CN106191059B - 荠菜过氧化物酶基因启动子及其改良植物抗寒性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体为荠菜过氧化物酶基因启动子及其改良植物抗寒性中的应用。该荠菜过氧化物酶基因启动子的核酸序列为SEQ ID No：1中碱基第1‑1021位碱基的核酸序列。该启动子驱动的基因编码一个受低温诱导的、能调节植物细胞内活性氧的过氧化物酶基因。在4℃诱导条件下，所述启动子除了在根中表达量上调外，在叶片和茎中表达量也有一定的上调。利用所述启动子片段构建的诱导型植物表达载体可以在植物受到低温胁迫时启动目标基因表达。本发明还提供上述启动子在培育抗寒植物中的应用，用于改良农作物品种的抗寒性能。

Description

荠菜过氧化物酶基因启动子及其改良植物抗寒性中的应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及植物低温诱导启动子及其应用，特别涉及荠菜低温诱导的、能调控冷诱导基因的启动子，以及该启动子在改良植物抗寒性中的应用。

背景技术

外界环境因素的如温度、水分、光照、土壤离子浓度等大幅度变化都会对植物造成不利影响，不仅影响农作物的生长发育和产量，也会限制它们的时间和空间分布（KasugaM, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Improving plantdrought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat.Biotechnol., 1999, 17:287-291）。而低温地区的许多植物经历了长期适应过程提高了对较低的零上温度的适应能力，这种对低温的适应能力称冷驯化，能够引发植物体内出现一系列生理生化反应，如细胞膜的流动性和稳定性的变化，细胞内渗透物质的积累，细胞壁的抗压能力的变化等等（Medina J. Luc-imagingthe cold signal transduction pathway. Trends Plant Sci., 2001, 6(8):344）。低温引起的这些生理变化多数是通过基因表达的变化造成的，这些基因包括感知低温信号并传递低温信号的转录因子和一些低温诱导基因产生的低温诱导蛋白。近些年从多种物种中克隆分离了一些冷诱导相关的基因，对于改良农作物的抗冷性有着极大的意义（Zhou MQ,Shen C, Wu LH, Tang KX, Lin J. CBF-dependent signaling pathway: A key lowtemperature responder in plants. Crit. Rev.Biotechnol. 2011, 31(2):186-192）。但是在这些基因转到植物中表达时，由于使用的是组成性的CaMV35S启动子，导致基因在植物体内广泛性的大量表达，虽然植物的抗冷性有了很大程度的提高，但植物在非低温的正常环境下出现了矮化、生长延迟、晚花等表型，同样会影响农作物的产量（Zhou MQ, Xu M,Wu LH, Shen C, Ma H, Lin J. CbCBF from Capsella bursa-pastorisenhances coldtolerance and restrains growth via antagonism with gibberellin and affectingcell cycle signaling in tobacco,PlantMol Biol,2014, 85:259-275）。为了在达到植物抗冷目的的同时，保证植物的正常生长发育，利用抗冷基因自身的启动子进行转基因植物的培育已成为一种新的途径。一些研究发现利用低温调控基因自身的启动子能保证低温响应基因在正常温度下维持较低的表达量，只在低温寒害来临时增加目的基因的表达，这样不仅能提高植物的抗冷性，也大大减轻植物生长发育迟缓的表型（Kasuga M, Miura S,Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. A combination of the Arabidopsis DREB1Agene and stress-inducible RD29A promoter improved drought and low-temperaturestress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol., 2004, 45(3):346-350）。利用特异性的诱导型启动子降低外源基因在宿主植物中非特异性的持续、高效表达，避免出现不需要的表型，已经得到普遍认可，但实际上有效应用于转基因植物生产的特异性启动子却屈指可数，冷诱导型的特异启动子则更是少之又少。克隆基因的特异启动子并研究其结构功能早已是转基因植物研究中的一个热点，而这一热点所催发的一系列应用也会大力推动转基因植物的研究发展，从而促进转基因植物产业化的发展。

植物在遭受冷害时，会导致机体中产生大量的活性氧（Reactive OxygenSpecies, ROS），过多的ROS积累会对植物细胞造成损伤，但是一定量的ROS的提升还可做为细胞信号传递途径中的第二信使，如钙离子的增加，从而激活植物细胞中一种抗氧化防御机制来消除ROS的不利作用，导致植的抗冷能力的提高。近几年在模式植物拟南芥的研究中发现一类低丰度的低温诱导基因，称为RCI（Rare Cold Inducible）基因。其中一类基因编码产物为一种阳离子过氧化物酶（Llorente F, López-Cobollo RM, Catalá R, Martínez-Zapater JM, Salinas J. A novel cold-inducible gene from Arabidopsis,RCI3, encodes a peroxidase that constitutes a component for stress tolerance.Plant J.2002, 32(1):13），该基因受低温诱导，在植物中的作用为在严寒胁迫下可增强植物细胞中活性氧的解毒功能从而抗寒（Kim MJ, Ciani S, Schachtman DP. A peroxidasecontributes to ROS production during Arabidopsis root response to potassiumdeficiency. Mol. Plant. 2010, 3(2):420-427）。本发明的荠菜过氧化物酶基因启动子是从较抗冷植物荠菜叶片的总基因组中克隆得到。目前尚未发现有关荠菜过氧化物酶基因启动子在培育耐寒植物中的报道。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的荠菜过氧化物酶基因启动子，该启动子是能够在低温下强烈诱导表达的植物内源性启动子。

本发明的的第二目的是提供所述荠菜过氧化物酶基因启动子在利用转基因技术改良植物抗逆（耐低温）上的应用。

首先，通过基因组步移技术，从荠菜总DNA中克隆过氧化物酶基因的启动子。过氧化物酶基因为植物中受冷诱导表达，能够通过调控细胞内的活性氧而调控植物产生抗冷性的一类稀有的冷诱导上调基因（RCI），将该基因的启动子命名为pCbRCI。所述启动子序列是序列表SEQ ID No: 1中的碱基第1-1021位碱基序列。

本发明所提供的荠菜过氧化物酶基因启动子区域含有4种与冷诱导以及非生物诱导相关的顺式作用元件，分别是：

一个GGTCCAT-motif（auxin-responsive element），可以和生长素反应因子（ARF）相结合；

一个CGTCA-motif和一个TGACG-motif（MeJA-responsiveness），说明此基因可能能够被甲基茉莉酸所诱导；

一个TATCCCA-motif（auxin-responsive element），说明此基因可能可以被赤霉素诱导激活；

一个GAGAAGAATA-motif和一个TCAGAAGAGG-motif，表明此基因可能可以被水杨酸诱导激活。

此外还发现该启动子区域除了这些与启动子核心功能和非生物诱导相关的顺式作用元件外，还有一组与逆境诱导相关的元件，如与干旱诱导相关的MBS元件（MYB bindingsite involved in drought-inducibility），说明此基因在干旱情况下也可能会强烈表达。

将利用所述启动子构建的诱导性表达载体转入植物中时，发现该启动子能够强烈诱导报告基因在植株中的表达，尤其是在植物根中的表达。

利用本发明所提供的启动子构建的带有抗寒基因的表达载体，转化烟草后，在低温诱导条件下，该启动子可驱动抗寒基因在抗冷性较差的模式植物烟草中诱导表达，可通过检测转基因烟草的表型和抗寒的生理指标，显示植株耐寒性能有了显著提高。

本发明详细技术方案如下：

本发明首先提供一种分离出的荠菜DNA分子，即荠菜过氧化物酶基因,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No: 1所示；其中荠菜过氧化物酶基因启动子包含序列表SEQ ID No:1所示序列中的1-1021位碱基的核苷酸序列，之后连接的基因编码一个受低温诱导的、通过调控细胞内的活性氧而调控植物产生抗冷性的基因。

所述的一种分离的DNA分子，其启动子区（SEQ ID No: 1序列中1-1021位）包含有一个响应生长素顺式作用元件GGTCCAT，两个响应甲基茉莉酸的顺式作用元件CGTCA和TGACG，一个响应赤霉素的元件TATCCCA，两个水杨酸诱导的元件GAGAAGAATA和TCAGAAGAGG，还有两个与干旱诱导相关的MBS元件CAACTG。

此外还有甲基茉莉酸、水杨酸、生长素、赤霉素等4种激素的顺式响应元件。

本发明还提供一种植物表达载体，所述表达载体含有权利要求1所述的荠菜过氧化物酶基因启动子。

本发明还提供所述的荠菜过氧化物酶基因启动子的制备方法，具体步骤为：

（1）将荠菜种子经过70%酒精消毒后，播种于MS培养基上；

（2）待所述荠菜种子长出叶片后，提取所述叶片的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳分析其质量；以及

（3）采用基因克隆技术得到荠菜过氧化物酶基因的启动子序列，使用的引物对为：上游引物为CbRCIF：5-TCACAAAACTAGTTGTTCTTTAGTT-3（SEQ ID No：2），下游引物为CbRCIR:5-CTTTAAAGTTGTGGGGGTTTTTTTT-3（SEQ ID No：3）。

本发明还提供所述植物表达载体的制备方法，具体步骤为：

（1）扩增出上述荠菜过氧化物酶基因启动子的DNA片段，所用引物对为：上游引物为CbRCIF：5-TCACAAAACTAGTTGTTCTTTAGTT-3（SEQ ID No：2），下游引物为CbRCIR: 5-CTTTAAAGTTGTGGGGGTTTTTTTT-3（SEQ ID No：3）；

（2）将所述DNA片段克隆到中间载体pMD18-T，再进一步克隆到植物表达载体p1304上，得到所述表达载体。

上述方法中，还包括向所述上游引物引入限制性酶切位点KpnI，以及向所述下游引物引入限制性酶切位点NcoI。

本发明还提供所述的荠菜过氧化物酶基因的启动子或所述的植物表达载体在植物的抗寒性改良中的应用。

所述植物为具有经济价值的作物，优选水稻、小麦、玉米、棉花、油菜、番茄或黄瓜。

附图说明

图1荠菜过氧化物酶基因启动子的活性分析。其中，A. 带有pCbRCI35::GUS的质粒构建模式图；B. GUS基因表达量分析；C. 培养2周的拟南芥转基因阳性苗全株冷处理前后GUS染色结果；D.培养5周的拟南芥转基因阳性苗冷处理前后GUS染色后半薄切片分析（幼苗中bar为0.1cm，根、茎、叶中bar为 0.001cm）。

具体实施方式

下面结合实验室具体的实验方法和操作过程，进一步阐述本发明所做的工作。这些实验方法仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如例如萨姆布鲁克(著)，黄培堂(主译). 分子克隆验指南 (精编版) ，化学工业出版社，2008）或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 荠菜过氧化物酶基因启动子的分离和鉴定

在该实施例中，通过基因组步移技术获得荠菜过氧化酶基因启动子序列。实验操作过程按照Universal Genome Walker TM Kit（CLONTECH）的说明书进行。

1. 荠菜幼苗的培养

所用播种的荠菜种子购买于上海市种子公司，播种前先在4℃处理3-7d，即进行春化处理，使种子萌发保持一致。春化过的种子用75%乙醇消毒5-10min，然后再到无菌操作台进行下一步操作。将75%乙醇中的种子换到少量的无水乙醇溶液中，然后将种子连同无水乙醇一起倒在灭菌的滤纸上。等无水乙醇挥发完滤纸上种子干燥后，将滤纸上的种子散播在含有1/2MS培养基（MS粉 4.41g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8.5g/L）的培养皿中，然后放置到22℃光照培养箱（16h光/8h暗）中培养。

2. 荠菜基因组DNA提取

将1 g新鲜荠菜叶片用液氮研磨成粉末状后加入500 μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃水浴保温60 min（中间不时缓慢振摇）；加入等体积的氯仿-异戊醇，轻轻混匀后静置10 min；8000 g离心10 min使其分层，取出上清液转入另一离心管；加入等体积的预冷的异丙醇（加入一滴NaAc），混匀后置于-20℃过夜以沉淀DNA；第二天取出离心管4℃，8000g 离心10 min，弃去上清；用70%乙醇洗涤沉淀，8000 g 离心10 min，弃去上清，在空气中干燥；将DNA沉淀溶解在合适体积（50μL）的TE缓冲液或dd H₂O水中，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量后放置于-20 ℃保存备用。

3. 基因组步移文库的构建

将荠菜基因组DNA分别用限制性内切酶DraI，StuI，Pvu

，EcoR

酶切后，与GenomeWalker 接头连接（试剂盒提供）。连接的产物即为制备的4个基因组步移文库。

4. PCR扩增

分为三个阶段进行：

（1）根据荠菜过氧化酶基因的（GenBankAccesion No., AY566573）cDNA序列的开放阅读框（ORF）设计2条引物：CbRCIF1：5-ATGAACTGCTTGAGAGCTATTGCCC-3（记为SEQ ID No.2）和CbRCIF2：5-TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3（记为SEQ ID No. 3），以基因组DNA序列为模板为，进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×PCR Buffer 5μL；MgCl₂ (25mM) 10μL；dNTPMix (10mM) 5μL；Taq DNA聚合酶(5U/μL) 1μL；Primer1 (10 μM) 1μL；Primer2 (10 μM) 1μL；DNA1 μL；dH₂O 26 μL; 总体积 50μL。使用程序为：94℃ for 5 min，30 cycles (94℃for 30 sec, 56℃ for 30 sec, 72℃ for 50 sec)。扩增到的PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条特异性很强的片段，长度为1500bp左右。回收该片段并连接到pMD-18T载体上，将连接产物转化E.coil DH5a感受态细胞，测序得到序列长度为1532bp。与荠菜过氧化酶的cDNA序列（AY566573）比对分析，发现除了多出的三段内含子序列外，其余序列与AY566573均相同，说明我们得到的序列为荠菜过氧化物酶基因组序列；

（2）根据步骤（1）获得的序列分别设计扩增中间序列上游的引物，其中两个上游引物分别记为CbRCI5-1（5-TCGCACGAAACAATCATGGAAATG-3（记为SEQ ID No.4））和CbRCI5-2（5-AGCACTGATCCATCGCATCC-3（记为SEQ ID No.5））。以步骤3构建基因组步移文库为模板，利用CIONTECH公司提供的Universal GenomeWalker Kit（Clontech）试剂盒中的接头引物AP1和AP2分别与上游基因特异引物组合进行巢式扩增，所得目的条带即包含有向中间序列的5’端外移了一定距离的序列。PCR的反应体系和程序均按试剂盒的说明书进行。上游序列的扩增经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条特异性很强的片段，长度为1300bp左右。回收这个片段并连接到pMD-18T载体上，将连接产物转化E.coil DH5a感受态细胞，测序得到上游序列长度为1312bp；

（3）根据步骤（2）扩增片段进行分析，发现步骤（2）扩增的片段与步骤（1）获得的片段有213bp是重复的，说明我们获得的序列为荠菜过氧化物酶基因的启动子序列。根据步骤（2）扩增片段，设计2条引物，上游引物为CbRCIF：5-TCACAAAACTAGTTGTTCTTTAGTT-3（记为SEQ ID No.6），下游引物为CbRCIR：5-CTTTAAAGTTGTGGGGGTTTTTTTT-3（记为SEQ ID No.7）。扩增获得全长启动子序列。

5. 扩增序列分析

测序结果显示克隆到的荠菜过氧化酶基因的5端序列全长1312bp记为SEQ ID No.1。荠菜过氧化酶基因基因编码框的第一个起始密码子在1100个碱基处，第一个起始密码子ATG前的1099个碱基为荠菜过氧化酶基因的5’侧翼序列，为荠菜过氧化酶基因的启动子序列，命名为pCbRCI。

6. 启动子序列顺式作用元件的预测

将测序得到的序列输入Neural Network Promoter Prediction

(http://fruitfly.org:9005/seq_tools/promoter.html)预测转录起始位点。并将测序得到的序列输入PLANTCARE网站进行启动子顺式作用元件的分析。

PLANTCARE网站地址为：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/。

实施例2 荠菜过氧化物酶基因在冷诱导和冷驯化处理下的表达特性

在该实施例中证实荠菜过氧化物酶基因具有低温诱导特性。

1.荠菜幼苗的处理

荠菜幼苗的培养与实施例1的程序相同。待荠菜幼苗生长到4w后进行冷驯化和冷诱导处理，冷驯化按温度梯度12℃ (4d), 4℃ (4d), 0℃ (2h)连续处理，冷诱导在4℃条件下，分别按4h，8h，24h时间梯度处理，之后分别收集叶片、茎段和根等材料，放置到-70℃保存备用。

2. 荠菜幼苗的RNA抽提

采用植物RNA提取试剂盒（CW0588）（北京康为世纪生物科技有限公司）分别提取荠菜根、茎、叶三种组织的总RNA, 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。

3. 荧光定量PCR扩增

采用荧光定量PCR技术检测各种处理条件下荠菜过氧化物酶基因表达量的变化，实验设置三组重复，以荠菜18s rRNA基因（GenBank Accession No.：AY662285）为内参。反转录反应采用SYBR® Green qPCR试剂盒进行操作，操作步骤按试剂盒操作程序反应液配制在冰上进行，将各项组分轻柔混匀后立即进行反转录反应。然后使用TaKaRa生物公司的荧光定量试剂，在ABI step one plus 机器上进行荧光定量PCR反应。SYBR®Green I与双链DNA结合后发出荧光，通过检测反应体系中的SYBR®Green I荧光强度，检测PCR产物扩增量。

4. 扩增结果分析

当荠菜生长在22℃条件下时，其体内的过氧化酶基因在根、茎和叶中的表达有些差别，在根中有少许微量表达，相对根中的表达，在茎和叶中表达量相对较低，几乎无表达。在4℃冷诱导处理后荠菜根、茎、叶中过氧化酶基因的表达均有不同程度的提高，在0到8h内表现出持续上调，且在8h达到最高，之后表达量下降，24h时下降到比较低的量。冷驯化处理后，荠菜根中过氧化酶基因的表达量也有一定的上调，12℃处理时表达有少量增加，4℃处理后表达量的上调明显进一步增加，0℃增加最为明显。但在茎和叶中，冷驯化处理后过氧化酶表达量增加不明显。

实施例3 荠菜过氧化物酶基因启动子低温诱导活性的GUS分析

在该实施例中，将克隆到的荠菜过氧化物酶基因的启动子序列加上酶切位点BglⅡ和PstⅠ，通过取代CaMV35S启动子的位置而连到pCAMBA1301载体上（由澳大利亚 CAMBIA[the Center of the Application of MolecularBiology to InternationalAgriculture, Australia]提供），构建出一个驱动GUS基因表达的植物转化载体。转化拟南芥实验表明，荠菜过氧化物酶基因启动子在低温诱导下能增强GUS基因的表达。因此，荠菜过氧化物酶基因启动子在利用基因工程手段培育抗寒作物中具有潜在的应用前景。

1. 表达载体的构建

在本实施方案中，构建的表达载体pCAMBA1301-GUS通过酶切连接的方法切除了商品化的植物表达载体pCAMBA1301上自带的CaMV35S启动子，连入荠菜过氧化物酶基因的启动子，调控GUS基因的表达，构建的模式图见图1A所示。

2. 将质粒转入GV3101农杆菌

取出存于-80℃的农杆菌感受态细胞，放在冰上融化后，加入1μl上述构建好的表达载体混匀，冰上放置30min后，加入液氮，5min后移入37℃水浴锅中热激5min，取出后再在冰上放5min，然后加入0.8mlLB培养液。放在28℃恢复培养2~3h后，5500rpm离心5min，留下约100μl上清，吹打底部沉淀混匀后，在超净工作台中将菌液涂到带有三抗培养基（LB+50mg/mL链霉素＋30 mg/mL利福平＋25 mg/mL卡那霉素）的培养皿中，晾干后倒置在28℃培养箱培养2d。

3. 农杆菌菌液的培养和转化液配制

挑取培养皿中生长的单个菌斑，接种到装有10ml的三抗培养液的培养瓶中活化培养，并采用PCR方法鉴定菌中是否带有潮霉素和目的基因片段。转化前一天，取确定的阳性菌按照1:100扩大培养转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时，农杆菌液OD₆₀₀当在1.2到1.6之间。室温5000rpm离心10min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使OD₆₀₀在0.8左右。

4. 浸花法转化拟南芥

转基因之前将已经长出的果荚和花序上已经开放和露白的花去掉，将花序浸泡在转化液中约3~5min，然后将拟南芥水平放置在托盘上，将幼嫩的花序浸入相应的农杆菌菌液中浸泡1 min后，用保鲜膜覆盖住植株，移入黑暗中恒温过夜培养，第二天将拟南芥取出光照培养，7d后相同操作步骤再转化一次。培养3到4w待种子成熟后，收种子并放在干燥环境存放2w，该种子被称为T0代种子。

5. 转基因阳性植株的获得和纯系筛选

将T0代的种子先进行消毒，消毒程序为：70%乙醇浸泡8min，处理时不停地悬浮种子，最后用无水乙醇悬浮三次，置于无菌滤纸上待种子干燥后。然后均匀播撒在含有20mg/L潮霉素的平板上，2-3w后将生根的抗性苗移到营养土中继续培养，待苗长到4-5片叶时，取一小片叶提取DNA，PCR鉴定拟南芥抗性小苗中是否带有潮霉素基因或者GUS基因。留下PCR鉴定的阳性苗，继续培养，单株收种子，得到T1代种子。继续种植，观察T1代植株有没有发生性状分离，若发生分离则为杂合，若不分离则为纯合；如果没有纯合植株，则继续种植T2代，最终获得不发生性状分离的转基因纯合阳性株系。

6. GUS染色

将获得的转GUS基因的拟南芥纯合株系的种子播撒在1/2MS 固体培养基上，待幼苗长到2w左右时，将一部分幼苗移入培养箱中4°C冷处理1 d后进行GUS 染色分析。GUS染色步骤如下：先将X-gluc用 N,N-二甲基甲酰胺预溶后加入GUS染色液储存液（配方：100ml 溶液中含有0.2M NaH₂PO₄、0.2M Na₂HPO₄、100mM K₃Fe(CN)₆、100mM K₄Fe(CN)₆）中。然后将材料用预冷的90%丙酮处理10min，再用GUS 染色液储存液（未添加 X-gluc）冲洗干净。加入冷的GUS染色液，用真空抽气泵抽气1 h后， 37°C温育过夜。逐步加入100%-90%-80%-75%一系列乙醇脱去叶绿素，65°C温育，每隔1 h换一次乙醇，直至叶绿素脱干净，染色后的材料在体视镜下进行观察和拍照。

另一部分拟南芥幼苗移栽植到营养土中，培养6w左右，对拟南芥苗进行4°C冷处理1d，分别取根、茎和叶进行 GUS 染色。GUS基因的表达产物，可将反应液中的X-Gluc水解成蓝色物质，使组织呈现蓝色，蓝色的深浅及斑点数量，一定程度上反应GUS基因的表达水平。

7. 结果分析

将冷处理前后的纯合转基因幼苗进行组织染色分析，并通过荧光实时定量PCR检测冷处理前后GUS基因的表达量变化。通过染色分析发现在正常温度下，转化pCbRCI35-GUS质粒的转基因烟草小苗根茎叶组织几乎没有蓝色，但在低温条件下，拟南芥小苗根茎叶组织均显现蓝色斑点，由此说明，荠菜过氧化物酶基因的启动子低温诱导后在拟南芥中能启动报告基因的表达（图1C），同时发现在幼苗的根茎叶组织中，GUS的表达量在冷处理8 h后明显上升，在冷处理8h后上调了18倍左右（图1B）。

实施例4 荠菜过氧化物酶基因启动子低温诱导活性的半薄切片观察

1、荠菜转基因阳性苗

转基因阳性苗获得与实施例3相同。

2、GUS染色

转基因阳性苗的GUS染色与实施例3相同。

3、半薄切片

取已经进行GUS染色的叶片、根、茎等组织，用FAA固定液固定材料，然后分别用70%-85%-95%的乙醇连续脱水30min，更换无水乙醇后继续脱水两次，每次2h。接着将无水乙醇与Base Liquid Technovit 7100等体积混匀后预渗透材料约1~2h。将1g硬化剂1溶于100ml Base Liquid Technovit 7100后用于渗透材料过夜。随后将1ml硬化剂2加入15ml预渗透液中，混匀后，立即包埋样品，然后于65℃烘箱烘烤2-3d。半薄切片切片机切片，厚度约4~5um。最后在显微镜下观察、拍照。

4、结果分析

转基因幼苗长到5w大小时，利用半薄切片技术观察组织的染色情况，如图所示（图1C）发现冷处理之前根茎叶中的表达量都非常低，叶和茎中几乎没有，根中也只能看到一点点隐隐约约的淡蓝色。但是冷处理之后组织中表达量都有明显上升，根中上升尤其明显而且根中表达量的上调主要集中在根组织中细胞特别集中的形成层部位，这说明此基因可能参与冷害中植物具有分化能力部位组织的保护，茎和叶片中可以看出淡淡的蓝色出现在细胞边缘。

<110> 复旦大学

<120> 荠菜过氧化物酶基因启动子及其改良植物抗寒性中的应用

<130> 001

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1312

<212> DNA

<213> 荠菜（Capsella bursa-pastoris）

<400> 1

tcacaaaact agttgttctt tagttaaatt ttgctttata tctcgaggcg attgctcaac 60

taccactaat tcactatata tgttttcatc catccataaa ttcatcagaa tattcaagat 120

tttacgaatt ctaaaaatga aagtgtcata gaatctcagt tatgatgtat aacttttaat 180

ttttggtgtt gattatgaca tcacaacgct caagacaatt aattaagttt agctttctat 240

gttacttact attagctaga cttttttctg ctgttgatta tgacatcata acgctcaaat 300

tcgaaaaaga gtcaaataag tttacgagac gttctatgtt accaacttac ccatagcttg 360

atttaaggac caactattta ccctctttta acatatctaa tactttatta tcccaggaca 420

aaataaaata aaataaaata tgtaaataca gttattgagg tttgagtttt aatacaatag 480

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cctttccacc caagaattat ggcgagagta ttggtcatgc ccaaatcttt agtaacttaa 600

aacaaaatca cattggctac cttctggtgt aaaaatagtt ccataaacga actaaaacac 660

aagttacaag taatgggagg aaaacaatat ataagtggaa agacgtaaaa ctttaattaa 720

cttgagagta aaaacatctt ccaacttctc taattgaagc taaacatgat aatatgatat 780

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tcaagctttt gtaattacga gtggcgcaga aaaaataatg aaaaataaca aaagcaaaac 900

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aacccccaca actttaaaga tgaactgctt gagagctatt gccctctcac tctctctctt 1140

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<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213>

<400> 2

atgaactgct tgagagctat tgccc 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213>

<400> 3

ttaactattt gcaacggaac attgcc 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213>

<400> 4

tcgcacgaaa caatcatgga aatg 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 5

agcactgatc catcgcatcc 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213>

<400> 6

tcacaaaact agttgttctt tagtt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213>

<400> 7

ctttaaagtt gtgggggttt ttttt 25

Claims (6)

1.一种从荠菜中分离的具有低温诱导特性的荠菜过氧化物酶基因的启动子，其特征在于：

其核苷酸序列如SEQ ID No.1中第1-1021位碱基所示，且其核苷酸序列包含有一个响应生长素顺式作用元件：GGTCCAT，两个响应甲基茉莉酸的顺式作用元件：CGTCA和TGACG，一个响应赤霉素的元件：TATCCCA，两个水杨酸诱导的元件：GAGAAGAATA和TCAGAAGAGG，还有两个与干旱诱导相关的MBS元件：CAACTG。

2.一种植物表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的荠菜过氧化物酶基因启动子。

3.一种权利要求1所述的荠菜过氧化物酶基因启动子的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）将荠菜种子经过70%酒精消毒后，播种于MS培养基上；

（2）待所述荠菜种子长出叶片后，提取所述叶片的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳分析其质量；以及

（3）采用基因克隆技术得到荠菜过氧化物酶基因的启动子序列，其中，使用的引物对为：上游引物：SEQ ID No：2，下游引物：SEQ ID No：3。

4.一种如权利要求2所述的植物表达载体的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）扩增出上述荠菜过氧化物酶基因启动子的DNA片段，所用引物对为：上游引物：SEQID No：2，下游引物： SEQ ID No：3；

（2）将所述DNA片段克隆到中间载体pMD18-T，再进一步克隆到植物表达载体p1304上，得到所述表达载体。

5.根据权利要求4所述的植物表达载体的制备方法，其特征在于还包括向所述上游引物引入限制性酶切位点KpnI，向所述下游引物引入限制性酶切位点NcoI。

6.由权利要求1所述的荠菜过氧化物酶基因的启动子或权利要求2所述的植物表达载体在植物的抗寒性改良中的应用；所述植物为拟南芥、荠菜或油菜。

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