CN115851823A - 一种春兰CgARF18基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种春兰CgARF18基因及其应用，CgARF18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从春兰栽培品种“宋梅”中克隆获得CgARF18的基因序列，并在春兰中进行表达分析，随后将其构建至过表达载体导入目的植物中验证其功能，发现过表达CgARF18基因的拟南芥与野生型植株相比莲座叶数目增加，表面出现凹陷，部分果实弯曲；离体叶片在含有IAA的MS培养基上生根率显著提高、根长增加，叶片中内源激素IAA、GA、ABA、MeJA含量降低，BR含量增加，可见该基因在兰花及其它园艺植物的栽培和遗传改良中将有广泛的用途。

Description

一种春兰CgARF18基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种春兰CgARF18基因及其应用。

背景技术

兰科(Orchidaceae)是开花植物中最大科之一，全世界有25000多种，约占所有开花植物的10％。春兰(Cymbidium goeringii)属于兰科兰属中的小花型地生兰种类，其花型奇特、花色淡雅，花香清幽，叶姿优美，观赏价值和经济价值极高，是典型的叶艺、花艺两全兰花。但近年来，该物种的过度挖掘和生态环境的恶化对春兰种子资源和生存环境的维护提出了较大的挑战。植物叶片是植物的重要器官之一，是植物光合作用的主要部位，良好的营养生长和叶片发育状态对繁殖成功至关重要。且春兰从幼苗到开花所需要的时间较长，野生春兰实生苗需十年左右方可开花，人工组培苗在养护得当的情况下也需至少三年才能开花，果实发育缓慢。因此，研究基因作用于植物生长发育的分子机制对春兰的育种、生产及应用具有重要意义。而ARF基因家族在植物生长发育方面具有重要作用，可为植物的遗传改良提供重要依据。

生长素响应因子(auxin response factor,ARF)是于1997年发现的一类调控生长素响应基因表达的转录因子家族，可以通过与生长素应答元件相互作用来调控相关基因表达，从而参与多种植物的生长发育过程。在拟南芥中，AtARF1、AtARF2、AtARF7和AtARF19与叶片衰老相关，AtARF3和AtARF4则能影响叶片的极性生长于发育。在番茄中，SlARF10能够抑制叶片的生长，且叶形发生改变；SlARF12在叶的早期发育中发挥作用，而SlARF2对叶片衰老有影响。水稻OsARF19在叶节中强烈表达，参与调控水稻叶片的生长角度，Osarf111突变体也表现出剑叶夹角变小。证明ARF转录因子在其他植物种可调控叶片发育。

此外，ARF转录因子也可调节果实发育过程。研究发现，在番茄中沉默SlARF7会导致单性结实，出现无籽和心形果实，表明SlARF7可能是坐果的负调控因子；在拟南芥和茄子中也观察到类似现象。另外，SlARF7对果实生长发育的调控作用可通过协调赤霉素和生长素途径来实现。SlARF4转录水平的降低会使果实在未成熟期表现为深绿色，果实硬度增强。在桃中，硬核期果实中PpARF1显著上调表达，预测PpARF1参与调控桃胚的形态建成和内果皮的木质化等过程；另有研究推测PpARF6在果实花色素苷的积累中发挥调控作用。番木瓜、葡萄、苹果及甜橙等植物中均检测到相关ARF基因参与调控果实的发育。因此，利用基因工程技术，将从春兰中克隆获得的CgARF18基因转入模式植物中，对研究其功能具有重要意义，同时极具应用前景。

发明内容

针对现有育种技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种春兰CgARF18基因。本发明的另一目的是提供春兰CgARF18基因在植物育种中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种春兰CgARF18基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的春兰CgARF18基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的春兰CARF18基因在植物生长发育中的应用。

春兰CgARF18在改变拟南芥“哥伦比亚”莲座叶生长发育的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；包括：将所述春兰CgARF18基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

春兰CgARF18在改变拟南芥“哥伦比亚”果实发育的应用，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；包括：将所述春兰CgARF18基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

春兰CgARF18在促进拟南芥“哥伦比亚”离体叶片生根中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；包括：将所述春兰CgARF18基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

春兰CgARF18在改变拟南芥“哥伦比亚”叶片内源激素含量中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；包括：将所述春兰CgARF18基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过对春兰CgARF18基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，及遗传转化，验证其功能，发现过表达CgARF18基因的拟南芥幼苗与野生型相比，莲座叶数目增加，表面出现凹陷，部分果实弯曲；但离体叶片生根率增加，且各内源激素含量发生变化，可见该基因在兰花生长发育及其他植物生产、育种中将有广泛用途。

附图说明

图1 A图是春兰CgARF18基因克隆的菌检电泳图，其中，M为DL2000 Marker，目的条带长度为2106bp；B图是CgARF18过表达载体双酶切验证电泳图；

图2 A图是CgARF18在春兰各组织中的表达情况，其中，R代表根，S代表假鳞茎，L代表叶，F代表花；B图是IAA处理下春兰CgARF18基因的表达情况；

图3是春兰CgARF18基因克隆和构建的过表达载体结构示意图；

图4 A图是转基因拟南芥植株PCR结果图，其中，M代表DL2000 Marker，1以野生型DNA为模板作为阴性对照，2-12以转基因植株DNA模板；

图5是过表达CgARF18基因植株与野生型拟南芥植株对比图；A图为株型对比图；B图为转基因植株叶片凹陷现象；C图为果实对比图；

图6是过表达CgARF18基因植株与野生型拟南芥植株的离体叶片在含不同浓度IAA的MS培养基上的生根情况；

图7是过表达CgARF18基因植株与野生型拟南芥植株叶片中的内源激素含量比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

本实施例所采用的材料是春兰‘宋梅’各组织，采后速冻于液氮中，超低温冰箱(-80℃)保存。

1)春兰各组织总RNA的提取

按照TaKaRa植物总RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：

将超低温冻存的春兰各组织迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至分别研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品分别加入到含有450μlBuffer PE的1.5mL灭菌tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000rpm，4℃离心5分钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中。加入上清液1/10体积的Buffer NB，Vortex振荡混匀，12,000rpm，4℃离心5钟；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌tube中，加入450μL的Buffer RL，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到RNA Spin Column中；12,000rpm，离心1分钟，弃滤液，将RNA Spin Column放回到2ml Collection Tube中；将500μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；将600uL的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；向RNA SpinColumn膜中央加入50μL DNase I反应液，室温静置15分钟；向RNA Spin Column膜中央加入350μL的Buffer RWB，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；将RNA Spin Column重新安置于2mLCollection Tube上，12,000rpm离心2分钟；将RNA Spin Column安置于1.5mL的RNase FreeCollection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入30μL的RNase Free dH₂O室温静置5分钟，12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。所得RNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。

吸取2μL RNA利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S和18S条带较为清晰，28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测RNA纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀均在1.8～2.1之间，完整性较好，可用于反转录。

2)第一链cDNA的合成

以所得到的总RNA为模板，使用天根反转录试剂盒进行反转录。具体操作如下：

将模板RNA在冰上解冻，5×Fastking-RT SuperMix和RNase-Free ddH₂O在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。在离心管中配制混合液，总量为10uL，含5×Fastking-RTSuperMix 4uL，Total RNA 800ng，剩余体积用RNase-Free ddH₂O补足。将该离心管离心，使离心管中的混合液均沉于管底，缓慢摇匀，在PCR仪上，42℃15min去除基因组并进行反转录反应，95℃3min使酶灭活，冰上放置，得到cDNA溶液。

3)目的基因引物的设计及克隆

根据现有的春兰转录组测序结果，利用CE Design设计春兰CgARF18基因扩增引物，引物序列为：

CgARF18-F:

5’-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAAAGAGAATAATTTTATTTCTGAAGAGG-3’

CgARF18-R:5’-ATAAGGGACTGACCACCCGGGCAACTTGCCCACGTTGTCG-3’。

以cDNA为模板，利用Takara的PrimerStar Max高保真酶进行春兰CgARF18基因的克隆。PCR扩增体系(50μL)为：25μlL PrimerStar Max，2μL Forward Primer，2μL ReversePrimer，2μL Template cDNA，19μL ddH₂O。PCR程序为：反应条件为94℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环，72℃总延伸5min，16℃保温。

PCR反应完成后，取全部PCR产物通过1.8％琼脂糖凝胶电泳检测(PCR扩增结果如图3)并切割目的片段，凝胶回收纯化PCR目的扩增产物。采用TransGen公司的DNA凝胶回收试剂盒，进行目的片段纯化回收，具体操作为：将单一目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量；向胶块中加入3倍体积溶液GSB(如果凝胶为0.1g，其体积可视为100μL，则加入300μL GSB溶液)，55℃水浴放置，其间不断温和上下翻转离心管，直至胶块完全溶解；将融化的凝胶溶液降至室温，加入1倍体积异丙醇(如果凝胶为0.1g，则加入100μL异丙醇)，轻柔混匀；将混合液加入离心柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min，弃流出液，后将离心柱放回收集管中；向离心柱内加入650μL溶液WB，12000rpm离心1min，弃流出液；12000rpm离心2min，尽量除尽残留的WB，将吸附柱置于室温开盖放置5min，彻底晾干；将离心柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL ddH₂O(ddH₂O需提前置于60～70℃水浴预热)，室温静置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。取2μL回收纯化后的产物，使用1.5％琼脂糖进行凝胶电泳检测，其余放置在-20℃冰箱，后续将用于与pBI121载体连接，构建过表达载体。

3)质粒的提取：

按照天根质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒，具体步骤如下：

取过夜培养的10mL菌液，12000rpm离心1min，去掉上清液；取500μL P1溶液(含RNase A)加至留有菌体沉淀的离心管中，使用涡旋仪彻底悬浮菌体沉淀；取500μL P2溶液加至离心管中，温和上下翻转时菌体裂解充分，取700μL P3溶液加至离心管中，立即温和上下翻转，充分混匀，当出现白色絮状沉淀后，12000rpm离心10min；取500μL平衡液BL加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，将收集的上清液分批加入过滤柱CS中，12000rpm离心2min，小心将收集管中收集的溶液分批加入吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管；取500μL去蛋白液PD加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱CP4重新放回收集管；取600μl漂洗液PW(含无水乙醇)加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液；将吸附柱CP4移至新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间加入60μL ddH₂O；室温静置2min，12000rpm离心1min，离心管中收集的溶液即为质粒。最后测定质粒浓度，为下一步实验做准备。

4)双酶切反应

将提取的pBI121质粒用XbaI和SmaI在37℃条件下酶切30min，电泳回收线性载体，-20℃保存备用。双酶切反应体系为50μL：pBI121质粒20μL，5×buffer 5μL，XbaI 1μL，SmaI 1μL，ddH₂O 23μL。

5)重组反应

琼脂糖凝胶电泳检测酶切后所回收到的目的基因和载体pBI121，根据所检测出的纯度和浓度，按连接体系加入各试剂。其中，目的片段分子数：载体分子数＝3:1～5:1，连接反应体系为：线性化pBI121载体7μL，插入片段3μL，5×CE II buffer 4μl，Exnase II 2μl，ddH₂O Up to 20μL。在37℃下反应30min，常温放置(勿立即置于冷却)，10min后转化至大肠杆菌感受态。

6)连接产物转入大肠杆菌

从超低温冰箱中取出感受态细胞Trans5α菌株，置于冰上融化。吸取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中；将离心管置于冰上冰浴10min；42℃水浴锅中水浴，热激90s，期间不要摇动；后立即置于冰上冰浴2min；在超净台中加入500μL无抗生素的液体培养基，37℃、200rpm摇25min复苏；6000rpm离心1min，吸去350μL上清；将沉淀的菌体重悬，涂布于LB平板(Kana的浓度为50mg/L)，37℃培养过夜。

7)重组子的鉴定

挑取平板上的单菌落接种到含有抗生素(Kana)的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养过夜。使用目的基因全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，菌检结果如图1A所示。筛选后的阳性克隆送南京思普金公司测序。测序结果正确的阳性克隆，扩大培养后，使用天根质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切验证，判断酶切后片段大小是否一致，酶切结果如图1B所示。

根据对测序结果的分析，最终确定克隆得到1个春兰CgARF编码基因，命名为CgARF18基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CgARF18基因编码长度为2106bp，含有ATG起始密码子和TAG终止密码子，其中ORF全长为2106bp，编码701个氨基酸，该氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

以克隆得到的春兰CgARF18基因为参照设计荧光定量引物，引物序列为：

qCgARF18-F：5’-TAAGCCCGTGGTTGGTAGAA-3’

qCgARF18-R：5’-ATGCCTGGGTCCCTGTATGC-3’

同时，以18S作为内参基因，引物序列为：

18S-F：5’-GGTCCTATTGTGTTGGCT-3’

18S-R：5’-TCGCAGTGGTTCGTCTTT-3’

利用ChamQ^TMUniversal SYBR Qpcr Master Mix试剂盒(Vazyme公司)的说明书进行反应溶液的配制，在Applied Biosystems型实时荧光定量分析仪上运行PCR程序：95℃5min；95℃10s，60℃30s，循环40次；95℃15s，60℃1min，95℃15s。待反应结束，获得扩增曲线，通过StepOne Software v2.3导出数据，利用Excel进行数据分析，根据CT值用2^-ΔΔCt相对定量法计算相对表达量，数据分析结果如图2所示。

本实施例研究结果表明CgARF18基因在春兰各个组织中均有表达(图2A)，但是该基因在春兰叶和根中表达量较高，说明该基因在这两种器官中功能活跃；通过对春兰IAA激素喷施处理的叶片进行表达分析，证明CgARF18基因在春兰叶片的IAA处理响应中起着重要的作用(图2B)。

实施例3

1)农杆菌感受态细胞的制备与转化

本实施例利用农杆菌GV3101来制备农杆菌感受态，进行拟南芥的侵染实验；农杆菌感受态制备过程为：挑取已经活化好的农杆菌单菌落，接种于5mL液体LB培养基中，28℃、250rpm摇菌培养20-24h；吸取2mL菌液，接种到含有50mL液体LB培养基的三角瓶中，28℃、250rpm摇菌至OD₆₀₀值为0.8左右；将扩大繁殖后的菌液置于冰上冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；加入10mL经预冷的0.1mo1/L CaCl₂溶液，充分悬浮沉淀的菌体；4℃，5000rpm离心5min，弃去上清；加入1mL预冷的20mmo1/L CaCl₂溶液充分悬浮菌体，即得到所要制备的GV3101感受态细胞，用离心管将其分装成100μL/管，迅速加入20％的无菌甘油，-80℃放置保存。

重组子的农杆菌转化：冰浴，使农杆菌感受态细胞融化，将600ng经回收纯化后的质粒加入到100μl的农杆菌感受态中，轻轻混匀，冰浴5min；使用液氮速冻5min，37℃金属浴中热激5min，迅速置于冰上冰浴5min；加入800μl不含任何抗生素的LB培养基，28℃，200rpm复苏2h；4000rpm离心3min，吸掉部分液体培养基；使用移液枪充分混匀剩余的菌液，后涂布于添加50mg/L卡那霉素和200mg/L的利福平的固体LB培养基上；28℃倒置培养30～48h。

农杆菌重组子的鉴定：从平板培养基上挑取长出的单菌落，接种于含有相应抗生素的液体培养基中；28℃，200rpm培养过夜后进行菌液PCR，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定是否含有目的片段，鉴定后的阳性克隆加入适量无菌50％甘油，于-80℃保存备用。

2)农杆菌介导的拟南芥的转化

采用花序侵染法将目的基因转入拟南芥中，具体操作方法为：拟南芥(哥伦比亚型)保持健康生长状态至开花；活化携带有目的基因的农杆菌GV3101菌株。挑取单菌落，接种于5mL含有卡那霉素和利福平的LB培养液中，28℃、200rpm摇菌至菌液刚刚变浑浊，约8-10h；吸取1mL菌液，接种到三角瓶中(50mL)摇菌24h，至OD值约为0.8左右；将菌液6000rpm在室温下离心5min，去除上清后收集菌体，用PH5.8的3％蔗糖溶液悬浮；浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.03％(300μl/L)，晃出泡沫；将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡1min，期间轻轻晃动；将浸过的拟南芥平躺在托盘中，用保鲜膜覆盖，锡箔纸密封避光，放置24h；揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

3％蔗糖溶液重悬液各成分如下：MS培养基，添加蔗糖30g/L，Silwet-77 300μl/L。(注意：配制后pH调制5.8，菌液离心重悬后再加入SilwetL-77；重悬液和菌液的换算关系为：重悬液用量：菌液OD*菌液体积＝0.8*重悬液)。

3)转基因植株的筛选

收集的T1代转基因拟南芥的种子，用酒精和次氯酸钠进行灭菌，步骤为：取适量获得的转基因种子放置于1.5mL离心管中，用8％NaClO与乙醇混合液(现配，比例为体积比1:1)浸泡5min；75％酒精灭菌5～6次，每次2min；无菌水冲洗3～4次；用0.1％琼脂糖溶液悬浮。

将灭菌后的转基因拟南芥种子播种于含有抗生素(卡那霉素50mg/L和头孢霉素100mg/L)的MS固体培养基上，锡纸包裹放入4℃冰箱中春化。2天后从冰箱中取出，将培养基置于22℃，光照培养。大约一周后将培养基上可以正常生长的拟南芥移植与土中，继续生长。

4)转基因植株的DNA检测

取适量T1代拟南芥和转基因植株的幼嫩叶片，采用擎科的植物DNA直扩试剂盒进行检测，具体操作步骤为：将适量幼嫩叶片剪碎后置于灭菌处理后的2mL离心管中，加入50uL Lysis Buffer A溶液，95℃加热裂解10min，继续4℃过夜裂解。次日14000rpm离心3min，取上清液移至新的无菌离心管中，作为PCR反应模板。用2×T5 Direct PCR Mix与基因的特异性引物进行PCR检测，结果如图4A所示。

5)转基因植株的荧光定量PCR检测

从上述11个过表达春兰CgARF18基因拟南芥株系的幼嫩茎生叶中提取总RNA，反转录及荧光定量引物、方法及程序同实施例2，最终数据分析结果如图4B所示。

6)转基因纯合株系的获得

收获的转基因T1代种子经灭菌，筛选培养后，再移植于营养土中，22℃，16h光照/8h黑暗培养；经检测后保留初步确认的转基因植株，待成熟后收获T1代种子，进行编号，得到T2代；同T1代一样，将T2代种子经灭菌后涂布于含抗生素的筛选培养基上，置于22℃，连续光照；10天左右，对不同编号的T2代种子进行存活率统计，选取存活比例为75％的植株移植与营养土中按照22℃，16h光照/8h黑暗培养，并取叶片进行阳性检测；阳性T2代植株继续进行编号，收集种子，得到T3代种子；将种子灭菌后，用筛选培养基筛选，置于光下连续光照培养；10天左右，观察不同编号的T3代植株，全部存活并且没有出现分离的为T3代纯合植株。

7)表型观察

选取其中表型明显的转基因株系进行观察，结果发现与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥植株比野生型提前抽茎，莲座叶数目增多，且发现叶片形态奇特，多数叶片会在叶脉两侧出现对称的凹陷，植株整体长势更加旺盛，部分果实出现弯曲。

将野生型和转基因种子经消毒后播种于MS培养基上，培养至4-6片真叶后在超净工作台中选取长势一致的幼苗，将真叶剪下，分别置于MS、MS+0.2mg/L IAA、MS+0.5mg/LIAA培养基上，每个基因每个处理选取15片叶片，重复3次，每个处理下均以野生型拟南芥作为对照。接种后置于培养箱内，培养条件为温度23℃，24h光照，光照强度6000lx，相对湿度70％。在接种第12d观察并记录叶片生长变化，发现转基因叶片在各培养基上的生根率和根长均比野生型高。

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定拟南芥叶片内源激素含量。样品在含有1mM丁基羟基甲苯(BHT)作为抗氧化剂的80％(v/v)甲醇萃取介质的10mL中研磨。提取液4℃孵卵4h，4000rpm离心15min。上清液经C-18柱，依次用80％(v/v)甲醇、100％(w/v)甲醇、100％(w/v)醚、100％(w/v)甲醇洗涤。然后激素组分在N2下干燥，溶解在含0.1％(v/v)Tween 20和0.1％(w/v)明胶的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行分析。ELISA试剂盒中抗IAA、ABA、GAs(GA1+GA3)、MeJA和BR的单克隆抗原和抗体由中国农业大学植物激素研究所生产)。采用96孔微量滴定板进行酶联免疫吸附测定。每孔用含抗激素抗原0.25μg/mL的包覆缓冲液(1.5g/LNa₂CO₃、2.93g/L NaHCO₃、0.02g/L NaN₃)100μL包覆，37℃孵育30min。用含0.1％(v/v)Tween20的PBS洗涤4次后，每孔充50μL样品提取物和50μL 20μg/mL抗体，按上述方法孵育和洗涤。每孔加入含1.5mg/mL 0-苯二胺和0.008％(v/v)H₂O₂的显色液100μL。每孔12mol/L H₂SO₄停止反应。采用ELISA仪(型号EL310,Bio-TEK,Winooski,VT)490nm显色。根据Weiler et al.(1981)计算激素含量。每种激素设3个生物重复。结果发现转基因植株叶片中内源激素IAA、GA、ABA、MeJA含量较野生型相比有所下降，而BR含量升高。

本实施例将过表达的春兰CgARF18基因的重组质粒转入模式植物拟南芥中，并进行表型观察和分析。从结果可以看出，过表达CgARF18基因的拟南芥植株与野生型植株幼苗相比莲座叶数目增多，叶片形态改变，果实出现弯曲；离体叶片在含有IAA的MS培养基上生根率提高、根长增加，叶片中内源激素IAA、GA、ABA、MeJA含量降低，BR含量升高，可见该基因对植株的花发育、不定根形成及激素水平变化均有影响。

SEQ ID NO.1：

ATGAAAGAGAATAATTTTATTTCTGAAGAGGAAGCAAGAAAGGACGCAGAGAAGTGCTTGGACGCCCAGCTGTGGCATGCTTGCGCTGGTGGAATGGTGCAGATGCCATCAGTGAATTCTAAAGTATACTATTTCCCTCAAGGCCATGCCGAGCATGCTCAAAGTCCTGTGGATTTCGGCACTTCTCTGAGAATTCCTCCTCTGGTTCTTGGCCGTGTCCTTTCTGTTAAATTTATGGCCGATTCAGTTACGGATGAGGTCTTTGCCAAGATTCATTTGATCCCTATGAGGAATAACGACCCAGATTACAACGAAGATGATGAGCTTGTTTTAGGTAGCAATGGGTCAGATTTGCAAGAAAAGCTTGCATCTTTTGCAAAGACTTTGACTCAATCTGATGCCAATAATGGTGGTGGATTCTCCGTTCCGAGATATTGCGCGGAGACTATATTTCCTAGATTGGATTACTCAGCTGACCCACCAGTCCAAACAGTGCTAGCCAAGGATGTCCATGGCAAGGTTTGGAAATTCCGACATATCTATAGAGGCACACCTCGCCGGCATTTGCTCACCACTGGTTGGAGCAATTTTGTCAATGAGAAGAAGCTTGTGGCAGGTGATTCCATTGTGTTCTTAAGAACTGAGAATGGAGATCTCTGTGTGGGGATCAGAAGGGCTAAGAGAGGAATTGGTGGGGGACCTGAGATGTCTGCAGGTTGGAATCAGCCTACAGGAAACTGTATGTATGGAGGATTCTCTGTTTTCTTGAGGGAGGATGAGAAGTTTAATAGAGGCAACGGAAATGGAGGCCGAATCAGTTCTGGTTCAAGCATGAGGGGAAGAGCCAAAGTGAGGGCAGATTCGGTGATCGAGGCTGCAACATCTGCAGCCAGAGGTCAGCCATTCGAAGTCATTTACTATCCAAGGGCGAGCACGCCGGAGTTTTGTGTGAAGGCATCAGCAGTGAGAGCTGCAATGAGGATCCAGTGGTGTTCTGGCATGAGGTTTAAGATGGCTTTTGAGACTGAGGACTCCTCGAGGATAAGTTGGTTTATGGGTACCATATCTGCTGTTCATGTTGCTGACCTTATGAGGTGGCCTGGATCACCTTGGAGGCTTCTTCAGGTTTCATGGGACGAGCCTGATCTCTTACAGAATGTAAAACGCGTAAGCCCGTGGTTGGTAGAACTCGTCTCCAACATTCCATCCATCCACTTATCTCCGCCCTTCTCGCCTCCACGAAAGAAAACTCGGATCCCTCAGCATCCTGAATTCTCTCTCGATGTTCAACTCACATCCTCACCATTCCCAGAAAACACCCTCATTCCCAGCAGCAGCCCACTGTGTTGTCTTCCAGACAACACTACTGCAGTTGGCATACAGGGACCCAGGCATAGTCAGTATGGCGCAAATCTACCAGAACTCCGCTTCGGAAAGTTGCAGTCTGGCCTGTTCCATACTGGATTTCATCGGCTCGATCACTTTGCTCCATCTCATAGAATCTCCACAGGCCTCATTGTTCCGAATTCCACCATTCATGAAGATGTATCCTGCTTGTTAACCATTGGGAATCCTTCTCAGAATGCGAGAAAGGATTGCAGCAATGAATGCGATGCGAGGACGCCCAAGTTTATACTGTTTGGAAAGCCTATACACACTGAAAAACAGCTTTCTCTTAGCCCAAACCACTCTTCTAATATGAATTCTGACAAGATGACGAATTTATCGAACGGTTCGGGATCATCGATTCATCAGAATGGAATAGGAGATTATAATTCATCTTCTGAAGGTCTTCTTCCTTGGTATCGGGATCGAAAACTGAATGAGCTTGGTTCGGAGTTCGGTCGCTGCAAGTTGTTCCTGGAATCCGAAGATGTAGGCCAGACCCTTGACCTCTCCTCCTTTGCTTCATATGAGGAGTTGTATAAAAGATTAGCTAACATGTTTGGAATCAAGAAATCAGAACTGAACTGCCGTATTCTTTATCGAGATTTTGCTGGTGTTGTTAAGCACACTGGAGATGAGCCTTTTGCTGAATTCATGAAGGCGGCGAGGAGACTAACAATATTTATGGATTCGAGCAGCGACAACGTGGGCAAGTTGTAG

SEQ ID NO.2：

MKENNFISEEEARKDAEKCLDAQLWHACAGGMVQMPSVNSKVYYFPQGHAEHAQSPVDFGTSLRIPPLVLGRVLSVKFMADSVTDEVFAKIHLIPMRNNDPDYNEDDELVLGSNGSDLQEKLASFAKTLTQSDANNGGGFSVPRYCAETIFPRLDYSADPPVQTVLAKDVHGKVWKFRHIYRGTPRRHLLTTGWSNFVNEKKLVAGDSIVFLRTENGDLCVGIRRAKRGIGGGPEMSAGWNQPTGNCMYGGFSVFLREDEKFNRGNGNGGRISSGSSMRGRAKVRADSVIEAATSAARGQPFEVIYYPRASTPEFCVKASAVRAAMRIQWCSGMRFKMAFETEDSSRISWFMGTISAVHVADLMRWPGSPWRLLQVSWDEPDLLQNVKRVSPWLVELVSNIPSIHLSPPFSPPRKKTRIPQHPEFSLDVQLTSSPFPENTLIPSSSPLCCLPDNTTAVGIQGPRHSQYGANLPELRFGKLQSGLFHTGFHRLDHFAPSHRISTGLIVPNSTIHEDVSCLLTIGNPSQNARKDCSNECDARTPKFILFGKPIHTEKQLSLSPNHSSNMNSDKMTNLSNGSGSSIHQNGIGDYNSSSEGLLPWYRDRKLNELGSEFGRCKLFLESEDVGQTLDLSSFASYEELYKRLANMFGIKKSELNCRILYRDFAGVVKHTGDEPFAEFMKAARRLTIFMDSSSDNVGKL-

Claims (4)

1.春兰CgARF18在改变拟南芥“哥伦比亚”莲座叶生长发育的应用，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；包括：将所述春兰CgARF18基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

2.春兰CgARF18在改变拟南芥“哥伦比亚”果实发育的应用，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示；包括：将所述春兰CgARF18基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

3.春兰CgARF18在促进拟南芥“哥伦比亚”离体叶片生根中的应用，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；包括：将所述春兰CgARF18基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

4.春兰CgARF18在改变拟南芥“哥伦比亚”叶片内源激素含量中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；包括：将所述春兰CgARF18基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

Images