CN108795944B - 棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉花长链非编码RNA lncRNA‑lnc973序列及其在植物耐盐性中的应用，所述的lncRNA‑lnc973的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过PCR证实了lncRNA‑lnc973的客观存在，且在盐胁迫条件下其表达量显著提高。克隆棉花lncRNA‑lnc973全长转录本，构建过表达载体转化野生型拟南芥，转基因拟南芥提高了耐盐性；通过病毒诱导基因沉默技术，构建VIGS敲除载体，转染棉花叶片，结果证实，VIGS敲除后棉花lnc973的表达量显著降低，耐盐性下降。这表明过表达棉花lncRNA‑lnc973可以提高植物的耐盐性。

Description

棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用。

背景技术

棉花既是主要的纤维作物，也是重要的油料作物，它虽然是比较耐盐的农作物，但是，土壤盐渍化不仅限制棉花生长，而且还影响其产量及纤维品质，给棉花生产造成极大损失。因此，研究棉花耐盐调控机理，克隆棉花耐盐相关基因及调控元件，开展棉花的转基因研究，是提高棉花盐碱育种的核心关键技术。

长链非编码RNA是长度大于200bp，且不具有编码蛋白质功能的一类RNA分子。根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以将lncRNA分为5类：正义(sense)、反义(antisense)、双向(bidirectional)、基因内(intronic)、及基因间(intergenic)。长期以来，lncRNA一直被作为是转录过程中产生的“噪音”而被忽视。lncRNA的长度普遍更短，保守性较差并且表达水平明显低于蛋白编码基因。近年来大量研究结果表明，长链非编码RNA参与多个生物代谢进程，具有很多生物学功能，参与剂量补偿、基因组印记、染色体重塑、可变剪切、细胞核亚结构组装等众多生物进程。lncRNA没有一种普遍的作用模式，它可以以不同的方式来调控基因表达和蛋白合成，如通过顺式(cis)或反式(trans)作用调控编码基因的表达，除此之外还可以作为miRNA的“sponge”，竞争性地结合miRNA，进而影响miRNA对下游靶基因的调控。lncRNA可以在多个层面上对基因表达进行调控，包括表观遗传学水平调控、转录水平调控以及转录后水平调控几个方面。近几年来，lncRNA逐渐被植物学家重视，除了在模式植物拟南芥中发现了lncRNA之外，水稻、小麦、玉米和棉花中也陆续有所发现。在植物lncRNA方面的研究表明，植物lncRNA与基因表达调控，植物花期调控以及重要的生物代谢途径密切相关。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一个棉花盐胁迫相关的长链非编码RNAlncRNA-lnc973，探索其在棉花耐盐过程中的作用机制，进而应用该长链非编码RNA改良棉花的耐盐性，创造耐盐棉花优良品种。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种棉花长链非编码RNA，其为lncRNA-lnc973，具有：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

2)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％以上序列同源性，且功能上与SEQID NO.1所示的核苷酸序列等同。

本发明的第二方面，提供含有上述棉花长链非编码RNA的植物表达载体。

进一步的，本发明还提供包含上述植物表达载体的重组菌。

本发明的第三方面，提供上述棉花长链非编码RNA、植物表达载体或重组菌在提高植物耐盐性中的应用。

本发明的第四方面，提供上述棉花长链非编码RNA、植物表达载体或重组菌在植物育种方面的应用。所述植物育种为培育耐盐植物品种。

本发明的第五方面，提供一种提高植物耐盐性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物为拟南芥。

本发明的有益效果：

本发明首次从棉花中分离得到一个与植物耐盐性相关的棉花长链非编码RNAlncRNA-lnc973。本发明的lncRNA-lnc973可作为基因资源在农业生产上使用或选育转基因植物以提高耐盐性，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为lncRNA-lnc973的基因结构。

图2为lncRNA-lnc973在0mmol/L和250mmol/L NaCl处理陆地棉山农91-11真叶中的表达量结果图。

图3为克隆lncRNA-lnc973的扩增结果。左泳道为DNAmarker，DNA分子量标准为DL2000，右泳道为lncRNA-lnc973的PCR扩增片段为2134bp。

图4为双酶切鉴定单克隆pMD19-lnc973，所用DNA marker为DL5000。

图5为双酶切鉴定单克隆过表达载体pCAMBIA1300-lnc973-eGFP，过表达载体pCAMBIA1300-eGFP质粒大小为12291bp，所用DNA marker为DL10000bp。

图6为PCR扩增鉴定阳性转基因植株，Marker为DL10000，1-4为阳性植株。

图7为转基因阳性植株表型鉴定结果，A、B分别为0mmol/L和100mmol/L NaCl处理7天内转基因和野生型拟南芥种子萌发率情况；C为NaCl处理后相对鲜重的统计；D为NaCl处理后相对根长的统计。

图8为不同浓度NaCl处理下转基因和野生型拟南芥根长的比较图。

图9为VIGS载体敲除lnc973片段和阳性对照GhCLA1PCR产物电泳结果，Marker为DL2000，lnc973敲除片段大小为500bp，GhCLA1敲除片段为465bp。

图10为双酶切鉴定单克隆VIGS载体pTRV2-lnc973和pTRV2-GhCLA1，Marker为DL2000。

图11为RT-PCR鉴定VIGS敲除的阳性植株，TRV2为对照陆地棉，UBQ7为内参基因对照，Marker为DL2000。

图12为250mmol/L NaCl处理pTRV2-lnc973阳性植株的表型鉴定，以及GhCLA1敲除后白化表型。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，lncRNA与植物的多种代谢途径密切相关，但与棉花耐盐性相关的lncRNA还未见报道。基于此，本发明的目的是提供一种棉花盐胁迫相关的长链非编码RNA，并将其用于耐盐棉花的育种。

本发明利用RNA测序(RNA-seq)术，在0mmol/L和250mmol/L NaCl处理陆地棉山农91-11中筛选出表达差异显著的长链非编码RNA lncRNA-lnc973。lncRNA-lnc973定位于陆地棉D基因组的第四号染色体，长度为3296bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，属于lincRNA。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1所示多核苷酸的变体，只要其与该核苷酸具有90％以上同源性，且具有相同的功能，则均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

通过结构分析网站GSDS分析了lnc973的结构(图1)，第一个转录本lnc973.1含有两个外显子(exon)，一个内含子(intron)和一个非编码区(UTR)。

本发明使用荧光定量PCR的方法，验证了RNA-seq结果的可靠性，在NaCl处理下陆地棉山农91-11的lnc973表达量显著提高，其lnc973序列通过PCR及测序验证了其客观存在。

本发明还克隆lnc973第一个转录本序列，将克隆片段连入克隆载体pMD19-T后测序鉴定，通过构建过表达载体，通过KpnⅠ和PstⅠ酶切过表达载体pCAMBIA1300-eGFP和克隆载体pMD19-T，胶回收线性化过表达载体pCAMBIA1300-eGFP和目的片段进行连接，构建植物过表达载体。用根癌农杆菌GV3101介导，通过蘸花法转化哥伦比亚野生型拟南芥，通过标记筛选和分子检测，获得转lnc973基因的拟南芥。通过不同浓度NaCl处理转基因lnc973拟南芥，结果证明，在盐处理条件下，转基因拟南芥比野生型拟南芥种子萌发率升高、根长增长、幼苗的鲜重增加，从而确定棉花lnc973提高了拟南芥的耐盐性。

根据lnc973的转录本序列设计引物，构建了VIGS敲除载体pTRV2-lnc973，注射到两叶期的棉花叶片，敲除lnc973中片段长度为500bp的目的片段，结果证实，敲除lnc973后的棉花中lnc973的表达量降低，耐盐性也显著下降。

综上所述，利用植物过表达载体，使棉花lncRNA-lnc973增加表达量，可以显著提高植物的耐盐性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：lncRNA-lnc973的表达量检测

1.材料与试剂

1.1材料

本试验所用棉花为陆地棉(G.hirsutum L.)，耐盐棉花品系山农91-11(未处理材料记为S_CK，250mmol/L NaCl处理材料记为S_NaCl)。

1.2试剂

RNAprep Pure Plant Kit购自北京天根生物科技有限公司；反转录试剂盒(RR047A)、qRT-PCR试剂盒(RR420A)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.实验方法

2.1 lncRNA的转录组测序

以未处理棉花和250mmol/L NaCl处理24h的棉花样本作为对象，RNA-seq委托北京安诺优达基因科技有限公司进行。按照RNA提取试剂盒使用RNAprep Pure Plant KitPolysaccharides&Polyphenolics-rich从每个棉花幼苗样品中分离总RNA，使用EpicentreRibo-Zero Gold试剂盒(Epicentre，USA)去除TRIBosomal RNA。随后，根据制造商建议，通过用于Illumina(NEB，Ipswich，USA)的NEBNext Ultra Directional RNA文库制备试剂盒以各种指标标记产生测序文库。在Illumina HiSeq 4000平台上对文库进行测序，并产生150bp配对末端读数。根据lncRNA的特点筛选出样品中具有差异表达的lncRNA，采用GO分析和KEGG分析挑选出与棉花盐胁迫过程有着密切关系的且表达量较高的lncRNA,即lncRNA-lnc973，全长3296bp，其位于D基因组第四号染色体，核苷酸序列如SEQ ID NO.1，基因结构如图1。

2.2 lncRNA-lnc973的荧光定量PCR检测

2.2.1总RNA的提取

以未处理棉花和250mmol/L NaCl处理24h的棉花样本作为对象，棉花总RNA提取参照RNAprep Pure Plant Kit试剂盒的使用说明，具体操作如下：

分别称取约100mg处理和未处理三叶期棉花幼苗叶片，在高通量组织研磨器中液氮研磨成粉末，加入500μl裂解液(使用前加入β-巯基乙醇至终浓度5％)，立即涡旋剧烈震荡混匀；12000rpm，离心2min；将上清液转移至过滤柱上(过滤柱放在收集管中)，12000rpm，离心2min，吸取收集管中的滤液至新的RNase-Free的离心管中；缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混合均匀后(此时可能会出现沉淀)转移吸附柱中，12000rpm，离心15s，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入350μl去蛋白液，12000rpm，离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中(去蛋白步骤重复2次)；向吸附柱中加入500μl漂洗液(使用前加入48ml乙醇)，12000rpm，离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中(漂洗2次)；12000rpm，离心2min，将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加40μl RNase-FreeddH₂O，室温放置2分钟，12000rpm，离心1min，得到RNA溶液。

用NanoDrop2000Spectrophotometer测定所提总RNA样品的OD260、OD280和OD230，计算RNA浓度。取1μg所提总RNA样品用1.2％琼脂糖凝胶电泳方法检测总RNA完整度。

2.2.2引物设计

根据lncRNA-lnc973的核苷酸序列，通过Primer premier 5.0软件设计qRT-PCR引物，产物长度在80-300bp之间，使用表达量稳定的GhUBQ7(ubiquitin extension protein7，GenBank:DQ116441)作为内参基因，引物设计同lnc973。引物序列如下：

2.2.3反转录反应

以提取的总RNA(1μg)为模板，首先去除基因组DNA反应，加入以下反应体系：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，加RNase Free dH₂O至10μL，室温放置5min。下一步进行反转录反应，在上述反应液中继续添加PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ和RT Primer Mix各1.0μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)和RNase Free dH₂O各4.0μL，总体积为20μL。将上述总反应液置于37℃15min，85℃5s，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-Time PCR检测。

2.2.4 Quantitative real-time(RT)PCR

使用

Premix Ex Taq^TM(TliRNaseH Plus)试剂盒在QuantStudio^TM 6plex定量PCR仪上进行实时定量PCR反应，在冰上配制qRT-PCR反应体系如下：

荧光定量PCR以两步法扩增，扩增程序为95℃30s预变性，95℃15s、60℃30s进行PCR反应44个循环，最后进行溶解曲线分析，获得Ct值。棉花GhUBQ7基因表达量为标准内参，以2^-ΔΔCt衡量每个样品中的基因表达的相对水平，ΔΔCt＝(Ct,lnc973-Ct,GhUBQ7)实验组-(Ct,lnc973-Ct,GhUBQ7)对照组。实验重复3次。

3.实验结果

未处理棉花及250mmol/L NaCl处理棉花组织中lnc973的表达情况见图2，qRT-PCR检测结果与测序结果一致，由此可以看出，lncRNA-lnc973在盐处理棉花组织中高表达，而在未处理棉花组织中低表达。实验结果表明，lncRNA-lnc973在盐处理与未处理棉花中表达水平存在显著差异，lnc973在调控棉花盐胁迫中具有重要作用。

实验例2：lncRNA-lnc973序列的克隆与分析

1.试剂与载体

反转录试剂盒PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、限制性内切酶Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ、克隆载体pMD19-T和DNA A-Tailing Kit均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；高保真酶2×

Max Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；通用DNA纯化回收试剂盒(DP214)和质粒小提试剂盒(DP103)购自天根生化科技(北京)有限公司。

2.方法

2.1总RNA的提取

实验方法同实验例1中2.2.1总RNA提取.

2.2引物设计

根据lncRNA-lnc973核苷酸的序列(SEQ ID NO.1)，通过Primer premier 5.0软件设计lncRNA-lnc973扩增引物，具体如下：

lnc973-F：AAATGGCTGTTTGGTTCG；(SEQ ID NO.6)

lnc973-R：ACCATTACAATAGTCACTCAAAAC。(SEQ ID NO.7)

2.3第一链cDNA合成反应

反转录反应分为两步，以提取的总RNA(<5μg)为模板，首先配制反应液OligodTPrimer 1.0μL、dNTP Mixture 1.0μL，添加RNA和RNase Free dH₂O后至体积为10μL，将上述反应液65℃保温5min，冰上迅速冷却。将上述反应液变性后，继续添加5×PrimeScriptBuffer 4.0μL、RNase Inhibitor 0.5μL、PrimeScriptRTase 1.0μL，加4.5μLRNase Free dH₂O至总体积为20μL，缓慢混匀后，42℃60min、70℃15min进行反转录反应得到第一链cDNA。

2.4 lncRNA-lnc973转录本PCR扩增

使用高保真酶2×

Max Master Mix试剂盒在PCR仪上进行PCR反应，反应体系如下：2×Phanta Max Master Mix 25μL，lnc973特异性上下游引物各2.0μL，模板cDNA3.0μL，无菌ddH₂O补至50μL。反应程序为预变性95℃3min；变性95℃15sec，退火54℃15sec，延伸72℃140sec，循环35次；然后72℃延伸5min。获得的PCR产物进行琼脂糖电泳检测，使用凝胶成像仪拍照，分析所得片段大小(图3)。

2.5平滑末端DNA片段的3’末端加“A”反应

将PCR扩增得到的平滑末端DNA片段使用DNA A-Tailing Kit在3’末端进行加“A”反应，在微量离心管中配制加“A”反应液，反应体系如下：10×A-Tailing Buffer 5.0μL、dNTP Mixture 4.0μL、A-Tailing Enzyme 0.5μL、平滑末端DNA片段为0.5-5μg，加RNaseFree dH₂O至总体积为50μL，混匀后，72℃反应20min即完成加“A”反应。

2.6 A Tailing DNA片段连接克隆载体与测序

进行加“A”反应后的lnc973目的片段，与克隆载体pMD19-T连接，反应体系如下：lnc973目的片段4.0μL、克隆载体pMD19-T 1.0μL和SulotionⅠ5.0μL，总体积为10μL，16℃连接30-60min。克隆载体转化大肠杆菌DH5α感受态，E.coli DH5α感受态细胞使用前在冰上融化，加入DNA样品(≤10ng)，在冰上放置30min，42℃放置45s，冰上放置1-2min，添加SOC液体培养基(预先在37℃保温)至终体积1ml，37℃振荡培养1h。取适量菌液涂布在LB固体培养基上倒置于37℃过夜培养，挑取单克隆摇培12h，提取质粒后利用KpnⅠ和PstⅠ进行双酶切鉴定(图4)，将鉴定正确的单克隆载体送去生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。

经琼脂糖电泳检测，所得片段大小为2134bp，与预期片段大小一致。将目的片段连接到克隆载体后送去测序验证扩增片段正为lncRNA-lnc973核苷酸序列，证实该lncRNA-lnc973真实存在。

2.7lncRNA-lnc973过表达载体构建及转化农杆菌

2.7.1 lncRNA-lnc973过表达载体构建

将测序正确的含有目的片段的克隆载体与过表达载体pCAMBIA1300-eGFP用KpnⅠ和PstⅠ进行双酶切，琼脂糖电泳检测后切取正确的单一条带，进行目的片段与线性化过表达载体的胶回收，胶回收步骤按照通用DNA纯化回收试剂盒(天根)说明书进行。胶回收得到的DNA溶液用SolutionⅠ进行连接，连接体系如下：lnc973目的片段3.0μL、pCAMBIA1300-eGFP(过表达载体)2.0μL、SolutionⅠ5.0μL，将混合液置于16℃下过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，取适量菌液涂布在LB固体培养基上倒置于37℃过夜培养，挑取单克隆提取质粒进行双酶切鉴定阳性单克隆。质粒提取按照质粒小提试剂盒(天根)说明书进行。酶切体系为：KpnⅠ和PstⅠ各1.0μL，10×QuickCutGreen Buffer 2.0μL，质粒浓度小于1.0μg，添加无菌ddH₂O至体积为20μL，37℃酶切5min。琼脂糖电泳检测，分析是否连接成功(图5)。

2.7.2 lncRNA-lnc973过表达载体转化农杆菌GV3101

将鉴定正确的pCAMBIA1300-lnc973-eGFP转化至农杆菌GV3101，每100μl感受态加入0.01-1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时。取100ul菌液涂布在LB固体培养基上倒置于28℃培养48h，挑取单克隆摇培24h后进行PCR扩增鉴定。

实验例3：转基因功能验证—拟南芥转化、筛选及耐盐性表型分析

1.拟南芥的种植及转化前处理

将野生型拟南芥均匀的铺洒在育苗盘中，等长到四片叶时，将其移植到营养钵中(营养土与蛭石等比例混合)，在23℃培养，16/8h光周期。待植株侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成1-2个角果时，即可用于转化，转化前需剪去已开花的花朵及长成的角果。

2.拟南芥的转化

挑取活化的含重组质粒pCAMBIA1300-lnc973-eGFP的单克隆阳性农杆菌GV3101菌株至5ml新鲜LB液体培养基(含Kan⁺和Rif⁺)中，28℃摇培24h，得菌液。取上述菌液0.1ml接至20ml新鲜LB液体培养基中，28℃180rpm培养至OD值达到1.0左右。分装于50ml离心管，室温20℃，4000rpm，离心10min，弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右，加sillvet-77，至终浓度为0.3％。将待转化的拟南芥去除花和果荚，使地上部分浸泡于悬浮菌液中，浸泡5min轻轻甩掉浸液。将植株平放，并用塑料袋罩住拟南芥地上部分，暗环境培养16-24h(过夜)后，小心去掉塑料袋，将其竖直培养，恢复正常光照，继续培养至植株成熟，获得T₀代种子。

3.转基因植株的筛选

T₀代种子用2％次氯酸钠溶液消毒后，点播在1/2MS选择培养基(含50mg/L潮霉素)上，于4℃下春化2-3天，培养10天左右挑选潮霉素抗性植株(长出真叶1-2对，根伸长在培养基中)并移植到营养钵中，培养直至种子成熟得到T₁代种子。采用同样的方法继续筛选直至获得纯合T₃代株系用于转基因拟南芥表型鉴定。

4.转基因拟南芥的PCR鉴定

提取筛选得到的T₁代转基因拟南芥基因组DNA，以其为模板，用特异性PCR引物扩增，其中引物如下：

F：AAATGGCTGTTTGGTTCG；(SEQ ID NO.8)

R：GTAAAACGACGGCCAGT。(SEQ ID NO.9)

PCR反应程序为94℃预变性4min，94℃变性30s，57℃复性20s，72℃延伸2min30s，循环35次，72℃延伸10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度为2300bp，鉴定结果如图6。

5.转基因拟南芥的表型鉴定

5.1拟南芥的种植

将野生型拟南芥种子和T₃代转基因拟南芥种子分别用70％无水乙醇消毒后，再用2％次氯酸钠溶液(2％次氯酸钠和0.05％Tween-20)消毒5-10min后，然后用无菌水漂洗5-6次，点播于1/2MS固体培养基上，在23℃培养，16/8h光周期条件下培养。

5.2耐盐性表型观察

为了确定lnc973对盐胁迫的调控作用，野生型拟南芥和T₃代转基因拟南芥(标号分别为：pUbi:lnc973-2、pUbi:lnc973-3和pUbi:lnc973-5)分别种在含有不同浓度NaCl(0/50/100/150mmol/L)的1/2MS培养基中，每个处理三个重复，每个培养皿中至少20-30棵种子，在23℃，16/8h光周期条件下培养7天后观察实验结果。统计1-7天每天种子的萌发率，并在生长7天后统计测量根长和植株鲜重(如图7)。通过表型观察统计，在0mmol/LNaCl中种子萌发率无差别，在100mmol/L NaCl中，野生型拟南芥的萌发率在第三天之后明显低于转基因拟南芥。同时统计了野生型和转基因拟南芥的根长变化，在0mmol/L NaCl下，根长无差别，在50-150mmol/L NaCl下，野生型和转基因植株的根长都变短，但野生型的根长与转基因植株的相比明显较短(图8)，对于鲜重的测量，得到相似的结果。种子萌发率、根长和鲜重的表型变化表明T3代转基因植株具有明显的耐盐性，从而说明lnc973对盐胁迫中具有调控作用，提高了植株的耐盐性。

实验例4：lncRNA-lnc973的VIGS载体构建、注射棉花叶片及表型鉴定

1.试剂与载体

限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；VIGS载体(pTRV1和pTRV2)购自长沙赢润生物科技有限公司；pEASY-Blunt Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂与菌株与实验例2相同。

2.方法

2.1 lncRNA-lnc973VIGS载体构建

根据lncRNA-lnc973转录本的序列(SEQ ID NO.1)和VIGS敲除片段长度的设计原则，其中阳性对照是白化基因GhCLA1，阴性对照是空载体pTRV2，通过Primer premier 5.0软件设计lncRNA-lnc973和GhCLA1敲除片段扩增引物，具体如下：

通过用高保真酶进行PCR扩增，配制体系同2.4，反应程序为预变性95℃3min；变性95℃15sec，退火54℃15sec，延伸72℃40sec，循环32次；然后72℃延伸5min。获得的PCR产物进行琼脂糖电泳检测，使用凝胶成像仪拍照，分析所得片段大小(图9)。然后将扩增得到的片段连接到克隆载体pEASY-Blunt，具体步骤同实验例2.

经琼脂糖电泳检测，所得片段与预期片段大小一致。将目的片段连接到克隆载体后送去测序验证扩增片段正为lncRNA-lnc973敲除序列和GhCLA1敲除序列。

将测序正确的含有目的片段的克隆载体与VIGS载体pTRV2用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，琼脂糖电泳检测后进行目的片段与线性化pTRV2载体的胶回收，胶回收步骤按照通用DNA纯化回收试剂盒(天根)说明书进行。连接及得到阳性单克隆的具体过程同实验例2中2.6.1，酶切鉴定单克隆重组质粒电泳检测如图10。

2.2 VIGS载体转化农杆菌GV3101

将得到的含有目的片段重组载体和协助载体pTRV1分别转化GV3101，转化过程同实验例2中2.6.2。

2.3农杆菌注射棉花叶片及阳性植株筛选

种植陆地棉山农91-11，待植株长到子叶完全展开，真叶还未长出时用于VIGS敲除使用。在接种前三天，将pTRV2-lnc973SL、pTRV2-GhCLA1、pTRV2、pTRV1进行摇菌培养，在LB液体培养基(含Kan⁺和Rif⁺)中加入10mM MES和20μM乙酰丁香酮，28℃180rpm过夜摇培。第二天进行4000rpm，5min离心收集菌液，用含10mM MgCl₂、10mMMES和20μM乙酰丁香酮的悬浮液悬浮至OD600至1.5。将培养物放在室温下3h，在转化之前，用针刺穿子叶的下部，子叶的每个部分都有一个或两个洞。将pTRV2-lnc973SL、pTRV2-GhCLA1、pTRV2与pTRV1进行1:1混合，用无针注射器从子叶的下部伤处渗透至整片子叶。用塑料盖住植株，在黑暗的光线下室温下渗透过夜，渗透两周后沉默表型检测。提取RNA进行反转录得到cDNA(方法同实验例1和实验例2)以cDNA为模板用RT-PCR检测对照和沉默植株RNA检测内源性基因的表达水平，以UBQ7为内参基因，验证基因沉默的有效性(如图11)。

2.4 VIGS植株表型鉴定

将上述筛选得到的阳性植株和阴性对照TRV2植株移植到含有1/8Hoagland’s营养液中进行水培处理，待植株适应水环境后进行NaCl处理。配制含有250mmol/L NaCl的1/8Hoagland’s营养液处理植株24h，观察植株表型。

NaCl处理VIGS敲除的阳性植株和TRV2植株发现两者叶片都有萎蔫和脱水，但敲除lnc973的棉花叶片出现了明显皱缩，脱水较严重，与TRV2植株相比叶片偏黄叶绿素含量降低(图12)，表明VIGS敲除lnc973植株耐盐性低于TRV2植株，这表明lncRNA-lnc973的存在提高了棉花的耐盐性，敲除后影响了对盐胁迫的调控作用，进一步说明了lncRNA-lnc973在调控棉花盐胁迫中具有重要作用与功能。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用

<130> 2018

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3297

<212> RNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）

<400> 1

gcaattagca acaaattttc aaaccattcg gttcaagtat actcagagat catcaaatca 60

gatgacacat ttcatcgcaa cagagtgctt aaagcgcgga gaagaaatgt acttggaaag 120

actgatacct cattatgcag tggattctct atgccctagc agacaaagag agagggagcc 180

tgactgaggg atggggagga gcaaaaccga tggagaggat gctgctaatt gggattttgt 240

ctttggaagc atcgagtagt cgcctcgggg tactggaacc gtcaagtaaa tgaaggtttt 300

atttttacga aaatacagat ggttgccagc taatcatgac tggtaacatt tctagaatgg 360

tctattagtt ttttactttt gcttgttggt cctgtttttc ggcctttgct ttaagaattg 420

gttttgtttt attgttttct ttgattttgg tttcattaat aaaaggtcca gtctgattta 480

tttcaaaaaa aatattagtg ctgcttatta attgggttag aattcagttt taaaattaac 540

ataaatcatt tttttataaa ttggaagatg agattacttg atgtttgaac tcaaattttc 600

atgcctcaca atatatatga aatttagaaa agtaggaaac catcataata ttcacacctt 660

caaccttatc atttcagtag aaatcatttt tatttttatg ttaaactttt tatgattttg 720

ctgtataatt atttttcatt caaattaata gtagagggcg tttggttggg gggaatgcat 780

gcgtattccc cctatgcagc gggcccacaa cgaaatggct gtttggttcg ctgtaaaagg 840

attacagccc gaatcagtta ctggcctatt accctcattg cgtgtaatag gcattacgcc 900

ccctcagcgc cgattaggta ttccgcctct tttcatattt tgtattccat tttctaccct 960

catcatcaag cttctgattc tcccacgttt ccttgcagag gtaatttctt ttcccttcca 1020

tcggttctgc catcggttct tgttcatcgt ttcttttatt ttcttcattt tatcaagaac 1080

ggaaaaccga tttccagagg tattttcact gttcccttaa aattgatttc ccttttcttt 1140

ctagaggtat tttagcagct cgcactcttc ccgatttatt ttacaggtta gttttccttt 1200

ggctcaaatc ggcaatattt gtttctgttc tcctaaactt tgggcttttc tttgactgtt 1260

tgtattgcat gttcgattga aaaaattgtt caatccttaa gctaaatagt tttatgggtt 1320

gcgtgttatg ttctgcttac atctcttaag ctgtgatgaa atccatttta tggattgctt 1380

gtctgtgata aagtaaagtt ttatgggttg cttgttatgt tttgctcctg attgttgtta 1440

cgtaatggca taatcagtgg ttctgtttca aatttagcgt gattaaggat gctcaggtta 1500

ttttgtgtta actttgttgc aactatactg attacagttg aagcatttga agcattgaag 1560

catttgaaat ggcataatca gtggttattt tgtgttaact ttgttgcaac tatcctaaat 1620

acatctattg aagcatttaa aatgccctga atttaggcga taaagtgaaa tttataaacg 1680

tgattctgaa gtataagtgg aatgcatttt gtgattggga ttagttttta gttatttaac 1740

tgcataccaa tatatttaaa aagccatgaa aggagatcat atttacactt actaacagag 1800

tagagaggag tgagatcaaa ccaggagatc atatttacac ttacagagct gttttcacct 1860

actcccataa tggtagcccc tctttccttt ccattccccc tttttccgaa ttatgcttcc 1920

cttcttcttc tttttttctt gtttattaca gagaattgaa gaaaaaaaac ttgaaatatt 1980

tttgcattgt gattgtgctc ttatctcgtt ttctgggttt gccttgtttt ttatatgtat 2040

tttgttccac cgttttgttt gtttgattgc ccccgattta cttttgatgt actggttagt 2100

agataaactg ctacaagttc tagtgtccaa aagtaatcaa catttagtca aacatggaat 2160

tatacagtct ccaaggatta aagaggctgt tcttcacaga atatcactac ttgcatcttg 2220

gttgaattgc ctgtaatttg gctcctttcc atccgattta tctatgcatt ccttgctaaa 2280

cgtaaaatgg tagtcaattt cctttgtagt tggcatagtt gaagtacttt ttgccatata 2340

tgacattgag ctgatatggc ttatagtata ccatttaagg aataagaaag atcaatgtat 2400

gtccctggtg gaataaaaat tttaagttac cttattttaa gaaaaaaact gttgtaaggc 2460

tacctttgct tctacctgtg taacgattgt cgtagaggtt catgtgtaag gagtttcgta 2520

gatgtttccg aatggcttgt gatttcaata tatagatgag ttgatgtttc cgaatattat 2580

ctactctttg cctctgcgct cactctgcta tatttgattt tccgtttttt atcctattgc 2640

ttgttactct ctttgatcta attttttaaa tggtatctgt ttacagacat agtggaatgc 2700

tatcatgtat gacatttctt ttactattat taacatttct tttatactat tttatactat 2760

tttcttttat gctatcgtga aatttgttaa catttctttt atactatttt cttttaaatg 2820

agttccttga gctaatttga taagcatgaa agtcatactg ttttttgata gtgtgctgtt 2880

ttttaaggat aattgaatta tatttaacaa gttaggatac tgttttaatc gagattatgt 2940

gatattgcta tacatctaca ttagtaaaca gtagtaaact gtttgataag catgaaagtg 3000

aaattgttag cagatgatta attgggattg atcaatttta aaagctgatt tctaccgaga 3060

aaatgcgcaa caactatttt gagtagcttg tttgtttcat ttcttgttcg attatttgtt 3120

tagatggttg taatagttag caaatcagtt ttgagtgact attgtaatgg ttagtgcaaa 3180

acaatatatt tttattattt tttattttaa ctattatttt tcaattatta ttcaagattt 3240

aatttaatta ttatggatca gttttatgca tttgtttttc aatttactaa ataatgc 3297

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggagtgaga tcaaaccagg ag 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaacaaggca aacccagaaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaggtcgag tcttcggaca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcttgatctt cttgggcttg 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaatggctgt ttggttcg 18

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

accattacaa tagtcactca aaac 24

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaatggctgt ttggttcg 18

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcaatgtatg tccctggtgg 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaacagcaca ctatcaaaaa acag 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tattttgctg aggctttgat tg 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcttgggtaa cggaaacagc 20

Claims (6)

1.一种棉花长链非编码RNA，其为lncRNA-lnc973，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.含有权利要求1所述棉花长链非编码RNA的植物表达载体。

3.含有权利要求2所述植物表达载体的重组菌。

4.权利要求1所述的棉花长链非编码RNA、权利要求2所述的植物表达载体或权利要求3所述的重组菌在提高植物耐盐性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

6.一种提高植物耐盐性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建含有SEQ ID NO.1所示的棉花长链非编码RNA的植物过表达载体；

（2）将步骤（1）的植物过表达载体转化至植株中，使棉花长链非编码RNA的表达量增加，进而提高了植物的耐盐性。

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