CN116179590B - 一种春兰miR396基因在调控植物茎增粗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种春兰miR396基因及其在调控植物茎增粗中的应用，春兰miR396基因的前体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其成熟体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从春兰栽培品种“宋梅”中克隆获得miR396的前体基因序列，并在春兰中进行组织表达差异分析，将其构建至过表达载体导入目的植物中验证其功能，发现过表达miR396基因的拟南芥植株与野生型植株相比出现主茎增粗、株高增加等表型，可见该基因在兰花及其它园艺植物的栽培和性状改良中将发挥特定的用途。

Description

一种春兰miR396基因在调控植物茎增粗中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种春兰miR396基因在调控植株茎增粗中的应用。

背景技术

兰科（Orchidaceae）是开花植物中最大科之一，全世界有25000多种，约占所有开花植物的10%。春兰（Cymbidium goeringii）属于兰科兰属中的小花型地生兰种类，其花型奇特、花色淡雅，花香清幽，叶姿优美，观赏价值和经济价值极高，是典型的叶艺、花艺两全兰花。但近年来，该物种的过度挖掘和生态环境的恶化对春兰种质资源和生存环境的维护提出了较大的挑战。植物主茎是植物的重要器官之一，是植物支撑与营养传输的主要部位，春兰小鳞茎更能起到贮存养分的作用，对其生长状态和分株繁殖至关重要。因此，研究基因作用于植物茎发育的分子机制对春兰及其他植物的育种、生产及应用具有重要意义。

MicroRNA396是一类由约21个核苷酸组成的小RNA，能够通过抑制其靶标生长因子GRF进行转录后调控。目前已在多种植物中研究了miR396在植物生长发育中的作用，主要发现其能够调控细胞增殖的有丝分裂过程，从而影响分生组织生长、次生生长、叶细胞形态发生等生物学过程。其中，次生生长即维管组织的中间形成层向外发育形成次生韧皮部，向内发育形成次生木质部，该生长过程的改变能够对植物茎段发育产生重要的影响，改变其粗度、密度等指标。目前已在杨树等植物中发现了miR396调控茎干增粗的现象，但较其在叶片中的研究较少。因此，利用基因工程技术将从春兰中克隆获得的miR396前体基因转入模式植物中，对研究其在茎中的功能具有重要意义，同时极具应用前景。

发明内容

针对现有育种技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种春兰miR396基因。本发明的另一目的是提供春兰miR396基因在植物育种中的应用，尤其是在主茎发育方面。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种春兰miR396前体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的春兰miR396前体中包含的成熟体序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的春兰miR396基因在调控植物茎增粗及株型中的应用。

优选的，所述植物为春兰‘宋梅’。

具体方法为：将所述春兰miR396前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过对春兰miR396基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，及遗传转化，验证其功能，发现过表达miR396基因的拟南芥与野生型相比，主茎增粗、株型增大，可见该基因在兰花营养生长及其他植物生产、育种中将发挥特定用途。

附图说明

图1 A图是春兰miR396前体基因克隆的菌检电泳图，其中，M为50 bp DNA Ladder，目的条带长度为200bp左右（目的基因125bp+载体同源臂）；B图是miR396前体过表达载体双酶切验证电泳图；

图2 是miR396在春兰各组织中的表达情况，假鳞茎中表达量最高；

图3 是春兰miR396前体基因构建的过表达载体结构示意图；

图4 是转基因拟南芥植株DNA的PCR结果图，其中，M代表DL2000 Marker，WT泳道以野生型DNA为模板作为阴性对照，S1-S8泳道以转基因植株不同株系的DNA为模板；

图5 是过表达mi396基因植株与野生型拟南芥植株的主茎粗度测量对比图；

图6 是过表达miR396基因植株与野生型拟南芥植株的株型对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

本实施例所采用的材料是春兰‘宋梅’营养生长时期的新鲜叶片，所用的大肠杆菌菌株为Trelief 5α。

1）春兰gDNA的提取

按照Takara植物DNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：

将新鲜的春兰“宋梅”叶片转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；迅速将研磨成粉状的样品加入到含有500 μl Buffer HS I和10μl 50x DTT Buffer混合液的1.5 mL灭菌 tube中混匀，向其中加入10 μl RNase A，涡旋振荡混匀，于56℃金属浴温育10min。将62.5 μl 的Buffer KAC加入裂解好的样品中，用移液枪反复吹打混匀，将其在冰上放置5min，12,000rpm离心5分钟；小心吸取上清液，并转移至新的新的1.5ml 灭菌 tube中，加入与上清液等体积的Buffer GB并将二者混合均匀；将上述所得混合液分次移入安置在Collection tube的Spin Column中，12,000rpm 离心1分钟，弃滤液；将500 μl Buffer WA加至Spin Column中，12,000rpm 离心1分钟，弃滤液；将700 μl Buffer WB沿Spin Column 管壁四周加入，12,000rpm 离心1分钟，弃滤液；再次将700 μl Buffer WB沿Spin Column 管壁四周加入，12,000rpm 离心1分钟，弃滤液；12,000rpm离心2分钟，以确保无剩余液体残留在Spin Column中。将Spin Column安置于新的1.5ml 灭菌 tube中，向Spin Column膜的中央处加入30 μl 在65℃金属浴上温育过的无菌水，室温静置5min；12,000rpm离心2分钟以洗脱gDNA。所得gDNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。

吸取2μL gDNA利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示仅有一条清晰的大分子条带，全基因组DNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测gDNA纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀均在1.8~2.1之间，完整性较好，可用于PCR。

2）目的基因引物的设计及克隆

根据现有的春兰microRNA组学高通量测序结果，利用CE Design设计春兰miR396前体基因扩增引物，引物序列为：

MIR396-F: 5’- gagaacacgggggactctagaGCTGGGTTGCCTCATATTTTTC-3’

MIR396-R: 5’- ataagggactgaccacccgggTTTGGATTTACCCATGTTTTCCC-3’。

以gDNA为模板，利用Takara的PrimerStar Max高保真酶进行春兰miR396前体基因的克隆。PCR扩增体系（50μL）为：25μlL PrimerStar Max，2μL Forward Primer，2μLReverse Primer，2μL Template cDNA，19μL ddH₂O。PCR程序为：反应条件为94℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环，72℃总延伸5min，16℃保温。

PCR反应完成后，取全部PCR产物通过1.8%琼脂糖凝胶电泳检测并切割目的片段，凝胶回收纯化PCR目的扩增产物。采用TransGen公司的DNA凝胶回收试剂盒，进行目的片段纯化回收，具体操作为：将单一目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量；向胶块中加入3倍体积溶液GSB（如果凝胶为0.1g，其体积可视为100μL，则加入300μLGSB溶液），55℃水浴放置，其间不断温和上下翻转离心管，直至胶块完全溶解；将融化的凝胶溶液降至室温，加入1倍体积异丙醇（如果凝胶为0.1g，则加入100μL 异丙醇），轻柔混匀；将混合液加入离心柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min，弃流出液，后将离心柱放回收集管中；向离心柱内加入650μL溶液WB，12000rpm离心1min，弃流出液；12000rpm离心2min，尽量除尽残留的WB，将吸附柱置于室温开盖放置5min，彻底晾干；将离心柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL ddH₂O（ddH₂O需提前置于60~70℃水浴预热），室温静置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。取2μL回收纯化后的产物，使用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测，其余放置在-20℃冰箱，后续将用于与pBI121载体连接，构建过表达载体。

3）质粒的提取：

按照天根质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒，具体步骤如下：

取过夜培养的10mL菌液，12000 rpm离心1min，去掉上清液；取500μL P1溶液（含RNase A）加至留有菌体沉淀的离心管中，使用涡旋仪彻底悬浮菌体沉淀；取500μL P2溶液加至离心管中，温和上下翻转时菌体裂解充分，取700μL P3溶液加至离心管中，立即温和上下翻转，充分混匀，当出现白色絮状沉淀后，12000rpm离心10min；取500μL平衡液BL加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，将收集的上清液分批加入过滤柱CS中，12000rpm离心2min，小心将收集管中收集的溶液分批加入吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管；取500μL去蛋白液PD加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱CP4重新放回收集管；取600μl 漂洗液PW（含无水乙醇）加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液；将吸附柱CP4移至新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间加入60μL ddH₂O；室温静置2min，12000rpm离心1min，离心管中收集的溶液即为质粒。最后测定质粒浓度，为下一步实验做准备。

4）双酶切反应

将提取的pBI121质粒用XbaI和SmaI在37℃条件下酶切30min，电泳回收线性载体，-20℃保存备用。双酶切反应体系为50μL：pBI121质粒 20μL，5×buffer 5μL，XbaI 1μL，SmaI 1μL，ddH₂O 23μL。

5）重组反应

琼脂糖凝胶电泳检测酶切后所回收到的目的基因和载体pBI121，根据所检测出的纯度和浓度，按连接体系加入各试剂。其中，目的片段分子数：载体分子数=3:1~5:1，连接反应体系为：线性化pBI121载体7μL，插入片段3μL，5×CE II buffer 4μl，Exnase II 2μl，ddH₂O Up to 20μL。在37℃下反应30min，常温放置（勿立即置于冷却），10min后转化至大肠杆菌感受态。

6）连接产物转入大肠杆菌

从超低温冰箱中取出感受态细胞Trans5α菌株，置于冰上融化。吸取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中；将离心管置于冰上冰浴10 min；42℃水浴锅中水浴，热激90 s，期间不要摇动；后立即置于冰上冰浴2 min；在超净台中加入500μL无抗生素的液体培养基，37℃、200 rpm摇25min复苏；6000 rpm 离心1 min，吸去350μL上清；将沉淀的菌体重悬，涂布于LB平板（Kana的浓度为50 mg/L），37℃培养过夜。

7）重组子的鉴定

挑取平板上的单菌落接种到含有抗生素（Kana）的LB液体培养基中，37℃、200 rpm震荡培养过夜。使用目的基因全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，菌检结果如图1A所示。筛选后的阳性克隆送南京思普金公司测序。测序结果正确的阳性克隆，扩大培养后，使用天根质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切验证，判断酶切后片段大小是否一致，酶切结果如图1B所示。

根据对测序结果的分析，最终确定克隆得到1个春兰miR396前体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中包含一个春兰miR396成熟体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

本实施例所采用的材料是春兰‘宋梅’各组织，采后速冻于液氮中，超低温冰箱（-80℃）保存。

1）春兰各组织Small RNA的提取

按照TaKaRa植物RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：

将超低温冻存的春兰各组织迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至分别研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品分别加入到含有450 μlBuffer PE 的1.5 mL灭菌 tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000 rpm，4℃离心5分钟；将上清液小心吸取到新的1.5 mL灭菌tube 中。加入上清液 1/10体积的Buffer NB，Vortex 振荡混匀，12,000 rpm，4℃离心5 钟；将上清液小心吸取到新的1.5 mL灭菌 tube 中，加入450μL的 Buffer RL，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1.5倍体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到RNASpin Column中；12,000 rpm，离心1分钟，弃滤液，将RNA Spin Column 放回到2 mlCollection Tube 中；将600μL的80%乙醇加入至RNA Spin Column 中，12,000 rpm 离心30秒钟，弃滤液；向RNA Spin Column膜中央加入50μL DNase I 反应液，室温静置15分钟；向RNA Spin Column膜中央加入350μL的Buffer RWB，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液；将600μL的80%乙醇加入至RNA Spin Column 中，12,000 rpm 离心30秒钟，弃滤液；将 RNA SpinColumn 重新安置于2mL Collection Tube 上，12,000 rpm 离心2分钟；将 RNA SpinColumn 安置于1.5 mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央处加入30μL的 RNase Free dH₂O室温静置5分钟，12,000 rpm 离心2分钟洗脱RNA。所得SmallRNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。

吸取2μL RNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S和18S条带较为清晰，28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测RNA纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀均在1.8~2.1之间，完整性较好，可用于反转录。

2）第一链cDNA的合成

根据克隆结果，利用Vazyme miRNA Design V1.01软件设计春兰miR396基因的茎环引物，参考序列为：5’- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTCA-3’。同时，以18S作为内参基因，引物序列为：5’-TCGCAGTGGTTCGTCTTT-3’。以上述所提取的春兰各组织的Total Small RNA分别为模板，按照Vazyme公司的HiScript III 1^st Strand cDNASynthesis Kit试剂盒的说明书混合好体系，进行cDNA反转录，反转录程序为：37℃ 15min，85℃ 5s。所得cDNA用于后续的荧光定量实验。

3）实时荧光定量PCR

以克隆得到的春兰miR396基因为参照设计荧光定量引物，引物序列为：

qmiR396-F：5’- GCGCGTTCCACAGCTTTCT-3’

qmiR396-R：5’- AGTGCAGGGTCCGAGGTATT -3’

同时，以18S作为内参基因，引物序列为：

18S-F：5’-GGTCCTATTGTGTTGGCT-3’

18S-R：5’-TCGCAGTGGTTCGTCTTT-3’

利用ChamQ™ Universal SYBR Qpcr Master Mix试剂盒（Vazyme公司）的说明书进行反应溶液的配制，在Applied Biosystems型实时荧光定量分析仪上运行PCR程序：95℃5min；95℃ 10s，60℃ 30s，循环40次；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。待反应结束，获得扩增曲线，通过StepOne Software v2.3导出数据，利用Excel进行数据分析，根据CT值用2-ΔΔCt相对定量法计算相对表达量，数据分析结果如图2所示。

本实施例研究结果表明春兰miR396在春兰各个组织中均有表达（图2），该基因在春兰假鳞茎中表达量最高，说明该基因在其中功能活跃。

实施例3

1）农杆菌感受态细胞的制备与转化

本实施例利用农杆菌GV3101来制备农杆菌感受态，进行拟南芥的侵染实验；农杆菌感受态制备过程为：挑取已经活化好的农杆菌单菌落，接种于5mL液体LB培养基中，28℃、250 rpm摇菌培养20-24 h；吸取2mL菌液，接种到含有50mL液体LB培养基的三角瓶中，28℃、250 rpm摇菌至OD₆₀₀值为0.8左右；将扩大繁殖后的菌液置于冰上冰浴30 min，4℃、5000rpm离心5 min，弃上清；加入10mL经预冷的0.1 mo1/L CaCl₂溶液，充分悬浮沉淀的菌体；4℃，5000 rpm离心5 min，弃去上清；加入1mL预冷的20 mmo1/L CaCl₂溶液充分悬浮菌体，即得到所要制备的GV3101感受态细胞，用离心管将其分装成100µL/管，迅速加入20%的无菌甘油，-80℃放置保存。

重组子的农杆菌转化：冰浴，使农杆菌感受态细胞融化，将600ng经回收纯化后的质粒加入到100 μl的农杆菌感受态中，轻轻混匀，冰浴5 min；使用液氮速冻5min，37℃金属浴中热激5 min，迅速置于冰上冰浴5min；加入800 μl不含任何抗生素的LB培养基，28℃，200 rpm复苏2 h； 4000 rpm离心3 min，吸掉部分液体培养基；使用移液枪充分混匀剩余的菌液，后涂布于添加 50 mg/L卡那霉素和200 mg/L的利福平的固体 LB 培养基上；28℃倒置培养30~48 h。

农杆菌重组子的鉴定：从平板培养基上挑取长出的单菌落，接种于含有相应抗生素的液体培养基中；28℃，200 rpm培养过夜后进行菌液PCR，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定是否含有目的片段，鉴定后的阳性克隆加入适量无菌50%甘油，于-80℃保存备用。

2）农杆菌介导的拟南芥的转化

采用花序侵染法将目的基因转入拟南芥中，具体操作方法为：拟南芥（哥伦比亚型）保持健康生长状态至开花；活化携带有目的基因的农杆菌GV3101菌株。挑取单菌落，接种于5mL含有卡那霉素和利福平的LB培养液中，28℃、200 rpm摇菌至菌液刚刚变浑浊，约8-10 h；吸取1mL菌液，接种到三角瓶中(50mL )摇菌24 h，至OD值约为0.8左右；将菌液6000rpm在室温下离心5 min，去除上清后收集菌体，用pH5.8的3%蔗糖溶液悬浮；浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.03%(300 μl/L)，晃出泡沫；将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡1min，期间轻轻晃动；将浸过的拟南芥平躺在托盘中，用保鲜膜覆盖，锡箔纸密封避光，放置24 h；揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

3%蔗糖溶液重悬液各成分如下：MS培养基，添加蔗糖30g/L，Silwet-77 300µl/L。（注意：配制后pH调制5.8，菌液离心重悬后再加入SilwetL-77；重悬液和菌液的换算关系为：重悬液用量：菌液OD*菌液体积=0.8*重悬液）。

3）转基因植株的筛选

收集的T1代转基因拟南芥的种子，用酒精和次氯酸钠进行灭菌，步骤为：取适量获得的转基因种子放置于1.5mL离心管中，用8 % NaClO与乙醇混合液（现配，比例为体积比1:1）浸泡5min；75%酒精灭菌5~6次，每次2 min；无菌水冲洗3~4次；用0.1%琼脂糖溶液悬浮。

将灭菌后的转基因拟南芥种子播种于含有抗生素（卡那霉素50 mg/L和头孢霉素100 mg/L）的MS固体培养基上，锡纸包裹放入4℃冰箱中春化。2天后从冰箱中取出，将培养基置于22℃，光照培养。大约一周后将培养基上可以正常生长的拟南芥移植与土中，继续生长。

4）转基因植株的DNA检测

取适量T1代拟南芥和转基因植株的幼嫩叶片，采用擎科的植物DNA直扩试剂盒进行检测，具体操作步骤为：将适量幼嫩叶片剪碎后置于灭菌处理后的2mL离心管中，加入50uL Lysis Buffer A溶液，95℃加热裂解10 min， 继续4℃过夜裂解。次日14000 rpm离心3 min，取上清液移至新的无菌离心管中，作为PCR反应模板。用2×T5 Direct PCR Mix与基因的特异性引物进行PCR检测，结果如图4所示。

5）转基因纯合株系的获得

收获的转基因T1代种子经灭菌，筛选培养后，再移植于营养土中，22℃，16 h光照/8h黑暗培养；经检测后保留初步确认的转基因植株，待成熟后收获T1代种子，进行编号，得到T2代；同T1代一样，将T2代种子经灭菌后涂布于含抗生素的筛选培养基上，置于22℃，连续光照；10天左右，对不同编号的T2代种子进行存活率统计，选取存活比例为75%的植株移植与营养土中按照22℃，16 h光照/8h黑暗培养，并取叶片进行阳性检测；阳性T2代植株继续进行编号，收集种子，得到T3代种子；将种子灭菌后，用筛选培养基筛选，置于光下连续光照培养；10天左右，观察不同编号的T3代植株，全部存活并且没有出现分离的为T3代纯合植株。

6）表型观察

选取其中表型明显的转基因株系进行观察，结果发现与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥植株的主茎增粗（距地面1cm处测量），叶片变大，株高增加，株型增大，植株长势较为强壮。

本实施例将过表达的春兰miR396基因的重组质粒转入模式植物拟南芥中，并进行表型观察和分析。从结果可以看出，过表达miR396基因的拟南芥植株与野生型植株相比出现主茎增粗、株型增大等表型，可见该基因对植株的主茎发育及株型建成具有调控作用。

Claims (1)

1.春兰miR396在调控拟南芥“哥伦比亚”主茎发育中的应用，其前体核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，成熟体序列如SEQ ID NO. 2所示；将所述春兰前体miR396基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得主茎增粗的转基因植株。