处理前超表达柠檬(#7系和#4系)与野生型WT的Fv/Fm值无明显差异，而低温处理后及常温恢复后超表达柠檬Fv/Fm值明显高于野生型(图10中C)。

电导率测定发现野生型柠檬在低温处理后的相对电导率更高(图10中D)。此外，相对于WT柠檬，转基因柠檬积累的MDA含量更低(图10中E)。二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四哩(NBT)进行组织化学染色，测定H₂O₂和O₂ ^·-的积累量结果显示低温处理后，超表达柠檬株系(#7系和#4系)H₂O₂和O₂ ^·-含量明显低于对照WT株系(图10中F)。因此，在低温处理下转基因植株表现出更强的活性氧清除的能力，这可能是导致其低温抗性增强的重要原因。GB可以增强植物的抵御逆境胁迫的能力，因此对植株BADH酶活及GB含量进行测定，低温处理前后结果显示超表达柠檬株系(#7系和#4系)比WT的BADH酶活及GB含量显著升高(图11中A/B)，综上表明超表达PtrBADH使转基因柠檬具有更高的耐寒抗冻能力。

实施例8：VIGS材料鉴定及低温抗性分析

采用VIGS介导的方法，将该基因进行干涉。转化的植株用两对引物检测，一对是扩增TRV2引物，一对是扩增TRV1的引物，只有当转化植株能同时用两对引物扩增出条带时才被认定为阳性植株。TRV2-PtrBADH与TRV1共转的植株为实验组(TRV-PtrBADH)，TRV2空载与TRV1共转为对照组(TRV)。转化后对2个月苗龄的植株做阳性鉴定，鉴定出数13棵阳性植株(图12中A)，qRT-PCR对阳性苗PtrBADH进行了相对表达分析(图12中B)，结果显示，阳性植株中PtrBADH的表达量相对于空载被抑制到1％至70％，且普遍表达量较低，说明VIGS具有较高的干涉效率。

在低温处理前后，对PtrBADH干涉株系的表型及有关生理指标测定。低温处理前，干涉株系(TRV-PtrBADH)、对照植株(TRV)及干涉株系+GB处理(TRV-PtrBADH+GB)组在表型上并没有明显的区别，但是-2℃处理12h后，干涉植株的叶片萎蔫程度远高于对照植株(TRV)和干涉株系+GB处理(TRV-PtrBADH+GB)组(图13中A)。电导率及MDA含量测定显示，低温处理前，干涉株系(TRV-PtrBADH)、对照植株(TRV)及干涉株系+GB处理(TRV-PtrBADH+GB)相对较低且无明显差异，低温处理后，干涉植株的电导率及MDA含量远高于对照植株(TRV)和干涉株系+GB处理(TRV-PtrBADH+GB)组(图13B/C)。为进一步验证PtrBADH提高枳的抗寒性，对TRV、TRV-PtrBADH及TRV-PtrBADH+GB的叶绿素荧光、叶绿素荧光参数Fv/Fm值、GB含量、H₂O₂和O₂ ^·-的积累量进行了分析，结果显示，低温处理前，TRV、TRV-PtrBADH及TRV-PtrBADH+GB三组植物叶片叶绿素荧光呈深蓝色，低温处理后，TRV-PtrBADH组着色变浅，TRV和TRV-PtrBADH+GB组无明显变化(图14中A)。叶绿素荧光参数Fv/Fm值结果显示低温处理后TRV-PtrBADH组较TRV和TRV-PtrBADH+GB组显著降低(图14中B)。低温处理后，TRV-PtrBADH组较TRV和TRV-PtrBADH+GB组GB含量也显著降低(图14中C)。二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四哩(NBT)进行组织化学染色，测定H₂O₂和O₂ ^·-的积累量结果显示低温处理后，TRV-PtrBADH组较TRV和TRV-PtrBADH+GB组H₂O₂和O₂ ^·-着色加深明显(图14中D)。综上表明PtrBADH可以提高植物抵御寒冷的能力。

在PtrBADH基因抗寒验证中根据所用载体及PtrBADH基因序列所设计引物如下：

1、平末端(PZT4)克隆全长引物：

PtrBADH-pBI121-XbaI-F：5'-GCTCTAGAATGGCTTTTTTGTTTTCGTTGATCG-3'

PtrBADH-pBI121-BamHI-R：5'-CGGGATCCTCAATCATTCCTTCTACTGCTGACA-3'

2、亚细胞定位引物：

PtrBADH-101YFP-EcoRI-F:5'-CGGAATTCATGGCTTTTTTGTTTTCGTTGATCG-3'

PtrBADH-101YFP-BamHI-R：5'-CGGGATCCATCATTCCTTCTACTGCTGACAGGA-3'

3、一步法VIGS-BADH扩增片段：5`端跨启动子，共390bp

Trv-F：AGAAGGCCTCCATGGGGATCC TCTCACCGAGCAAATACGAGATC(BamH I)

Trv-R：TGTCTTCGGGACATGCCCGGG CTGAACTTTTGTTTCCGACTGCG(Sma I)

4、转基因阳性鉴定通用引物

超表达系

35S-F:5’-TCCTCGGATTCCATTGCCCAGC-3’

NPT II-F:5’-CGGCTATGACTGGGCACAACA-3’

NPT II-R:5’-CGGCAGGAGCAAGGTGAGATG-3’

干涉系

TRV1-F：5’-ATTGAGGCGAAGTACGATGG-3’

TRV1-R：5’-CCATCCACAATTATTTTCCGC-3’

TRV2-F：5’-ATTCACTGGGAGATGATACGCT-3’。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 枳抗寒基因PtrBADH及其在植物抗寒遗传改良中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1788

<212> DNA

<213> Poncirus trifoliata

<400> 1

atggcttttt tgttttcgtt gatcgtcctc gctttcgctt acgcgatctg tcgcttcttg 60

ctcatgctca tccctcccaa tgtgccttcc atcgacgtcg acgcatccga cgtgttggat 120

gacggaaacc aaacgccaga taacagtttc atttatatcc ctccgagagg aaggacgccg 180

cagtcggaaa caaaagttca gtgttatgag ccagcaacta tgaaatactt gggatacgtc 240

cctgcattat cgcgtgctga ggttgaggag cgcgtggcac aggcaaggaa ggcacaaaaa 300

gtatgggcaa aaagtagctt caagcaaaga cgtcagtttc tgcggatact tctgaagtat 360

attattgaac atcaagagct tatatgcgaa atctcttcgc gtgatactgg aaagacaatg 420

gtggatgcct ctttgggaga aataatgaca acatgtgaga agataacttg gcttctttct 480

gagggtgaga agtggctgaa gcctgaatac cggtcttctg gaaggtcaat gattcataag 540

aaagcaaagg tggagtttca tccccttggt gttgttggtg ctattgtatc atggaattat 600

ccttttcata atatctttaa tccaatgctg gcggcagtct tttctgggaa tggcattgtc 660

atcaaggttt cagaaaatgc aagttggtct ggatgtttct acttcagaat tattcaagca 720

gctcttgctg cagttggtgc tccagaaaac ctggttgatg taataacagg gtttgctgag 780

acaggggaag ccctggtgtc gtcagttgat aaaattatat ttgttggatc gcatggtgtt 840

ggtaagatga taatgagaaa tgcttccaag acccttacac cagttacact tgagcttggt 900

ggaaaagatg cttttattgt ttgtgatgat gtagacgtac ctcatgttgc tcaaattgct 960

gtcagggctg ctcttcagtc gagtgggcag aactgtgctg gggctgagag attttatgtc 1020

cacagggaca tttatgcttc gtttgtcggt caagtggcta aaatcgtgaa gtctgtttca 1080

gctggtccgc ctatagccgg aaagtatgat atgggagcct tatgcctgct ggagcactcg 1140

gaaaagcttc aaaaccttgt gaatgatgct ttagacaaag gagcagaaat tcttgcccgt 1200

ggaagttttg gccatttaag tgaaggtgca gttgatcagt atttccctcc tactgtgatt 1260

gtgaatgtaa atcacacaat gaagttaatg caagaagagg cttttggacc aataatgccc 1320

ataatgaaat tcgacactga tgaagaggta gtgaagctcg caaatgactc aagatatgga 1380

cttggatgcg ctgttttctc tggcagtcag caccgtgcta gggagttagc ttcccaaata 1440

caatgtgggg ttgctgcaat taatgatttt gcatcaaatt atatgtgtca gtccctgcca 1500

tttggtggtg tcaaggatag tggttttgga cgatttgccg gtgtagaggg attaagagcc 1560

tgctgccttg tcaaatctgt cgtcgaggat agatggtggc cgtatattaa aaccaagata 1620

cccaaaccca ttcagtatcc tgttgcggag aatggctttg agttccagga atcacttgta 1680

gaagcacttt atggcttgaa catatgggat cgtttgcgag cactggtcaa tgtattgaaa 1740

gtccttaccg aacaaaacac tcctgtcagc agtagaagga atgattga 1788

<210> 2

<211> 595

<212> PRT

<213> Poncirus trifoliata

<400> 2

Met Ala Phe Leu Phe Ser Leu Ile Val Leu Ala Phe Ala Tyr Ala Ile

1 5 10 15

Cys Arg Phe Leu Leu Met Leu Ile Pro Pro Asn Val Pro Ser Ile Asp

20 25 30

Val Asp Ala Ser Asp Val Leu Asp Asp Gly Asn Gln Thr Pro Asp Asn

35 40 45

Ser Phe Ile Tyr Ile Pro Pro Arg Gly Arg Thr Pro Gln Ser Glu Thr

50 55 60

Lys Val Gln Cys Tyr Glu Pro Ala Thr Met Lys Tyr Leu Gly Tyr Val

65 70 75 80

Pro Ala Leu Ser Arg Ala Glu Val Glu Glu Arg Val Ala Gln Ala Arg

85 90 95

Lys Ala Gln Lys Val Trp Ala Lys Ser Ser Phe Lys Gln Arg Arg Gln

100 105 110

Phe Leu Arg Ile Leu Leu Lys Tyr Ile Ile Glu His Gln Glu Leu Ile

115 120 125

Cys Glu Ile Ser Ser Arg Asp Thr Gly Lys Thr Met Val Asp Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Glu Ile Met Thr Thr Cys Glu Lys Ile Thr Trp Leu Leu Ser

145 150 155 160

Glu Gly Glu Lys Trp Leu Lys Pro Glu Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Ser

165 170 175

Met Ile His Lys Lys Ala Lys Val Glu Phe His Pro Leu Gly Val Val

180 185 190

Gly Ala Ile Val Ser Trp Asn Tyr Pro Phe His Asn Ile Phe Asn Pro

195 200 205

Met Leu Ala Ala Val Phe Ser Gly Asn Gly Ile Val Ile Lys Val Ser

210 215 220

Glu Asn Ala Ser Trp Ser Gly Cys Phe Tyr Phe Arg Ile Ile Gln Ala

225 230 235 240

Ala Leu Ala Ala Val Gly Ala Pro Glu Asn Leu Val Asp Val Ile Thr

245 250 255

Gly Phe Ala Glu Thr Gly Glu Ala Leu Val Ser Ser Val Asp Lys Ile

260 265 270

Ile Phe Val Gly Ser His Gly Val Gly Lys Met Ile Met Arg Asn Ala

275 280 285

Ser Lys Thr Leu Thr Pro Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asp Ala

290 295 300

Phe Ile Val Cys Asp Asp Val Asp Val Pro His Val Ala Gln Ile Ala

305 310 315 320

Val Arg Ala Ala Leu Gln Ser Ser Gly Gln Asn Cys Ala Gly Ala Glu

325 330 335

Arg Phe Tyr Val His Arg Asp Ile Tyr Ala Ser Phe Val Gly Gln Val

340 345 350

Ala Lys Ile Val Lys Ser Val Ser Ala Gly Pro Pro Ile Ala Gly Lys

355 360 365

Tyr Asp Met Gly Ala Leu Cys Leu Leu Glu His Ser Glu Lys Leu Gln

370 375 380

Asn Leu Val Asn Asp Ala Leu Asp Lys Gly Ala Glu Ile Leu Ala Arg

385 390 395 400

Gly Ser Phe Gly His Leu Ser Glu Gly Ala Val Asp Gln Tyr Phe Pro

405 410 415

Pro Thr Val Ile Val Asn Val Asn His Thr Met Lys Leu Met Gln Glu

420 425 430

Glu Ala Phe Gly Pro Ile Met Pro Ile Met Lys Phe Asp Thr Asp Glu

435 440 445

Glu Val Val Lys Leu Ala Asn Asp Ser Arg Tyr Gly Leu Gly Cys Ala

450 455 460

Val Phe Ser Gly Ser Gln His Arg Ala Arg Glu Leu Ala Ser Gln Ile

465 470 475 480

Gln Cys Gly Val Ala Ala Ile Asn Asp Phe Ala Ser Asn Tyr Met Cys

485 490 495

Gln Ser Leu Pro Phe Gly Gly Val Lys Asp Ser Gly Phe Gly Arg Phe

500 505 510

Ala Gly Val Glu Gly Leu Arg Ala Cys Cys Leu Val Lys Ser Val Val

515 520 525

Glu Asp Arg Trp Trp Pro Tyr Ile Lys Thr Lys Ile Pro Lys Pro Ile

530 535 540

Gln Tyr Pro Val Ala Glu Asn Gly Phe Glu Phe Gln Glu Ser Leu Val

545 550 555 560

Glu Ala Leu Tyr Gly Leu Asn Ile Trp Asp Arg Leu Arg Ala Leu Val

565 570 575

Asn Val Leu Lys Val Leu Thr Glu Gln Asn Thr Pro Val Ser Ser Arg

580 585 590

Arg Asn Asp

595

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctagaat ggcttttttg ttttcgttga tcg 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggatcctc aatcattcct tctactgctg aca 33

Claims

1.一种分离的基因，为枳抗寒基因PtrBADH，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述基因在提高植物抗寒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的基因在植株中进行超表达，可获得抗寒的转基因植株。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的植物为烟草、柠檬或枳。