CN116120413A - SlHAT5基因及其在番茄抗高温胁迫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及的是一种SlHAT5基因及其在番茄抗高温胁迫中的应用。本发明通过研究番茄HD‑ZIP家族转录因子SlHAT5株系，观察转基因植株与野生型植株在高温胁迫下的表型差异，并通过对处理样品的生理指标及相关基因表达水平的差异，筛选诱导其表达的基因及其互作蛋白，明确了该基因在番茄高温胁迫反馈中的作用机理，发现SlHAT5基因负向调控番茄对高温胁迫的耐受性，SlHAT5的超量表达可以降低植株的抗高温能力、抗氧化水平，同时参与ABA通路，并在高温胁迫下通过调控以上途径相关基因，提高番茄植株对高温胁迫的敏感性。本专利为番茄的高温胁迫反馈研究及耐高温番茄种质资源的培育奠定基础。

Description

SlHAT5基因及其在番茄抗高温胁迫中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及的是一种SlHAT5基因及其在番茄抗高温胁迫中的应用。

背景技术

随着温室效应的日益加剧，全球极端气候出现频率逐渐增大。其中，高温作为常见的自然灾害，其出现的程度和次数都呈上升趋势。而高温导致的高温胁迫作为非生物胁迫的一种，是植物生存面临的重要挑战。严重的高温胁迫致使植物出现生理生化上的伤害，损伤其细胞，干扰其体内正常的分子调节机制，对植物造成不可逆的损伤。因此，研究植物对高温胁迫的自我适应与抵抗调控机制作为对植物抗逆性研究的重要一环成为当前研究热点。

番茄作为世界广泛种植的蔬菜之一，其产量和质量都是人们关注的焦点。现有研究表明，高温胁迫对番茄的正常生长造成了极为严重的影响，因此，对作为高等植物中基因功能研究模式植物之一的番茄进行抗高温特性的研究，不仅有助于人们发现并明确其体内对高温胁迫的反馈机制，也为培育耐高温番茄新品种奠定了一定的分子基础。研究发现HD-ZIP转录因子在植物体内生长发育及多种胁迫反馈上都有着不可或缺的作用。而在番茄中，已证实有大量转录因子参与了植株的高温胁迫响应，但HD-ZIP家族作为一类重要的转录调控因子，其于高温胁迫中的重要作用仍鲜见报道。

已多项研究发现，HD-ZIP家族转录因子与植物高温胁迫息息相关。例如，在玉米中，超表达向日葵Hah-4基因可有效增强其对高温胁迫的抗性(Colombo et al.,2017)；LpHOX21在多年生黑麦草耐热品种中表达上调，这表明它可能参与增强了黑麦草对耐热胁迫的抵抗力(Wang et al.,2019)；通过对黄瓜体内HD-ZIP家族基因进行筛选，发现该亚家族的两个成员CsHDZ02和CsHDZ33受到高温胁迫的诱导而表达(Sharif et al.,2020)；过表达HaHB4基因的转基因大豆植株通过激活热休克蛋白AT-HSC70-1、AT-HSFB2A和Hsp81.4的转录活性，表现出更好的高温胁迫耐受能力，而该转基因植株也因此减轻了结荚过程中的高温损伤，从而获得了更高的产量(Ribichich et al.,2020)。

本专利在前期对于逆境胁迫转录因子的筛选中，获得了转录因子SlHAT5，进一步研究发现，HD-ZIP家族成员SlHAT5在番茄对高温胁迫的应答中具有重要作用。基于此，本专利通过生物信息学分析、转基因技术、生理生化指标检测、转录水平分析等多种方法，深入挖掘HD-ZIP转录因子SlHAT5在番茄体内抗高温的机制。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种提高番茄抗高温能力的HD-ZIP转录因子SlHAT5基因，本发明研究发现SlHAT5基因超表达株系可显著提高番茄植株对高温胁迫的敏感性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

提高番茄抗高温能力的HD-ZIP转录因子SlHAT5基因，所述SlHAT5基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述SlHAT5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述SlHAT5基因的表达受到激素的诱导；所述激素包括ABA、Eth、JA、GA、SA中的任一种或几种。

更进一步，所述SlHAT5基因的表达量在Eth处理12h后显著下调；在ABA处理6h后显著上调；JA处理6h后显著上调，JA处理12h后均显著下调；GA处理1h和24h时，SlHAT5基因的表达量显著高于野生型，并在12h出现短暂下调；SA处理1h，SlHAT5基因的表达量显著上调，且上调趋势随时间推移逐渐减缓，并在24h表达量出现下调。

更进一步，所述Eth抑制SlHAT5的表达。

进一步，所述SlHAT5基因3000bp启动子中有许多不同类型的顺式作用元件，包括光响应顺式作用元件，参与防御和应激反应的顺式作用元件，以及水杨酸、茉莉酸、脱落酸、生长素等激素响应元件。

进一步，所述SlHAT5基因在组成花器官的各个部分(尤其是花瓣)中的表达水平最高，而在根、茎、不同成熟度的叶片及不同时期的果实中，SlHAT5基因的表达水平均较低，约为花中表达量的1/100。

本发明的目的之二在于提供一种调控所述SlHAT5基因对植物逆境胁迫响应的基因。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

调控所述SlHAT5基因对植物逆境胁迫响应的基因，所述基因为SlPLL(NCBI登录号为：XM_004233304)、SlPC(NCBI登录号为：NM_001309263)、SlDD2(NCBI登录号为：XM_004230247)、SlRBCS4(NCBI登录号为：NM_001309210)、SlGAPDH(NCBI登录号为：XM_004236801)和DnaJ(NCBI登录号为：XM_004239689)。

本发明的目的之三在于提供一种调控目的二所述基因的筛选方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

调控SlHAT5基因对植物逆境胁迫响应的基因的筛选方法，所述方法为：以SlHAT5为饵蛋白，利用酵母单杂交技术，筛选均一化的酵母文库，筛选得到调控所述SlHAT5基因对植物逆境胁迫响应的基因，并进行酵母点对点验证。

本发明的目的之四在于提供一种所述SlHAT5基因的互作蛋白。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

所述SlHAT5基因的互作蛋白，所述互作蛋白为SlVDAC(NCBI登录号为：XM_004233301)、SlCP3L(NCBI登录号为：XM_004243659)、Dp-1(NCBI登录号为：XM_004249087)、SlNBRL1(NCBI登录号为：XM_004241451)、SlBELL6(NCBI登录号为：XM_026028738)和DnaK(NCBI登录号为：XM_004230397)。

本发明的目的之五在于提供一种所述互作蛋白的筛选方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

所述互作蛋白的筛选方法，所述方法为：以SlHAT5为饵蛋白，利用酵母双杂交技术，筛选均一化的酵母文库，筛选得到SlHAT5基因的互作蛋白，并进行酵母点对点验证。

本发明的目的之六在于提供一种超表达SlHAT5基因的番茄株系的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种超表达SlHAT5基因的番茄株系的制备方法，具体包括以下步骤：

S1：构建超表达载体：采用限制性核酸内切酶BamHI和SacI对所述SlHAT5基因及pVCT2024载体进行双酶切，再采用T4连接酶连接两个酶切片段，构建PVCT2024-SlHAT5超表达载体；

S2：番茄的遗传转化：将S1获得的SlHAT5基因超表达载体转入农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导法侵染番茄子叶进行番茄转化；

S3：利用qRT-PCR技术筛选得到SlHAT5基因超量表达的番茄株系。

进一步，高温胁迫下，超表达SlHAT5基因的番茄植株叶片叶绿素含量显著低于野生型番茄植株叶片；高温胁迫使超表达株系中叶绿素的积累受到抑制。

更进一步，高温胁迫下，超表达株系植株呈现出严重的萎蔫特征，且叶片枯萎。

进一步，超表达SlHAT5基因的番茄植株丙二醛含量为野生型番茄植株的2倍；SlHAT5基因的超量表达提升了高温胁迫对植株细胞膜的损伤。

进一步，SlHAT5基因的超量表达对植株细胞对体内的ROS清除产生干扰。

本发明的目的之七在于提供一种所述番茄转录因子SlHAT5基因在提升番茄抗高温能力和抗氧化水平中的应用，通过构建低表达SlHAT5基因的番茄株系，提升番茄抗高温能力和抗氧化水平。

本发明的目的之八在于提供一种所述番茄转录因子SlHAT5基因在耐高温番茄育种中的应用，通过筛选出低表达SlHAT5基因的番茄植株，获得耐高温的番茄种子。

本发明的有益效果在于：

1.本发明在番茄中发现了SlHAT5基因，同时发现该基因在植物对逆境处理的响应中发挥重要作用。本发明初步明确了SlHAT5基因在番茄高温胁迫反馈中的作用机理，为番茄的高温胁迫反馈研究及耐高温番茄种质资源的培育奠定基础。

2.本发明研究发现SlHAT5的超量表达降低了细胞膜在高温胁迫下稳定性，增强了其通透程度，显著的增加了番茄对高温胁迫的敏感性，提升了其受到高温胁迫的伤害程度；同时发现，在高温胁迫下，SlHAT5的超量表达显著降低了植株体内活性氧清除系统中多个酶的活性，使得植物细胞壁受损程度更加严重，进而提升了SlHAT5超表达番茄植株对于高温胁迫的敏感性。并且发现SlHAT5在高温诱导体内激素通路中扮演重要角色。

3.本发明研究发现，超表达SlHAT5通过影响高温胁迫相关基因、抗氧化相关基因及ABA通路相关基因来改变番茄对高温胁迫的敏感性。高温胁迫作用于植物体内的SlPLL、SlPC、SlDD2、SlRBCS4、SlGAPDH及DnaJ等基因，这些基因调控SlHAT5行使功能，而SlHAT5抑制了本应在高温胁迫下受到诱导的ABA通路各基因的表达；同时，SlHAT5与SlVDAC、SlCP3L、Dp-1、SlNBRL1、SlBELL6和DnaK互作，并调控HSFA1的SUMO化，进而影响HsfA2、HsfB1的表达。

附图说明

图1为SlHAT5基因扩增结果；

图2为SlHAT5启动子扩增结果；

图3为SlHAT5与同源蛋白的系统发育进化树；

图4为SlHAT5在番茄AC++各部位的表达模式(R：根；S：茎；YL：幼叶；ML：成熟叶；SL：老叶；Sp：萼片；St：雄蕊；Pe：花瓣；Pi：雌蕊；AZ：离层；IMG：青果期；MG：绿熟期；B：破色期；B+4：破色4天；B+7：破色7天)；

图5为番茄叶片中SlHAT5在光周期及外源激素处理下的相对表达模式，图5-A：光周期；图5-B：1mM Eth处理；图5-C：100μM ABA处理；图5-D：100μM JA处理；图5-E：100μM GA处理；图5-F：100μM SA处理，差异显著性*：p<0.05，**：p<0.01；

图6为番茄中SlHAT5在不同逆境处理诱导下的表达模式，图6-A～图6-C：高、低温胁迫处理；图6-D：干旱-复水处理；图6-E：淹水处理；图6-F：高盐胁迫处理(叶片)，差异显著性*：p<0.05，**：p<0.01；

图7为pVCT2024-SlHAT5菌落PCR检测(M：DL2000+Marker；1-9：pVCT2024-SlHAT5菌落样品；10：CK+，阳性对照；11：CK-，阴性对照)；

图8为CRISPR/Cas9-SlHAT5载体菌落PCR检测(M：DL2000+Marker；1-2：SlHAT5-A菌落样品；3：SlHAT5-B菌落样品；4：SlHAT5-C菌落样品；5：CK+，阳性对照；6：CK-，阴性对照)；

图9为番茄的遗传转化(A：分化培养的番茄子叶；B：抗性愈伤组织；C：生根培养的番茄植株)；

图10为部分转基因植株的阳性筛选(M：DL2000+Marker；1：CK+，阳性对照；2：CK-，阴性对照；3-9：转PVCT2024-SlHAT5独立株系；10-13：CRISPR-Cas9株系)；

图11为T₀代超表达植株的SlHAT5基因表达量检测(差异显著性*：p<0.05，**：p<0.01)；

图12为SlHAT5超表达株系高温胁迫处理和常温对照的表型(Before：处理前；After：处理后；Heat Stress：高温处理；Control：对照)；

图13为SlHAT5超表达株系高温胁迫处理下的表达量检测和生理指标测定(A：高温处理及常温对照下超表达株系及AC++中SlHAT5的表达量检测；B：叶绿素含量；C：丙二醛含量；D：超氧化物歧化酶活性；E：过氧化物酶活性；F：过氧化氢酶活性；差异显著性*：p<0.05，**：p<0.01)；

图14为抑制pAbAi-SlHAT5酵母生长的金担子素(AbA)浓度筛选(ng/mL)；

图15为单克隆阳性PCR检测(M：DL2000+Marker；1-9：阳性菌落样品；10：CK-，阴性对照)

图16为调控SlHAT5的基因的酵母单杂交验证；

图17为pGBKT7-SlHAT5酵母表达载体的构建(M：DL2000+Marker；1-8：阳性菌落样品；9：CK+，阳性对照；10：CK-，阴性对照)；

图18为部分单克隆阳性PCR检测(M：DL2000+Marker；1-39：阳性单克隆样品；40：阴性对照)；

图19为SlHAT5互作蛋白的酵母双杂交验证；

图20为SlHAT5互作蛋白对应基因在番茄叶片受到高温胁迫下的表达谱(CK：对照组；HT：高温胁迫处理组)；

图21为SlHAT5超表达株系高温胁迫处理下高温胁迫相关基因的表达水平检测(差异显著性*：p<0.05，**：p<0.01)；

图22为SlHAT5超表达株系高温胁迫处理下抗氧化相关基因的表达水平检测(差异显著性*：p<0.05，**：p<0.01)；

图23为SlHAT5超表达株系高温胁迫处理中ABA相关基因的表达检测(差异显著性*：p<0.05，**：p<0.01)；

图24为SlHAT5基因在番茄中响应高温胁迫的调节网络示意图。

具体实施方式

下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

实施例1.SlHAT5基因序列的克隆及生物信息学分析

1.SlHAT5基因及其启动子的克隆和PCR产物的凝胶电泳检测

(1)SlHAT5基因及其启动子的克隆：根据已获得的SlHAT5基因CDS及启动子序列，以番茄AC++叶片的cDNA及gDNA为模板，以基因特异性引物SlHAT5-F/SlHAT5-R和proSlHAT5-F/proSlHAT5-R为扩增引物，使用高保真酶对这两个序列分别进行PCR扩增，扩增体系为：5μL SYBR+0.5μL Primer-F(5μM)+0.5μL Primer-R(5μM)+2μL cDNA+2μL RNase-free H₂O；反应程序为：①94℃反应20s；②94℃反应10s；③最适退火温度反应20s；④溶解曲线程序，其中，程序②和③循环40次。

实时荧光定量PCR：保证结果准确性，对设计的荧光定量引物进行了最适退火温度的摸索，温度梯度范围为55℃-65℃，设置三个技术重复。

相关引物设计：采用Primer Premier 5.0引物设计软件设计SlHAT5基因特异性扩增及相关定量检测引物，详见表1。

PCR产物(目的基因片段)纯化回收后，将纯化后的目的片段与线性化平末端克隆载体pESAY-Blunt进行连接以进一步验证扩增出的目的片段，连接体系为：20ng SlHAT5基因/启动子片段+1μL pEASY-Blunt Cloning Vector+to 5μL ddH₂O，25℃20min连接。

表1.SlHAT5基因相关的特异性扩增及检测引物序列

(2)PCR产物的凝胶电泳检测：称取0.5g琼脂糖粉末于50mL 1×TAE溶液中，加热至缓冲液中无油滴状物质，稍晾凉后加入1μL 10×Gene Green核酸染料混匀后倒入制胶槽，凝固后备用。吸取5μL上述PCR产物，加入1μL 6×Loading Buffer，点样，电压150V，12min进行电泳，观察电泳结果。

结果：对SlHAT5 CDS序列进行扩增后以电泳检测，产物条带大小为867bp，连入pEASY-Blunt克隆载体并转化大肠杆菌并测序，SlHAT5基因扩增结果如图1所示，图1中M为DL2000+Marker；1、2为扩增产物，测序结果和茄科基因组网站上获得的SlHAT5基因序列相似度为100％。对SlHAT5启动子序列进行扩增后以电泳检测，产物条带大小为1432bp，连入pEASY-Blunt克隆载体并转化大肠杆菌并测序，SlHAT5启动子扩增结果如图2所示，图2中M为DL2000+Marker；1、2为扩增产物，测序结果和茄科基因组网站上获得的SlHAT5基因启动子序列相似度为100％。

2.生物信息学分析

为预测转录因子SlHAT5的保守结构与推测其所属转录因子家族，我们使用NCBI对其进行保守结构域预测；并使用ExPASy-Translatetool、SOPMA及ExPASy-SWISS-MODEL对SlHAT5的氨基酸序列进行分析，并对该蛋白的理化性质及结构进行预测。为了明确SlHAT5在系统进化中的位置及与其它同源蛋白的发育关系，使用NCBI-Blastp筛选出SlHAT5的同源蛋白，并使用MEGA6.0中的NJ法建立系统发育树，并使用FigTree v1.4.3对该树进行美化；同时，为了推测SlHAT5在细胞内的具体存在部位，使用Predict-Protein对SlHAT5进行亚细胞定位预测。为了预测SlHAT5在植物中可能存在的功能，在NCBI中下载得到了SlHAT5的启动子区3000bp序列，并将该段序列置于PlantCARE中，分析其上元件及具体功能。

结果：

(1)SlHAT5蛋白的性质及结构预测：使用ExPASY翻译出的SlHAT5的氨基酸序列与NCBI中下载得到的序列进行比对确认，相似度为100％。由软件分析可得：SlHAT5编码288个氨基酸，分子量为33416.99Da，理论等电点为4.94，是含有36个带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)、52个带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)的带负电不稳定疏水蛋白，其氨基酸组成包括Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val，其中77.8％的氨基酸残基暴露在外面，22.22％深埋在内部。SlHAT5含有31.25％的螺旋、9.03％的延伸链、1.74％的β-转角以及57.99％的无规则卷曲，预测SlHAT5蛋白位于细胞核内。

(2)SlHAT5蛋白的同源比对及系统发育分析：NCBI显示，SlHAT5蛋白具有典型HD、LZ结构域，可归属为HD-ZIP家族蛋白。以Multalin对番茄SlHAT5蛋白(XP_004238764.1)及其他物种中的同源蛋白序列如，辣椒CaHOX16(KAF3648869.1)，烟草NtHB54-like(XP_009594284.1)，蒺藜苜蓿MtHAT5(XP_003608986.1)，拟南芥AtHAT5(NP_186796.1)，玉米ZmHAT5(AQK74514.1)进行比对，并对这些序列进行系统发育分析，发现SlHAT5与辣椒CaHOX16聚类在一起，推测其功能具有相似性，详见图3。

(3)SlHAT5基因启动子顺式作用元件分析：SlHAT5基因3000bp启动子中有许多不同类型的顺式作用元件，除含有大量的光响应顺式作用元件外，还包含有参与防御和应激反应的顺式作用元件及水杨酸、茉莉酸、脱落酸、生长素等激素响应元件，详见表2。

表2.SlHAT5 3000bp启动子区域顺式作用元件分析

位点名称	序列	数目	功能
				TC-rich repeats	ATTCTCTAAC	1	参与防御和应激反应
ARE	AAACCA	3	参与厌氧诱导
				GC-motif	CCCCCG	1	参与厌氧诱导
GATA-motif	AAGGATAAGG/GATAGGA	2	参与光响应
				AT1-motif	AATTATTTTTTATT	2	参与光响应
chs-CMA1a	TTACTTAA	1	参与光响应
				G-box	TACGTG	5	参与光响应
TCT-motif	TCTTAC	1	参与光响应
				Box 4	ATTAAT	8	参与光响应
I-Box	AGATAAGG/GATAAGGTC	2	参与光响应
				TCA-element	CCATCTTTTT	1	参与水杨酸反应
TGACG-motif	TGACG	2	参与茉莉酸反应
				CGTCA-motif	CGTCA	2	参与茉莉酸反应
ABRE	ACGTG	3	参与脱落酸反应
				AuxRE	TGTCTCAATAAG	1	参与生长素反应

实施例2.SlHAT5基因在番茄各部位的表达模式及不同诱导因素下的表达水平分析

1.零处理样品的获取以及SlHAT5基因在番茄AC++各部位的表达分析

将番茄AC++种植于网室中，收取番茄AC++的根、茎、不同成熟度叶片(幼叶、成熟叶、老叶)、花的各个部分(雄蕊、花瓣、雌蕊、离层、萼片)、青果期、绿熟期、破色期、破色后4天(4days after breaker，B+4)和破色后7天(7days after breaker，B+7)五个不同成熟时期的果实样品，液氮速冻，收取完成后放置在-80℃冰箱保存。

本专利通过qRT-PCR检测SlHAT5基因在番茄各组织中的表达模式，以明确SlHAT5基因在番茄各部位的表达水平，结果如图4所示。SlHAT5基因在组成花器官的各个部分(尤其是花瓣)中的表达水平最高，而在根、茎、不同成熟度的叶片及不同时期的果实中，SlHAT5基因的表达水平均较低，约为花中表达量的1/100。进一步，本专利对转SlHAT5基因番茄植株的开花期、花形态、果实颜色、形态、成熟期等指标进行观察统计，并未发现与野生型的显著差异，故未在花相关方向进行进一步研究。

2.激素处理样品的获取以及SlHAT5基因在光周期和多种激素处理下的表达分析

将番茄AC++播种于营养钵中，待植株长至五叶一心时，配制浓度为100μM的水杨酸(SA)、赤霉素(GA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)及1mM的乙烯(Eth)溶液，并分别喷施在番茄植株的叶片正面，至叶面有水且不滴流，分别在0h、1h、6h、12h、24h收取根、茎、叶的样品(光周期设置为16h light/8h dark)。以液氮速冻各样品材料并置于-80℃冰箱保存。

为了确定SlHAT5基因的表达是否受到激素的诱导，在对番茄AC++外源喷施ABA、Eth、JA、GA和SA后，以光周期样品作为对照，分别分析番茄叶片中SlHAT5基因在激素诱导下不同时段的表达水平。结果如图5所示，SlHAT5基因的表达量在Eth处理12h后表达量显著下调；在ABA处理6h后显著上调；在JA处理下，SlHAT5基因的表达量在6h上调，而在12h后均呈显著下调趋势；在GA处理1h和24h时SlHAT5基因的表达量显著高于野生型，而在12h出现短暂下调；在SA处理1h，SlHAT5基因的表达量表现出显著上调且随时间推移至上调趋势减缓，并在24h表达量出现下调。据此推测SlHAT5基因在番茄中的表达可能受到ABA、JA、GA和SA等激素的诱导，而Eth能抑制SlHAT5的表达。

3.逆境处理样品的获取以及SlHAT5基因在非生物胁迫下的表达分析

将番茄AC++播种于营养钵中，待植株长至五叶一心时，选取长势一致的植株进行温度、干旱、淹水及高盐逆境处理(光周期设置为16h light/8h dark)，在一段时间后分别采取根、茎、叶，于-80℃冰箱保存。具体处理及取样时间点如下：

①温度处理：将植株置于恒温培养箱中，并将温度调至42℃/4℃处理24h，以24℃作为对照，在0h、4h、8h、24h取样。

②干旱处理：待植株生长至五叶一心时，停止浇水至植物出现干旱胁迫造成的萎蔫表型，并进行复水处理24h。在干旱处理0h、停止时及复水后2h、4h、8h、24h取样。

③淹水处理：将植株置于盛满水的托盘中(保持营养钵排水口始终位于水面下)8d，并在处理0d、2d、4d、8d进行取样。

④盐胁迫处理：将植株置于不同浓度(100mM、200mM、300mM、400mM、500mM)的盐溶液中，以淹水处理样品作为对照，在处理24h时取样。

本专利对不同非生物胁迫下的番茄AC++中SlHAT5基因表达水平进行检测，以明确各种非生物胁迫对SlHAT5基因表达水平的影响。结果如图6所示，在37℃高温及4℃低温处理下，SlHAT5基因表达水平均呈现显著上调趋势；而当番茄受到干旱胁迫时，叶片和茎中该基因表达量显著下降，复水后，该基因的表达量仅在根中显现出升高的趋势。在淹水处理下2d和4d，SlHAT5表达量在根和叶片中均出现显著上调，而8h后，该基因在茎和根中表达量也呈显著升高趋势。在NaCl浓度超过300mM后，SlHAT5在番茄植株中的表达量呈现显著升高。依此，我们推测高低温、淹水、高盐胁迫可促进SlHAT5基因的表达，而干旱胁迫则反之。其中，高温、低温及盐胁迫对番茄植株中SlHAT5基因的表达促进作用均较强。重庆夏季温度高，因此本专利选定高温胁迫作为SlHAT5基因功能的研究方向。

实施例3.植物表达载体的构建及番茄的遗传转化

1.超表达及CRISPR/Cas 9载体的构建

(1)pVCT2024-SlHAT5超表达载体的构建

使用限制性核酸内切酶BamHI和SacI对连接至克隆载体上的SlHAT5基因及pVCT2024载体进行双酶切后，胶回收获取酶切片段，使用T4连接酶对这两个片段其进行连接，构建PVCT2024-SlHAT5超表达载体。

①酶切及连接

酶切体系为：2μg质粒/目的基因+2μL限制性内切酶+5μL限制性内切酶Buffer+to50μL ddH₂O，37℃过夜酶切，对酶切产物进行纯化回收，测定浓度后进行连接，连接体系为：0.01pmol酶切后的载体质粒+0.03～0.1pmol酶切后的目的基因片段+0.7μL T4 DNA连接酶+1μL 10×T4 Buffer+to 10μL ddH₂O，16℃过夜连接。

②连接产物的转化

1)向5μL连接产物中加入10μL 5×KCM，35μL ddH₂O并混匀；

2)取出保存的DH5α感受态置于冰上，待其融化至冰水共存时将(1)中混合液加入；

3)冰浴静置25min后，37℃水浴5min，加入700μL LB液体，37℃220rpm震荡培养1h；

4)6000rpm离心5min，保留100μL上清重悬菌体；

5)将重悬液涂布在LB+Kan(50mg/L)固体培养基上，37℃倒置黑暗过夜培养。

③阳性菌落检测

将过夜培养的菌板取出，挑取长势大小规则的单菌落分别于10μL无菌水中，充分吸打混匀，吸出2μL用于PCR检测，剩余菌液于4℃冰箱保存。使用通用引物M13F与基因特异性扩增后引物SlHAT5-R、proSlHAT5-R分别进行单菌落检测，检测体系为：2.50μL 10×TaqBuffer+0.5μL dNTPs+1.00μL Primer-F(5μM)+1.00μL Primer-R(5μM)+0.25μL Taq酶+2.00μL菌液+17.75μL ddH₂O，阳性菌落检测程序为：1)预变性，95℃反应3min；2)变性，95℃反应15s；3)退火，55℃反应15s；4)延伸，72℃反应1kb/min；5)后延伸，72℃反应5min，其中，程序2)、3)、4)循环35次。取PCR反应产物进行琼脂糖电泳，观测其是否为阳性、片段大小是否正确。将阳性且片段大小正确的扩增产物对应菌液接种于10mL LB+Kan(50mg/L)液体培养基中扩繁10-16h。吸出600μL扩繁后菌液加于预先配制的300μL 60％甘油中作为甘油菌保存，其余菌液离心后保留干菌体用于质粒提取，具体方法详见诺唯赞质粒提取试剂盒说明书。将提取的质粒取10μL进行测序验证，剩余质粒样品保存于-20℃冰箱待后续使用。

结果：将连接至pEASY-Blunt的SlHAT5基因片段和pVCT2024载体进行酶切并连接为一个重组载体，转化大肠杆菌后进行PCR检测，条带大小为867bp，如图7所示，提取质粒并测序验证，测序结果与SlHAT5基因CDS序列相一致，表明构建pVCT2024-SlHAT5超表达载体成功。

(2)CRISPR/Cas9载体构建

CRISPR/Cas9载体构建过程如下：

①突变位点目的片段的扩增

从SlHAT5 gDNA序列的上游、下游分别找一个符合条件的Cas9识别位点，构建CRISPR/Cas9载体SlHAT5-A、SlHAT5-B、SlHAT5-C。通过PCR合成突变位点目的片段SlHAT5-a、b、c，SlHAT5基因及其启动子的扩增体系为：2μL PrimeSTAR Max Premix(2x)+2μLPrimer-F(5μM)+2μL Primer-R(5μM)+20ng cDNA+to 50μL ddH₂O；SlHAT5基因及其启动子的扩增程序为：1)预变性，98℃反应2min；2)变性，98℃反应30s；3)退火，55℃反应30s；4)延伸，72℃反应1kb/min；5)后延伸，72℃反应2min，其中，程序2)、3)、4)循环35次。前后引物各加10μL，混匀，用双链DNA片段合成程序进行互补，形成双链DNA片段。双链DNA片段合成程序为：1)95℃反应30s；2)50℃反应30s；3)保持4℃。

②酶切：使用酶切体系对载体pKSE401进行37℃酶切3-4h，对酶切后的大片段进行胶回收，保存于-20℃备用；酶切体系为：2μg pKSE401+5μL BsaⅠBuffer+1μL BsaⅠ+to 50μLddH₂O。

③连接：将①得到的双链DNA片段与②得到的酶切后的pKSE401进行连接，连接体系同(1)pVCT2024-SlHAT5超表达载体的构建中的①。

④连接产物的转化及阳性菌落检测：步骤同(1)pVCT2024-SlHAT5超表达载体的构建中的②和③。

结果：将片段SlHAT5-A、SlHAT5-B、SlHAT5-C与酶切后的pKSE401载体进行连接，转化后进行PCR检测，条带大小为423bp，如图8所示，提取质粒并测序验证，结果表明构建SlHAT5基因的CRISPR/Cas 9敲除载体SlHAT5-A、SlHAT5-B和SlHAT5-C成功。

(3)pAbAi-SlHAT5载体构建

使用SacI和SmaI对连接至pEASY-Blunt的proSlHAT5片段和pAbAi空载体进行酶切，分别进行切胶回收后，测定回收产物浓度，用T4连接酶将这两个片段连接以构建pAbAi-SlHAT5酵母表达载体，酶切、连接体系及时间详见(1)pVCT2024-SlHAT5超表达载体的构建中的①。连接后使用BstBI进行酶切，体系及时间详见(1)pVCT2024-SlHAT5超表达载体的构建中的①。

(4)pGBKT7-SlHAT5载体构建

使用NcoI和BamHI对连接至pEASY-Blunt的SlHAT5片段和pGBKT7空载体进行酶切，分别进行切胶回收后，测定回收产物浓度，用T4连接酶将这两个片段连接以构建pGBKT7-SlHAT5酵母表达载体，酶切、连接体系及时间详见(1)pVCT2024-SlHAT5超表达载体的构建中的①。

2.番茄的遗传转化SlHAT5转基因番茄的培育及阳性鉴定

采用农杆菌介导法侵染番茄子叶进行遗传转化，生根培养基中抗性植株生根后，将其上覆膜掀开进行3-5d炼苗，待该植株完全适应外部环境后，洗去植株上残余的培养基，移栽至营养钵中，进行其后的筛选工作。待筛选后移栽至网室。

具体为：将SlHAT5基因超表达载体和3个不同突位点的CRISPR-Cas9载体分别转入农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导法侵染无菌的番茄外植体子叶，共培养48h后，转入筛选培养基上继续进行分化培养，获得独立的抗性愈伤组织，最后进行生根培养，并在炼苗后种植于土壤中，详见图9。

通过番茄的遗传转化，共获得49个转SlHAT5基因独立株系，其中30个转PVCT2024-SlHAT5基因株系及12个转SlHAT5基因CRISPR-Cas9株系。以转基因生根植株的叶片DNA为模板，利用Kanr区域设计的引物NPTⅡ-F/NPTⅡ-R检测外源基因整合到番茄基因组中的情况，检测情况表明该30个转PVCT2024-SlHAT5独立株系及12个CRISPR-Cas9独立株系均为转基因阳性植株。部分转基因阳性植株PCR检测结果如图10所示。

3.SlHAT5超表达及CRISPR/Cas9番茄株系的筛选

(1)转SlHAT5基因阳性番茄植株的筛选

采用DNA快速释放法获取转基因阳性植株的DNA，在1.5mL离心管中加入30μL TPS缓冲液，取适量番茄幼叶于离心管中捣碎至均匀无明显块状叶片，沸水浴10min，冰上冷却至室温，加入70μL ddH₂O，高速离心2min，即得到DNA粗提液。利用普通番茄中不含有Kanr区段这一特点，对阳性植株中Kanr区段进行PCR扩增并采用电泳检测扩增结果。PCR反应体系为：10μL 2×Taq Master Mix+1μL Primer-F(5μM)+1μL Primer-R(5μM)+8μL DNA粗提液；检测程序为：①预变性，94℃反应2min；②变性，94℃反应30s；③退火，55℃反应30s；④延伸，72℃反应2kb/min；⑤后延伸，72℃反应2min，其中程序②③④循环30次。

(2)转基因阳性植株中SlHAT5基因表达量的筛选

对转SlHAT5基因超表达阳性植株的总RNA进行提取，反转得到cDNA，利用实时荧光定量PCR对获得的30个转PVCT2024-SlHAT5独立株系中SlHAT5基因的表达水平进行了检测，引物详见表1。收取这些株系的幼嫩叶片组织进行检测，并比较这些株系中SlHAT5基因表达量与番茄AC++中该基因表达量，结果如图11所示，其中OE-2、OE-3、OE-5、OE-9、OE-11、OE-14、OE-54这7个转PVCT2024-SlHAT5基因株系为超表达株系，表达倍数依次为2.9×、3.0×、3.0×、3.7×、6.1×、6.1×、5.0×，后续主要以这3个超表达株系((高于野生型3倍))进行研究。

(3)SlHAT5敲除株系的鉴定

在CRISPR敲除株系的鉴定时，先以CTAB法提取12株转基因阳性CRISPR-Cas9植株和AC++的gDNA，再以高保真酶扩增敲除区段，扩增体系为：2μL PrimeSTAR Max Premix(2x)+2μL Primer-F(5μM)+2μL Primer-R(5μM)+20ng cDNA+to 50μL ddH₂O；扩增程序为：1)预变性，98℃反应2min；2)变性，98℃反应30s；3)退火，55℃反应30s；4)延伸，72℃反应1kb/min；5)后延伸，72℃反应2min，其中，程序2)、3)、4)循环35次。电泳检测后测序，将测序结果与番茄AC++同段序列进行比较，发现SlHAT5-B有一个株系SlHAT5-B-10序列发生突变，在102bp处增加了一个碱基T，由于基因编辑的偏好性，其余11株均未成功编辑。

本专利对SlHAT5-B-10突变后对应的蛋白序列进行预测，以推测这一突变对于SlHAT5基因功能行使上的影响，结果发现，碱基T的增加造成了移码，经过预测，SlHAT5-B-10的蛋白序列只剩下26个氨基酸或较野生型前35个氨基酸存在变化，试剂变化仍有待进一步探究。但对其T₀代植株进行花及果实的表型观察，并未发现相比于野生型存在差异，推测这一基因可能为花及果实发育中的冗余基因，而其功能则有待进一步确认。

实施例4.转SlHAT5基因番茄植株在高温胁迫下的表型观察及样品收集

1.植物材料的准备：

选取颗粒饱满的番茄AC++种子和表达量最高的三个转SlHAT5基因株系番茄种子，于28℃恒温培养箱中催芽；将露白种子播种于营养钵中(每钵3颗)，长出2片真叶时进行阳性植株筛选，筛选后分苗于10cm的营养钵中；长出4片真叶时超表达植株筛选；植株总培养时长约45天时(16h light/8h dark，24℃)，进行高温胁迫处理。

2.高温胁迫处理及样品收取：

将已培养45天的番茄植株进行高温处理，处理前使幼苗及盆中土壤具备充足的水。将幼苗(各株系及野生型)均分为实验组与对照组两组，处理组放于42℃恒温培养箱(16h light/8h dark，42℃)，对照组置于24℃培养箱(16h light/8h dark，24℃)进行培养，处理期间保持各植株水分充足。高温处理约54h至高温胁迫处理组转基因植株与野生型植株出现显著表型差异时，收取两组全部植株叶片(第3、4、5叶)、根和茎的样品，存于-80℃冰箱用作后续试验。

结果：将SlHAT5表达量最高的三个超表达株系OE-11、OE-14、OE-54进行高温处理，以番茄植株AC++为对照，可以看出野生型叶片失水程度较轻，出现轻微萎蔫特征；超表达株系植株则呈现出更为严重的萎蔫特征，其叶片已基本枯萎，详见图12。从高温胁迫后各株系的形态特征可看出，SlHAT5基因的超量表达可提高番茄对高温胁迫的敏感度，同时，高温胁迫并不会影响转基因植株中SlHAT5的相对表达趋势，详见图12。

在高温胁迫预实验中，发现SlHAT5超表达株系较番茄AC++而言在高温胁迫下有较显著的萎蔫表型，而CRISPR-Cas9株系SlHAT5-B-10在胁迫下的表型与AC++相比差异不显著，所以后续高温胁迫相关实验均使用SlHAT5超表达株系为材料进行。

实施例5.转SlHAT5基因番茄植株在高温胁迫后的生理指标测定

测定实施例4收取好的处理后样品的不同生理指标，包括叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶活性等，结果如图16所示，其中图13-A为高温处理及常温对照下超表达株系及AC++中SlHAT5的表达量检测。

1.叶绿素含量的测定：

叶绿素是植物进行光合作用，为植物正常生长提供营养物质的重要光合色素，也是判断植株受到非生物胁迫损伤的重要指标。对照组中野生型植株中叶绿素含量与超表达植株叶绿素含量无显著差异，均在2.5mg/g左右；而高温胁迫处理下，超表达植株中叶绿素含量较野生型植株叶绿素含量显著偏低，后者约为3.6mg/g，前者约为2.0mg/g。这表明：植株在受到高温胁迫后叶绿素含量的积累速度减缓甚至受到抑制，无法进行正常的光合作用，从而抑制番茄植株的生长。实验中，SlHAT5基因的超量表达使植株对高温胁迫的耐受性降低，较野生型植株有更低的叶绿素积累速度和积累量，甚至出现黄化萎蔫，推测高温胁迫使超表达株系中叶绿素的积累受到抑制，详见图13-B。

2.丙二醛含量的测定

丙二醛的含量是衡量植物受到胁迫后细胞膜受损程度的重要指标之一。对处理及对照组叶片样品进行检测后发现，对照组中，超表达株系与AC++叶片中丙二醛含量相对一致且较低，约为0.009μmol/g；处理组中，在整体丙二醛含量均增加的情况下，超表达株系的丙二醛积累量约0.03μmol/g，是野生型中的2倍。这一结果显示，SlHAT5基因的超量表达提升了高温胁迫对植株细胞膜的损伤，详见图13-C。

3.超氧化物岐化酶(SOD)活性的检测

本发明检测了处理及对照组中超氧化物歧化酶的活性，并发现在高温处理下，AC++与转基因植株细胞内超氧化物歧化酶活性均呈下降趋势，由约100u/g FW下降至低于85u/g FW；同时，转基因植株内SOD活力(约40u/g FW)显著低于AC++(约70u/g FW)。这一结果同样说明SlHAT5基因的超量表达在一定程度上影响植株细胞对体内的ROS清除，详见图13-D。

4.过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性的检测

本发明检测了处理及对照组中过氧化物酶和过氧化氢酶的活性。结果显示：对照组中，过氧化物酶及过氧化氢酶的活性较低，前者大致为16u/g FW，后者则在30u/g FW左右，且在AC++与转基因植株体内无显著差异。而在高温处理下，这两个酶的活性在AC++与转基因植株体内均有较大提升，在AC++中提升至常温下的1.5倍，且转基因植株中的酶活性显著低于AC++只提升至常温下的1.1～1.3倍。这一结果说明，SlHAT5基因的超量表达在一定程度上干扰植株细胞对体内的ROS清除，详见图13-E和图13-F。

实施例6.SlHAT5的酵母单、双杂交cDNA文库筛选

1.酵母cDNA文库获得备选基因、蛋白

采用Mating法进行酵母cDNA文库筛选，Mating后对SD/-Leu/Aba(单杂交)及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal(双杂交)固体培养基上阳性菌斑对应菌液进行测序，将测序结果与NCBI各基因序列进行比对，选取基因，再对这些基因功能进行分析，筛选出可能调控SlHAT5行使功能的基因及与SlHAT5互作的蛋白作为备选以待验证。

2.备选基因及蛋白的初步验证

将备选基因、蛋白对应的菌液提取酵母质粒，然后将酵母质粒转化至大肠杆菌并提取大肠杆菌质粒。转化pAbAi-proSlHAT5与单杂筛选出的调控基因对应质粒于Y1H感受态中，涂布于SD/-Leu/Aba固体培养基上；将双杂筛选出的蛋白对应转入Y187酵母感受态并涂布于SD/-Leu固体培养基上，同时，转化pGADT7-T于Y187感受态中，转化pGBKT7-SlHAT5、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam质粒于Y2H感受态中，分别涂布于SD/-Trp及SD/-Leu固体培养基上。

将以下组合进行点对点互作试验以初步验证备选基因对应蛋白与SlHAT5互作关系：单杂交阳性对照pGADT7-53+pAbAi-proSlHAT5、阴性对照pGADT7-T+pAbAi-proSlHAT5，备选基因验证pAbAi-proSlHAT5+pGADT7-X(X为备选基因)；双杂交阳性对照pGBKT7-53+pGADT7-T、阴性对照pGBKT7-Lam+pGADT7-T、备选基因验证pGBKT7-SlHAT5+pGADT7-X(X为备选蛋白)。单杂点对点验证的菌液涂于SD/-Leu/Aba固体培养基上，观察其生长情况。双杂点对点验证的菌液涂于SD/-Trp/-Leu固体培养基上，培养至有阳性菌落出现后再次点于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal固体培养基上观察其生长情况。

结果分析：

(1)调控SlHAT5表达的上游基因筛选

①调控SlHAT5表达的上游基因筛选载体的构建：通过双酶切，将已扩增出的proSlHAT5 1432bp序列与载体pAbAi连接在一起，转化大肠杆菌后，通过目的片段特异性引物筛选出阳性单菌落，摇菌后进行PCR检测，证明pAbAi-SlHAT5重组载体构建完成。

②抑制pAbAi-SlHAT5酵母生长的金担子素(AbA)浓度筛选：将构建完成的pAbAi-SlHAT5酵母表达载体线性化后转入Y1HGold，对能够完全抑制酵母正常生长的AbA浓度进行筛选，发现当SD/-Ura固体培养基中AbA浓度为1000ng/mL时，能够完全抑制酵母的正常生长，详见图14。

③酵母文库中调控SlHAT5表达的上游基因筛选：通过对proSlHAT5在酵母中的毒性及自激活检测，发现其无毒性和自激活。因此，使用proSlHAT5为饵蛋白对番茄cDNA文库进行筛选，共筛选出8个阳性克隆，PCR检测结果如图15所示。将这些PCR产物送测序后，将测序结果在茄科基因组网站进行BLAST，比对分析出基因8个。其后，经功能分析，筛选出6个基因进行互作验证，这六个基因功能涉及植物光合作用、呼吸作用、氧化还原与热响应，具体的，SlPLL促进气孔运动，SlPC和SlRBCS4参与光合作用，SlDD2参与光合作用和光呼吸，GAPDH参与氧化还原代谢，DnaJ参与热响应。因此在提取酵母质粒后分别构建了AD-SlPLL、AD-SlPC、AD-SlDD2、AD-SlRBCS4、AD-SlGAPDH、AD-DnaJ等多个酵母表达载体，与SlHAT5进行点对点互作验证。点对点验证后，发现这些蛋白均能与SlHAT5互作，详见图16，推测这些基因均参与调控SlHAT5对番茄高温胁迫的响应。

(2)SlHAT5互作蛋白的筛选

①SlHAT5互作蛋白筛选载体的构建：通过双酶切，将已扩增出的SlHAT5 867bp的基因序列与载体pGBKT7连接在一起，转化大肠杆菌后，通过目的片段特异性引物筛选出阳性单菌落，摇菌后进行PCR检测，结果显示，pGBKT7-SlHAT5重组载体构建完成，详见图17。

②酵母文库中SlHAT5互作蛋白的筛选：通过对SlHAT5在酵母中的毒性及自激活检测，发现其无毒性和自激活。因此，使用SlHAT5为饵蛋白对番茄cDNA文库进行筛选，共筛选出210个阳性克隆，部分PCR检测结果如图18所示。将这些PCR产物进行测序，然后将测序结果在茄科基因组网站进行BLAST，比对出基因41个。

③SlHAT5互作蛋白的验证：根据SGN基因数据库及NCBI对以上41个基因功能的描述，从中挑选6个基因片段进行点对点验证，对应基因包括SlVDAC(基因号：Solyc02g067460)、SlCP3L(基因号：Solyc07g041910)、Dp-1(基因号：Solyc10g078430)、SlNBRL1(基因号：Solyc06g071770)、SlBELL6(基因号：Solyc01g109980)、DnaK(基因号：Solyc01g103450)，这些基因参与了植物的光合作用、高温胁迫及细胞凋亡过程。因此在提取酵母质粒后分别构建了pGADT7-SlVDAC、pGADT7-SlCP3L、pGADT7-Dp-1、pGADT7-SlNBRL1、pGADT7-SlBELL6、pGADT7-DnaK等多个酵母表达载体，与SlHAT5进行点对点互作验证。点对点验证后，发现这些蛋白均能与SlHAT5互作，详见图19。

本专利还采用在线转录组数据网站TomExpress预测了上述6个基因在番茄叶片中的高温处理后的表达水平，发现DnaK和SlNBRL1在高温处理下表达水平降低，而其余4个基因则呈现出上调的表达水平，如图20所示。鉴于这些基因在植物的光合作用、高温胁迫、细胞凋亡过程均承担重要角色，推测这些基因在番茄的高温胁迫响应网络中具有重要功能，但具体所处位置和主要作用仍有待进一步研究。

(3)高温胁迫下SlHAT5超表达株系相关基因的表达量分析

植物受高温胁迫后，体内活性氧(ROS)大量增加，为了维持体内稳态、保护系统，活性氧清除系统中的抗氧化相关酶活性随之增强；同时，体内ABA水平发生变化，ABA合成代谢通路也随之受到影响；此外，高温诱导热激转录因子和热激蛋白大量表达。基于此，本专利采用qRT-PCR技术对处理下叶片中高温胁迫相关基因、抗氧化相关基因及ABA相关基因的表达量进行分析。

①高温胁迫相关基因的表达量分析：热激转录因子HsfA2、HsfB1和高温响应基因SlSIZ1在现有报道中与高温胁迫过程密切相关，为进一步明确SlHAT5在调控番茄对高温胁迫响应过程中可能的调控机制，我们分析了高温胁迫处理与对照试验中这些基因分别在超表达株系及野生型中的表达变化，详见图21。

如图21所示，高温胁迫后各株系体内HsfA2、HsfB1和SlSIZ1表达量较对照组均升高。在处理组与对照组中，超表达植株体内HsfA2基因的表达量相较于野生型均处于显著较低水平，但处理组中超表达植株体内该基因表达量较野生型的差异倍数由对照组中的1/30上升至1/20，详见图21-A；而HsfB1和SlSZ1基因在处理下表达水平的变化趋势同HsfA2基因较为相似，超表达株系高温后相对于野生型的表达倍数呈显著升高趋势，差异倍数由对照组中的1/70提升至1/2～3/4，详见图21-B、图21-C)。结果表明，在番茄受到高温胁迫时，通过调控SlHAT5基因的表达来影响上述基因的表达，从而影响其抗逆性。

②抗氧化相关基因的表达量分析：为了探究高温胁迫对转基因番茄植株活性氧系统的影响，本发明选取抗坏血酸过氧化物酶基因APX1、APX2和超氧化物歧化酶基因SOD2进行检测。在超表达植株中，对照组中APX1、APX2基因的表达量均比野生型高，而在高温处理下其表达量出现显著下调至与AC++无显著差异甚至略低于AC++，详见图22-A、图22-B；而SOD2水平则呈现出完全相反的趋势，在常温下，超表达组中SOD2基因的表达量显著低于野生型，而在高温处理下其表达量出现显著上调至略高于AC++，详见图22-C。结果表明，在番茄受到高温胁迫时，SlHAT5基因调控上述基因的表达，从而影响其抗逆性。

③ABA相关基因的表达量分析：根据实施例2SlHAT5基因在光周期和多种激素处理下的表达分析中SlHAT5在激素诱导条件下的表达谱，推测该基因可能受到ABA激素诱导表达。故筛选出ABA信号途径相关基因SlPP2C2、SlNCED、SlAREB1和SlTAS14对高温胁迫处理及对照处理植株进行qRT-PCR以分析上述基因表达量变化情况。

结果如图23所示，在对照组中，超表达植株中NCED的表达量显著低于野生型，而在高温胁迫处理组中，超表达植株内该基因表达水平虽仍显著低于野生型，但相较同期野生型表达倍数减小，由1/5提升至1/4左右；与之相反，超表达植株中TAS14、PP2C2与AREB1表达量在对照组中与AC++持平至高于AC++3倍左右，但在高温处理下表达水平迅速下调至显著低于同期AC++(约1/3)。这一结果表明，在番茄中SlHAT5基因参与ABA途径对高温胁迫做出响应。

综上，SlHAT5在番茄高温胁迫下的调控网络如图24所示：高温胁迫作用域植物体内的SlPLL、SlPC、SlDD2、SlRBCS4、SlGAPDH及DnaJ等基因，这些基因调控SlHAT5行使功能，而SlHAT5抑制了本应在高温胁迫下受到诱导的ABA通路各基因的表达；同时，SlHAT5与SlVDAC、SlCP3L、Dp-1、SlNBRL1、SlBELL6和DnaK互作，并调控HSFA1的SUMO化，进而影响HsfA2、HsfB1的表达；此外，SlHAT5的表达也影响了高温胁迫处理下番茄体内抗氧化酶相关基因的表达，最终降低番茄对高温胁迫的敏感性。图24中，箭头方向表示调控方向；实线：文献证实；虚线：本文结论；虚线1、5：正调控；虚线2、3、4、6：负调控。

Claims (10)

1.提高番茄抗高温能力的HD-ZIP转录因子SlHAT5基因，其特征在于，所述SlHAT5基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的SlHAT5基因，其特征在于，所述SlHAT5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的SlHAT5基因，其特征在于，所述SlHAT5基因的表达受到激素的诱导；所述激素包括ABA、Eth、JA、GA、SA中的任一种或几种。

4.根据权利要求3所述的SlHAT5基因，其特征在于，所述SlHAT5基因的表达量在Eth处理12h后显著下调；在ABA处理6h后显著上调；JA处理6h后显著上调，JA处理12h后均显著下调；GA处理1h和24h时，SlHAT5基因的表达量显著高于野生型，并在12h出现短暂下调；SA处理1h，SlHAT5基因的表达量显著上调，且上调趋势随时间推移逐渐减缓，并在24h表达量出现下调。

5.调控权利要求1所述SlHAT5基因对植物逆境胁迫响应的基因，其特征在于，所述基因为SlPLL、SlPC、SlDD2、SlRBCS4、SlGAPDH和DnaJ。

6.权利要求5所述基因的筛选方法，其特征在于，所述方法为：以SlHAT5为饵蛋白，利用酵母单杂交技术，筛选均一化的酵母文库，筛选得到调控所述SlHAT5基因对植物逆境胁迫响应的基因，并进行酵母点对点验证。

7.权利要求1所述SlHAT5基因的互作蛋白，其特征在于，所述互作蛋白为SlVDAC、SlCP3L、Dp-1、SlNBRL1、SlBELL6和DnaK。

8.权利要求7所述互作蛋白的筛选方法，其特征在于，所述方法为：以SlHAT5为饵蛋白，利用酵母双杂交技术，筛选均一化的酵母文库，筛选得到SlHAT5基因的互作蛋白，并进行酵母点对点验证。

9.权利要求1所述番茄转录因子SlHAT5基因在提升番茄抗高温能力和抗氧化水平中的应用，其特征在于，通过构建低表达SlHAT5基因的番茄株系，提升番茄抗高温能力和抗氧化水平。

10.权利要求1所述番茄转录因子SlHAT5基因在耐高温番茄育种中的应用，其特征在于，通过筛选出低表达SlHAT5基因的番茄植株，获得耐高温的番茄种子。

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