CN117700509A - TaPIF5基因在调控小麦株型中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TaPIF5基因在调控小麦株型中的应用。本发明提供了TaPIF5蛋白或其相关生物材料在调控植物株型中的应用。所述TaPIF5蛋白为如下任一：(A1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1或经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(A2)与(A1)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(A3)在(A1)‑(A2)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。与野生型相比，过表达TaPIF5后，株高降低、有效分蘖数增加。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种TaPIF5基因在调控小麦株型中的应用。
背景技术
普通小麦(Triticum aestivum L.)作为人类的主粮之一，为人类饮食提供热量的同时也是微量营养元素的重要来源。随着世界人口的增长，对小麦的需求量不断增加，小麦高产稳产的保持需要在株型上有新的突破。因此，明确关键基因在调控小麦株型方面的功能，发掘优异等位变异，解析其调控网络，为最终实现抗逆小麦新品种的培育及株型的改良提供理论基础。
作物株型是指与作物产量或植物体空间排列有关的形态特征，包括株高、分枝数、分枝角度、穗形、叶角等。株型反映作物群体结构与群体光合态势，为实现作物高产的需求，需将株型与群体紧密结合，培育高光合产物、低消耗、分配合理的株型，进而对源库流和产量之间的关系进行协调。在二倍体野生近缘种演变为现代六倍体品种的漫长进化过程中，小麦经历了复杂的环境变化以及人工选择压，株型逐渐从松散型向紧凑型演变，小麦的理想株型也逐渐优化为上细下粗的“金字塔”型，即茎秆粗壮、韧性好、上部节间细长、株高和有效分蘖数适宜。
碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子是植物第二大转录因子家族，其参与植物多个生长发育过程的调控的响应。光敏色素互作因子(Phytochromeinteracting factors，PIFs)是属于bHLH转录因子家族的一个亚家族，目前已知PIFs转录因子在植物生长发育及调控光形态建成方面发挥重要作用，但PIF转录因子在调控小麦株型方面的研究还非常有限。因此，进一步挖掘PIF转录因子在调控小麦株型方面的影响具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控小麦株型。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了TaPIF5蛋白或其相关生物材料在调控植物株型中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；
所述TaPIF5蛋白为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
所述植物株型包括植物株高和/或分蘖数。所述调控为降低植物株高和/或增加植物分蘖数。
本发明还提供了TaPIF5蛋白或其相关生物材料在培育株高降低和/或分蘖数增加的植物中的应用。
本发明还提供了一种培育株高降低和/或分蘖数增加的转基因植物的方法，包括如下步骤：使受体植物中TaPIF5蛋白的含量和/或活性提高，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比株高降低和/或分蘖数增加；
所述TaPIF5蛋白为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
本发明还提供了一种培育株高降低和/或分蘖数增加的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中TaPIF5蛋白编码基因的表达量，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比株高降低和/或分蘖数增加；
所述TaPIF5蛋白为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
所述提高受体植物中TaPIF5蛋白编码基因的表达量为向受体植物中导入能够表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子；
进一步地，所述能够表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子是通过含有表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子的重组载体导入目的植物中的。
所述方法中还包括向受体植物中导入抑制表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子作为对照，通过该方法获得的转基因植物株高升高和/或分蘖数降低；进一步地，所述抑制表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子是通过含有抑制表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子的重组载体导入目的植物中的。
所述能够表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子为如下任一所述的DNA分子：
(B1)SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述TaPIF5蛋白的DNA分子；
(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaPIF5蛋白的DNA分子。
所述植物为单子叶植物；进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；更进一步地，所述禾本科植物为小麦。
本研究对小麦TaPIF5基因展开研究，通过转基因材料的创制、表型鉴定、表达模式分析、亚细胞定位以及酵母自激活验证等对TaPIFs在小麦中的功能进行初步研究。以冬性小麦‘科农199’为受体分别过表达这4个基因发现：与野生型相比，过表达TaPIF5后，株高降低，有效分蘖数增加。
附图说明
图1为TaPIF5的基因结构；
图2为TaPIF5与其他物种同源蛋白的系统进化树；
图3为TaPIF5与其他物种同源蛋白的保守结构域分析；其中，y轴表示氨基酸叠加的高度，高度体现该位点序列的保守程度，字母代表相应氨基酸，字母的高度体现相应氨基酸在该位点的出现频率；
图4为TaPIF5目的片段以及各个表达载体的PCR电泳图。其中M：MarkerⅢ；a：1：TaPIF5目的片段；b：1-5：TaPIF5-110-Flag表达载体菌液的PCR产物；
图5为转基因材料表型观察及统计；
图6为TaPIFs在过表达株系中的相对表达水平；其中(a)KN199以及TaPIF5-OE过表达株系分蘖基部组织中TaPIF5的表达量。(b)KN199以及TaPIF5-SRDX过表达株系分蘖基部组织中TaPIF5的表达量。TaGAPDH基因是内参基因。误差线表示±SD(**P<0.01，标准t检验)；
图7为TaPIF5在小麦原生质体中的亚细胞定位；
图8为转录因子TaPIFs转录活性分析。注：(a)TaPIF5蛋白分段示意图。TaPIF5-NT代表TaPIF5的N端；TaPIF5-M代表TaPIF5的中间区域；TaPIF5-CT代表TaPIF5的C端；(b)TaPIF5全长及分段转录活性分析。SD-Trp-Leu代表缺乏色氨酸(Trp)和亮氨酸(Leu)的二缺酵母培养基；SD-Trp-Leu-His-Ade代表缺乏色氨酸(Trp)、亮氨酸(Leu)、组氨酸(His)和腺嘌呤的四缺酵母培养基。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
植物材料
科农199(‘KN199’)是由中国科学院遗传与发育生物学研究所培育的国审小麦品种，其株型紧凑，分蘖力强，抗寒性好，遗传转化效率高，用于构建TaPIF5-Flag及TaPIF5-SRDX转基因株系。
种植方法
转基因T0代植株和作为对照的科农199种植于本实验室人工气候室中20×20cm花盆内，培养条件为16h光照/8h黑暗，18-25℃，湿度为65％。转基因T1代及T2代植株种植于中国农业科学院作物科学研究所旱棚内，行距30cm，行长2m，每行人工点播15粒种子。
载体与菌株
载体：用作亚克隆的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector购自北京全式金生物技术有限公司；用作酵母自激活实验的pGBKT7载体和亚细胞定位实验的pAN580载体由本实验室保存。
pWMB110载体引用文献：“Dong H,Li D,Yang R,Zhang L,Zhang Y,Liu X,Kong X,Sun J.GSK3 phosphorylates and regulates the Green Revolution protein Rht-B1bto reduce plant height in wheat.Plant Cell.2023May 29；35(6):1970-1983.doi:10.1093/plcell/koad090.PMID:36945740；PMCID:PMC10226569”.菌株：从北京全式金生物技术有限公司购买用作基因克隆的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Trans-T1；从北京庄盟国际生物基因科技有限公司购买用作小麦遗传转化的根癌农杆菌(Agrobacterium)菌株EHA105。
酶及其他化学试剂
使用TOYOBO公司购买的高保真酶KOD FX Neo进行PCR实验；使用北京酷来搏科技有限公司购买的CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)提取DNA；使用北京庄盟国际生物基因科技有限公司购买的DNA Marker进行琼脂糖凝胶电泳；使用美国Invitrogen公司购买的TRIzolTM试剂提取RNA；使用abm公司购买的5×All-In-OneRT MasterMix试剂盒进行反转录；使用日本TaKaRa公司购买的Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时荧光定量PCR；使用北京普洛麦格生物技术有限公司购买的DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收实验；使用Axygen公司购买的质粒DNA小量试剂盒提取质粒；从北京威格拉斯生物技术有限公司购买质粒大量提取纯化试剂盒；使用ENVIR LOGIX公司购买的QuickStixTM Kit for PAT/bar Cotton Leaf and Seed试剂盒进行转基因材料鉴定；实验中使用的限制性内切酶购买自北京NEB有限公司。
实施例1TaPIF5基因的获得
一、TaPIF5基因的发现
在六倍体小麦中有TaPIF5蛋白，基于小麦六倍体的特性，在TaPIF5中根据表达量的预测选择一个拷贝，进行简单序列分析发现，图1示出TaPIF5的开放阅读框(ORF)为1524bp(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，且编码一个含507个氨基酸的蛋白质(蛋白质序列如SEQ ID NO:1所示)，同时该基因包括4个外显子和3个内含子。
二、TaPIF5基因的克隆
1、RNA提取
提取科农199(‘KN199’)(由中国科学院遗传与发育生物学研究所培育的国审小麦品种)幼苗的总RNA，TRIzol法提取RNA具体步骤如下：
(1)实验开始前应先将研钵洗净，少量无水乙醇点燃灼烧。
(2)将所取小麦组织于液氮中研磨成粉末状后转移至RNase-free的2.0mL的离心管中，加入1mL TRIzol试剂后用涡旋器充分混匀。
(3)室温静置10min后，于4℃低温离心机12000rpm离心10-15min。
(4)将上清液转移至RNase-free的1.5mL离心管中。
(5)将CHCl3以TRIzol∶CHCl3＝1∶0.2的比例加入离心管中，盖紧管盖，剧烈混匀1min。
(6)室温静置3min后，于4℃低温离心机12000rpm离心15min，将上清液转移至新的1.5mL离心管中，大约吸取400μL。
(7)将1/10体积的3M NaAc加入离心管中，将异丙醇以TRIzol：异丙醇＝1∶0.4的比例加入离心管中，盖紧管盖，剧烈混匀后在-20℃静置30min。
(8)于4℃低温离心机12000rpm离心10min，弃去上清后加入1mL 70％乙醇，静置2min洗涤沉淀。
(9)再次于4℃低温离心机12000rpm离心1min，弃去上清后加入1mL 70％乙醇，静置2min洗涤沉淀。
(10)弃去上清后，将残留在管壁的剩余乙醇瞬时离心并用枪吸取干净。
(11)于超净工作台中吹干沉淀，完全吹干后加入30-50μL DEPC水溶解。
(12)完全溶解后，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳跑胶检测RNA质量，NanoDrop2000检测RNA的浓度。
2.RNA反转录
以上述步骤1提取的小麦RNA为模板，使用abm公司生产的5×All-In-One RTMasterMix反转录试剂盒合成第一链cDNA，在冰上依次加入以下样品，在PCR仪上进行反应，反应程序为：37℃15min，60℃10min，95℃3min，10℃保温。结束程序后短暂离心，将产物稀释3-6倍后续使用。反转录体系如表1所示：
表1反转录体系
3.qRT-PCR分析
以上述步骤2获得的cDNA为模板，用小麦内参基因Tubulin引物LR51-F和LR51-R(引物序列见表2)扩增检测反转录产物的质量后进一步测序验证目标片段的正确性，其中，本实验中针对不同检测基因设计荧光定量PCR特异引物，片段大小设计在80-150bp之间。
表2引物序列
使用罗氏荧光定量PCR仪分析检测基因的相对表达水平。以TaGAPDH作为内参基因，反应体系见表3，反应程序为：95℃，10s；95℃，5s；60℃，30s；72℃，10s；40个循环。每组实验设置3个生物学样本，每个生物学样本设置3个技术重复，数据为3个生物学重复平均值±标准误差。相对表达量的计算采用2-ΔΔCT方法，实验数据采用SPSS软件进行分析。结果显示Ct值结果较稳定，重复性较好，扩增曲线正常，表明实验数据可靠。
表3实时荧光定量PCR反应体系
4、目的基因的克隆及回收
以KN199叶片的cDNA为模板进行扩增，根据目的基因的参考序列，利用小麦数据库设计特异引物(TaPIF5-1A-F：CGTCGTTTATATATCGACACCTGC(SEQ ID NO:3)；TaPIF5-1A-R:GGTAGGACATGTCAGGATTGTGTAT(SEQ ID NO:4))进行PCR扩增。反应体系如下：
表4PCR扩增目的片段反应体系
PCR反应程序为：94℃预变性5min；98℃变性30s，62℃退火30s，68℃延伸30s，35个循环；68℃延伸10min，10℃保温。
PCR反应结束后，得到1928bp的产物。经过测序后，PCR产物具有序列1所示的核苷酸序列，得到目标基因。
三、TaPIF5亚细胞定位
为了确定TaPIF5蛋白在细胞中具体的位置，作为后续研究基因功能的基础信息，构建了TaPIF5与GFP融合表达的载体，同时构建已知定位信息的Marker基因与mCherry融合表达的载体，共转化小麦原生质体，确定TaPIF5在亚细胞水平中的定位。具体操作步骤如下：
(1)设计特异性引物(TaPIF5-1A-F：CGTCGTTTATATATCGACACCTGC(SEQ ID NO:3)；TaPIF5-1A-R:GGTAGGACATGTCAGGATTGTGTAT(SEQ ID NO:4))从相应KN199特异表达组织的cDNA中扩增得到TaPIF5基因的全长CDS，胶回收得到约1.5Kb的片段(具体步骤见北京普洛麦格生物技术有限公司DNA凝胶回收试剂盒说明书)，将其连接到pEASY-Blunt Simple亚克隆载体上，提取质粒测序正确后作为后续表达载体的模板使用。
(2)将实验室依据pAN-580载体序列设计的同源重组接头加到目的基因特异引物上扩增CDS序列，胶回收得到约4.5Kb的片段。
(3)将实验室保存的pAN-580空载用Spe I和BamH I进行双酶切，具体体系见表5。
表5双酶切反应体系
(4)将双酶切回收到的片段与步骤(2)胶回收得到的片段根据1∶3的比例混合后，使用In-Fusion无缝克隆酶进行连接转化。
(5)转化后经过菌液PCR和测序得到正确菌液和正确质粒待用。
(6)按照威格拉斯大提质粒试剂盒说明书提取高质量、高浓度质粒待用。
(7)小麦原生质体的分离：
1)短光周期下，小麦幼苗进行10天左右的土培培养(保持不缺水的状态)。
2)实验开始前，准备好要用的质粒、离心管、枪头(减去枪头尖，烧平)以及实验所需试剂。
3)选择长势较好的适量叶片，将叶片正面向上放在培养皿上，用刀片轻轻的沿叶脉垂直方向在表面划出多道伤口(去掉叶尖，尽量不切断叶片)。
4)将叶片轻柔放入含有10mL酶解液的50mL离心管中，轻轻混匀，使叶片充分接触酶解液。
5)用锡箔纸将50mL管充分包裹，避光，28℃，40rpm，摇床中酶解3-4h。
6)将20mL W5溶液加入酶解液中，轻轻混匀。
7)先后用蒸馏水和W5溶液清洗、润洗200目过滤筛，将酶解液过滤到新的50mL管中。
8)将离心机预冷至4℃，100g离心2min，弃上清。
9)将20mL W5溶液缓慢加入50mL管，重悬原生质体，100g离心2min收集原生质体。
10)根据裂解得到的原生质体的量缓慢加入2-10mL W5溶液重悬原生质体。
11)冰上静置30min。此时可在显微镜下检测原生质体是否破损以及浓度是否合适。
DNA转染：
12)100g离心2min后倒掉W5溶液，根据原生质体的量加入1-5mL MMG溶液重悬原生质体。
13)向2.0mL离心管中依次加入备好的质粒(10-20μL，10-20μg)以及100μL重悬的原生质体，轻弹混匀。
14)将110μL现配的PEG溶液加入离心管中，轻弹混匀，室温下避光15min。
15)将1mL W5溶液加入离心管中，上下颠倒混匀，终止反应。
16)重复两次步骤8。
17)向离心管中加入200-1000μL W5溶液，在25℃培养箱中过夜培养16-20h后检测融合蛋白的表达。
18)GFP检测：用烧平的枪头吸取20μL的转染液滴在洁净的载玻片上，轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡。用激光共聚焦扫描显微镜(ZeissLsm700，Germany)检测小麦原生质体融合表达的情况并拍照。结果发现TaPIF5在亚细胞水平中均定位在细胞核(见图7)。
上述亚细胞定位所需试剂及配方详见下表6。
表6亚细胞定位实验所需试剂及配方
四、TaPIF5酵母激活活性分析
为了验证TaPIF5蛋白是否具有自激活活性，以及自激活活性区域具体存在于哪个区域，将TaPIF5基因的全长开放阅读框序列及两端缺失不同长度的片段克隆到酵母双杂交系统中含有结合结构域(BD)的载体之中，与BD融合表达，并转化酵母。通过检测酵母在不同缺陷型培养基上的生长情况确定TaPIF5的转录激活活性。具体操作步骤如下：
(1)设计特异性引物(TaPIF5-1A-F：CGTCGTTTATATATCGACACCTGC(SEQ ID NO:3)；TaPIF5-1A-R:GGTAGGACATGTCAGGATTGTGTAT(SEQ ID NO:4))从相应KN199特异表达组织的cDNA中扩增得到TaPIF5基因的全长CDS，胶回收得到约1.5Kb的片段(具体步骤见北京普洛麦格生物技术有限公司DNA凝胶回收试剂盒说明书)，将其连接到pEASY-Blunt Simple亚克隆载体上，提取质粒测序正确后作为后续表达载体的模板使用。
(2)将实验室依据pGBKT7载体序列设计的同源重组接头加到目的基因特异引物上扩增CDS序列，胶回收得到约8.8Kb的片段。
(3)将实验室保存的pGBKT7空载用BamH I和EcoR I进行双酶切，具体体系见表7。
表7双酶切反应体系
(4)将双酶切回收到的片段与步骤(2)胶回收得到的片段根据1∶3的比例混合后，使用In-Fusion无缝克隆酶进行连接转化。
(5)转化后经过菌液PCR和测序得到正确菌液和正确质粒待用。
(6)按照威格拉斯大提质粒试剂盒说明书提取高质量、高浓度质粒待用。
(7)参考上海唯地生物技术有限公司Y2HGold Chemically Competent Cell产品说明书酵母转化实验方法转化酵母，29℃培养箱培养48-96h后观察酵母菌落是否长出。
(8)从长出菌落的培养基上用枪头挑一片菌，用提前灭菌的ddH2O进行不同浓度梯度的稀释，由高浓度向低浓度依次吸取3-10μL菌液按照相应顺序依次点到二缺(SD-Trp/Leu)及四缺(SD-Trp/Leu/His/Ade)培养基上，29℃培养48-96h观察酵母菌落生长状况，并拍照进行转录活性分析。图8结果发现TaPIF5蛋白均具有转录激活活性，且激活活性区域位于蛋白N端。
实施例2、基因的功能
一、转基因植物的构建
1.载体构建
根据实验目的，将TaPIF5的编码序列构建到以Ubi为启动子的过表达载体中，构建pUbi::TaPIF5-1A::3×Flag表达载体，分别在SEQ ID NO:2所示的TaPIF5基因的3'端融合3×Flag(DYKDDDDK(SEQ ID NO:37))编码序列，并将其替换pWMB110载体的Sma1和Spe1酶切位点间的片段，得到的重组载体pUbi::TaPIF5-1A::3×Flag。
为了进一步研究以上基因的显性负效应，构建pUbi::TaPIF5-1A-SRDX表达载体，将TaPIF5的SUPERMAN抑制域(SRDX:LDLDLELRLGFA(SEQ ID NO:38)，SRDX是一个转录抑制结构域，应用于植物中激活型转录因子的功能研究，抑制内源性和功能冗余的转录因子)融合到3'端，然后将其克隆到pWMB110载体中生成抑制结构。其中TaPIF5目的片段以及表达载体的PCR电泳图详见图4。电泳结果显示条带大小为目标片段大小，条带单一且较亮，特异性好。
重组载体pUbi::TaPIF5-1A-SRDX为将LDLDLELRLGFA(SEQ ID NO:38)的编码基因融合到SEQ ID NO:2所示的TaPIF5基因3'端得到的DNA分子替换pWMB110载体的Sma1和Spe1酶切位点间的片段，得到的重组载体。
表8回收产物与载体的连接转化
在0.2mL的PCR管中依次加入表8中各组分，轻轻混合，离心后在水浴锅中50℃连接20min，反应结束后取出PCR管离心后放置冰上，后续进行转化实验，若暂时不转化则需将连接产物放置-20℃冻存。
2、重组菌的构建
将pUbi::TaPIF5-1A::3×Flag载体转入大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Trans-T1，得到重组菌。
于超净台内将上述37℃倒置培养12-16h的LB固体培养基上挑取单菌落并进行菌液PCR检测，得到1524bp为阳性重组菌，命名为pUbi::TaPIF5-1A-Flag。
反应体系如下：
表9菌液PCR反应体系
依据目的片段的大小设置PCR反应的程序。
其中，上述表9中的Primer F序列为TaPIF5-1A-Flag-110-F：GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGATGAGCGAGCCGGGCAACGA(SEQ ID NO:5)；Primer R序列为TaPIF5-1A-Flag-110-R:CATGAATTCCGGCTCGAGACTAGTCATTGCTCGTGGGACCTGCG(SEQ ID NO:6)。
二、TaPIF5转基因材料的制备
1、构建转基因材料
将上述重组载体pUbi::TaPIF5-1A::3×Flag和重组载体pUbi::TaPIF5-1A-SRDX分别转入小麦品种KN199中，得到转基因小麦，命名为pUbi::TaPIF5-1A::3×Flag以及pUbi::TaPIF5-1A-SRDX材料(见表10)。
具体步骤如下：
1、将上述重组质粒pUbi::TaPIF5-1A::3×Flag及pUbi::TaPIF5-1A-SRDX转化入农杆菌EHA105感受态细胞。
2、将EHA105/pUbi::TaPIF5-1A::3×Flag及EHA105/pUbi::TaPIF5-1A-SRDX接种至含利福平50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基，37℃培养过夜，得到OD600nm值为0.6-0.8的菌液。
3、取3mL菌液，4000rmp离心3min，收集沉淀；之后将沉淀用20mL含100μmol/L乙酰丁香酮的AMM液体培养基重悬，28℃、150rpm培养2h，得到侵染液。
4、取小麦KN199的种子，去壳灭菌，平铺到愈伤诱导培养基诱导两周，挑出愈伤继代培养两周至长出直径2mm左右的愈伤颗粒。
5、将愈伤颗粒在侵染液中浸泡20min，再放到有一层滤纸的共培养基上；3天以后将愈伤用灭菌蒸馏水洗三次，每次20min；再用含500mg/L羧苄的灭菌水洗两次(可重复多次直到洗液清亮)，每次30min；将愈伤放在无菌滤纸上晾干，再将其放到一筛培养基上；两周后将愈伤转到二筛培养基上，再两周后转到三筛培养基，得到抗性愈伤。
6、将抗性愈伤转到分化培养基上，得到分化小苗。
7、将分化小苗转移到1/2MS培养基上生根，然后转到培养箱花盆内，得到T0代转基因小麦。
上述步骤3-7浸染的方法具体参考如下文献：Yuji Ishida,Masako Tsunashima,Yukoh Hiei,Toshihiko Komari.Wheat(Triticum aestivum L.)Transformation UsingImmature Embryos.Methods in Molecular Biology,2015,1223,189-198.
2、鉴定
1)分子鉴定
以转基因小麦的cDNA为模板，采用引物TaPIF5-1A-Flag-110-F：GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGATGAGCGAGCCGGGCAACGA(SEQ ID NO:5)及TaPIF5-1A-Flag-110-R:CATGAATTCCGGCTCGAGACTAGTCATTGCTCGTGGGACCTGCG(SEQ ID NO:6)组成的引物对进行PCR扩增，鉴定转基因阳性株系，得到1524bp为阳性。
2)试纸鉴定
利用转基因试纸条进行阳性植株的筛选，该试纸条检测步骤如下：
取适量正常生长到三叶期的小麦植株叶片到2.0mL离心管中，打样后向离心管中加入适量(300-600μL)提取液，用上海佑隆生物科技有限公司PAT/bar速测试纸条进行检测。等待约10min后可读取结果，显示一条杠结果为阴性植株，显示两条杠结果为阳性植株。
鉴定后的植株pUbi::TaPIF5-1A::3×Flag，共得到62个阳性单株；同样地，pUbi::TaPIF5-1A-SRDX过表达株系得到12个阳性单株。
3、表型鉴定
通过对转基因材料进行表型鉴定发现，图5示出了与野生型KN199相比，小麦TaPIF5过表达株系pUbi::TaPIF5-1A::3×Flag表现为分蘖增加，株高降低。而作为对比的过表达株系pUbi::TaPIF5-1A-SRDX则表现为分蘖减少，株高升高的相反表型。
对主要农艺性状进行统计发现，株高及分蘖数目符合表型变化。
表10转基因材料创制
4、TaPIF5转基因材料表达水平
为了检测TaPIF5在转基因材料中的表达水平，分别利用qRT-PCR实验(引物为TaPIF5-1A-QF5：CGCGCAGTTCCCTTACCA(SEQ ID NO:9)；TaPIF5-1A-QR4：ACCTGCGGATGGTCGCCG(SEQ ID NO:10))对TaPIF5-OE、及TaPIF5-SRDX中过表达基因的表达水平进行检测，每个材料取3个株系，每个株系取3个单株，以野生型KN199作为对照，取样部位为小麦初分蘖期的分蘖基部，结果表明，在转基因材料中，TaPIF5的表达量均呈现出明显上调的趋势，上调表达倍数各不相同(图6)。
通过本申请的上述研究可以得出以下结论：
(1)TaPIF5基因的编码区大约在1.5kb左右，外显子和内含子数目各不相同。系统进化树分析发现小麦TaPIFs与水稻TaPILs蛋白群高度同源，保守结构域分析表明TaPIFs具有保守的bHLH结构域。
(2)构建了TaPIF5-Flag及TaPIF5-SRDX表达载体，以KN199为受体进行转化，创制转基因材料，对表型进行鉴定发现，与野生型相比，过表达TaPIF5后，株高降低、有效分蘖数增加；对主要农艺性状进行调查统计发现其结果符合表型变化。
(3)亚细胞定位结果表明，TaPIF5定位于细胞核，酵母实验表明四个蛋白均具有转录激活活性，且转录激活活性区域位于蛋白N端。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.TaPIF5蛋白或其相关生物材料在调控植物株型中的应用；
所述相关生物材料为能够表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；
所述TaPIF5蛋白为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物株型包括植物株高和/或分蘖数。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控为降低植物株高和/或增加植物分蘖数。
4.TaPIF5蛋白或其相关生物材料在培育株高降低和/或分蘖数增加的植物中的应用。
5.一种培育株高降低和/或分蘖数增加的转基因植物的方法，包括如下步骤：使受体植物中TaPIF5蛋白的含量和/或活性提高，得到转基因植物；
所述转基因植物与所述受体植物相比株高降低和/或分蘖数增加；
所述TaPIF5蛋白为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
6.一种培育株高降低和/或分蘖数增加的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中TaPIF5蛋白编码基因的表达量，得到转基因植物；
所述转基因植物与所述受体植物相比株高降低和/或分蘖数增加；
所述TaPIF5蛋白为如下任一所示蛋白质：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中TaPIF5蛋白编码基因的表达量为向受体植物中导入能够表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述能够表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子是通过含有表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子的重组载体导入目的植物中的。
9.根据权利要求1-3或权利要求7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述能够表达所述TaPIF5蛋白的核酸分子为如下任一所述的DNA分子：
(B1)SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述TaPIF5蛋白的DNA分子；
(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaPIF5蛋白的DNA分子。
10.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物优选为禾本科植物。
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