CN110872598B - 一种棉花抗旱相关基因GhDT1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种棉花抗旱相关基因GhDT1及其应用，属于生物技术应用领域。本发明涉及的GhDT1基因，其编码一个脂转移蛋白。本发明提供了GhDT1在异源四倍体陆地棉遗传标准系TM‑1中的全长ORF核苷酸序列和氨基酸序列。棉花中的GhDT1基因在纤维组织中优势表达，受非生物胁迫和激素诱导表达。通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了过表达和干扰表达GhDT1转基因棉花材料。对后代纯合转基因株系苗期自然干旱鉴定，发现与转基因受体材料相比，过表达该基因可显著提高植株耐旱性，干扰表达则显著降低耐旱性，表明该基因在棉花抗旱胁迫过程中起重要作用。

Description

一种棉花抗旱相关基因GhDT1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及一种棉花GhDT1基因及其应用，该基因编码一个脂转移蛋白。通过对棉花中的脂转移蛋白基因(Lipid transfer proteins,LTPs)家族成员进行系统分析，发现GhDT1基因显著受非生物胁迫，如：盐、旱和激素诱导表达。棉花中的GhDT1基因在纤维组织中优势表达，受PEG6000处理显著上调表达。通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了过表达和干扰表达转基因棉花材料。对后代纯合转基因株系苗期自然干旱鉴定，发现与转基因受体材料相比，过表达该基因可显著提高植株耐旱性，干扰表达则显著降低耐旱性，表明该基因在棉花抗旱胁迫过程中起重要作用。

背景技术

非生物胁迫(包括干旱、高盐、低温等)严重影响作物的生长发育。而近年全球水资源短缺、土壤盐渍化、频繁的极端天气更加剧了这一趋势(FAO，2009)。适应非生物胁迫，提高作物对环境适应能力是现今新品种选育需求之一。棉花是世界性重要的经济作物，我国是世界棉花生产、消费和进口大国，同时也是纺织服装生产贸易大国，在世界植棉国中占有举足轻重的重要位置。但是，我国主要产棉区也是重要的粮食或其它重要经济作物的产区，粮棉、粮经争地的矛盾历来十分突出，进一步加剧了对棉花耐逆性需求。有效应对这一挑战，创制抗逆新材料，培育抗逆新品种是基础。因此，发掘耐旱关键基因资源，利用基因工程、分子育种等手段，结合传统育种技术创制抗逆优异种质资源，培育高产、优质、多抗新品种，提高其广适性和耐逆水平。

抗菌肽是一种具有抗菌活性的小分子多肽，通常由13-45个氨基酸构成，抗菌肽通过改变病原菌细胞膜的通透性来起到抑菌作用(Zasloff et al,2002)。其中，脂转移蛋白(Lipid transfer proteins,LTPs)属于植物抗菌肽的一种，是一种植物碱性小分子蛋白，其氨基酸种类中缺乏色氨酸。Kader等(1975)首次在马铃薯块茎中发现植物脂转移蛋白，随后在小麦中分离出了脂转移蛋白(Bernhand et al,1989)。Thoma等(1994)通过多种分子生物学技术发现该类蛋白存在于细胞壁中，推测其可能参与了分泌途径。后来，从烟草、玉米、水稻、菠菜、拟南芥、高粱、油菜等多种植物中分离到了该蛋白(Boutrot et al,2008；Li etal,2014；Kader et al,1996；Wei and Zhong,2014)。植物非特异性脂转移蛋白(nonspecific lipid transfer protein,nsLTP)是一类广泛存在于高等植物中的碱性小分子蛋白,编码nsLTP的基因在许多植物中都以基因家族的形式存在。nsLTP成员具有不同的生物学功能,主要涉及角质合成，参与调节脂质储藏分解代谢的β氧化、体细胞胚胎形成、植物信号转导、参与植物有性生殖、花粉发育、对病原物的防御以及对生物和非生物胁迫的应答等。明确不同成员在植物抗性形成方面的作用,对于调控植物抗性和利用基因工程改良植物抗性有重要意义。

棉花是世界性重要的经济作物，棉纤维是重要的纺织原料。Ma等(1995)最早从棉花纤维中分离到脂转移蛋白，GhLTP3，GhLTP6，GhLTPG1在纤维细胞中特异表达，在纤维发育后期达到一个最大值(Ma et al,1995；Han et al,2013；Deng et al,2016)，而GhLTP7,GhLTP8,GhLTP11在纤维起始期高表达((Han et al,2013),表明这些脂转移蛋白基因参与了棉纤维发育。Meng等(2018)通过生物信息学分析方法在四倍体棉花中鉴定出138个脂转移蛋白基因，发现过表达GhLtpXLs促进了拟南芥表皮毛细胞的伸长，推测该基因可能在棉纤维伸长过程中发挥了重要作用。前人研究表明脂转移蛋白基因在棉花纤维发育均有重要促进作用，但在其他方面功能特征报道较少。本研究发现一个在棉纤维中优势表达的脂转移蛋白基因，通过转基因技术在棉花中过量表达，可显著提高棉花的抗逆性，为提高棉花抗逆基因工程提供重要的候选基因和调控元件。

发明内容

本发明的目的是提供一种棉花GhDT1基因在提高棉花抗旱性及培育棉花新种质中的应用。通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了过表达和干扰表达转基因棉花材料。对后代纯合转基因株系苗期自然干旱鉴定，发现与转基因受体材料相比，过表达该基因可显著提高植株耐旱性，干扰表达则显著降低耐旱性。以此基因为靶基因，通过转基因等基因工程方法，过量表达GhDT1基因，培育生长发育良好，棉纤维产量及品质正常，且抗旱性显著提高的棉花新种质并在生产上应用。

本发明的另一目的在于提供一种提高棉花抗旱性的方法。

本发明的又一目的在于提供一种棉花GhDT1基因，并提供该基因在异源四倍体陆地棉TM-1中的全长ORF核苷酸序列和氨基酸序列。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

如SEQ ID NO.1所示的GhDT1基因在提高棉花抗旱性及培育棉花新种质中的应用。

上述的应用，其在于：将所述的GhDT1基因过量表达到棉花中提高了抗旱性。以所述的GhDT1基因为靶基因，通过过量表达技术等基因工程方法，在棉花中过量表达GhDT1基因，培育生长发育正常，且抗旱性显著提高的棉花新种质并在生产上应用。

一种提高棉花抗旱性的方法，在棉花中过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhDT1基因。

一个能显著提高棉花抗旱性的GhDT1基因，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

由上述GhDT1基因编码的蛋白，该蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

含有上述GhDT1基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高棉花抗旱性及培育棉花新种质中的应用。

所述的新种质为抗旱性显著提高的棉花新种质。

本发明的优点表现在：

(1)通过农杆菌介导的遗传转化方法同时获得了过表达和干扰表达GhDT1的稳定转基因棉花材料。

利用本领域技术人员公知的技术将GhDT1正向编码序列和反向互补序列分别插入pCAMBIA2301载体的XbaI和Sac I之间，构建了GhDT1基因的CaMV35S组成性表达启动子驱动的过量表达载体和反义干扰载体，通过农杆菌介导转化法转入棉花，获得稳定遗传的转基因株系。创制了新的棉花种质。

(2)GhDT1过量表达的转基因棉花是研究基因所引起的抗旱性变化以及所影响的逆境信号通路和分子机制的优异材料，过量表达GhDT1可以增强转基因植株的抗旱性，干扰表达则显著降低抗旱性。

长链脂肪酸在GhCER、GhKCS、GhKCR等基因调控的还原酶作用下形成蜡质，而脂转运蛋白负责蜡质的沉积，植株表面的蜡质可以有效抵御外界胁迫，从而提高植株的抗旱性。

附图说明

图1 GhDT1在棉花不同组织中的表达分析

GhDT1在陆地棉TM-1不同组织中的表达模式，包括根(root)、茎(stem)、叶(leaf)，开花后5天，10天，15天，20天(5S,10S,15S,20S)的种子；开花当天0(0dS)和开花后3天(3dS)纤维种子混合物；开花5天(5dF)，8天(8dF)，10天(10dF)，13天(13dF)，15天(15dF)，18天(18dF)，20天(20dF)，23天(23dF)和25天(25dF)的纤维组织。

注：根：Root；茎：Stem；叶：Leaf；d:表示天数；S：表示种子或胚珠；F：表示纤维

图2 GhDT1在不同胁迫和激素处理的诱导表达分析

GhDT1分别在200mM NaCl,20％PEG6000(g/100mL)和100uM ABA处理0h,2h,4h,6h,10h,12h,24h的表达模式。与0h相比，盐处理的峰值出现在处理后4h，干旱处理从2h开始就达到极显著诱导，而ABA处理的峰值则出现在处理6h之后。*p<0.05，**p<0.01。

图3转GhDT1基因棉花材料的创制与鉴定

目的基因、标记基因和报告基因在转基因材料中的扩增情况。利用35S启动子(正向引物)-基因特异引物(反向引物)扩增检测目的基因，目的条带为438bp；利用卡那特异引物扩增检测标记基因，目的条带为720bp；报告基因为GUS基因，使用GUS特异引物进行扩增，目的条带为576bp。Marker、阳性对照、阴性对照分别为分子量Marker(DL2000Plus)、质粒阳性对照和野生型阴性对照。OE28，OE22，OE2，OE11表示转基因过量表达克隆系，SI-119，SI-134，SI-3，SI-15表示目的基因干扰表达克隆系。野生型为转基因受体W0。

利用定量引物检测了GhDT1在过表达材料(OE28，OE22，OE2，OE11)和干扰表达材料(SI-119,SI-134,SI-3,SI-15)的表达水平，结果表明，与W0相比，目的基因在过表达材料表达显著升高，而在干扰材料中显著降低。

图4转GhDT1基因棉花材料的抗旱性鉴定

在幼苗期对GhDT1的过表达材料(OE28，OE22，OE11和OE2)和干扰表达材料(SI-15，SI-119和SI-134)以及对照W0进行自然干旱处理，处理6天时，干扰材料叶片开始萎蔫，处理8天时W0开始萎蔫，而过表达材料则仍然较绿。在复水2和7天时，对照W0和干扰材料全部萎蔫致死，而过表达材料恢复较好；与对照相比，过表达材料植株成活率显著增加，而对照和干扰材料成活率较低。*p<0.05，**p<0.01。

图5蜡质合成相关基因在转GhDT1基因材料干旱胁迫下的表达分析

通过实时荧光定量PCR对干旱处理后蜡质合成相关基因进行定量表达分析。结果显示GhCER3、GhCER10、GhKCS10、GhKCR1基因在过表达株系中的表达量都高于对照W0，而在反义干扰材料中的表达量则低于W0，存在显著性差异。*p<0.05，**p<0.01。

具体实施方式

下列实例中未注明的具体实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克(Sambrook J.)和D.W.拉塞尔(Russell D W.)著《分子克隆实验指南》(科学出版社，2005)中所述条件，或按照生物试剂生产厂商的使用说明。

实施例1 GhDT1在棉花不同组织中的表达分析

采用实时定量PCR的方法检测GhDT1在本领域技术人员公知的陆地棉遗传标准系TM-1植株中的组织分布情况，并采取以下措施保证检测结果的可靠性：用扩增级别DNase I消化提取的总RNA中可能存在的少量基因组DNA的污染，为检测基因组DNA是否消除干净，可取出一部分用DNase I消化的总RNA样品进行常规PCR反应，当发现没有扩增条带产生时，再进行反转录步骤，同时为了进一步验证实时定量PCR扩增的条带是否是目标基因，将PCR产物切胶回收进行测序。具体方法为：取TM-1两叶一心期根、茎、叶和胚珠与纤维不同发育时期(0-25DPA)的材料提取总RNA为模板，定量PCR引物为P1和P2(引物由上海生物工程公司合成)：

P1：5’-GCAAGCATTTTCCTTACAAG-3’，

P2：5’-TACACAACCCACAACTCTGG-3’。

以棉花的histone(组蛋白)cDNA为内参，定量PCR引物为(引物由上海生物工程公司合成)：

H-F(上游引物)：5’-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-3’

H-R(下游引物)：5’-CCACCAATCTTGTACACATCC-3’

实验步骤如下：先取1μg总RNA加入扩增级别DNase I(Sigma,USA)室温放置30分钟以去除基因组DNA的污染，然后加入停止缓冲液(50mM EDTA)，70℃加热10分钟变性DNase I和RNA；然后采用宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒按照试剂盒说明书进行反转录，每个样品取1μg总RNA，在42℃下反应1小时，在70℃加热10分钟后取出，置于冰上，以使反转录酶失活；最后取1μl翻转录产物进行半定量PCR扩增。用SYBR Green I染料,在荧光定量PCR仪Light Cycler 2.0(Roche公司)上进行。数据处理采用Light Cycler 2.0中的2-ΔΔCT方法进行基因相对表达量分析。PCR反应条件为：95℃5s,60℃10s,72℃20s，共40个循环。检测结果表明，检测结果表明GhDT1在纤维组织中优势表达(图1)。

实施例2 GhDT1在不同胁迫和激素处理的诱导表达分析

采用实时定量PCR的方法检测GhDT1在陆地棉TM-1的根组织在不同处理条件下的表达模式，包括，NaCl、PEG、ABA激素等分别处理0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h。

实施步骤、实施方法和所用引物同具体实施例1，检测结果表明GhDT1受盐、旱和ABA诱导表达(图2)。

实施例3转GhDT1基因棉花材料的创制与鉴定

采用农杆菌介导的遗传转化方法获得稳定转基因棉花植株，根据载体上携带的启动子序列、报告基因和标记基因序列进行DNA和mRNA水平的鉴定。

具体实施步骤如下：利用本领域技术人员公知，通过市场购买的pCAMBIA2301质粒载体将GhDT1插入pCAMBIA2301载体的XbaI和Sac I之间，通过本领技术人员公知的技术构建了GhDT1基因的CaMV35S组成性表达启动子驱动的过量表达载体和反义干扰载体，通过农杆菌介导转化法转入棉花，获得稳定遗传的转基因株系。

DNA水平的鉴定通过PCR方法，包括：

1.棉花基因组DNA提取方法

选取GUS活性强的植株叶片，提取DNA。取1g棉花叶片加液氮研磨成粉末，转移到50mL离心管中，加入5mL抽提缓冲液(500mMNaCl；50mMTris/HCl,pH8.0；50mM EDTA,pH8.0；1％β-巯基乙醇(v/v))，0.6mL 20％PVP(g/100mL)及1mL 10％SDS(g/100mL),轻轻混匀。65℃温育20分钟后，加入1/10体积的5M KAC，冰浴30分钟。4℃，15,000rpm离心10分钟，吸取上清液。加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，冰浴10分钟，4℃，10,000rpm离心5分钟，弃去上清液。沉淀用75％(v/v)乙醇洗涤后晾干，加入500uL TE溶解。加入适量的RNAase,37℃温育30分钟后，用等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1-2次。将上层液转移到新管中，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3N NaAC(pH5.2),冰浴10分钟。4℃，12,000rpm离心5分钟后，沉淀用75％乙醇洗涤抽干，溶于100uL TE中。

表1.DNA提取缓冲液配制

表2.裂解缓冲液配制

注：以上溶液清亮，室温可保存1-2周，用前加β-Me(巯基乙醇)。

2.PCR检测过程

(1)超净台上取再生小植株2-3片嫩叶，加入预冷的新鲜配制的提取缓冲液600μL，电转研磨。5000rpm离心20min(4℃)，弃上清；

(2)于沉淀中加入600μL 65℃预热的裂解缓冲液，65℃水浴30min，期间翻转混匀2-3次；

(3)加入800μL氯仿∶异戊醇(24：1)混合液，翻转50次以上，9,000rpm离心20min(15℃)，将上清转入1.5mL的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，9,000rpm，离心10min(RT)，弃上清，于沉淀中加入1mL 70％的乙醇洗涤，1,000rpm离心2min。倒掉上清液，通风干燥20min；

(4)加30μL TE缓冲液，溶解DNA(4℃，30min以上)，并保存。

(TE缓冲液：10mM Tris/HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0))。

再生棉花植株PCR检测使用35S启动子和目的基因配对的特异引物，

过量表达目标基因的转基因材料检测引物序列为：

Forward：5'CGTAAGGGATGACGCACAAT 3'；

Reverse：5'CAGTCAGTGCTAGGGCTGATCTT 3'，产物大小为438bp。

反义干扰转基因材料检测引物为：

Forward：5'CGTAAGGGATGACGCACAAT 3'；

Reverse：5'CGAGCTCATGGCTAGCTCAATGTCC 3'，产物大小为541bp。

选择标记基因NPTⅡ引物：

Forward：5'GAGGCTATTCGGCTATGACTG 3'；

Reverse：5'TAGAAGGCGATGCGCTGCGA 3'，产物大小为720bp。

报告基因GUS引物：

Forward：5'GTGATGTCAGCGTTGAACTG 3'；

Reverse：5'GGTTTTTGTCACGCGCTATC3'，产物大小为576bp。

PCR反应体积：(20uL)

mRNA水平的检测通过qRT-PCR技术分析，实施步骤、实施方法和所用引物同具体实施例1，检测结果表明获得了纯合的转基因材料，并且表达水平也符合预期(图3)。

实施例4转GhDT1基因转基因棉花材料的抗旱性鉴定

在控制土量和水分一致的情况下，对转基因株系及野生型两叶一心期幼苗进行自然干旱处理，每隔一定时间进行拍照，同时把处理前后的叶片取样进行标记基因的定量检测。

具体步骤：将营养土和蛭石以1：1比例(体积比)混合均匀后，在100℃的烘箱烘4小时，待混好的培养土冷却至室温后，将其以7：4的比例(体积比)与水搅拌均匀，称130g左右装入纸杯中，待出苗后，每次定量浇水，浇40～50mL，一般每四天浇一次(视情况而定)，在“两叶一心”时开始不浇水干旱处理，10天左右出现表型。检测结果表明，与对照相比，反义干扰材料对干旱敏感，过表达材料抗旱性明显增强(图4)。

实施例5蜡质合成相关基因在转GhDT1基因材料干旱胁迫下的表达分析

LTP蛋白在脂质转运过程中起重要作用，因此，将上述抗旱性鉴定的植株自然干旱一周左右，出现表型后，取植株“倒二叶”叶片，提mRNA，反转录，通过实时荧光定量PCR进行蜡质合成相关基因的定量表达分析。长链脂肪酸在GhCER、GhKCS、GhKCR等基因调控的还原酶作用下形成蜡质，沉积在植物表面，从而提高植株的抗旱性。

实施步骤和实施方法同具体实施例1，检测结果表明四个蜡质合成关键基因在过表达材料中表达较高(图5)。

GhCER3、GhCER10、GhKCR1、GhKCS10的定量PCR引物分别如下：

SEQ ID NO.1目的基因GhDT1 cDNA的核苷酸序列

ATGGCTAGCTCAATGTCCCTTAAGCTTGCATGTGTGGCGGTGTTGTGCATGGTGGTGGGTGCACCCCTGGCTCAAGGGGCCGTAACCTGTGGTCAAGTCACAAGCTCCCTCGCACCCTGCATTGGTTACTTGACAGGGAATGGTGCTGGTGGCGTTCCCCCAGGTTGCTGCGGCGGCATAAAATCTCTCAACTCCGCCGCCCAAACAACACCAGACCGGCAAGCAGCTTGCAAATGCATCAAAAGTGCGGCCGCCGGCATTTCTGGCATCAACTATGGTATTGCAAGCGGACTCCCAGGCAAGTGCGGTGTCAACATCCCTTACAAGATCAGCCCTAGCACTGACTGCAACAGGTTCGTATGA

SEQ ID NO.2GhDT1编码的氨基酸序列

MASSMSLKLACVAVLCMVVGAPLAQGAVTCGQVTSSLAPCIGYLTGNGAGGVPPGCCGGIKSLNSAAQTTPDRQAACKCIKSAAAGISGINYGIASGLPGKCGVNIPYKISPSTDCNRFV

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种棉花抗旱相关基因GhDT1及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium spp)

<400> 1

atggctagct caatgtccct taagcttgca tgtgtggcgg tgttgtgcat ggtggtgggt 60

gcacccctgg ctcaaggggc cgtaacctgt ggtcaagtca caagctccct cgcaccctgc 120

attggttact tgacagggaa tggtgctggt ggcgttcccc caggttgctg cggcggcata 180

aaatctctca actccgccgc ccaaacaaca ccagaccggc aagcagcttg caaatgcatc 240

aaaagtgcgg ccgccggcat ttctggcatc aactatggta ttgcaagcgg actcccaggc 300

aagtgcggtg tcaacatccc ttacaagatc agccctagca ctgactgcaa caggttcgta 360

tga 363

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 棉花(Gossypium spp)

<400> 2

Met Ala Ser Ser Met Ser Leu Lys Leu Ala Cys Val Ala Val Leu Cys

1 5 10 15

Met Val Val Gly Ala Pro Leu Ala Gln Gly Ala Val Thr Cys Gly Gln

20 25 30

Val Thr Ser Ser Leu Ala Pro Cys Ile Gly Tyr Leu Thr Gly Asn Gly

35 40 45

Ala Gly Gly Val Pro Pro Gly Cys Cys Gly Gly Ile Lys Ser Leu Asn

50 55 60

Ser Ala Ala Gln Thr Thr Pro Asp Arg Gln Ala Ala Cys Lys Cys Ile

65 70 75 80

Lys Ser Ala Ala Ala Gly Ile Ser Gly Ile Asn Tyr Gly Ile Ala Ser

85 90 95

Gly Leu Pro Gly Lys Cys Gly Val Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Ser Pro

100 105 110

Ser Thr Asp Cys Asn Arg Phe Val

115 120

Claims (4)

1.如SEQ ID NO.1所示的GhDT1基因在提高棉花抗旱性及培育棉花新种质中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：以所述的GhDT1基因为靶基因，通过基因工程方法，在棉花中过量表达GhDT1基因，培育抗旱性显著提高的棉花新种质并在生产上应用。

3.一种提高棉花抗旱性的方法，其特征在于：在棉花中过量表达核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的GhDT1基因。

4.含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GhDT1基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高棉花抗旱性及培育棉花新种质中的应用。

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