CN115011607B

CN115011607B - 芝麻育性调控基因及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN115011607B
Application number: CN202110192812.0A
Authority: CN
Inventors: 林勇翔; 汪强; 赵莉; 张祎; 张银萍
Original assignee: Institute Of Crops Anhui Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Crops Anhui Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-02-20
Filing date: 2021-02-20
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2041-02-20
Also published as: CN115011607A

Abstract

本发明公开了芝麻育性调控基因及其表达载体和应用。本发明从芝麻隐性核不育保持系WB7‑1D中克隆得到育性调控基因(ZMwb58基因)，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示，该ZMwb58基因对植物育性具有调控作用，其过量表达，可使花粉活力降低，育性下降，种子数量减少。本发明进一步利用所述的育性调控基因提供了一种调控植物育性的方法。本发明为进一步解析保持系WB7‑1D的育性调控机制奠定了基础，为芝麻三系配套杂交育种的应用提供理论指导。

Description

芝麻育性调控基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及植物育性调控基因，尤其涉及从芝麻隐性核不育保持系WB7-1D中分离的育性调控基因及其应用，属于芝麻育性调控基因的分离及其应用领域。

背景技术

芝麻杂种优势利用是提高产量的有效途径之一，作物杂交育种中广泛采用的是细胞核雄性不育系统，芝麻细胞核雄性不育系统多为两用系，如芝麻两用系杂交种豫芝9号、皖杂芝1号等，但芝麻两用系群体中包括50％的可育株和50％的不育株，因此在杂交种生产中必须将一半的可育株在初花期去除，利用两用系制种费时费工，制种产量低，这就增加了杂交种生产的成本并且限制了它们的使用。以芝麻隐性核不育保持系WB7-1D和两用系(0176AB系)中不育株杂交而获得全不育系(W71A)，用全不育系W71A为母本，与恢复系(R系)为父本杂交，生产大田用杂交种子F₁实现了制种三系配套，选育出强优三系杂交品种皖芝11号和皖芝12号等，《芝麻隐性核不育三系配套杂交制种方法》获得了国家发明专利授权(授权公告号CN 104285782 B)，从而有效解决了两用系法制种成本高、效率低的问题，具有广阔应用前景。

芝麻隐性核不育保持系WB7-1D开放花的部分，花药表现为可育花药特征，即花药较大、白色、用手轻捏有花粉，部分花药表现为不育花药特征，即较小、白色或淡绿色、用手轻捏无花粉，花粉碘-碘化钾花粉染色镜检显示有部分颜色较淡且较小而不规则的不育花粉，同时也有颜色较深且大而圆的可育花粉。汪强等(2016)利用WB7-1D为母本，分别以中芝11号和皖芝5号为父本配制杂交组合，通过对F₂代群体和回交群体的育性调查表明，WB7-1D的基因型可以描述为msms+rf₁rf₁rf₂rf₂…rf_irf_i，WB7-1D的育性除了受到细胞核内一对隐性不育基因(msms)控制外，还受到一组修饰基因(rfirfi)的调控。

目前，保持系WB7-1D育性相关的分子调控机制尚不清晰，这些限制了对芝麻三系杂交制种技术充分利用，发掘克隆保持系WB7-1D育性调控基因，将在理论上阐明芝麻保持系WB7-1D育性调控基因的分子机制提供科学依据，应用上将为进一步完善芝麻隐性核雄性不育三系配套杂交技术体系，培育优异的杂交芝麻新品种和开辟芝麻杂种优势新途径提供理论指导。

发明内容

本发明目的之一是提供一种从芝麻隐性核不育保持系WB7-1D中分离得到的育性调控基因。

本发明目的之二是提供含有上述育性调控基因的表达载体。

本发明目的之三是将所述的育性调控基因应用于调控植物的育性或培育芝麻新品种。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种从芝麻隐性核不育保持系WB7-1D中分离的育性调控基因，其cDNA序列为(a)、(b)或(c)所示：

(a)SEQ ID No.1所示的核苷酸；

(b)编码SEQ ID No.2所示氨基酸的核苷酸；

(c)与SEQ ID NO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸，该核苷酸所编码蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

优选的，本发明所述的从芝麻隐性核不育保持系WB7-1D中分离的育性调控基因的cDNA序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸。

本发明目的之二是提供由上述芝麻隐性核不育保持系WB7-1D中分离的育性调控基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：

(a)SEQ ID No.2所示的氨基酸；

(b)将SEQ ID No.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有调控植物育性的功能或活性的蛋白变体。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

本发明还提供了含有所述育性调控基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将所述育性调控基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该育性调控基因的重组植物表达载体。“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，SEQ ID No.1所示的核苷酸和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达。例如。可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达。

该重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明进一步提供了一种应用所述育性调控基因使植物育性下降的方法，包括：构建含有所述育性调控基因的重组植物表达载体；将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中，将所述育性调控基因在植物中进行过表达，使植物的育性下降，其中，所述的育性下降包括花粉活力降低，种子数量减少等。

本发明还进一步提供了一种应用所述育性调控基因使芝麻育性提高的方法，包括：沉默或抑制芝麻中该育性调控基因的表达从而提高芝麻育性，所述的提高芝麻育性包括提高花粉活力，增加种子数量等。

本领域技术人员可以通过常规的沉默基因的方法将芝麻中该育性调控基因进行沉默或抑制其表达，包括：将所述的育性调控基因的靶基因片段与pTRV2载体可操作性的连接后得到干扰载体，将该干扰载体转化到农杆菌中，再通过农杆菌介导法转化到芝麻组织或细胞中，能够有效沉默芝麻中该育性调控基因的表达；或者通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对该育性调控基因进行敲除突变，构建得到该育性调控基因的基因编辑载体，将该基因编辑载体转化到芝麻中，将该育性调控基因进行突变或敲除得到育性提高的转基因芝麻。

所述的“转化”指将基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

转化方案以及将所述多核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的基因转化到植物体中。在其它实施方案中，本发明的基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。

利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick etal.PlantCell Reports.1986.5:81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是芝麻、玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生、甘蔗或棉花等，优选为芝麻。

芝麻隐性核不育保持系WB7-1D是芝麻隐性核不育三系配套杂交制种体系中的关键亲本，其育性表现为降低，保持系WB7-1D与隐性纯合两用系AB内不育株杂交，可使其不育性实现全不育保持，其后代为完全不育系WA，利用两用系、保持系、恢复系三系配套选育出芝麻高产新品种皖芝11号和皖芝12号等，但对芝麻隐性核不育保持系WB7-1D的育性调控机制尚不明细。在本发明人的前期研究中，已结合基因组重测序和分离群体分组分析法(Bulked segregant analysis，BSA)将芝麻隐性核不育保持系WB7-1D的育性相关基因定位在芝麻基因组1号连锁群360kb的区域，对定位区域内的基因表达量进行定量比较分析，结果发现相比对照可育的常规栽培品种，ZMwb58基因在育性降低的保持系WB7-1D花蕾中表达量显著升高，表明此基因与保持系WB7-1D育性调控相关。为了进一步研究芝麻隐性核不育保持系WB7-1D的育性调控机制，本发明从保持系WB7-1D中克隆出育性调控ZMwb58基因，该ZMwb58基因对育性具有调控作用，其过量表达，可使花粉活力降低，育性下降，种子数量减少，这为进一步解析保持系WB7-1D的育性调控机制奠定了基础，为芝麻三系配套杂交育种的应用提供理论指导。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％ SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％ SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％ SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“启动子”指下述的任何核酸序列(如DNA序列)：这种序列在转录起始期间被DNA依赖性RNA聚合酶识别并(直接或间接)结合，导致生成与转录的DNA互补的RNA分子；这种区域也可以称作“5'调节区”。启动子通常位于在待转录的编码序列前方存在的5'非翻译区(UTR)的上游并且具有多个区域，这些区域充当RNA聚合酶II和其他蛋白质如转录因子的结合位点以引发可操作地连接的基因的转录。启动子本身可以含有调节可操作地连接的基因的转录的子元件(即启动子基序)如顺式元件或增强子结构域。该启动子和连接的5'UTR也称作“启动子区”。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1芝麻花蕾RNA琼脂糖凝胶电泳。

图2ZMwb58基因在保持系WB7-1D花蕾和栽培品种中芝11号花蕾表达水平比较；A为栽培品种中芝11号花蕾中表达水平，B为保持系WB7-1D花蕾中表达水平。

图3芝麻隐性核不育保持系WB7-1D花蕾RNA琼脂糖凝胶电泳；M为DL2000 DNAMarker，1-2为保持系WB7-1D花蕾RNA。

图4ZMwb58基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；M为DL15000 DNA Marker，1为扩增的目的片段。

图5ZMwb58基因DNA序列和蛋白质序列的编码对应图。

图6ZMwb58基因植物过量表达载体构建图谱。

图7重组产物转化大肠杆菌DH5α菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳；M为DL2000 DNAMarker，1-8为菌液PCR产物。

图8过量表达载体转化农杆菌菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳；M为DL2000 DNAMarker，-为纯水对照，+为质粒对照，1和2为随机2个农杆菌单克隆扩增的目的片段。

图9 T₀代种子卡那霉素培养基平板抗性筛选。

图10 T₁代植株PCR检测转基因阳性植株DNA扩增片段电泳图谱；M为DL2000 DNAMarker，1-12为每个植株基因组DNA扩增的目的片段，WT为非转基因拟南芥植株，减号为阴性对照，加号为阳性对照。

图11ZMwb58转基因拟南芥植株和非转基因拟南芥植株株型比较；A为ZMwb58转基因拟南芥植株，B为非转基因拟南芥植株。

图12ZMwb58转基因拟南芥植株和非转基因拟南芥植株花药中花粉亚历山大染色液染色；A为ZMwb58转基因拟南芥植株花药，B为非转基因拟南芥植株花药；所用显微镜为OLYMPUSBX51，显微镜成像系统为OLYMPUSDP73，图中标尺长度50μm。

图13ZMwb58转基因拟南芥植株和非转基因拟南芥植株果荚比较；A为ZMwb58转基因拟南芥植株果荚(物镜倍数为2倍)，B为非转基因拟南芥植株果荚(物镜倍数为0.75倍)；所用体视显微镜为Nikon SMZ18，体视显微镜成像系统为Nikon DS-Ri2，图中标尺长度500μm。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

试验例1对ZMwb58基因在不同芝麻品种花蕾中的表达水平进行定量比较分析

1试验方法

1.1育性降低的芝麻隐性核不育保持系WB7-1D和完全可育的常规芝麻栽培品种中芝11号的总RNA提取

育性降低的芝麻隐性核不育保持系WB7-1D和完全可育的常规芝麻栽培品种中芝11号于2017年夏季安徽省农业科学院试验田播种种植，盛花期早晨6:00-7:00采集花蕾样品，采集的花蕾立即液氮冷冻，-80℃冰箱保存，待提取总RNA。

总RNA提取步骤：

(1)液氮研磨样品，转入RNase-free 1.5mL离心管里，加入1mL TRIzol裂解液。剧烈震荡，室温静置2-3分钟。

(2)加入200μL氯仿，剧烈涡旋30秒，室温静置5分钟。

(3)4℃，12000×g离心15分钟。。

(4)小心转移上清至RNase-free 1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇混匀。

(5)加入500μL RNA Wash Buffer I至柱子中，4度，12000×g离心30秒。弃滤液。

(6)13000×g，4℃离心10分钟。

(7)弃上清，加入1mL 70％乙醇漂洗沉淀。

(8)13000×g，4℃离心5分钟。

(9)弃70％乙醇，空气晾干RNA。

(10)加60μL DEPC处理水溶解RNA。

(11)变性电泳检测，即可反转录使用。

1.2DNase I处理

DNase I处理的体系见表1。

表1体系配置

(1)37℃水浴30分钟。

(2)65℃水浴10分钟灭活DNase I。

1.3mRNA反转录

mRNA反转录体系见表2。

表2mRNA反转录体系体系配置

(1)混匀，离心。

(2)37℃水浴60分钟。

(3)85℃水浴10分钟，灭活酶。

1.4实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测ZMwb58基因在保持系WB7-1D和栽培品种中芝11号花蕾中表达量变化

ZMwb58基因Quantitative Real-time PCR引物序列：

上游引物：GCTTCTGGTGGGATTTTTGA

下游引物：GGTTGCCAGTCATTTCGTTT

Quantitative Real-time PCR体系配置(20μL体系)见表3。

表3Quantitative Real-time PCR反应体系

混合均匀，离心，分到8联排管或者96孔PCR板里，每个样品每个基因3个PCR平行反应。Quantitative Real-time PCR反应程序设置见表4。

表4Quantitative Real-time PCR反应程序

以Actin为内参基因，比较Ct方法分析数据。

2试验结果

盛花期早晨分别采集芝麻隐性核不育保持系WB7-1D和常规栽培品种中芝11号花蕾样品，使用TRIzol试剂分别提取保持系WB7-1D和常规栽培品种中芝11号花蕾总RNA，电泳(图1)显示具有清晰的28S和18S及5S 3条带，28S条带的亮度大概是18S条带的2倍，说明RNA提取完整性较好，后续反转录合成cDNA。

以反转录合成的cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR)检测ZMwb58基因在保持系WB7-1D和栽培品种中芝11号花蕾中表达量变化(图2)。

ZMwb58基因Quantitative Real-time PCR引物序列：

上游引物：GCTTCTGGTGGGATTTTTGA

下游引物：GGTTGCCAGTCATTTCGTTT

芝麻隐性核不育保持系WB7-1D表现为育性降低，常规栽培品种中芝11号表现为完全可育，实时荧光定量PCR结果显示，ZMwb58基因在保持系WB7-1D花蕾中的表达水平极显著高于栽培品种中芝11号花蕾中的表达水平，表明ZMwb58基因与保持系WB7-1D的育性调控相关，因此下一步开展对此基因的克隆工作。

试验例2从芝麻隐性核不育保持系WB7-1DZ中克隆ZMwb58基因1试验方法

1.1芝麻隐性核不育保持系WB7-1D花蕾组织cDNA的制备

为获取ZMwb58基因克隆所需的花蕾组织cDNA，芝麻隐性核不育保持系WB7-1D于2018年夏季安徽省农业科学院试验田播种种植，待进入盛花期，早晨6:00-7:00采集花蕾，芝麻花蕾总RNA采用TRIzol法提取，步骤如下：

(1)取100μg花蕾组织在液氮中研磨至粉状放于1.5ml离心管中。

(2)加入1ml放置于4℃的TRIzol，剧烈振荡，颠倒混匀，室温静置5min。

(3)加1/5总体积的氯仿(200μL)，振荡，颠倒混匀，室温静置5min，提前准备冷冻离心机。

(4)12000rpm，4℃离心10min。

(5)转上层水相(约400μL)于另一1.5ml离心管中。

(6)加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。

(7)12000rpm，4℃离心10min。

(8)弃上清，加1000μL 75％乙醇。

(9)12000rpm，4℃离心1min。

(10)弃上清，超净台干燥10min。

(11)溶于H₂O(DEPC处理)中至30μL。

(12)所得总RNA凝胶电泳，28s和18s两个条带清楚为佳。

1.2反转录合成cDNA

所得RNA用于反转录合成cDNA，(采用Vazyme公司HiScript 1st Strand cDNASynthesis Kit)，反应体系如下：

(1)RNA模板变性

在RNase-free离心管中配制如下表5所述的混合液。

表5混合液体系

65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

(2)第一链cDNA合成

表6第一链cDNA合成体系

用移液器轻轻吹打混匀。50℃反应45min；85℃反应5min。

1.3PCR扩增ZMwb58基因

利用公布的芝麻基因组数据设计ZMwb58基因特异性引物，以上述合成的cDNA为模板，采用PCR的方法扩增ZMwb58基因，步骤如下：

引物序列(斜体为连接载体重组臂序列)

上游引物：

ATGTCTAGACTCGAGGGATCCATGGGGAAGCGATTGAGGAAG

下游引物：

AGCCTGCAGCCATGGGGATCCCTACAGCAGCTGCTGGGATAT

采用Vazyme公司phanta max super-fidelity DNA Polymerase，

PCR反应体系(总体积50μL)如表7所示：

表7PCR反应体系

PCR反应程序为：95℃30s；(95℃15s，退火温度56℃15s，延伸72℃1min)×39循环；最后延伸72℃，5min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，显示扩增条带。

2试验结果

盛花期早晨采集芝麻隐性核不育保持系WB7-1D花蕾样品，采用TRIzol法提取总RNA(图3)。

所得RNA反转录成cDNA(采用Vazyme公司HiScript 1st Strand cDNA SynthesisKit)。

采用ZMwb58基因特异性引物，以芝麻隐性核不育保持系WB7-1D花蕾样品cDNA为模板进行PCR扩增，反应程序为：95℃30s；(95℃15s，退火温度56℃15s，延伸72℃1min)×39循环；最后延伸72℃，5min)，通过琼脂糖凝胶电泳分离目的条带单一清晰，扩增片段的条带如图4所示。经过序列分析，从芝麻隐性核不育保持系WB7-1D花蕾cDNA中克隆出来ZMwb58基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长度为744bp，GC含量为45.43％，编码247个氨基酸，Pfam数据库序列比对表明ZMwb58基因编码的蛋白质中包含一个F-box结构域，此结构域具体氨基酸序列为：VWTEIAKFLDGRSLVMLAVTCKWFNRIMMEDSVWKYACLR，ZMwb58基因DNA序列与公布的芝麻基因组数据比对，ZMwb58基因定位于芝麻基因组1号连锁群(LG1)。图5为ZMwb58基因DNA序列和蛋白质序列的编码对应。

试验例3ZMwb58基因转拟南芥功能验证试验

1试验方法

1.1构建植物过表达载体

利用酶切和重组反应将ZMwb58基因ORF序列连入植物过量表达载体(pCambia2301-KY，卡那霉素抗性筛选标记)的CaMV35s启动子下游，重组载体命名为pCambia2301-KY-ZMwb58，步骤如下：

用限制性核酸内切酶BamHI酶切载体pCambia2301-KY线性化(采用Takara公司相应限制性内切酶产品)。

酶切反应体系如表8所示：

表8酶切反应体系

酶切产物纯化后与上述PCR产物进行重组反应(重组反应试剂盒为Vazyme公司ClonExpress-IIOne Step Cloning Kit)。

重组连接反应体系(总体积10μL)如表9所示：

表9重组连接反应体系

上述反应液使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。放置于37℃反应30min，随后立即置于冰上冷却。

重组产物转化大肠杆菌DH5α细胞。

转化步骤：

(1)在100μL大肠杆菌感受态细胞中加入10μL连接产物。

(2)冰浴30min。

(3)42℃热激60-90s。

(4)冰浴2min。

(5)加入800μL LB液体培养基。

(6)37℃摇床培养30min。

(7)6000rpm离心3min，弃上清，涂布卡那霉素(Kana 50mg/L)抗性培养基平板。

(8)37℃倒置培养12-16h后，挑取抗性菌落。

(9)在96孔板中，每孔加入100μL LB(含Kana)液体培养基

(10)各平板取4-8个菌落，37℃，2h，180rpm扩大培养。

(11)取1μL菌液进行PCR阳性检测。

挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，同时扩增产物送测序。扩增和测序引物为插入目的基因两侧的载体序列，分别为：

35S-F：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’。

2301-F：5’-GCTTCCGGCTCGTATGTTG-3’。

依据测序比对结果，分析ZMwb58基因是否已插入载体，同时获得此基因编码序列的碱基信息。

1.2植物过表达载体转入农杆菌

将上述构建好的pCambia2301-KY-ZMwb58植物过表达载体转入农杆菌GV3101，转化步骤如下：

(1)取GV3101农杆菌一管，在冰上融解后，加入5μL质粒，轻轻混匀。

(2)液氮速冻1min，将小管放入37℃水浴中15min。

(3)加入800μL的YEP培养基(每升含有：酵母提取物5g，peptone蛋白胨10g，蔗糖1g，七水硫酸镁0.5g，PH 7.0)，28℃培养2-4h。5000rpm，离心3min，弃去上清，再用100μL的YEP培养基重悬细胞。

(4)涂布重悬物于25mg/L Rif+50mg/L Km+25mg/L Gen的YEP平板上(Rif：利福平，Km：卡那霉素，Gen：庆大霉素)，28℃培养3d。

(5)挑取3个单菌落接种于25mg/L Rif+50mg/L Km+25mg/L Gen YEP培养基中，过夜培养。

(6)取1μL培养菌液进行PCR鉴定。

1.3农杆菌PCR鉴定

农杆菌PCR鉴定采用Vazyme公司2×Taq Master Mix(Dye Plus)，扩增体系如表10所示：

表10 2×Taq Master Mix扩增体系

PCR反应程序：95℃预变性5min；循环为95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。

上游扩增引物统一使用35S启动子片段35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC，下游扩增引物使用ZMwb58基因3’端下游扩增引物(见前述)。

1.4农杆菌转化拟南芥

将载体质粒转化的农杆菌培养至合适时期，采用浸花法侵染拟南芥花序。侵染具体步骤如下：

(1)拟南芥主花序开花后，即可用于侵染。

(2)将花序浸入农杆菌菌液(OD600：0.8-1.0)中，1分钟后拿出，将花序上包裹保鲜膜。

(3)24h后将包裹的保鲜膜揭开，放置光照下，正常管理。

植物在22℃、湿度约70％，16小时光照条件下养护至收种(T₀代种子)。

1.5ZMwb58转基因阳性拟南芥植株的筛选

通过抗生素平板培养和PCR扩增目的基因片段两种方式筛选ZMwb58转基因阳性拟南芥植株。具体方法如下：

(1)收获的拟南芥T₀代种子用75％乙醇消毒后，平铺在含卡那霉素(40mg/L)的1/2MS培养基平板上萌发，进行抗性筛选。选取长出真叶，并能生根的抗性苗移栽到混合草炭、蛭石和珍珠岩的育苗土中长大。

(2)待抗性苗基本确定可以正常开花收种，随机选取叶片，提取DNA，常规PCR扩增目的基因片段，扩增产物电泳，与PCR扩增含有目的基因片段的载体质粒对比确认。

扩增目的基因片段为：载体片段(35子启动子约100bp)上游+ZMwb58基因下游。

PCR检测引物：

35s-F：GACGCACAATCCCACTATCC

WB58-R：CTACAGCAGCTGCTGGGATAT

表11 2×Taq Master Mix扩增体系(共20μL)

表12PCR反应程序

筛选出的阳性植株在22℃、湿度约70％，16小时光照条件下养护至收种(T₁代种子)。

收种后的ZMwb58转基因T₁代种子在卡那霉素(40mg/L)1/2MS培养基平板上进行抗性筛选，移栽抗性苗至育苗土中长大获得T₂代ZMwb58转基因株系，收获T₂代株系种子经卡那霉素(40mg/L)1/2MS培养基平板抗性筛后移栽，获得T₃代ZMwb58转基因株系。

1.6ZMwb58转基因拟南芥植株表型观察和育性鉴定

花期观察比较非转基因的哥伦比亚生态型拟南芥和ZMwb58转基因拟南芥植株(T₂代和T₃代)育性变化情况，比较植株表型差异，采用亚历山大染色液(Alexander stain)染色花粉，比较花粉育性变化，取非转基因的哥伦比亚生态型拟南芥和ZMwb58转基因拟南芥植株的花苞，去除花萼、花瓣等器官，分离出雄蕊，滴上一到两滴亚历山大染液后，盖上盖玻片，避光染色5-8个小时，显微镜下观察雄蕊花药中花粉染色情况，可育有活力的花粉染色成紫红色，不育或活力下降的花粉染色较浅或成绿色；成熟期比较果荚的生长情况，比较结实量的多少，判断育性高低。

3试验结果

3.1ZMwb58基因植物过量表达载体的构建

利用BamHI限制性内切酶线性化pCambia2301-KY载体，采用重组反应(重组反应试剂盒为Vazyme公司ClonExpress-IIOne Step Cloning Kit)将ZMwb58基因完整开放阅读框连入pCambia2301-KY载体上CaMV35s启动子下游(图6)，构建ZMwb58基因植物过量表达载体，命名为pCambia2301-KY-ZMwb58。

上述重组反应产物转化大肠杆菌DH5α细胞，进行菌液PCR并进行琼脂糖凝胶电泳(图7)，挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，同时扩增产物送测序。扩增和测序引物为插入目的基因两侧的载体序列，分别为：

35S-F：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’

2301-F：5’-GCTTCCGGCTCGTATGTTG-3’。

DNA测序分析表明扩增片段中包含ZMwb58基因开放阅读框大小为744bp，编码248个氨基酸，在NCBI数据库序列比对中未检索到相同的DNA序列信息，此基因编码序列尚未见报道。

3.2植物过表达载体质粒转化农杆菌GV3101

用冻融法将pCambia2301-KY-ZMwb58过量表达载体质粒转化农杆菌GV3101，培养菌液进行PCR鉴定(图8)。

上游扩增引物统一使用35S启动子片段35S-F：GACGCACAATCCCACTATCC，下游扩增引物使用ZMwb58基因3’端扩增引物(见前述)。

3.3农杆菌浸花法转化拟南芥

通过农杆菌浸花法转化拟南芥哥伦比亚生态型，收获T₀代种子用75％乙醇消毒后，平铺在含卡那霉素(40mg/L)的1/2MS培养基平板上萌发，进行抗性筛选(图9)，选第一对真叶展开，且生根的抗性苗移栽至育苗土中长大，随机选取叶片，提取DNA，PCR扩增目的基因片段，检测T₁代ZMwb58转基因阳性植株(图10)。

PCR检测引物：

35s-F：GACGCACAATCCCACTATCC

WB58-R:CTACAGCAGCTGCTGGGATAT

收获ZMwb58转基因T₁代阳性植株种子，经卡那霉素平板抗性筛选继续传代，获得T₂代和T₃代转基因植株进行后续表型鉴定。

3.4转基因拟南芥植株表型观察和育性鉴定

对T₂代和T₃代ZMwb58转基因拟南芥植株进行表型观察和育性鉴定，与对照非转基因拟南芥植株相比，如图11所示ZMwb58转基因植株叶片和果荚较小，非转基因植株叶片和果荚较大；如图12所示亚历山大染色液(Alexander stain)分别染色ZMwb58转基因植株和非转基因植株花药中的花粉，结果表明：ZMwb58转基因植株花粉活力降低，花药中花粉染色较浅或成绿色，对照非转基因植株的花药充满被染色成紫红色的花粉，花粉可育，活力较强；如图13所示，相比对照非转基因植株果荚，ZMwb58转基因植株果荚较小且不饱满，内含种子数量较少。

综上所述，芝麻隐性核不育保持系WB7-1D中ZMwb58基因为首次克隆的新基因，ZMwb58基因对育性具有调控作用，其过量表达，可使花粉活力降低，育性下降，种子数量减少。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽省农业科学院作物研究所

<120> 芝麻育性调控基因及其表达载体和应用

<130> AH-2003-210115A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 744

<212> DNA

<213> Sesamum indicum Linn.

<400> 1

atggggaagc gattgaggaa ggcgagatcc atgtgctgct gcgtctctcc gcgctcctcc 60

taccttactc ctcactcaat tttcagctgg tacgaagagg atgtatggac ggagattgcc 120

aagtttctag atggcagatc tttagtgatg cttgcagtga cttgcaaatg gtttaatcgt 180

atcatgatgg aggacagtgt gtggaaatat gcatgtctgc gtgatctgca ggtccctgac 240

cctggaaaag tagcatttaa atggagcaaa ctttatgcca cagcttttga tggaagtcac 300

gcatatatgt tccgccagca ggagaagcat attgacttgc agcttgttcg atgtcctgtt 360

tgcgaccttg atacatgtga tggaacaatg caaaccctgg atgcaaggca tattgaactg 420

ttcctgaatg aggggtatca tgatgggagc tgggactatg atacattagg atcccatgac 480

ataaaaaagc aggctgaagg ggcttctggt gggatttttg acgtagagca tctcaaggat 540

caatcaacct ctgatatttt tgatctaaag tcatgggtgg gaaaacgaaa tgactggcaa 600

ccaaaagcga tgattactct gcacgcggtt gcagtaaata ccaatttgca agacaatgaa 660

ggtcttcagg tcaaatacca tgcaatgagg gctggaaaag atggtgaagt tgtttcaatt 720

cgtatatccc agcagctgct gtag 744

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> Sesamum indicum Linn.

<400> 2

Met Gly Lys Arg Leu Arg Lys Ala Arg Ser Met Cys Cys Cys Val Ser

1 5 10 15

Pro Arg Ser Ser Tyr Leu Thr Pro His Ser Ile Phe Ser Trp Tyr Glu

20 25 30

Glu Asp Val Trp Thr Glu Ile Ala Lys Phe Leu Asp Gly Arg Ser Leu

35 40 45

Val Met Leu Ala Val Thr Cys Lys Trp Phe Asn Arg Ile Met Met Glu

50 55 60

Asp Ser Val Trp Lys Tyr Ala Cys Leu Arg Asp Leu Gln Val Pro Asp

65 70 75 80

Pro Gly Lys Val Ala Phe Lys Trp Ser Lys Leu Tyr Ala Thr Ala Phe

85 90 95

Asp Gly Ser His Ala Tyr Met Phe Arg Gln Gln Glu Lys His Ile Asp

100 105 110

Leu Gln Leu Val Arg Cys Pro Val Cys Asp Leu Asp Thr Cys Asp Gly

115 120 125

Thr Met Gln Thr Leu Asp Ala Arg His Ile Glu Leu Phe Leu Asn Glu

130 135 140

Gly Tyr His Asp Gly Ser Trp Asp Tyr Asp Thr Leu Gly Ser His Asp

145 150 155 160

Ile Lys Lys Gln Ala Glu Gly Ala Ser Gly Gly Ile Phe Asp Val Glu

165 170 175

His Leu Lys Asp Gln Ser Thr Ser Asp Ile Phe Asp Leu Lys Ser Trp

180 185 190

Val Gly Lys Arg Asn Asp Trp Gln Pro Lys Ala Met Ile Thr Leu His

195 200 205

Ala Val Ala Val Asn Thr Asn Leu Gln Asp Asn Glu Gly Leu Gln Val

210 215 220

Lys Tyr His Ala Met Arg Ala Gly Lys Asp Gly Glu Val Val Ser Ile

225 230 235 240

Arg Ile Ser Gln Gln Leu Leu

245

Claims

1.从芝麻中分离的用于育性调控的基因，其特征在于，所述基因的cDNA为SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸为SEQ IDNo.2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求1所述的基因。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体是重组植物表达载体。

5.权利要求1所述的基因在调控植物育性中的应用，其特征在于，包括：构建含有所述基因的重组植物表达载体；将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中，将所述育性调控基因在植物中进行过表达，使植物的育性下降；所述的植物是芝麻。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的育性下降包括花粉活力降低和种子数量减少。