CN112662688B - 核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1在油脂合成与积累中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学以及植物基因工程技术研究领域，具体涉及一种核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1及其在油脂合成与积累中的应用。该核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过将核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，经筛选培养获得T3代植株，结果发现，与野生型拟南芥的种子相比，超表达核桃JrSnRK1基因的拟南芥拟南芥的种子瘪小、表皮皱缩，油脂含量显著降低。可见，核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1参与调控油脂的合成与积累，这将为为核桃品质改良和新品种的选育提供参考。

Description

核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1在油脂合成与积累中的 应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及植物基因工程技术研究领域，具体涉及一种核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1及其在油脂合成与积累中的应用。

背景技术

核桃（Juglans regia L.）是重要的“木本粮油”生态树种，在保障我国粮油安全和退耕还林方面扮演重要角色。核桃种仁的含油量高达63%以上，其中不饱和脂肪酸含量高达90%，含有较多的生物活性成分，在预防糖尿病、防治动脉粥样硬化和提高记忆力等方面具有重要作用。核桃种仁含油率的高低直接影响坚果的品质和果农的经济收益。

核桃种子发育过程中油脂合成的原料物质主要来源于光合作用产生的可溶性糖。SnRK1(Sucrose non-fermentation1-Related Kinase1)蛋白激酶是植物体内碳氮代谢和能量平衡的重要调节枢纽，在碳代谢分配中起着关键的作用。前期研究表明桃SnRK1蛋白激酶能够显著提高植株的光合速率、可溶性糖含量、淀粉含量及其利用率。可见，桃SnRK1蛋白激酶参与光合碳代谢过程。为进一步探讨果树SnRK1蛋白激酶是否在油脂合成与积累过程中的作用，发明人利用基因工程技术，从“香玲”核桃种仁中克隆获得SnRK1蛋白激酶α亚基编码基因JrSnRK1全长，构建了克隆载体和植物表达载体，并成功转化了拟南芥，获得了超表达核桃JrSnRK1转基因拟南芥植株。研究发现，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的种子瘪小、表皮皱缩，油脂含量显著降低。这将为进一步研究JrSnRK1基因在核桃果实油脂合成与积累中调控机理奠定了基础，也为利用分子手段进行核桃品质改良及新品种的选育提供理论依据，同时极具应用前景。

发明内容

针对现有技术中存在的研究空白，本发明提供了一种核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1。

本发明还提供了一种核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1在油脂合成与积累中的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种上述核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1在植物油脂合成与积累中的应用。

具体方法为：将包含所述核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得超表达核桃JrSnRK1转基因植株。

含有所述的核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1的载体。

含有核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1的宿主细胞。

本发明以“香玲”核桃种仁cDNA为模板克隆并分离得到SnRK1蛋白激酶α亚基的一个编码基因JrSnRK1，其DNA序列全长为1539 bp，编码512个氨基酸，该基因编码蛋白属于植物SnRK1蛋白激酶家族。构建了植物超表达重组载体PBI121-JrSnRK1，转化并获得了超表达核桃JrSnRK1拟南芥植株，对转基因拟南芥的种子进行观察，结果发现，相比于野生型，转基因拟南芥株系的种子瘪小、表皮皱缩。进一步对种子进行了油脂含量测定，结果表明，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥株系种子的油脂含量显著下降。可见，核桃JrSnRK1基因参与调控拟南芥种子油脂的合成与积累过程，这为进一步研究JrSnRK1在核桃果实油脂合成与积累过程中的功能奠定基础，也为利用分子手段加快核桃新品种的选育提供参考。

本发明的有益效果为：本发明通过将核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，经筛选培养获得T3代植株，结果发现，与野生型拟南芥的种子相比，超表达核桃JrSnRK1基因的拟南芥拟南芥的种子瘪小、表皮皱缩，油脂含量显著降低。可见，核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1参与调控油脂的合成与积累，这将为为核桃品质改良和新品种的选育提供参考。

附图说明

图1是核桃JrSnRK1基因在“香玲”核桃种仁生长阶段中的表达情况。

图2 核桃JrSnRK1基因PCR扩增凝胶图谱。A. JrSnRK1基因全长PCR扩增凝胶图谱(M：DL2000 Marker)；B. pBI121- JrSnRK1重组质粒菌液PCR扩增凝胶图谱(M：DL2000Marker)。

图3 是野生型拟南芥（WT）和转基因拟南芥基因株系(J-1、J-2和J-3)幼苗表型。

图4是T3代阳性转基因拟南芥植株鉴定结果。A. 3个株系的JrSnRK1全长PCR扩增凝胶图谱(M：DL2000 Marker；WT：阴性对照；水：空白对照；J-1、J-2和J-3：转基因株系)；B.3个株系的JrSnRK1荧光定量分析结果(WT：野生型拟南芥； J-1、J-2和J-3：转基因株系)。

图5是野生型拟南芥(WT)和转基因拟南芥基因株系(J-1、J-2和J-3)种子表型。

图6是野生型拟南芥(WT)和转基因拟南芥基因株系(J-1、J-2和J-3)种子的油脂含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 JrSnRK1基因在核桃种仁发育过程中的表达水平检测

本实施例所采用的材料是“香玲”核桃油脂快速合成与积累期的种仁，采后速冻于液氮中，超低温冰箱(-80℃)保存。

1）核桃种仁Total RNA的提取

按照TaKaRa植物总RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：将超低温冻存的“香玲”核桃种仁迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至分别研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品分别加入到含有450 μl Buffer PE 的1.5 mL灭菌 tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000 rpm，4℃离心5分钟；将上清液小心吸取到新的1.5 mL灭菌tube 中。加入上清液 1/10体积的Buffer NB，Vortex 振荡混匀，12,000 rpm，4℃离心5 钟；将上清液小心吸取到新的1.5 mL灭菌 tube中，加入450μL的 Buffer RL，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1.5倍体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到RNA Spin Column中； 12,000rpm，离心1分钟，弃滤液，将RNA Spin Column 放回到2 ml Collection Tube 中；将600μL的80%乙醇加入至RNA Spin Column 中，12,000 rpm 离心30秒钟，弃滤液；向RNA SpinColumn膜中央加入50μL DNase I 反应液，室温静置15分钟；向RNA Spin Column膜中央加入350μL的Buffer RWB，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液；将600μL的80%乙醇加入至RNASpin Column 中，12,000 rpm 离心30秒钟，弃滤液；将 RNA Spin Column 重新安置于2mLCollection Tube 上，12,000 rpm 离心2分钟；将 RNA Spin Column 安置于1.5 mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央处加入30μL的 RNase FreedH₂O室温静置5分钟，12,000 rpm 离心2分钟洗脱RNA。所得RNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。

吸取2μL RNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S和18S条带较为清晰，28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测RNA纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀均在1.8~2.1之间，完整性较好，可用于反转录。

2）反转录cDNA第一链的合成

RNA进行反录前进行电泳检测是否降解，并用RNA/DNA calculator 测算 RNA 浓度，根据RNA反转录试剂盒对RNA的要求进行。反转录cDNA第一链采用宝生物反转率试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit(Perfect Real Time)，具体操作参照试剂盒说明书进行。

3）荧光定量分析

根据核桃JrSnRK1测序结果，运用NCBI中BLAST设计核桃JrSnRK1基因的荧光定量引物，以18S作为内参基因，将反转录cDNA稀释10倍，取1μL作模板，所用荧光定量引物如下：

JrSnRK1-F：5’-CTTTGGGGATGAACCGACCA-3’，如SEQ ID NO.2所示；

JrSnRK1-R：5’-GCCAGGAAAGCAGCACAAAG-3’ ，如SEQ ID NO.3所示；

18S-F：5’-ACAGGACCTCTCACGATCCA-3’ ，如SEQ ID NO.4所示；

18S-R：5’-CAGCAAATCCAGCACGCATT-3’ ，如SEQ ID NO.5所示；

利用ChamQ™ Universal SYBR Qpcr Master Mix试剂盒(Vazyme公司)的说明书进行反应溶液的配制，在Applied Biosystems型实时荧光定量分析仪上运行PCR程序：95℃5min；95℃ 10s，60℃ 30s，循环40次；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。待反应结束，获得扩增曲线，通过StepOne Software v2.3导出数据，利用Excel进行数据分析，根据CT值用2^-ΔΔCq相对定量法计算相对表达量，数据分析结果如图1所示。

本实施例根据对荧光定量结果的分析，测定了核桃JrSnRK1基因在花后60~130天之间的表达水平。从图1可以看出核桃JrSnRK1基因在花后60最高，随后下降，至花后90天时相对表达量最低，在花后90~120天之间呈上升趋势，在核桃成熟期(花后120~130天)又呈下降趋势。

实施例2 基因的克隆与转化

本实施例所用的植物材料为“香玲”核桃种仁，拟南芥(Arabidopsis thaliana)为“哥伦比亚（Columbia）”野生型，北京华越洋生物公司，产品货号NRR00220。试验中所用植物表达载体为pBI121，购自Takala公司; 所用的大肠杆菌菌株为Trans5α，农杆菌菌株为LBA4404，购自Tiangen公司，用于转化拟南芥。

1）目的基因引物的设计及克隆

根据GeneBANK中公布的核桃JrSnRK1(>XM_018958439.1:349-1887 PREDICTED:Juglans regia SNF1-related protein kinase catalytic subunit alpha KIN10-like(LOC108985954), transcript variant X2, mRNA)基因的CDS序列(见SEQ NO.1)，利用Prime5.0设计扩增引物，并在两端加入酶切位点（KpnI、EcoRI）及pBI121上两酶切位点所在的同源臂，其引物序列为：

JrSnRK1- KpnI -F：5'- GGGGTACCATGGATGGCTCAACTG -3'（下划线部分为KpnI酶切位点），如SEQ ID NO.6所示；

JrSnRK1- EcoRI -R：5'- CGGAATTCAAGGACTCGGAGCTGG-3'（下划线部分为EcoRI酶切位点），如SEQ ID NO.7所示；。

以cDNA为模板，利用PrimerStar Max高保真酶进行核桃JrSnRK1基因的克隆。PCR扩增体系(50μL)为：25μlL PrimerStar Max，2μL Forward Primer，2μL Reverse Primer，2μL Template DNA，19μL ddH₂O。PCR程序为：反应条件为94℃预变性3min，98℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环，72℃总延伸5min，4℃保温。

PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测（PCR扩增结果如图2A）并切割目的片段，凝胶回收纯化PCR目的扩增产物。采用TransGen公司的DNA凝胶回收试剂盒，进行目的片段纯化回收，具体操作为：将单一目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量；向胶块中加入3倍体积溶液GSB（如果凝胶为0.1g，其体积可视为100μL，则加入300μL GSB溶液），55℃水浴放置，其间不断温和上下翻转离心管，直至胶块完全溶解；将融化的凝胶溶液降至室温，加入1倍体积异丙醇（如果凝胶为0.1g，则加入100μL 异丙醇），轻柔混匀；将混合液加入离心柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min，弃流出液，后将离心柱放回收集管中；向离心柱内加入650μL溶液WB，12000rpm离心1min，弃流出液；12000rpm离心2min，尽量除尽残留的WB，将吸附柱置于室温开盖放置5min，彻底晾干；将离心柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL ddH₂O（ddH₂O需提前置于60~70℃水浴预热），室温静置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。取2μL回收纯化后的产物，使用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测，其余放置在-20℃冰箱，后续将用于与pBI121载体连接，构建过表达载体。

3）质粒的提取：

按照天根质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒，具体步骤如下：

取过夜培养的10mL菌液，12000 rpm离心1min，去掉上清液；取500μL P1溶液（含RNase A）加至留有菌体沉淀的离心管中，使用涡旋仪彻底悬浮菌体沉淀；取500μL P2溶液加至离心管中，温和上下翻转时菌体裂解充分，取700μL P3溶液加至离心管中，立即温和上下翻转，充分混匀，当出现白色絮状沉淀后，12000rpm离心10min；取500μL平衡液BL加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，将收集的上清液分批加入过滤柱CS中，12000rpm离心2min，小心将收集管中收集的溶液分批加入吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管；取500μL去蛋白液PD加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱CP4重新放回收集管；取600μl 漂洗液PW（含无水乙醇）加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液；将吸附柱CP4移至新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间加入60μL ddH₂O；室温静置2min，12000rpm离心1min，离心管中收集的溶液即为质粒。最后测定质粒浓度，为下一步实验做准备。

4）双酶切反应

将提取的pBI121质粒用KpnI和EcoRI在37℃条件下酶切30min，电泳回收线性载体，-20℃保存备用。双酶切反应体系为50μL：pBI121质粒 20μL，5×buffer 5μL，KpnI 1μL，EcoRI 1μL，ddH₂O 23μL。

5）重组反应

琼脂糖凝胶电泳检测酶切后所回收到的目的基因和载体pBI121，根据所检测出的纯度和浓度，按连接体系加入各试剂。连接反应体系为：线性化pBI121载体7μL，插入片段3μL，5×CE II buffer 4μl，Exnase II 2μl，ddH₂O Up to 20μL。在37℃下反应30min，常温放置（勿立即置于冷却），10min后转化至大肠杆菌感受态Trans5α。

6）连接产物转入大肠杆菌

从超低温冰箱中取出感受态细胞Trans5α菌株，置于冰上融化。吸取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中；将离心管置于冰上冰浴10 min；42℃水浴锅中水浴，热激90 s，期间不要摇动；后立即置于冰上冰浴2 min；在超净台中加入500μL无抗生素的液体培养基，37℃、200 rpm摇25min复苏；6000 rpm 离心1 min，吸去350μL上清；将沉淀的菌体重悬，涂布于LB平板（Kana的浓度为50 mg/L），37℃培养过夜。

7）重组子的鉴定

挑取平板上的单菌落接种到含有抗生素（Kana）的LB液体培养基中，37℃、200 rpm震荡培养过夜。使用目的基因全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，菌检结果如图3B所示。筛选后的阳性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果正确的阳性克隆，扩大培养后，使用天根质粒提取试剂盒提取质粒以备转化农杆菌感受态。

8）根癌农杆菌LBA4404感受态的制备与转化

感受态制备操作步骤：挑取单菌落接种于10mL含有抗生素利福平的YEP液体培养基中，28℃，180~250rpm的摇床上震荡培养过夜。取2mL菌液转入50mL含有抗生素利福平的YEP液体培养基中，继续培养至OD值为0.3~0.4。将菌液转入无菌离心管中，冰浴30min。5000rpm，离心10min，去上清。加入2mL预冷的含有15%甘油的0.1mol·L^-1的CaCl2溶液，轻轻悬浮。将农杆菌悬浮液分装到1.5mL无菌离心管管中，每管200μL，用液氮迅速冷冻并保存于-80℃冰箱备用。

感受态转化具体步骤：取10μL质粒DNA，加入到200μL冰上解冻的农杆菌感受态中，冰浴5min，液氮中迅速冷冻5min，37℃水浴5min。加入800μL YEP液体培养基，28℃，100rpm，摇2~4小时。5000rpm离心机离心，倒去大部分上清，留50μL左右，重悬菌体。将菌液涂布于含有含有抗生素利福平及卡那霉素的YEP固体培养基上，28℃，倒置培养48~72h，至平板上长出单菌落。挑取单菌落，提取质粒，进行目的基因的PCR鉴定(PCR扩增结果如图2B)。鉴定后的阳性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司测序，选取测序结果正确的阳性菌落进行摇菌，加入适量无菌50%甘油，于-80℃保存备用。

9）农杆菌介导的拟南芥的转化

待野生型拟南芥开花时将拟南芥主花序的顶端剪掉，以诱导更多侧花序的生成，且侧花序同时开花，便于转化。转化前浇透营养液，转化后控制浇水。

农杆菌的准备应在转化前两天进行，将农杆菌加到10 ml含有利福平和卡那霉素的YEP培养基中，28℃摇床振荡培养，过夜，活化农杆菌。取1 ml的菌液加到20ml的YEP培养基中过夜培养，至菌液呈金黄色时收集菌体，5 000-6 000 rpm离心10min，弃上清液。用含有3%蔗糖的浸染液悬浮菌体，在悬浮菌液中加入0.05%的Silwet L-77表面活性剂，将拟南芥的花序浸到菌液中8~10分钟，然后用滤纸吸干多于的菌液。侵染过的拟南芥黑暗培养一天。第二天取出放到光下继续生长。根据浸染过的植株的长势，隔5-7天再浸一次。浸染4~5次后的拟南芥植株正常生长，收种子。

10）转基因植株的筛选

收集的T1代转基因拟南芥的种子，用酒精和次氯酸钠进行灭菌，步骤为：取适量获得的转基因种子放置于1.5mL离心管中，用0.8 %NaClO与乙醇混合液（现配，比例为体积比1:1）浸泡5min；75%酒精灭菌5~6次，每次2 min；无菌水冲洗9~10次；用0.1%琼脂糖溶液悬浮。

将灭菌后的转基因拟南芥种子播种于含有抗生素（卡那霉素50 mg/L）的MS固体培养基上，锡纸包裹放入4℃冰箱中春化。2天后从冰箱中取出，将培养基置于22℃，光照培养。大约一周后将培养基上可以正常生长的拟南芥移植与土中，继续生长。待植株长至一定程度，则取其叶片进行DNA检测以获得阳性植株。

本实施例克隆得到1个核桃SnRK1蛋白激酶α亚基编码基因，命名为JrSnRK1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，JrSnRK1基因核苷酸序列长度为1539b。随后，将已连有核桃JrSnRK1基因的35S: JrSnRK1过表达重组载体转入模式植物拟南芥中，并获得了T1代阳性植株。

实施例3 核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1调控油脂积累的功能鉴定

1）转基因纯合植株的获得：收获的转基因T1代种子经灭菌，筛选培养后，再移植于营养土中，22℃，16 h光照/8h黑暗培养；经检测后保留初步确认的转基因植株，待成熟后收获T1代种子，进行编号，得到T2代；同T1代一样，将T2代种子经灭菌后涂布于含抗生素的筛选培养基上，置于22℃，连续光照；10天左右，对不同编号的T2代种子进行存活率统计，选取存活比例为75%的植株移植与营养土中按照22℃，16 h光照/8h黑暗培养，并取叶片进行阳性检测；阳性T2代植株继续进行编号，收集种子，得到T3代种子；将种子灭菌后，用筛选培养基筛选，置于光下连续光照培养；10天左右，观察不同编号的T3代植株，全部存活并且没有出现分离的为T3代纯合植株，转基因植株如图3所示。

2）转基因植株的DNA检测

取适量T3代拟南芥和转基因植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA，具体操作步骤为：将适量叶片置于灭菌处理后的2mL离心管中，加入700 µl的CTAB溶液，用球磨仪彻底研磨，65℃静置10 min；加入等体积的氯仿：异戊醇，数次颠倒使其混合均匀，14000 rpm离心10 min；将上清移至新的无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀数次，室温静置2min，14000 rpm离心10 min，倒掉上清；加入70%的无水乙醇，使用移液枪吹打洗涤两次，14000 rpm离心1min，弃去上清；吹干表面液体，加入20 µL ddH₂O溶解。取上述提取的转基因和野生型拟南芥的DNA，用JrSnRK1基因的特异性引物进行PCR检测。

核桃JrSnRK1基因转化拟南芥至T3代，共获得3个过表达JrSnRK1基因拟南芥株系。以野生型为阴性对照，以水为空白对照，PCR结果如图4A所示。

3）转基因植株的荧光定量PCR检测

从上述3个过表达核桃JrSnRK1基因拟南芥株系的幼嫩茎生叶中提取总SmallRNA，反转录及荧光定量引物、方法及程序同实施例1。以18S作为内参基因，核桃JrSnRK1基因荧光定量引物同实施例1中3）。反应结束后，数据分析方式同实施例1，根据CT值用2^-ΔΔCq相对定量法计算相对表达量，最终数据分析结果如图4B所示。

4）T3代超表达核桃JrSnRK1转基因拟南芥种子表型观察及油脂含量检测

对转基因植株的种子在显微镜下进行表型观察，结果如图5所示，相比于野生型，转基因拟南芥株系的种子种子瘪小、表皮皱缩（图5）。进一步对种子进行油脂含量测定，结果表明，与野生型拟南芥WT相比，转基因拟南芥株系J-1、J-2、J-3的种子油脂含量显著下降(图6 )。

<110>山东省果树研究所

<120>核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1及其在油脂合成与积累中的应用

<160>7

<210>1

<211>1539

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

ATGGATGGCT CAACTGGGCT AGGTGGCAAT GGTCTGGATG TGTTTCTCCA AAATTATAAG 60

CTTGGAAAAA CCCTTGGAAT TGGTTCCTTT GGCAAGGTGA AAATTGCTGA GCATATCTTA 120

ACTGGTCATA AAGTTGCTGT AAAGATCCTT AACCGTCGGA AGATTAAGAA CATGGAAATG 180

GAGGAAAAAG TGAGAAGAGA AATCAAAATA TTGAGATTGT TTATGCATCC TCATATAATA 240

AGACTCTATG AGGTTGTAGA CACGCCAGCA GACATTTATG TTGTGATGGA GTACGTGAAG 300

TCTGGAGAGC TCTTCGATTA CATCGTGGAG AAGGGAAGGT TGCAGGAGGA TGAAGCTCGT 360

AATTTTTTTC AGCAGATAAT CTCTGGTGTG GAGTATTGCC ATAGGAATAT GGTGGTTCAT 420

AGAGACCTGA AGCCTGAGAA TTTGCTTTTA GATTCCAAAT GCAATGTGAA GATTGCTGAT 480

TTTGGTTTAA GCAACATAAT GCGTGATGGT CATTTTCTGA AGACAAGTTG TGGAAGTCCA 540

AACTACGCAG CCCCAGAGGT TATCTCTGGA AAATTGTATG CTGGGCCTGA AGTGGACGTA 600

TGGAGCTGTG GTGTTATATT GTATGCCCTT CTTTGTGGCA CCCTTCCTTT TGATGACGAA 660

AACATTCCCA ACCTATTTAA AAAGATAAAG GGTGGAATAT ACACTCTTCC CAGTCATTTA 720

TCATCTGGTG CAAGAGACTT GATCCCAAGG ATGCTTGTAG TTGACCCAAT GAAGCGAATG 780

ACCATTCCTG AGATTCGCCA GCACCAATGG TTTCAGTCTC ATCTTCCACG TTATTTAGCT 840

GTGCCCCCAC CAGATACAAT GCAACAAGCA AAAAATATTG ACGAGGAGAT TCTACAGGAA 900

GTTGTTAAAA GGGGATTTGA CAGGAACCAG CTGGTTGAAT CTCTTCGCAA CCGAATGCAG 960

AATAAGGCTA CTGTTGCTTA CTATTTGTTA TTGGACAACC GGTTCCGCCC TTCCAGTGGC 1020

TATCTTGGAG CTGAGTTCCA AGAGACTATG GATCTTGGTT TCAATCGTAT GCATCAAAAT 1080

GAGGTCTCTG CTTCAGCTGT TGGGCACCGC CTTCCAGGAT ATATGGAGTA TCAAGGGATG 1140

GGCGTGAGAC CACAGTACCC TGTTGAGAGG AAATGGGCTC TTGGACTTCA GTCCCGAGCT 1200

CATCCTCGTG AAATAATGAC GGAAGTCCTC AAAGCTCTGC AAGAATTGCA TGTATGTTGG 1260

AAGAAGATTG GACACTACAA CATGAAGTGC CGTTGGATTC CTAGTCATCT TGAAGGCATG 1320

CTGAACAATC CTGTGCACAA TAATCACTAC TTTGGGGATG AACCGACCAT TGTTGAGAAT 1380

GATGGTGTTA CCAACTCGCC CAATGTTGTT AAGTTCGAAG TGCAGCTCTA CAAAACTCGG 1440

GAGGAGAAGT ATCTGCTTGA TCTCCAAAGG GTCCATGGCC CACAGATTCT CTTCTTGGAT 1500

CTTTGTGCTG CTTTCCTGGC CCAGCTCCGA GTCCTTTAA 1539

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

CTTTG GGGAT GAACC GACCA 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>3

GCCAG GAAAG CAGCA CAAAG 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>4

ACAGG ACCTC TCACG ATCCA 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>5

CAGCA AATCC AGCAC GCATT 20

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>6

GGGGT ACCAT GGATG GCTCA ACTG 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>7

CGGAA TTCAA GGACT CGGAG CTGG 24

Claims (1)

1.一种核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1在拟南芥油脂合成与积累中的应用，其特征在于，所述核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

将包含所述核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得超表达核桃JrSnRK1转基因植株；

所述载体的构建过程中，所使用的引物序列为：

JrSnRK1- KpnI -F：5'- GGGGTACCATGGATGGCTCAACTG -3'，下划线部分为KpnI酶切位点，如SEQ ID NO.6所示；

JrSnRK1- EcoRI -R：5'- CGGAATTCAAGGACTCGGAGCTGG-3'，下划线部分为EcoRI酶切位点，如SEQ ID NO.7所示。

Images