CN110295183B - 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsPrx25基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；(2)超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株。该方法将一个编码过氧化物酶的基因过表达载体整合到柑橘中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。

Description

一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。

背景技术

柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)是由地毯黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc)所引起的检疫性细菌病害，严重影响着柑橘产业的健康发展(袁承东等，1997；Pitino et al，2015)。溃疡病菌主要侵染柑橘叶片、枝梢、果实等，其中苗木、幼树受害较为严重。病树会出现落叶、枯梢、树势衰弱以及落果等现象，严重的影响了柑橘的产量和品质(何秀玲等，2007)。在溃疡病菌发病初期，柑橘叶片表层首先出现针头般大小的油渍状圆斑，随着病原菌的生长，圆形斑逐渐变得凸起，出现白色、黄色的海绵状脓疤，呈现木栓化及火山口的形状，脓疤颜色变暗发展为褐色病斑，在病原菌的刺激下叶片畸形生长，最终导致叶片上下表皮破裂，木栓化而死亡。果实感染溃疡病后会发生病斑开裂，影响外观和品质，使得经济价值大打折扣。感染严重者，会造成大面积果树枯萎坏死，毁林毁园，造成不可恢复的破坏，给柑橘产业造成巨大的损失(何秀玲等，2007)。

目前，对柑橘溃疡病的预防只能是加强检疫防范，避免溃疡病的传播和感染。柑橘溃疡病菌可以随风雨传播，也可以通过果实、苗木、接穗运输而长距离传播，防不胜防(何君等，2016)。果园一旦感染溃疡病，可以通过化学防治、生物拮抗防治、加强人工管理防治等方法来缓解溃疡病对果园的危害程度，减缓毁园速度，但是治标不治本(陈力等，2008)。培育抗溃疡病品种是最根本有效的方法。但是柑橘有高度杂合、单雄(雌)不育的特点，传统的杂交育种在柑橘育种中周期长、效率低。抗溃疡病柑橘品种迟迟没有培育出来。而分子育种具有效率高、可控性强的特点，在培育柑橘抗溃疡病新品种中得到广泛的应用(陈善春等，1996；Peng et al，2017)。

漫长的进化过程中，物竞天择，适者生存。植物抵抗病原菌的过程中进化出一套复杂的免疫防护系统。病原菌的入侵，会引起柑橘体内活性氧的变化，例如过氧化氢(Almagroet al，2009)。正常状态下，过氧化氢作为一种信号分子存在柑橘体内，一旦感染溃疡病菌后，体内过氧化氢含量迅速增多，这种过氧化物能够营造不利于病菌生活的微环境，同时将信号传递至植物防卫系统的下游，激发抗病基因的表达，从而使柑橘抵抗溃疡病的能力提升。Class III过氧化物酶(Prx)可以维持细胞活性氧的平衡，使得活性氧浓度不会过高而使植物细胞坏死(Li et al，2015)。同时，Class III过氧化物酶也可以参与细胞壁木质素的合成(Kidwai et al，2019)，进而改变细胞壁成分，加固细胞壁这个抵御病原菌入侵的第一道物理屏障。所以，Class III过氧化物酶在提高植物对病害抗性方面具有较大的应用潜力。

发明内容

本发明为提高柑橘对溃疡病的抗性提供一种新的选择，公开一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。该方法将一个编码过氧化物酶的基因的过表达载体整合到柑橘中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。

本发明通过下述技术方案实现：

一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，包括以下步骤：

(1)克隆柑橘CsPrx25基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；

(2)超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株。

其中，步骤(1)中，克隆CsPrx25基因编码序列所采用的引物为OE-CsPrx25-F和OE-CsPrx25-R，分别具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

本发明中，CsPrx25(CDS)具有如SEQ ID NO：11所示核苷酸序列。

进一步的，步骤(1)中，柑橘CsPrx25基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，最后PCR扩增出CsPrx25基因片段。

进一步的，步骤(1)中，超量表达载体构建方法为：以pLGNe为载体，利用KpnⅠ和BamHⅠ酶切目的片段后连接到同样酶切的载体上，构建出超量表达载体。

进一步的，pLGNe载体具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，CaMV 35S启动子为花椰菜花叶病毒启动子，具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

进一步的，步骤(2)中，超量表达载体转化柑橘的方法为：超量表达载体通过电激法转化根癌农杆菌，再用农杆菌介导转化柑橘外植体。

进一步的，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。

进一步的，步骤(2)得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsPrx25基因超量表达与柑橘溃疡病的相关性。

进一步的，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-CsPrx25-F和ID-CsPrx25-R，ID-CsPrx25-F是根据载体上CaMV 35S的一段序列设计而成，ID-CsPrx25-R是基因尾部一段序列设计而成，分别具有如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。

进一步的，PCR验证后，利用实时荧光定量PCR进行CsPrx25基因表达量检测，采用的引物为RT-CsPrx25-F和RT-CsPrx25-R，分别具有如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，定量PCR内参为柑橘Actin基因，采用引物为RT-CsActin-F和RT-CsActin-R，分别具有如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示核苷酸序列。

目前，还没有在柑橘体内增加CsPrx25基因表达量以提高柑橘对溃疡病抗性的报道。可能的原因在于：一、过氧化物酶是个多基因家族，基因数目繁多，功能多样；二、部分柑橘过表达过氧化物酶基因后，园艺性状改变明显。因此获得过量表达CsPrx25且性状不变的转基因植株有一定难度。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明为一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，通过克隆柑橘CsPrx25基因编码序列，进行超量表达载体构建，然后转化柑橘，得到的转基因植株溃疡病发病程度可降低至现有柑橘的63％，能够显著减轻溃疡病发病程度，减小病斑面积，因而得出超量表达CsPrx25基因可一定程度上提高植株对溃疡病的抗性。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明CsPrx25基因植物超量表达载体构建流程图：GUS，β-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV 35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；NOS，冠瘿碱合成酶基因终止子；载体pLGNe具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化过程中对转化子进行GUS染色筛选。

图2为本发明CsPrx25基因在柑橘基因组中重组验证：OE-1、OE-2、OE-3、OE-4分别代表4个转基因植株，WT代表野生型，(下同)。

图3本发明转基因植株表型图。

图4为本发明转基因植株GUS染色图。

图5为本发明转基因植株中CsPrx25基因相对表达量分析图：*表示同野生型比较差异显著(P＝0.05)，(下同)。

图6为本发明转基因柑橘叶片针刺法点样溃疡病菌十天后发病症状图。

图7为本发明转基因柑橘叶片病斑大小统计图。

图8为本发明转基因柑橘叶片发病程度统计图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

本发明实施例以晚锦橙为试验对象，在实际应用中，该方法也能够用于提高其他柑橘品种对溃疡病的抗性。

实施例1

柑橘CsPrx25基因编码序列的克隆

1.RNA提取及cDNA合成

选取柑橘(晚锦橙)叶片0.1g用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱，CATNO：RN09)提取叶片总RNA，用非变性琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，用浓度计测定其浓度。使用Recombinant DNase I合成cDNA(宝生物)，cDNA于-20℃保存备用。

2.CsPrx25基因编码序列的PCR扩增

使用引物OE-CsPrx25-F和OE-CsPrx25-R从柑橘cDNA中扩增获得一个1032bp的片段。扩增的DNA片段经测序分析为柑橘CsPrx25基因编码序列，碱基无突变、缺失。PCR试剂盒采用PrimeS TAR master mix(宝生物)。

扩增体系：10X PCR mix：2.5μL；引物OE-CsPrx25-F(5μmol/L)：1μL；引物OE-CsPrx25-R(5μmol/L)：1μL；cDNA约60ng；加ddH₂O至25μL。

扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

3.DNA片段回收

紫外灯下，用洁净的刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶块。回收方法参照试剂盒的使用说明进行(艾德莱)，回收片段在浓度测试仪上进行定量。

实施例2

超量表达载体的构建并转化农杆菌

载体构建流程图如图1，所有限制性内切酶购自(THERMO)公司，按照使用说明操作。

具体操作如下：将CsPrx25基因编码序列的PCR产物和超表达载体pLGNe用限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ双酶切后回收进行连接过夜，连接采用T4DNA Ligase kit(宝生物)。连接产物转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆提取质粒即得到CsPrx25的超量表达载体。

用电激法将构建的超量表达载体质粒导入根癌农杆菌EHA105。预先取冻存的EHA105农杆菌感受态细胞(50μL)，于冰上融化。加入2μL所构建的超量表达载体的质粒于感受态细胞中，吹打混匀后，冰上放置5min。将混合液转入事先吹干的电击杯底(注意避免产生气泡)，并将电击杯放入卡槽调整到正确位点。将电击装置调节为“Agr”档，按下电击按钮，检查电击数据确保电击成功。加入1mL LB液体培养基至电击杯中，移液枪吹打混匀，移至无菌离心管中，260r/min，28℃摇床振荡培养40min。10000r/min将菌液离心1min，弃上清液(剩约100μL重悬菌体)，重悬后用移液枪打到LK固体培养基上(表达载体含有卡那抗性)，涂布均匀，28℃倒置暗培养2d。待菌斑长出后，挑取单菌落至LK液体培养基中，恒温摇床上(28℃)振荡过夜，菌液用于进行PCR验证。

实施例3

遗传转化柑橘

1.柑橘实生苗上胚轴的获得

取新鲜柑橘(晚锦橙)洗净，用70％酒精表面消毒，在无菌的条件下取出种子，剥掉种皮，接种在种子萌发培养基上萌发，28℃下暗培养2周，然后在16h光照/8h黑暗的光周期下培养1周。无菌条件下取萌发幼苗上胚轴切成1cm左右的茎段，用于根癌农杆菌的遗传转化。

2.根癌农杆菌的制备

用于转染的农杆菌菌液(含CsPrx25超量表达载体)加入30％的无菌甘油保存于-70℃的超低温培养箱中。转染前，在含50mg/L卡那霉素的LK固体培养基上划线培养。挑农杆菌单菌落，接种于25ml含有相同抗生素的LK液体培养基中，28℃震荡培养过夜。次日，测浓度后将菌液稀释成OD值0.1的菌液进行二摇，3h后，待菌液处于对数生长期(OD值为0.5左右)时，于5000r/min离心10min，弃上清，用PH 5.4的MS液体培养基重悬后用于转染。

3.柑橘上胚轴茎段的转化

将切成1cm左右的柑橘(晚锦橙)上胚轴茎段在农杆菌中浸泡13min，期间轻微晃动。取出茎段后将表面的菌液吸干；将茎段转移到共培养培养基中，26℃按培养2d。

4.转化子的筛选

共培养完成后，将上胚轴转移到筛选培养基中，28℃暗培养7d，外植体在28℃、16h光照/8h黑暗培养，每两周继代一次。

5.转化子的成苗培养

待幼苗长到1cm以上时，将其切下后嫁接到无菌试管晚锦橙苗，在成苗培养基中进行培养；待幼苗长到5cm左右时将其嫁接到枳实生苗上，在温室中进行培养。

实施例4

转基因植株验证

1.外源基因整合的PCR检测

取柑橘叶片100mg，使用DNA提取试剂盒(艾德莱，CAT：DN15)提取基因组DNA，PCR检测CsPrx25基因的整合。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min。检测引物为ID-CsPrx25-F和ID-CsPrx25-R，阳性扩增条带为1874bp。PCR结果见图2。经验证得到4个超量表达转基因植株。观察分析4株转基因植株表型，发现除了发育快慢稍有差异，其他外观上看并无明显差异(图3)。由于本发明得到的转基因植株是嫁接得来的，受到与砧木亲和差异或者伤口愈合等因素的影响，且目前发育时间较短，因此本发明认为其发育方面的不是很显著的差异完全可忽略，认为表型与野生型对照无变化，超量表达CsPrx25基因并未对植株的表型和发育产生直接的明显的变化。

2.转基因植株GUS染色鉴定

将转基因植株叶片切成叶圆片(直径7mm)，进行GUS组织化学染色，如图4所示，阳性植株叶圆片边缘显蓝色，野生型植株叶圆片为白色。

实施例5

CsPrx25基因表达量分析

提取柑橘叶片，使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱，CAT：RN09)提取叶片总RNA，用非变性琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，用浓度计测定其浓度。使用RecombinantDNase I合成cDNA(宝生物)。目的基因的检测引物为RT-CsPrx25-F和RT-CsPrx25-R；内参基因Actin的检测引物为RT-CsActin-F和RT-CsActin-R。

反应体积20μL，反应条件：95℃3min，94℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min。实验重复三次。采用2^-△△Ct法计算转基因植株中CsPrx25基因的相对表达量：定义水处理的样本为参照因子，即其CsPrx25的表达水平为1，然后计算转基因柑橘中相对参照因子基因表达的倍数2^-△△Ct，为其相对表达量。检测结果见图5。结果显示，CsPrx25基因在转基因植株中相比野生型植株有高水平表达。

实施例6

转基因植株的抗性评价

采集成熟叶片清洗后用75％的酒精消毒后置于超纯水中冲洗，置于超净台；以叶脉为中心进行针刺，六针为一组，每侧两组；用移液器点样溃疡病菌液，每针孔点样1μL(1X10⁵CFU/mL)。然后将柑橘叶片的叶柄用浸湿的脱脂棉包裹，石蜡带密封于培养皿，于28℃恒温光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)。对照组用LB代替溃疡病菌菌液，其他操作保持一致。叶片点菌后培养10天拍照，用Image J V1.47软件统计病斑面积(Lesion Area,LA,mm²)。根据病情指数公式计算发病程度(Disease Index,DI)。按照病斑面积将病情分为0-7共8级，以字母R表示病斑面积，0级(R≤0.25mm²)，1级(0.25mm²＜R≤0.5mm²)，2级(0.5mm²＜R≤0.75mm²)，3级(0.75mm²＜R≤1mm²)，4级(1.0mm²＜R≤1.25mm²)，5级(1.25mm²＜R≤1.5mm²)，6级(1.5mm²＜R≤1.75mm²)，7级(R＞1.75mm²)；根据公式计算发病程度：DI＝100XΣ【各级病斑数X相应级数值】/(病斑总数X最大级数)。

接种溃疡病菌10天后，转基因植株叶片上病斑大小与野生型柑橘叶片上存在大小差异(图6)。对柑橘叶片上的病斑面积和病情指数进行统计后，发现转基因植株叶片上的病斑面积(图7)和发病程度(图8)均小于野生型柑橘叶片，尤其是OE-2，病情指数仅为野生型柑橘叶片组的63％。

根癌农杆转化所用培养基：

种子萌发培养基：MS+30g/L蔗糖+2.5g/L Gelrite，PH 5.8。

共培养培养基：MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+1mg/L 2，4–D+100μmol AS+30g/L蔗糖+2.5g/L Gelrite，PH 5.8。

筛选培养基：MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+500mg/L Cef+50mg/L Kan+30g/L蔗糖+2.5g/L Gelrite，PH 5.8。

成苗培养基：MS+30g/L蔗糖，PH 5.8。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(1)

<400> 1

ggggtaccat ggcaactgct tcagcttc 28

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(2)

<400> 2

cgggatcctt agataatccc agaccaagcc 30

<210> 3

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(3)

<400> 3

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<210> 4

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人工序列(4)

<400> 4

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ggcaaacaat ga 1812

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(5)

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cgacacgctt gtctactcca 20

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(6)

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<213> 人工序列(10)

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<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(11)

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Claims (10)

1.一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，包括以下步 骤：

（1）克隆柑橘 CsPrx25 基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；

（2）超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株；

CsPrx25 基因的CDS序列如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（1）中，克隆 CsPrx25 基因编码序列所采用的引物对为 OE-CsPrx25-F 和 OE-CsPrx25-R，引物对OE-CsPrx25-F和OE-CsPrx25-R的核苷酸序列分别为如 SEQ ID NO：1 和 SEQ ID NO：2 所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（1）中，柑橘 CsPrx25 基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然 后反转录为 cDNA，最后 PCR 扩增出 CsPrx25 基因编码序列 DNA 片段。

4.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（1）中，超量表达载体构建方法为：以 pLGNe 为载体，利用 KpnⅠ和BamH Ⅰ酶切目的片段后连接到同样酶切的载体上，构建出超量表达载体 pLGNe-CsPrx25。

5.根据权利要求 4 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，pLGNe 载体具有 CaMV 35S 启动子调控下的 GUS 基因，CaMV 35S 启动子为花椰 菜花叶病毒启动子，CaMV 35S 启动子和GUS 基因的核苷酸序列分别为如 SEQID NO：3 和 SEQ ID NO：4 所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（2）中，超量表达载体转化柑橘的方法为：超量表达载体通过电激法转化根 癌农杆菌，再用农杆菌介导转化柑橘外植体。

7.根据权利要求 6 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。

8.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（2）得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定 CsPrx25基因超 量表达与柑橘溃疡病的相关性。

9.根据权利要求 8 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，对转基因植株进行抗性评价前，通过 PCR 验证转基因植 株，采用的引物为 ID-CsPrx25-F 和 ID-CsPrx25-R，ID-CsPrx25-F 是 取自 载体上 CaMV 35S 的一 段序 列， ID-CsPrx25-R 是基因尾部一段序列设计而成，引物ID-CsPrx25-F和ID-CsPrx25-R的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO：5 和 SEQ ID NO：6 所示的核苷酸序列。

10.根据权利要求 9 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，PCR 验证后，利用实时荧光定量 PCR 进行 CsPrx25 基因表达量检测，采用的引物为 RT-CsPrx25-F 和 RT-CsPrx25-R，引物RT-CsPrx25-F 和 RT-CsPrx25-R的核苷酸序列分别为如 SEQ ID NO：7 和 SEQ ID NO：8 所示的核苷酸 序列，实时荧光定量PCR 内参为柑橘 Actin 基因，采用引物为 RT-CsActin-F 和 RT-CsActin- R，引物RT-CsActin-F 和 RT-CsActin- R的核苷酸序列分别为如 SEQ ID NO：9 和 SEQ ID NO：10 所示的核苷酸序列。

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