CN115058449B - 一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，采用RNA干扰(RNAi)降低柑橘属植物中CsWRKY43的转录水平，其中，CsWRKY43编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；具体包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段；(2)构建CsWRKY43基因片段的干扰表达载体；(3)干扰表达载体转化柑橘，得到转基因植株。本发明通过克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段，构建干扰载体，然后转化柑橘，得到的转基因植株溃疡病病斑面积可最大降低至现有柑橘的64％，病情指数可最大降低至现有柑橘的61％，能够显著的减轻溃疡病的发病程度。

Description

一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法。
背景技术
近年来，我国柑橘产业发展迅猛，逐渐成为南方山区的主要经济支柱。然而，柑橘产业发展却饱受柑橘溃疡病等病害的制约。柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)是由地毯草黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.Citri，Xcc)引起的细菌性病害，其危害当前大多数主栽柑橘品种。因此，加强对柑橘溃疡病防控研究是柑橘产业发展的迫切需求。
柑橘溃疡病的传统防控手段(病树焚烧和农药使用等)需要投入大量人力和物力，且会造成巨大环境危害。因此，柑橘溃疡病防治更多寄希望于培育抗病新种质。分子育种由于可定向、高效培育抗病新种质，目前得到快速发展和广泛应用。近年来，通过生物技术手段已获得一些抗溃疡病的柑橘资源，例如转柞蚕抗菌肽D基因的锦橙、新会橙、脐橙株系；过表达CsBZIP40的晚锦橙株系；基因定点编辑柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子获得的对柑橘溃疡病抗性提高的植株等。但优质候选基因仍然匮乏，且功能和作用机制研究不深，致使多基因协同对抗溃疡病还难以实现，制约了柑橘抗溃疡病分子育种的发展。因此，亟待有针对性地挖掘更多与柑橘溃疡病紧密相关的基因，深入解析其功能和机制，用于抗溃疡病分子育种。
自1996年WRKY转录因子被首次报道在应对病原体方面发挥一定的调控作用以来，越来越多的研究聚焦于WRKY转录因子在植物抗病中的功能。不同的WRKY转录因子在植物免疫防御反应中功能各异。利用WRKY基因进行抗病分子育种具有重大的潜力。但是，植物WRKY转录因子家族成员众多，而且各成员的功能和机制也多种多样，利用WRKY进行抗病分子育种的尝试还不多，尚没有利用RNAi介导的WRKY沉默提高柑橘对柑橘溃疡病的抗性研究和应用。
研究中发现，受Xcc诱导后CsWRKY43在感病品种晚锦橙中表达量总体呈上升趋势，与之相反，在抗病品种四季橘中CsWRKY43的表达量呈下降趋势，暗示CsWRKY43是溃疡病的一个感病基因。CsWRKY43可以通过正调控下游的活性氧清除相关基因的表达降低植株的活性氧水平，活性氧在植物抗病过程中有积极的调控作用，所以推测CsWRKY43干扰可能降低活性氧清除相关基因的表达进而增加植株的活性氧水平和溃疡病抗性。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本发明为提高柑橘对溃疡病的抗性，提供一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，该方法通过将CsWRKY43编码基因的干扰载体整合到柑橘中，降低CsWRKY43的转录水平，能够显著提高柑橘对溃疡病的抗性，并且不影响转基因植株的表型。
本发明通过下述技术方案实现：
一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，所述方法为采用RNA干扰(RNAi)降低柑橘属植物中CsWRKY43的转录水平，其中，CsWRKY43编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；具体包括以下步骤：
(1)克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段；
(2)构建CsWRKY43基因片段的干扰表达载体；
(3)干扰表达载体转化柑橘，得到转基因植株。
步骤(1)中，柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板采用高保真酶PCR扩增得到CsWRKY43编码基因的RNAi片段，所述RNAi片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；PCR扩增所采用的引物为CsWRKY43-RNAi-F和CsWRKY43-RNAi-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
步骤(2)中，干扰载体构建方法为：(2.1)将步骤(1)中获得的PCR产物CsWRKY43编码基因的RNAi片段分两组，第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切，第二组用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切；(2.2)将酶切回收的两组片段同时连接到pUC-RNAi载体，得到中间载体pUC-RNAi-CsWRKY43；(2.3)将中间载体pUC-RNAi-CsWRKY43和pLGNe超量表达载体用KpnⅠ和SalⅠ分别双酶切；(2.4)将中间载体含有RNAi片段的酶切产物连接到pLGNe载体上；(2.5)连接转化至感受态细胞，提取质粒，得到干扰表达载体pLGNe-CsWRKY43-RNAi。
步骤(3)中，干扰表达载体转化柑橘的方法为：通过电击法将干扰表达载体质粒导入农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体，遗传转化后的外植体细胞再经离体培养、染色鉴定、嫁接、PCR验证和qRT-PCR验证后得到转基因植株。
另一种具体实施方式，步骤(2)得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsWRKY43干扰与柑橘溃疡病抗性的相关性。
另一种具体实施方式，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-CsWRKY43-F和ID-CsWRKY43-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。
另一种具体实施方式，PCR验证后，用qRT-PCR验证转基因植株中CsWRKY43的转录水平，目的基因检测采用的引物为RT-CsWRKY43-F和RT-CsWRKY43-R，核苷酸序列分别如SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明实施例提供的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，从柑橘感染溃疡病前后差异表达的基因中获得了一个在抗病品种中受柑橘溃疡病菌诱导下调、在感病品种中上调的转录因子CsWRKY43，通过构建CsWRKY43编码基因的干扰载体，根癌农杆菌介导转化柑橘后，能够对柑橘溃疡病表现出明显抗性；
2、本发明实施例提供的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，通过克隆柑橘CsWRKY43编码基因的RNAi片段，构建干扰载体，然后转化柑橘，得到的转基因植株溃疡病病斑面积可最大降低至现有柑橘的64％，病情指数可最大降低至现有柑橘的61％，能够显著的减轻溃疡病的发病程度；
3、本发明实施例提供的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，不会影响转基因柑橘植株的表型，通过CsWRKY43干扰可大大提高柑橘对溃疡病的抗性，相比基因编辑技术对柑橘基因进行沉默，本发明的RNAi技术更稳定，获得基因沉默植株的几率更大，适用于柑橘这种高杂合度的物种；
4、本发明实施例提供的一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法，在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值，CsWRKY43基因可以作为候选基因同多个溃疡病抗、感病基因进行溃疡病抗性育种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例柑橘CsWRKY43的结构域示意图；
图2为本发明实施例柑橘CsWRKY43的Xcc诱导表达图，数据柱上的小写字母表示差异显著性(P<0.05)；
图3为本发明实施例柑橘CsWRKY43的亚细胞定位图；
图4为本发明实施例利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的具体实施流程图；
图5为本发明实施例构建CsWRKY43干扰载体流程图：其中GUS：NPTII，β-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV 35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；NOS，冠瘿碱合成酶基因终止子；
图6为本发明实施例柑橘遗传转化流程图；
图7为本发明实施例转基因植株GUS染色图：WT表示野生型对照；R1、R2和R3表示三个转基因植株；
图8为本发明实施例转基因植株PCR检测图；
图9为本发明实施例转基因植株qRT-PCR检测图：*表示同野生型比较差异显著(P＝0.05)；**表示同野生型比较差异极显著(P＝0.01)；
图10为本发明实施例转基因植株表型图；
图11为本发明实施例转基因柑橘叶片接种Xcc后的发病情况；
图12为本发明实施例转基因柑橘叶片接种Xcc后病斑大小统计图；
图13为本发明实施例转基因柑橘叶片接种Xcc后病情指数统计图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。
在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
柑橘CsWRKY43的信息学与表达分析
1.柑橘CsWRKY43结构域分析
使用Pfam软件对CsWRKY43基因的结构进行分析，发现CsWRKY43编码116个氨基酸，含有一个由58个氨基酸残基组成的WRKY蛋白结构域，如图1所示，该结构域由N端的WKKYGQK保守七肽和C端的C2H2锌指基序组成。
CsWRKY43基因的核苷酸序列SEQ ID NO：1：
ATGGACCGACGAGTCCACAGATTGGTGTTGCCAGAAGATGGATATGAGTGGAAAAAATATGGCCAAAAATTCATCAAAAACATCAGAAAATTTAGGAGCTATTTCAAGTGCCAAGAGAGCAGTTGCATGGCCAAGAAACGAGCCGAGTGGTGCACCTCGGACCCAACCAACGTCCGAATTGTGTATGATGGGGTTCACAGTCACACCCACCATGGATCTTCCCCATCCTCAGCAGATCAACCTAGAAGAGGTTCCTCCAATACTTCATCAAATGGCAATCAGTATAATTTGTTAACACAAGTGTTTGGAGATCAATCATCAAACGCACCACCAGCTAGCAGACGCAATTAG。
2.柑橘CsWRKY43的Xcc诱导表达
为验证CsWRKY43与Xcc侵染之间的关系，通过在抗病品种四季橘和感病品种晚锦橙中注射柑橘Xcc，以CsWRKY43特异性区域设计qRT-PCR实时引物RT-CsWRKY43-F和RT-CsWRKY43-R；对CsWRKY43受Xcc侵染的诱导表达特性进行分析发现：晚锦橙中，CsWRKY43的表达量在病菌感染期间表达量明显上升。与之相反，四季橘中，CsWRKY43在病菌感染期间表达量总体呈下降趋势如图2所示。上述结果表明受Xcc诱导后，CsWRKY43在感病品种晚锦橙和抗病品种四季橘中有不同表达特性，推测CsWRKY43可能是一个溃疡病感病基因，其表达水平与溃疡病抗性呈负相关。
RT-CsWRKY43-F核苷酸序列SEQ ID NO：7：
AGTCCACAGATTGGTGTTGC
RT-CsWRKY43-R核苷酸序列SEQ ID NO：8：
TTTCTTGGCCATGCAACTGC。
3.柑橘CsWRKY43的亚细胞定位
为确定CsWRKY43在细胞内的定位，构建CsWRKY43与报告基因绿色荧光蛋白基因EGFP融合表达载体并转化拟南芥原生质体，在激光共聚焦扫描显微镜下观察其荧光表达部位。如图3所示，在目标蛋白荧光通道观察到CsWRKY43主要定位在细胞核，少量在细胞膜，而对照组中各区域均能观察到荧光，叶绿体荧光通道的红色荧光排除了叶绿体自发荧光对目的蛋白定位的干扰，明场和叠加图进一步明确CsWRKY43主要定位在细胞核。定位在细胞核是CsWRKY43发挥其转录因子调控作用的前提。
实施例2
如图4所示，本发明利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的具体实施流程如下：
克隆CsWRKY43编码基因的RNAi片段
1.RNA提取及cDNA合成
用RNA提取试剂盒(艾德莱，CAT：RN09)提取晚锦橙的RNA。使用Recombinant DNaseI(TAKARA)合成cDNA。
2.CsWRKY43编码基因的RNAi片段的PCR扩增
使用引物CsWRKY43-RNAi-F和CsWRKY43-RNAi-R克隆CsWRKY43编码基因的RNAi片段，长度为270bp，核苷酸序列SEQ ID NO：2：
ATCAGAAAATTTAGGAGCTATTTCAAGTGCCAAGAGAGCAGTTGCATGGCCAAGAAACGAGCCGAGTGGTGCACCTCGGACCCAACCAACGTCCGAATTGTGTATGATGGGGTTCACAGTCACACCCACCATGGATCTTCCCCATCCTCAGCAGATCAACCTAGAAGAGGTTCCTCCAATACTTCATCAAATGGCAATCAGTATAATTTGTTAACACAAGTGTTTGGAGATCAATCATCAAACGCACCACCAGCTAGCAGACGCAATTAG。
引物CsWRKY43-RNAi-F核苷酸序列SEQ ID NO：3：
TCTAGAGGCGCGCCATCAGAAAATTTAGGAGC
引物CsWRKY43-RNAi-R核苷酸序列SEQ ID NO：4：
GGATCCATTTAAATCTAATTGCGTCTGCTAGC。
PCR采用PrimeSTAR master mix(TAKARA)。
扩增体系：10X PCR mix：2.5μL；引物CsWRKY43-RNAi-F(5μmol·L-1)：1μL；引物CsWRKY43-RNAi-R(5μmol·L-1)：1μL；cDNA约60ng；加ddH2O至25μL。
扩增程序：98℃，5min；98℃，30s，56℃，30s，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。
3.DNA片段回收
紫外灯下，用洁净的刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶块，利用DNA凝胶回收试剂盒(艾德莱)回收RNAi片段。
实施例3
构建CsWRKY43干扰载体并转化根癌农杆菌
载体构建流程图如图5所示，具体操作如下：
1)将实施例2获得的CsWRKY43编码基因的RNAi片段的PCR产物回收后分两组，第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切，第二组用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切；
2)酶切回收的两组片段同时连接到pUC-RNAi载体，得到中间载体pUC-RNAi-CsWRKY43；
3)中间载体pUC-RNAi-CsWRKY43和pLGNe超量表达载体用KpnⅠ和SalⅠ分别双酶切；
4)将含有RNAi片段的酶切产物连接到pLGNe载体，构建出最终的干扰载体pLGNe-CsWRKY43-RNAi(载体构建所用限制性内切酶购自(THERMO)公司，按照使用说明操作)；
5)用电激法将构建的干扰导入根癌农杆菌EHA105，具体操作如下：
5.1)预先取冻存的EHA105根癌农杆菌感受态细胞(50μL)，于冰上融化；
5.2)加入2μL所构建的干扰载体于感受态细胞中，吹打混匀后，冰上放置5min；
5.3)加入1mL LB液体培养基至电击杯中，移液枪吹打混匀，移至无菌离心管中，260r·min-1，28℃摇床振荡培养40min；
5.4)10000r·min-1将菌液离心1min，弃上清液(剩约100μL重悬菌体)，重悬后用移液枪打到LK固体培养基上，涂布均匀，28℃倒置暗培养2天；
5.5)菌斑长出后，挑取单菌落至LK液体培养基中，恒温摇床上(28℃)振荡过夜。
实施例4
遗传转化柑橘(晚锦橙)
如图6所示，柑橘遗传转化流程具体操作如下：
1.柑橘实生苗上胚轴的获得
取新鲜柑橘(晚锦橙)洗净，用70％酒精表面消毒，在无菌的条件下取出种子，剥掉种皮，接种在种子萌发培养基上萌发，28℃下暗培养2周，然后在16h光照/8h黑暗的光周期下培养1周；无菌条件下取萌发幼苗上胚轴切成1cm左右的茎段，用于根癌农杆菌的遗传转化。
2.根癌农杆菌的制备
用于转染的根癌农杆菌菌液(含CsWRKY43干扰载体)加入80％的无菌甘油保存于-70℃的超低温培养箱中。转染前，在含50mg·L-1卡那霉素的LB固体培养基上划线培养。挑根癌农杆菌单菌落，接种于25mL含有相同抗生素的LB液体培养基中，28℃震荡培养过夜；次日，测浓度后将菌液稀释成OD600＝0.1的菌液进行二摇，3h后，待菌液处于对数生长期(OD600＝0.5)时，于5000r·min-1离心10min，弃上清，用PH＝5.4的MS液体培养基重悬后用于转染。
3.柑橘上胚轴茎段的转化
3.1将切成1cm左右的柑橘(晚锦橙)上胚轴茎段在根癌农杆菌中浸泡13min，期间轻微晃动。取出茎段后将表面的菌液吸干；将茎段转移到共培养培养基中，26℃暗培养2d；
3.2共培养完成后，将上胚轴转移到筛选培养基中，28℃暗培养7d，外植体在28℃、16h光照/8h黑暗培养，每两周继代一次；
3.3待幼苗长到1cm以上时，将GUS染色初筛阳性芽切下后嫁接到无菌试管晚锦橙苗，在成苗培养基中进行培养；待幼苗长到5cm左右时将其嫁接到枳实生苗上，在温室中进行培养。
其中，根癌农杆菌转化所用培养基如下：
种子萌发培养基：MS+30g·L-1蔗糖+2.5g·L-1Gelrite，PH＝5.8。
共培养培养基：MS+2mg·L-1BA+0.5mg·L-1IAA+1mg·L-1 2，4–D+100μmol AS+30g·L-1蔗糖+2.5g·L-1Gelrite，PH＝5.8。
筛选培养基：MS+2mg·L-1BA+0.5mg·L-1IAA+500mg·L-1Cef+50mg·L-1Kan+30g·L-1蔗糖+2.5g·L-1Gelrite，PH 5.8。
成苗培养基：MS+30g·L-1蔗糖，PH＝5.8。
实施例5
转基因植株验证
转基因植株使用GUS染色、PCR检测、qRT-PCR方式进行验证，具体方法如下：
1.转基因植株GUS染色鉴定
将转基因植株叶片切成直径7mm叶圆片，进行GUS组织化学染色，如图7所示，阳性植株叶圆片边缘显蓝色，野生型植株叶圆片不显色。
2.转基因植株PCR检测
取转基因植株叶片100mg，使用艾德莱公司试剂盒(CAT：DN15)提取基因组DNA，PCR检测CsWRKY43干扰片段的整合。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min。检测引物为ID-CsWRKY43-F(SEQ ID NO：5)和ID-CsWRKY43-R(SEQ ID NO：6)。如图8所示，阳性植株可以得到约500bp的扩增片段，而对照植株无扩增。
引物ID-CsWRKY43-F的核苷酸序列SEQ ID NO：5：
TCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAG
引物ID-CsWRKY43-R的核苷酸序列SEQ ID NO：6：
CTAATTGCGTCTGCTAGCTGGTGG。
3.转基因植株qRT-PCR分析
提取转基因柑橘叶片总RNA并反转录合成cDNA。目的基因的检测引物为RT-CsWRKY43-F(SEQ ID NO：7)和RT-CsWRKY43-R(SEQ ID NO：8)。
引物RT-CsWRKY43-F的核苷酸序列SEQ ID NO：7：
AGTCCACAGATTGGTGTTGC
引物RT-CsWRKY43-R的核苷酸序列SEQ ID NO：8：
TTTCTTGGCCATGCAACTGC。
反应体积20μL，反应条件：95℃3min，94℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min。实验重复三次。
采用2-△△Ct法计算转基因植株中CsWRKY43基因的相对表达量：定义水处理的样本为参照因子，即其CsWRKY43的表达水平为1，计算转基因柑橘中相对参照因子基因表达的倍数2-△△Ct，为其相对表达量。检测结果如图9所示，CsWRKY43基因转录水平在转基因植株中相比野生型植株被很大程度的降低，表达量最高下调至野生型对照的16％。
实施例6
转基因植株表型观察
观察转基因植株表型，并未发现明显差异。如图10所示，干扰CsWRKY43基因并未对植株的表型和发育产生明显影响。
实施例7
转基因植株的抗性评价
采用离体针刺法对转基因植株进行溃疡病抗性评价，具体操作如下：
采集成熟叶片清洗后用75％的酒精消毒后置于超纯水中冲洗；以叶脉为中心进行针刺,用移液器点样溃疡病菌液，每针孔点样1μL(1X 105CFU·mL-1)，于28℃恒温光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)；叶片点菌后培养10天拍照，用Image J V1.47软件统计病斑大小。
根据病情指数公式计算病情指数，按照病斑面积将病情分为0-7级，以字母R表示病斑面积，0级(R≤0.25mm2)，1级(0.25mm2＜R≤0.5mm2)，2级(0.5mm2＜R≤0.75mm2)，3级(0.75mm2＜R≤1mm2)，4级(1.0mm2＜R≤1.25mm2)，5级(1.25mm2＜R≤1.5mm2)，6级(1.5mm2＜R≤1.75mm2)，7级(R＞1.75mm2)。
根据公式计算发病程度：DI＝100XΣ【各级病斑数X相应级数值】/(病斑总数X最大级数)。
如图11-图13所示，接种溃疡病菌10天后，发现转基因植株和野生型对照的发病症状差异较大，转基因植株叶片上的病斑面积和病情指数均明显小于野生型对照，病斑最多降为野生型柑橘叶片的64％，病情指数为野生型61％。因此，CsWRKY43干扰可大大提高柑橘对溃疡病的抗性。
由此可见，CsWRKY43的干扰可很大程度上降低溃疡病的病斑面积，减轻溃疡病的发病程度。该基因可以独立用作抗病分子育种，也可以与其他的抗病或感病基因一起进行柑橘抗溃疡病分子育种。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
                         序列表
<110>  西南大学
<120>  一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法
<160>  8
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  2
<211>  351
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
atggaccgac gagtccacag attggtgttg ccagaagatg gatatgagtg gaaaaaatat  60
ggccaaaaat tcatcaaaaa catcagaaaa tttaggagct atttcaagtg ccaagagagc 120
agttgcatgg ccaagaaacg agccgagtgg tgcacctcgg acccaaccaa cgtccgaatt 180
gtgtatgatg gggttcacag tcacacccac catggatctt ccccatcctc agcagatcaa 240
cctagaagag gttcctccaa tacttcatca aatggcaatc agtataattt gttaacacaa 300
gtgtttggag atcaatcatc aaacgcacca ccagctagca gacgcaatta g          351
<210>  2
<211>  270
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
atcagaaaat ttaggagcta tttcaagtgc caagagagca gttgcatggc caagaaacga  60
gccgagtggt gcacctcgga cccaaccaac gtccgaattg tgtatgatgg ggttcacagt 120
cacacccacc atggatcttc cccatcctca gcagatcaac ctagaagagg ttcctccaat 180
acttcatcaa atggcaatca gtataatttg ttaacacaag tgtttggaga tcaatcatca 240
aacgcaccac cagctagcag acgcaattag                                  270
<210>  3
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
tctagaggcg cgccatcaga aaatttagga gc                                32
<210>  4
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  4
ggatccattt aaatctaatt gcgtctgcta gc                                32
<210>  5
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  5
tcgttgaaga tgcctctgcc gacag                                        25
<210>  6
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  6
ctaattgcgt ctgctagctg gtgg                                         24
<210>  7
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  7
agtccacaga ttggtgttgc                                              20
<210>  8
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  8
tttcttggcc atgcaactgc                                              20

Claims (7)

1.一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述方法为采用RNAi降低晚锦橙中CsWRKY43的转录水平，CsWRKY43基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
包括以下步骤：
（1）克隆晚锦橙CsWRKY43编码基因的RNAi片段，RNAi片段核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
（2）构建CsWRKY43基因片段的干扰表达载体：
（2.1）将步骤（1）中CsWRKY43编码基因的RNAi片段分两组，第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切，第二组用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切；（2.2）将酶切回收的两组片段同时连接到pUC-RNAi载体，得到中间载体pUC-RNAi-CsWRKY43；（2.3）将中间载体pUC-RNAi-CsWRKY43和pLGNe超量表达载体用KpnⅠ和SalⅠ分别双酶切；（2.4）将中间载体含有RNAi片段的酶切产物连接到pLGNe载体上；（2.5）连接转化至感受态细胞，提取质粒，得到干扰表达载体pLGNe-CsWRKY43-RNAi；
（3）干扰表达载体转化晚锦橙，得到转基因植株。
2.根据权利要求1所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，晚锦橙CsWRKY43编码基因的RNAi片段的克隆方法为：提取晚锦橙总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板采用高保真酶PCR扩增得到CsWRKY43编码基因的RNAi片段。
3.根据权利要求2所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，PCR扩增所采用的引物为CsWRKY43-RNAi-F和CsWRKY43-RNAi-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
4.根据权利要求1所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（3）中，干扰表达载体转化晚锦橙的方法为：通过电击法将干扰表达载体质粒导入根癌农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化晚锦橙外植体，遗传转化后的外植体细胞再经离体培养、染色鉴定、嫁接、PCR验证和qRT-PCR验证后得到转基因植株。
5.根据权利要求4所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（3）得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsWRKY43干扰与晚锦橙溃疡病抗性的相关性。
6.根据权利要求5所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-CsWRKY43-F和ID-CsWRKY43-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
7.根据权利要求6所述的一种利用CsWRKY43干扰以提高晚锦橙溃疡病抗性的方法，其特征在于， PCR验证后，用qRT-PCR验证转基因植株中CsWRKY43的转录水平，目的基因检测采用的引物为RT-CsWRKY43-F和RT-CsWRKY43-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。
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