CN114836439B - 油菜BnaBPA03基因及其调控油菜株型的应用及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程和植物育种技术领域，具体涉及一种油菜BnaBPA03基因及其调控油菜株型的应用及方法。本发明首先克隆了BnaBPA03基因，构建该基因的过表达载体pK7FWG2.0‑BnaBPA03，转化甘蓝型油菜，在油菜中获得了过表达的稳定转化株系，得到分枝角度小、株型紧凑的转基因植株，本发明所获得的转化株，分枝角度更小，叶角也更小，所获得的株型结构更加紧凑；本发明对油菜等经济作物的生产育种具有重要的指导借鉴意义，为改良油菜株型，实现油菜的高密度种植提供了一定的可利用种质资源。

Description

油菜BnaBPA03基因及其调控油菜株型的应用及方法
技术领域
本发明属于植物基因工程和植物育种技术领域，具体涉及一种油菜BnaBPA03基因及其调控油菜株型的应用方法及方法。
背景技术
油菜(Brassica napus L.)是重要的油料作物，是食用植物油和生物燃油的重要来源，也可用作观赏，具有广阔的市场前景。随着人口的增长和对可再生能源需求的增加，市场对菜籽油的需求不断增长，我国油菜产业存在巨大的供需缺口并严重依赖进口。因此，提高油菜产量，提高菜籽油的自给率对于保障我国植物油供给安全具有极其重要的战略意义，油菜的高产育种已成为油菜育种的首要目标。
株型的改良有助于提高作物产量，油菜的分枝角度是决定作物株型的重要因素。分枝角度指的是有效分枝与主茎形成的夹角，是影响油菜产量的重要株型性状。有研究表明，适度紧凑的株型有利于油菜中下部的通风透光、降低病虫害、提高群体光能利用率、提高叶面积系数和抗倒伏性，并且可以适度提高播种密度，对于作物合理密植、提高产量及机械化收获有重要意义。迄今为止，关于分枝角度的研究在拟南芥(分枝角度)、水稻(分蘖角度)、玉米(茎叶夹角)中已有较多研究，并对相关基因进行了克隆和鉴定，但在油菜上的研究较少且尚处于定位阶段，相关基因的克隆及功能分析鲜有报道，仍有待进一步发掘。
发明内容
针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了甘蓝型油菜BnaBPA03基因及其在改善油菜株型中的应用方法及方法。在本发明中，对BnaBPA03基因进行克隆，将其在油菜中过表达后，获得一种株型紧凑的转基因株系。
为达到上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供一种调控油菜株型的BnaBPA03基因，所述BnaBPA03基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
本发明还提供一种重组表达载体pK7FWG2.0-BnaBPA03，所述重组表达载体包括所述基因的核苷酸序列、35S启动子以及eGFP增强型绿色荧光蛋白。
本发明还提供一种重组工程菌，所述菌包括所述的重组表达载体。
本发明还提供一种调控油菜株型的方法，所述方法通过对BnaBPA03基因的过表达来调控油菜株型；所述调控为调控油菜的分枝角度、株高、分枝数量或叶角大小。
进一步的，所述方法包括如下步骤：
根据BnaBPA03基因设计特异引物，扩增包含BnaBPA03基因的cDNA序列，使用Gateway方法构建出重组表达载体pK7FWG2.0-BnaBPA03；进一步的，采用Gateway的方法将BnaBPA03基因序列与携带35S启动子和eGFP的植物表达载体pK7FWG2.0上的ccdb基因发生交换，最终形成pK7FWG2.0-BnaBPA03重组载体；
将重组表达载体pK7FWG2.0-BnaBPA03转化受体菌，得到重组工程菌；其中，所述受体菌为农杆菌GV3101；
将得到的重组工程菌扩大培养，菌液转化油菜下胚轴；
油菜下胚轴愈伤组织培养、诱导再分化，得到油菜转化株。
本发明还提供所述的BnaBPA03基因在调控油菜株型中的应用。
本发明还提供所述重组载体、所述重组工程菌或所述的调控油菜株型的方法在调控油菜株型中的应用；进一步的，所述的应用为调控油菜的分枝角度、株高、分枝数量或叶角大小中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
由于油菜机械化生产水平较低，收获损失率较大，产量少，难以满足生产的需求，且缺乏高产、抗病和适合全程机械化生产的株型优异的油菜新品种。本发明研究油菜株型调控的分子生物学机理，培育适合机械化作业的株型紧凑的优良油菜新品种，对于提高我国油菜机械化生产水平、提高油菜产量、降低油菜生产成本具有极其重要的战略意义。高密度种植是提高单位土地面积作物产量的有效措施，每棵植物生长所需的地上面积主要由侧枝角度、长度决定的。对侧枝角度的研究对于植物的高密度种植策略的应用具有重要意义。
本发明所涉及的基因在油菜中的研究较少，且油菜中有关株型结构的研究较少，尚且处于定位阶段，目前只有极少数基因被克隆。BREVIPEDICELLUS是植物中重要的转录因子，本发明中，在油菜的2个同源基因中，确定了与拟南芥最为相近的基因命名为BnaBPA03，并在油菜中过表达，获得了分枝角度小的油菜种质。
本发明所构建的载体pK7FWG2.0-BnaBPA03同时包含35S启动子原件与增强型绿色荧光蛋白元件，既可以实现对BnaBPA03基因的过量表达，又能表达绿色荧光蛋白，在植物体内观察其亚细胞定位的情况。转化油菜后获得的转化株，为研究基因BnaBPA03的功能及作用机制提供了实验材料，为优化油菜株型结构提供可利用的种质资源。与其它材料相比，通过调控该基因获得油菜的分枝角度更小，平均分枝角度可达15°，并且不仅分枝角度小，叶角(LA)也更小，所获得的株型结构更加紧凑。
本发明涉及的过表达基因BnaBPA03在改善油菜株型中的用途，对油菜等经济作物的生产育种具有重要的指导借鉴意义，为改良油菜株型，实现油菜的高密度种植提供了一定的可利用种质资源。
附图说明
图1为拟南芥中BP基因与甘蓝型油菜BnaBPA03基因的核苷酸及氨基酸序列差异比对图。
图2为甘蓝型油菜BnaBPA03基因组织表达模式分析结果，*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001。
图3为过表达载体pK7FWG2.0-BnaBPA03的构建示意图。
图4为油菜pK7FWG2.0-BnaBPA03过表达株系PCR鉴定结果(左图)及表达量分析结果(右图)；图中，WT：甘蓝型油菜野生型Y127；+：正对照，pK7FWG2.0-BnaBPA03质粒；-：负对照，ddH2O；Marker：Takara DL2000 DNA Marker；左图中1-25：转化植株叶片基因组；右图中#10-#16：PCR鉴定阳性转化株系。
图5为过表达pK7FWG2.0-BnaBPA03 2个阳性转化株系T1代鉴定结果；图中，上图为#12阳性转化株系，1-12为选取的12个检测样本；下图为#16阳性转化株系，1-26为选取的26个检测样本；图中，WT：甘蓝型油菜野生型Y127；+：正对照，pK7FWG2.0-BnaBPA03质粒；-：负对照，ddH2O；Marker：Takara DL2000 DNA Marker。
图6为过表达pK7FWG2.0-BnaBPA03 2个阳性转化株系#12和#16表达量分析结果；图中，左图为BnaBPA03基因在野生型Y127以及过量表达株系#12、#16叶片中的相对表达量；右图为BnaBPA03基因在野生型Y127以及过量表达株系#12、#16根中的相对表达量。
图7为甘蓝型油菜BnaBPA03基因亚细胞定位情况，从左至右依次为明场、绿色荧光、反射光、紫外光(UW)以及合成后的图像；Bar＝20μm。
图8为过表达阳性转化株系与野生型分枝角度对比图及数据统计结果，图A为10周龄的野生型、过量表达植株的株型结构图；图B为油菜成熟期野生型、过量表达植株的株型结构图；图C为野生型Y127与过表达阳性转化株系的株高与分枝角度统计图。
图9为过表达阳性转化株系#12与野生型Y127在分枝数量上表型对比图及数据统计结果，左图为表型图；右图为野生型Y127与过表达阳性转化株系#12分枝数量统计图。
图10为过表达阳性转化株系#16与野生型Y127在叶角上表型对比图及数据统计结果，上图为表型图，图中，A图中a-c为野生型Y127的3个重复，d-f为过表达阳性转化株系#16，B图为植株a的放大图，C图为植株d的放大图；下图为野生型Y127与过表达阳性转化株系#16叶角统计图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规实验方法完成，实施例中所涉及过程都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法均是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂无特殊说明，均以首次表明的内容相同；所涉及到的是试剂、材料等如无特殊说明，均为商业途径获得。
本发明中所采用的培养基及其配方或相关简写表达含义如下所示：
M0培养基：MS粉4.4g/L，蔗糖30g/L，双蒸水定容，调节pH值为5.84-5.88，凝固剂Agar 10g/L，分装，灭菌。
DM培养基：MS粉4.4g/L，蔗糖30g/L，双蒸水定容，调节pH值为5.84-5.88，灭菌，等培养基冷却后加入AS，1L中加入1mL AS(母液100μmol/mL)，4℃低温保存备用，也可以在用时在加入AS。
M1培养基：MS粉4.4g/L，蔗糖30g/L，甘露醇18g/L，2,4-D 1mg/L，KT 0.3mg/L，双蒸水定容，调节pH值为5.84-5.88，凝固剂Agar 10g/L，灭菌，等培养基快冷却时加入AS，1L中加入1mL AS(母液100μmol/mL)，放于4℃冰箱待用，也可以在用时在加入AS。
M2培养基：MS粉4.4g/L，蔗糖30g/L，甘露醇18g/L，2,4-D 1mg/L，KT 0.3mg/L，双蒸水定容，调节pH值为5.84-5.88，凝固剂Agar 10g/L，灭菌后等培养基冷却后加入：特美汀(TMT)300mg/L，STS 150μmol/L(注意现配现用，时间长会有沉淀出现)，卡那霉素25mg/L，然后分装到无菌平皿中。
M3培养基：MS粉4.4g/L，葡萄糖10g/L，木糖0.25g/L，MES 0.6g/L，双蒸水定容，调节pH值为5.84-5.88，凝固剂Agar 10g/L，灭菌后等培养基冷却后加入：ZT 2mg/L，IAA0.1mg/L，特美汀TMT 300mg/L，AgNO3 150μmol/L，卡那霉素25mg/L，然后分装到无菌平皿中。
M4培养基：MS粉4.4g/L，蔗糖10g/L，双蒸水定容，调节pH值为5.84-5.88，凝固剂Agar 8g/L，灭菌，培养基快冷却时加入特美汀TMT 300mg/L，然后分装，为了促进生根可以在培养基快冷却时加入少量生长素IAA。
Spec：奇霉素/壮观霉素
Gen:庆大霉素
Rif:利福平
实施例1：BnaBPA03基因的鉴定及获得
在甘蓝型油菜中，BP基因有2个成员，利用生物信息学方法对这2个成员基因进行分析确定表达量最高、相似度最高的基因为目的基因—BnaA03g23610D(https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)，将其记为BnaBPA03(简述为BnaA03)。
根据“https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/”上的BnaBPA03基因序列设计引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列为：
BnaA03-F(SEQ.ID.NO.3)：5’-ATGGAAGAATATCAACATGAAAGCAGATCC-3’
BnaA03-R(SEQ.ID.NO.4)：5’-TTATGGTCCAAGACGATAAGGACCATC-3’
将油菜Y127(来源于华中农业大学)作为实验材料，温室生长6周左右(生长条件：22±2℃，22h(光照)+2h(黑暗)，60％～70％湿度，光照强度约500μmol/m2·s)，取茎段，液氮速冻，Trizol法提取总RNA，-70℃超低温冰箱保存备用。
以提取的RNA为模板，使用反转录试剂盒III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)Kit进行反转录，该试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
使用高保真酶2×Phanta Max Master Mix(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号为P525-01/02/03)扩增BnaBPA03基因的cDNA序列，PCR反应体系如表1所示。
表1.高保真酶PCR扩增反应体系
PCR反应体系 体积
2×Phanta Max Master Mix 25μL
上游引物(10μM) 2μL
下游引物(10μM) 2μL
模板DNA(50-400ng) 1μL
ddH2O To 50μL
PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s；61.5℃退火15s；72℃延伸1min30s，共进行38个循环；72℃终延伸10min。
PCR反应结束后，将PCR产物点样在1.5％琼脂糖凝胶(质量体积分数)中，120V，400mA，凝胶电泳30min，然后在紫外凝胶成像仪下观察并拍照，记录结果。结果显示，该引物扩增出的目的片段，即BnaBPA03，该基因片段的大小为1200bp左右。
参照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中操作说明，从琼脂糖凝胶中回收PCR扩增产物，然后将回收的PCR扩增产物，即BnaBPA03基因连接到pMD19-T载体上(购自宝生物工程(大连)有限公司)，连接体系为：4.5μL胶回收产物、0.5μL pMD-19T载体、5μL SolutionⅠ(购自宝生物工程(大连)有限公司)，16℃，过夜连接。
向33μL大肠杆菌感受态细胞(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)中加入10μL的连接产物，热激法转化大肠杆菌，涂布于含Amp(终浓度为30mg/mL)的LB固体培养基平板上筛选阳性克隆，37℃倒置培养12-16h，挑取若干单菌落于1.5mL EP管中，其中含有400mL含Amp(终浓度为30mg/mL)的LB液体，震荡培养12-16h，取2μL菌液作为模板PCR扩增进行鉴定，PCR反应的引物为：
M13-F(SEQ.ID.NO.5)：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’
M13-R(SEQ.ID.NO.6)：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
PCR扩增反应体系如表2所示，PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共进行28个循环；72℃终延伸10min。
表2.菌液PCR扩增反应体系
PCR反应体系 体积
2×r Taq Premix 25μL
上游引物(10μM) 2μL
下游引物(10μM) 2μL
模板DNA(50-400ng) 1μL
ddH2O To 20μL
将PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测DNA片段为1200bp左右，选取大小正确、条带清晰且明亮的阳性单克隆送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将实际测序结果与预测序列进行比对分析，选取序列相似度最高且具有3个以上重复结果的单克隆，菌液扩大培养，甘油保藏法保菌并将菌液存放于-70℃超低温冰箱后，利用剩余的菌液提取质粒，即得到载体pMD19-T-BnaBPA03，质粒-20℃冷冻保存，以便后续的实验研究。
经测序验证，该实施例获得了目的基因，即BnaBPA03，图1为所扩增的甘蓝型油菜BnaBPA03基因与拟南芥中BP基因的核苷酸序列差异比对图，本发明分离得到的甘蓝型油菜BnaBPA03基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。
SEQ.ID.NO.1：
ATGGAAGAATATCAACATGAAAGCAGATCCACTCCTCATAGAGTAAGTTTCTTGTACTCTCCAATCTCTTCTTCCAACAAAAATGATAACACCACCACCAACAACAATAATACCAATTATGGTTCTGGTTACAATAATACTAATAACAATAATCATCAACAACACATGTTGTTCCCACATATGAGCTCTCTTCTTCCTCAAACGACTGAGAATTGCTTCCGATCCGATCATGATCAGCCAACCAACGCATCTGTTAAATCAGAAGCAAGCTCCTCAAGAATCAATCACTACTCTATGTTGATGAAAGCCATCCACAATACTCAAGAAGCTAACAACAACAACAACAACAATGATATGGAATCCATGAAAGCTAAGATCATCGCTCATCCGCACTACTCCACCCTCCTACACGCCTACTTGGACTGCCAGAAGATTGGAGCACCACCTGAAGTGGTTGATAAAATTACGGCGGCAACACAAGAGTTCGAGGCGAGGCAGCAGCGGCCAACAGCATCCGTAACTGCGCTGTCTAGAGACCCCGAATTGGATCAATTCATGGAAGCATACTGTGATATGCTGGTTAAATATCGAGAGGAGCTAACACGGCCCATTGAAGAAGCAATGGAGTATATACGTCGTATTGAATCTCAGATTAGCATGTTGTGTCAGGGTCCCATTCACATCCTCAACAATCCTGATGGGAAAAGTGAAGGAATGGAATCATCAGACGAAGAGCAAGATAATAACAACAGTGGAGGGGAAGCAGAATTACCGGAAATAGACCCGAGGGCGGAAGATCGGGAACTCAAGAATCACTTGCTGAAGAAGTACAGTGGATACTTGAGCAGTCTAAAGCAAGAACTGTCCAAGAAAAAAAAGAAAGGTAAACTTCCCAAAGAAGCAAGGCAGAAGCTTCTCACGTGGTGGGAATTGCATTACAAGTGGCCGTATCCTTCTGAGTCAGAGAAGGTGGCGTTGGCGGAATCAACGGGGTTAGATCAGAAACAGATCAACAATTGGTTCATAAACCAAAGAAAACGTCACTGGAAACCGTCCGAAGACATGCAGTTCATGGTGATGGATGGTCTACAGCACCCGCACCACGCAGCTCTATACATGGATGGTCATTACATGGGCGATGGTCCTTATCGTCTTGGACCATAA
SEQ.ID.NO.2：
MEEYQHESRSTPHRVSFLYSPISSSNKNDNTTTNNNNTNYGSGYNNTNNNNHQQHMLFPHMSSLLPQTTENCFRSDHDQPTNASVKSEASSSRINHYSMLMKAIHNTQEANNNNNNNDMESMKAKIIAHPHYSTLLHAYLDCQKIGAPPEVVDKITAATQEFEARQQRPTASVTALSRDPELDQFMEAYCDMLVKYREELTRPIEEAMEYIRRIESQISMLCQGPIHILNNPDGKSEGMESSDEEQDNNNSGGEAELPEIDPRAEDRELKNHLLKKYSGYLSSLKQELSKKKKKGKLPKEARQKLLTWWELHYKWPYPSESEKVALAESTGLDQKQINNWFINQRKRHWKPSEDMQFMVMDGLQHPHHAALYMDGHYMGDGPYRLGP
实施例2：BnaBPA03基因的表达模式及亚细胞定位
为了探究基因BnaBPA03在甘蓝型油菜各组织中的差异表达及其在细胞中的定位情况，首先采用qRT-PCR技术检测了BnaBPA03在甘蓝型油菜各组织中的表达量，本实施例中采用的植株材料为Y127，选取盛花期的各组织，取样速冻后，按照实施例1中的方法提取各组织RNA并合成cDNA。
根据BnaBPA03基因序列的非保守区设计实时荧光定量PCR引物，引物序列为：
BnaA03-Q-F(SEQ.ID.NO.7)：5’-AGCCATCCACAATACTCAAGAA-3’
BnaA03-Q-R(SEQ.ID.NO.8)：5’-CGCCGTAATTTTATCAACCACT-3’
选取甘蓝型油菜Actin基因(GenBank：AF111812.1)作为内参基因，内参引物序列为：
Actin-QF(SEQ.ID.NO.9)：5’-TGTTGCTATCCAGGCTGTTCTTTC-3’
Actin-QR(SEQ.ID.NO.10)：5’-GATAGCGTGAGGAAGAGCATAACC-3’
以Y127各个组织的cDNA为模板，根据AceQTM Universal SYBRMaster Mix试剂盒说明书进行qRT-PCR，反应体系如表3所示，实验数据采用GraphPad Prism 7软件作图处理。
表3.qRT-PCR扩增反应体系
qRT-PCR反应程序如表4所示。
表4.qRT-PCR扩增反应程序
反应结束后，将实验得到的数据使用2－△△CT法将程序输出的Ct值换算成相对表达量，用GraphPad Prism 7软件作图，使用T-test进行表达量差异显著性分析，其中，***即P<0.001，**即P<0.01，*即P<0.05。使用GraphPad Prism 7软件分析数据并作图可得图2，从图中可以看出，BnaBPA03在茎和花梗中的表达量较高，约为花中的3倍，在根中的表达量约为花中的1.5倍，在叶片中几乎不表达。基因的表达部位与其功能息息相关，茎、根是双子叶植物的重力信号感受器官，与植物的分枝角度有关，茎的伸长又与植物的株高密切相关，BnaBPA03在油菜的根、茎及花梗中表达较高，说明该基因很有可能参与调控油菜的株型结构。
实施例3：BnaBPA03基因过量表达载体的构建
本实施例使用Gateway的方法，在上游引物的5’加CACC序列，并且为了表达绿色荧光蛋白，在扩增BnaBPA03基因序列时，去掉了终止子。引物序列设计如下：
2.0-A03-F(SEQ.ID.NO.11)：5’-CACCATGGAAGAATATCAACATGAAAGCAGATCC-3’
2.0-A03-R(SEQ.ID.NO.12)：5’-TGGTCCAAGACGATAAGGACCATCGCCC-3’
首先，将实施例1中所获得的菌液从-70℃超低温冰箱中取出，活化，提质粒。利用高保真酶2×Phanta MAX Master Mix(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，以所提取的质粒为模板，扩增BnaBPA03基因序列，与实施例1不同的是，本次扩增所获得的片段在ATG起始密码子前端多了CACC四个碱基，在序列末端缺少了TAA终止密码子。扩增结束后，制备1.5％的琼脂糖凝胶，120V，400mA进行琼脂糖凝胶电泳，然后按照实施例1中的操作进行胶回收，随后进行入门克隆BP反应。
入门克隆BP反应的总体系为3μL，具体各组分如下：
入门载体pENTR-D-ToPo 0.5μL，Salt Solution 0.5μL，PCR回收产物与入门载体pENTR-D-ToPo的摩尔比为2：1，ddH2O补齐至3μL。22℃，温育2h后，转化DH5α感受态细胞(购于南京诺唯赞生物技术有限公司)，挑取若干单克隆至1.5mL的EP管中，里面装有400μL的Kan抗性的液体LB，摇培4h后，使用r Taq酶，通用引物M13-F/M13-R进行菌液PCR鉴定，目的条带约1400bp，琼脂糖凝胶电泳后成像将条带大小正确的菌液扩大培养，甘油保藏法保菌后，利用剩余的菌液提取质粒，将该质粒与终载体pK7FWG2.0进行LR重组反应。
反应体系总共10μL，具体各个组分如下：
BP反应后得到的入门载体pENTR-BnaBPA03-ToPo 150ng，终载体pK7FWG2.0150ng，LR ClonaseTM II Enzyme 2μL，TE buffer补齐至10μL。25℃温育1h后，加入1μL的蛋白激酶K solution，37℃温育10min，再次转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购于南京诺唯赞生物技术有限公司)，使用35S-F/2.0-A03-R进行菌液PCR鉴定，选取条带大小正确、明亮无杂带的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的菌液扩大培养，保菌并提取质粒，过表达BnaBPA03基因的载体pK7FWG2.0-BnaBPA03构建成功，载体示意图如图3所示。
将重组载体pK7FWG2.0-BnaBPA03转化到农杆菌GV3101感受态细胞(购于上海尚亚生物技术有限公司)，转化成功的阳性克隆扩大培养后使用甘油保藏法将菌液存于-70℃超低温冰箱备用。
实施例4：pK7FWG2.0-BnaBPA03重组载体转化甘蓝型油菜(Brassica napus)
播种：为了快速获得所需的油菜新种质，选取无需春化、可快速生长的甘蓝型油菜Y127(种子来自华中农业大学洪登峰教授课题组)作为转化材料。
首先，选取一定量饱满的油菜种子，放在10mL离心管中备用。75％的酒精消毒30s，期间上下翻转离心管，使种子与酒精充分接触。倒掉酒精，加入适量无菌水冲洗3-5遍；再加入15％bleach溶液(配制为8.115mL无菌水+1.875mL次氯酸钠+10μL曲拉通)，浸泡6min，期间将离心管上下翻转。污染较重的种子酒精消毒和灭菌的时间可以适当延长，但时间过长会影响种子发芽。随后吸掉消毒液，加入适量无菌水冲洗3-5遍，每次均上下翻转，并始终保持离心管内为无菌环境。最后吸掉无菌水，尽可能将无菌水吸干。用烧好的无菌镊子将已消毒的种子播到M0培养基上，每瓶25-30粒左右，置于无菌、黑暗的培养箱24℃培养6天，即可获得所需长度的油菜下胚轴。为了使下胚轴在经受农杆菌侵染后仍能保持一个良好的状态，可在侵染前暗光培养一天。
菌液准备：播种5-7天后用液体LB培养基培养实施例3中得到的含有pK7FWG2.0-BnaBPA03质粒的农杆菌，具体培养方式如下：在5mL抗性LB培养基(加入50mg/L spec+50mg/L Gen+50mg/L Rif)中加入20μL含有pK7FWG2.0-BnaBPA03质粒的农杆菌，于28℃、180-220rpm摇床中培养约14-16h。
由于农杆菌在培养液中繁殖速度与其活性有关，而在对数期繁殖状态下的农杆菌活力最好，最易侵染植物，所以要严格计算好接菌时间。选择间隔2h重复接菌，如分别18:00、20:00接菌，次日早8:00挑选合适浓度，能够防止出现细菌浓度过高的情况。摇菌之前要挑选阳性单菌落在抗性平板上接种细菌，28℃下培养48h，等到阳性细菌在平板上繁殖出单菌落后用10μL枪头挑取该单菌落在培养液中反复吹打几次，使得菌均匀生长。
侵染及共培养：准备好共培养培养基M1和DM液，M1培养基经过121℃15min灭菌后快冷却(约50℃)时加入乙酰丁香酮AS(终浓度100μM)，DM液也加入AS(终浓度100μM)，记为DM(AS+)，备用。
采用分光光度计测三抗LB液体培养基(上面所述的LB培养基加入spec+Gen+Rif)中摇培的菌的OD值，选取OD值为0.4左右时的菌液较好，一般摇菌14-16小时即可。吸取2mL培养好的菌液到无菌离心管中，3000rpm 3min离心，弃上清；然后加入2mL DM(AS+)液悬浮，3000rpm 3min离心，弃上清；再加入2mL的DM(AS+)液悬浮，放4℃冰箱备用。
用无菌解剖剪刀剪取播种后生长出来的油菜下胚轴，切成0.8cm-1.0cm的小段，放在含有18mL的DM液体的培养皿中，等下胚轴全部切成小段后，再倒入2mL上述用DM(AS+)液重悬后的菌液，这时皿里液体体积为20mL，浸染10-15min(时间不能长，不然外植体易死亡)，隔段时间摇晃1次，4～5次即可。当侵染8min时开始用移液器吸掉DM(AS+)菌液，用无菌镊子夹取外植体到无菌滤纸上放置片刻，吸走外植体上多余的菌液，然后将外植体再转到M1固体培养基中，外植体暗光下24℃放置或放在光照培养室避光处。
选择培养及愈伤诱导：将在M1培养基中培养36-48h的外植体转入到M2培养基中，培养条件为24℃，光照16h、黑暗8h的方式交替培养，2-3周诱导愈伤。
再分化：将外植体转到M3培养基中，每2-3星期继代一次，直至出现绿芽。
生根培养：将有完整生长点的绿芽转入M4培养基中长大生根，约需要20天。生根后，可以直接放置培养间进行炼苗，待苗状态稳定后，从培养基中取出，取苗过程中不要破坏植物的根系，然后将苗移到土壤中培养，培养时需要用保鲜膜保湿1-2周，即可获得等待鉴定的转基因油菜。
实施例5：转化植株的PCR鉴定以及BnaBPA03基因表达量检测
待实施例4中的转化油菜植株生长稳定后，采取CTAB法提取转基因油菜叶片中的DNA，具体步骤如下：
取少量叶片放入1.5mL离心管中，使用液氮进行研磨，研磨成干粉后，加入600μLCTAB，然后将样品放入65℃水浴锅中孵育60min。
等待孵育完成后，在管中加入600μL氯仿/异戊醇(体积比为24:1)溶液，剧烈震荡，充分除去蛋白质，然后放入离心机中12000g离心10min。
离心后轻轻取出离心管，此时溶液分为三层，依次是水相、叶片碎片杂质层、有机相，吸取400-500μL上清水相，转移到新的离心管中，然后向上清中加入400-500μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，接着将样品放入-20℃冰箱中冷却至少10min，以使异丙醇更加有效沉淀DNA。
将离心管放入离心机中，室温下12000g离心10min。
离心后弃上清，加入700μL预冷的体积分数为70％乙醇洗涤，弹起沉淀，轻轻颠倒洗涤，12000g瞬旋。
离心后弃上清，用移液器吸去乙醇溶液，然后在超净台风干沉淀，去除挥发性有机溶液。
向离心管中加入50-100μL ddH2O溶解沉淀，放入37℃水浴锅中30min，得到基因组样品。
取1μL基因组样品测定浓度，检测合格后，将基因组样品放入-20℃冰箱中备用。
将上述步骤中得到的基因组样品为模板，pK7FWG2.0-BnaBPA03质粒为正对照，以未经过遗传转化的受体材料DNA和ddH2O为负对照，根据pK7FWG2.0载体上的35S启动子和自身引物R为鉴定引物进行PCR鉴定，退火温度为61.5℃，其他PCR扩增反应程序以及条件与表2菌液PCR反应相同，引物序列如下：
35S-F(SEQ.ID.NO.5)：5’-CTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’
2.0-A03-R(SEQ.ID.NO.12)：5’-TGGTCCAAGACGATAAGGACCATCGCCC-3’
待PCR完成后，将扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，使用紫外凝胶成像仪成像，记录结果。选取条带清晰、明亮且大小正确的植株根据实施例1中的方法进行BnaBPA03基因的表达量检测。图4为经过转化得到阳性株叶片基因组的PCR鉴定胶图以及表达量分析。从图中可以看出，经PCR鉴定后，获得了12株PCR阳性株系，图中表现为条带亮度较高，条带大小符合预期，从这12株中挑取4株，#3、#9、#12、#16进行表达量检测，如图4所示，4个株系BnaBPA03基因的表达量均显著高于野生型。因此说明实施例3中所构建的过量表达载体成功转入到油菜中，共获得了4株鉴定成功的过量表达阳性株，其中#12和#16两个株系表达量最高，因此选取#12和#16过表达株系对它们T1代植株进行鉴定PCR鉴定以及表达量分析，结果如图5和图6所示，阳性T1代植株被用于后续的研究。
实施例5：BnaBPA03亚细胞定位观察
pK7FWG2.0-BnaBPA03载体在目的基因BnaBPA03的3’端融合了绿色荧光蛋白，因此也可以观察BnaBPA03在油菜中的亚细胞定位情况。在获得阳性转化植株后，提取#16株系叶片的原生质体，制备临时装片，使用荧光显微镜观察BnaBPA03蛋白在油菜中的亚细胞定位情况，Y127叶片的原生质体作为负对照。具体操作如下：
取生长四周左右的过表达BnaBPA03基因阳性转化T1代植株真叶，用水清洗干净并吸干水分，使用刀片将叶片切割成规则的矩形，尽可能的避开叶脉。
将切割好的叶片放入含有2mL细胞壁解离液的注射器中，反复加压。
而后将解离液及叶片转移至2mL EP管中，24℃避光消化2-4h，期间每隔一小时上下缓慢颠倒一次。
解离完成后，用镊子夹取叶片在解离液中轻轻晃动，使原生质体脱离叶片，600rpm，3min离心，弃上清。
避光加入2mL含1μL核染液的无酶液，染色30sec-1min，期间轻轻上下颠倒使染液充分混匀。染色完毕后立即离心，600rpm，3min，弃上清，加入2mL不含染料的无酶液清洗，再次600rpm，3min离心。清洗2-3次即可。其中，核染液是1μL 10mg/mL Hoechst加至10mL无酶液中，涡旋混匀，4℃避光保存备用。
使用移液器吸取并弃去1.8mL上清液，留约200μL液体重悬原生质体。
制片并使用荧光显微镜观察。取制备好的原生质体液体滴在载玻片上，轻轻从一侧盖上盖玻片，注意不要产生气泡，用荧光显微镜进行观察。以野生型Y127的原生质体作为对照组。
如图7所示，Y127原生质体中并没有观察到绿色荧光，而从过量表达株系原生质体的细胞核中观察到很强的绿色荧光，表明BnaBPA03基因定位在细胞核中，这与转录因子在细胞核中调节基因转录的一致。
实施例5：过表达BnaBPA03基因的阳性转化株系分枝角度测量统计
对野生型以及两个过量表达株系T1代的植株进行观察，观察到相同时期生长十周左右的植株，过量表达植株的株型紧凑，叶角明显小于野生型，如图8A所示。在油菜成熟期，过量表达植株株高均高于野生型，分枝角度小于野生型，株型紧凑，如图8B所示。对野生型以及2个过量表达株系T1代植株的分枝角度、株高进行统计，结果如图8C所示。数据表明，野生型Y127的平均株高约为70cm，与野生型相比，过量表达植株株高较高，约为90cm，另外过量表达植株的分枝角度相对较小，约为野生型的1/2，分枝角度15°左右，株型紧凑。对野生型以及2个过量表达株系T1代植株的分枝数量和叶角(茎与叶片的夹角，用角度°度量)也进行统计，结果表明，与野生型相比，过表达株系T1代的植株叶角明显小于野生型，分枝数量显著增加，如图9-10所示。述实验结果可以说明BnaBPA03是甘蓝型油菜中重要的转录因子，定位在细胞核中，对甘蓝型油菜的株型结构起重要的调控作用，为改良油菜株型，实现油菜的高密度种植提供了一定的可利用种质资源。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 油菜BnaBPA03基因及其调控油菜株型的应用及方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1164
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 1
atggaagaat atcaacatga aagcagatcc actcctcata gagtaagttt cttgtactct 60
ccaatctctt cttccaacaa aaatgataac accaccacca acaacaataa taccaattat 120
ggttctggtt acaataatac taataacaat aatcatcaac aacacatgtt gttcccacat 180
atgagctctc ttcttcctca aacgactgag aattgcttcc gatccgatca tgatcagcca 240
accaacgcat ctgttaaatc agaagcaagc tcctcaagaa tcaatcacta ctctatgttg 300
atgaaagcca tccacaatac tcaagaagct aacaacaaca acaacaacaa tgatatggaa 360
tccatgaaag ctaagatcat cgctcatccg cactactcca ccctcctaca cgcctacttg 420
gactgccaga agattggagc accacctgaa gtggttgata aaattacggc ggcaacacaa 480
gagttcgagg cgaggcagca gcggccaaca gcatccgtaa ctgcgctgtc tagagacccc 540
gaattggatc aattcatgga agcatactgt gatatgctgg ttaaatatcg agaggagcta 600
acacggccca ttgaagaagc aatggagtat atacgtcgta ttgaatctca gattagcatg 660
ttgtgtcagg gtcccattca catcctcaac aatcctgatg ggaaaagtga aggaatggaa 720
tcatcagacg aagagcaaga taataacaac agtggagggg aagcagaatt accggaaata 780
gacccgaggg cggaagatcg ggaactcaag aatcacttgc tgaagaagta cagtggatac 840
ttgagcagtc taaagcaaga actgtccaag aaaaaaaaga aaggtaaact tcccaaagaa 900
gcaaggcaga agcttctcac gtggtgggaa ttgcattaca agtggccgta tccttctgag 960
tcagagaagg tggcgttggc ggaatcaacg gggttagatc agaaacagat caacaattgg 1020
ttcataaacc aaagaaaacg tcactggaaa ccgtccgaag acatgcagtt catggtgatg 1080
gatggtctac agcacccgca ccacgcagct ctatacatgg atggtcatta catgggcgat 1140
ggtccttatc gtcttggacc ataa 1164
<210> 2
<211> 387
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 2
Met Glu Glu Tyr Gln His Glu Ser Arg Ser Thr Pro His Arg Val Ser
1 5 10 15
Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ser Ser Ser Asn Lys Asn Asp Asn Thr Thr
20 25 30
Thr Asn Asn Asn Asn Thr Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Asn Asn Thr Asn
35 40 45
Asn Asn Asn His Gln Gln His Met Leu Phe Pro His Met Ser Ser Leu
50 55 60
Leu Pro Gln Thr Thr Glu Asn Cys Phe Arg Ser Asp His Asp Gln Pro
65 70 75 80
Thr Asn Ala Ser Val Lys Ser Glu Ala Ser Ser Ser Arg Ile Asn His
85 90 95
Tyr Ser Met Leu Met Lys Ala Ile His Asn Thr Gln Glu Ala Asn Asn
100 105 110
Asn Asn Asn Asn Asn Asp Met Glu Ser Met Lys Ala Lys Ile Ile Ala
115 120 125
His Pro His Tyr Ser Thr Leu Leu His Ala Tyr Leu Asp Cys Gln Lys
130 135 140
Ile Gly Ala Pro Pro Glu Val Val Asp Lys Ile Thr Ala Ala Thr Gln
145 150 155 160
Glu Phe Glu Ala Arg Gln Gln Arg Pro Thr Ala Ser Val Thr Ala Leu
165 170 175
Ser Arg Asp Pro Glu Leu Asp Gln Phe Met Glu Ala Tyr Cys Asp Met
180 185 190
Leu Val Lys Tyr Arg Glu Glu Leu Thr Arg Pro Ile Glu Glu Ala Met
195 200 205
Glu Tyr Ile Arg Arg Ile Glu Ser Gln Ile Ser Met Leu Cys Gln Gly
210 215 220
Pro Ile His Ile Leu Asn Asn Pro Asp Gly Lys Ser Glu Gly Met Glu
225 230 235 240
Ser Ser Asp Glu Glu Gln Asp Asn Asn Asn Ser Gly Gly Glu Ala Glu
245 250 255
Leu Pro Glu Ile Asp Pro Arg Ala Glu Asp Arg Glu Leu Lys Asn His
260 265 270
Leu Leu Lys Lys Tyr Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Gln Glu Leu
275 280 285
Ser Lys Lys Lys Lys Lys Gly Lys Leu Pro Lys Glu Ala Arg Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Thr Trp Trp Glu Leu His Tyr Lys Trp Pro Tyr Pro Ser Glu
305 310 315 320
Ser Glu Lys Val Ala Leu Ala Glu Ser Thr Gly Leu Asp Gln Lys Gln
325 330 335
Ile Asn Asn Trp Phe Ile Asn Gln Arg Lys Arg His Trp Lys Pro Ser
340 345 350
Glu Asp Met Gln Phe Met Val Met Asp Gly Leu Gln His Pro His His
355 360 365
Ala Ala Leu Tyr Met Asp Gly His Tyr Met Gly Asp Gly Pro Tyr Arg
370 375 380
Leu Gly Pro
385
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaagaat atcaacatga aagcagatcc 30
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttatggtcca agacgataag gaccatc 27
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaaaacgac ggccag 16
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggaaacag ctatgac 17
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agccatccac aatactcaag aa 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgccgtaatt ttatcaacca ct 22
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgttgctatc caggctgttc tttc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatagcgtga ggaagagcat aacc 24
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caccatggaa gaatatcaac atgaaagcag atcc 34
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggtccaaga cgataaggac catcgccc 28

Claims (10)

1.调控油菜株型的BnaBPA03基因，所述BnaBPA03基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.重组表达载体pK7FWG2.0-BnaBPA03，所述重组表达载体包括权利要求1所述基因的核苷酸序列。
3.重组工程菌，所述菌包括权利要求2所述的重组表达载体。
4.一种调控油菜株型的方法，其特征在于，所述方法通过对BnaBPA03基因的过表达来调控油菜株型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
根据BnaBPA03基因设计特异引物，扩增包含BnaBPA03基因的cDNA序列，使用Gateway方法构建出重组表达载体pK7FWG2.0-BnaBPA03；
将重组表达载体pK7FWG2.0-BnaBPA03转化受体菌，得到重组工程菌；
将得到的重组工程菌扩大培养，菌液转化油菜下胚轴；
油菜下胚轴愈伤组织培养、诱导再分化，得到油菜转化株。
6.根据权利要求5所述的方法，其他在于，所述受体菌为农杆菌GV3101。
7.根据权利要求4所述的方法，其他在于，所述调控为调控油菜的分枝角度、株高、分枝数量或叶角大小。
8.权利要求1所述的基因在调控油菜株型中的应用。
9.权利要求2所述重组载体、权利要求3所述重组工程菌或权利要求4-7任一项所述的方法在调控油菜株型中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述应用为调控油菜的分枝角度、株高、分枝数量或叶角大小中的应用。
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NCBI.NCBI Reference Sequence: XM_013825446.2.GenBank.2017,第1-2页. *
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