CN112725353B - 重组载体、转化体、用于扩增AtNAC58基因的引物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种植物组织培养的方法，所述方法使用AtNAC58基因转化体促进植物组织快速分化，本申请提供的方法能够打破传统方案对外植体选材限制，能够使用较为成熟的植物材料作为外植体，并且，能够缩短植物组织分化时间，从而降低植物组织培养的难度，提高植物组织培养的成功率和效率。

Description

重组载体、转化体、用于扩增AtNAC58基因的引物及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于生物技术领域，特别涉及一种用于扩增AtNAC58基因的引物、AtNAC58重组载体、AtNAC58转化体及其制备方法和应用。

背景技术

植物组织培养是通过无菌操作，将离体的外植体接种于人工配制的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其成为完整植株的方法。植物组织培养是20世纪初以植物生理学为基础发展起来的植物细胞工程技术，是农业技术中最重要、最活跃的领域之一，它不仅是农业持续发展的基础，而且是生物技术中应用最广、最具现实意义的领域，被誉为农业发展史上的第四次绿色革命，其对解决农业资源匮乏、环境污染等重大问题，具有战略意义。

植物组织培养的选材非常重要，影响植物组织培养能否成功以及效率。由于其再生能力强，代谢旺盛较容易脱分化培养，通常，选取幼嫩的组织部位作为植物组织培养的外植体。但是，很多时候，由于种种原因限制难以获得植物的幼嫩组织，而且，对幼嫩组织往往较为脆弱，在被损伤后常会死亡，这都导致组织培养的成功率低。

此外，现有技术进行组织培养的分化时间至少需要一个月，使得组织培养的效率较为低下。

发明内容

为解决上述问题，本申请提供一种植物组织培养的方法，所述方法使用AtNAC58基因转化体促进植物组织快速分化，本申请提供的方法能够打破传统方案对外植体选材限制，能够使用较为成熟的植物材料作为外植体，并且，能够缩短植物组织分化时间，从而降低植物组织培养的难度，提高植物组织培养的成功率和效率。

本申请的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本申请提供一种AtNAC58基因，所述AtNAC58基因可以通过人工合成方法进行合成，也可以从拟南芥植物体中提取，进一步地，获得所述AtNAC58基因后还可以通过PCR方法克隆。

在本申请中，所述AtNAC58基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本申请还提供一组用于扩增所述AtNAC58基因的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的序列如SEQID NO.3所示。

第三方面，本申请还提供一种AtNAC58重组载体，所述AtNAC58重组载体包括所述AtNAC58基因。

可选地，所述AtNAC58重组载体中使用的载体为pCanG载体。

第四方面，本申请还提供一种AtNAC58转化体，所述AtNAC58转化体包括所述AtNAC58基因。

可选地，所述AtNAC58转化体采用的宿主为农杆菌。

第五方面，本申请还提供所述AtNAC58基因用于植物组织培养的用途。

第六方面，本申请还提供第三方面所述AtNAC58重组载体用于植物组织培养的用途。

第七方面，本申请还提供第四方面所述AtNAC58转化体用于植物组织培养的用途。

可选地，所述转化体直接转染植物组织，能够促进外植体的植物组织分化。

进一步地，所述转化体直接转染植物组织的时间为10min。

第八方面，本申请提供一种所述AtNAC58基因的制备方法，所述方法包括人工合成法以及生物克隆法。

在一种可实现的方式中，所述人工合成法可采用现有技术中任意一种根据已知序列合成基因的方法。

在另一种可实现的方式中，所述生物克隆法包括以下步骤：

步骤1-1，提取拟南芥RNA，反转生成cDNA；

步骤1-2，以步骤2-1获得的cDNA为模板，使用特异性引物进行扩增；

步骤1-3，将步骤2-2扩增所得产物进行筛选，获得AtNAC58基因。

第九方面，本申请还提供一种制备AtNAC58重组载体的方法，所述方法通过双酶切连接AtNAC58与pCanG，获得AtNAC58重组载体。

第十方面，本申请还提供一种制备AtNAC58转化体的方法，所述方法将AtNAC58重组载体嵌入宿主细胞中。

可选地，所述宿主细胞为农杆菌。

第十一方面，本申请还提供一种植物组织培养的方法，所述方法使用第四方面所述AtNAC58转化体促进外植体组织分化。

进一步地，所述方法使用第四方面所述AtNAC58转化体侵染外植体植物，所述外植体植物包括拟南芥和烟草等。

与现有技术相比，本申请筛选到拟南芥的AtNAC58基因可诱导植物发生异位分生组织，并且可促进植物分生组织分化。例如，在AtNAC58基因被制备成转化体后，所述转化体能够通过浸花法获得转基因株系，该转基因植物子叶上发现有异位分生化组织。进一步，利用叶盘法将所述AtNAC58转化体侵染至烟草叶片，可快速地分化植物组织，并且，可促使较成熟的外植体进行分化，从而提高组织培养的效率和成功率。本申请筛选所得AtNAC58基因可通过人工合成方法制备，也可由拟南芥中分离获得。

附图说明

图1示出拟南芥NAC蛋白系统进化树；

图2示出AtNAC58基因克隆产物电泳结果；

图3示出重组载体酶切产物电泳结果；

图4A示出植物叶片组织培养传统选材示意图；

图4B示出本申请植物叶片组织培养选材示意图；

图5A示出外植体叶片在培养第28天后的结果；

图5B示出外植体叶片在培养第40天后的结果；

图6示出AtNAC58转基因拟南芥株系植物表型。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。

首先，对本方案涉及的基因及以组织培养等作简要介绍。

NAC转录因子家族是植物特有的、最大的转录因子家族之一。科学家发现在矮牵牛的无顶端分生组织(No Apical Meristem，NAM)基因、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的转录激活因子(Arabidopsis Transcription Activation Factor，ATAF)基因和杯状子叶(Cup-Shaped Cotyledon，CUC)基因编码蛋白的N端包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为NAC。位于该家族转录因子N末端的高度保守结构域有150个左右氨基酸序列。作为DNA结合结构域，该结构域由A～E等五个亚结构域构成，其中A可能参与二聚体形成，C和D参与DNA结合，而B和D则决定NAC转录因子的多样性，其中，C末端相对可变，作为转录调控区域。

近年来，在许多物种中均发现NAC转录因子家族基因的存在，例如，拟南芥中有117个NAC基因，水稻(Oryza sativa)中有151个NAC基因，大豆(Glycine max)中有152个NAC基因，苜蓿(Medicago truncatula)中有97个NAC基因。

NAC转录因子参与植物生长发育的各个阶段，主要包括植物分生组织和器官边界的形成、植物细胞次生壁生长、种子萌发、根生长、植物衰老以及植物激素信号调控和响应胁迫反应。例如，拟南芥NAC二次壁增厚促进因子(NAC Secondary Wall ThickeningPromoting Factor，NST1)和次生壁相关NAC结构域蛋白(Secondary Wall-Associated NACDomain Protein，SND1)等NAC转录因子参与细胞次生壁生长；种子形态NAC调控因子(NAC-Regulated Seed Morphology，NARS)等转录因子与拟南芥种子形态有关；钙调素结合NAC蛋白(Calmodulin-Binding NAC Protein，CBNAC)具有调控钙调蛋白转录抑制的功能；血管相关NAC结构域(Vascular-Related NAC Domain，VND)和VND交互(VND-Interacting，VNI)参与拟南芥维管形成；相比对照植物，AtNAC1基因过表达能够使植物叶片更大、侧根更多；AtNAC046基因能够促进拟南芥叶绿素降解和叶片衰老；响应活性氧的NAC转录因子(JUNGBRUNNEN1，JUB1)能够延缓植物衰老，增强对非生物胁迫的耐受性；NTL8能够调控GA介导的盐信号响应途径，从而调节种子萌发；在非生物胁迫条件下，拟南芥脱水诱导的NAC蛋白26(Dehydration-Induced NAC Protein 26，RD26)可以作为脱落酸(Abscisic Acid，ABA)诱导基因的转录激活蛋白；在蔗糖、盐、氧化等胁迫条件下，AtNAC032基因能够抑制拟南芥花青素的合成；拟南芥ATAF1基因能够下调干旱胁迫应答基因的表达；水稻中过表达OsNAC6基因不仅能够增强抗脱水和盐胁迫耐受能力，而且能够增强抗病能力；过表达中间锦鸡儿CiNAC1基因和CiNAC4基因能够促进拟南芥主根的伸长及侧根数目的增加；中间锦鸡儿CiNAC1基因也能够促进转基因拟南芥叶片的衰老；中间锦鸡儿CiNAC3基因和CiNAC4基因能够提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。

矮牵牛NAM基因主要在分生组织和器官原基边界的细胞内表达，nam突变体缺少茎尖分生组织(Shoot Apical Meristem，SAM)，器官发育异常，导致幼苗大部分死亡，少部分存活下来的植株在成苗期花器官也会出现发育异常，说明NAM基因可能在分生组织器官原基的形成中起着一定的作用。高等植物的大部分地上部分来自茎顶端分生组织。在SAM中，分生组织/器官原基与其周围环境之间边界的形成对器官的形成至关重要。在拟南芥中，杯状子叶基因CUC1和CUC2可编码一对副同源的NAC转录因子，并由microRNA miR164负调控，已被证明参与胚胎SAM的形成和边界的确定。由于CUC1和CUC2在功能上冗余，cuc1单突变体和cuc2单突变体都没有表现出严重的幼苗表型，而cuc1cuc2双突变体表现出严重的子叶融合和缺乏SAM。CUC3是CUC1以及CUC2的同源物，也与CUC1和CUC2冗余地参与子叶边界和茎分生组织的建立。拟南芥AtNAM在胚胎SAM的整个区域均大量表达，暗示着AtNAM也参与SAM的形成。CUC蛋白与矮牵牛NAM蛋白属于同一亚家族，拟南芥cuc1cuc2双基因突变体中子叶、萼片和雄蕊融合，难以形成SAM，而单基因的突变体却没有明显的表型，说明它们参与植物顶端分生组织的形成，且存在功能的冗余。进一步研究发现，CUC1在拟南芥胚的顶端分生组织和花器官原基的边界处表达，处于STM(SHOOT MERISTEMLESS)基因的上游，可以激活很多SAM相关基因的表达，超量表达CUC1可以激活芽尖组织周缘细胞，诱导子叶不定芽的形成。CUC1也可以通过一种不依赖STM的途径促进SAM的形成，该途径受到AS1(ASYMMETRIC1)和AS2基因的负调控。此外，CUC1可以正调控LSH4(LIGHT-DEPENDENT SHORTHYPOCOTYLS4)及其同源基LSH3的表达，而在茎尖超量表达LSH4会抑制植物营养生长阶段叶片的生长，以及生殖生长阶段花中额外的芽或芽器官的形成。由此可见，植物NAM家族基因在分生组织和器官边界的形成中起着关键的作用。

本申请筛选到的AtNAC58转录因子属于NAC转录因子家族。

在本申请中，从Tair数据库中获得所有拟南芥NAC转录因子(AtNAC)的蛋白序列，利用ClustalW对所有AtNAC的蛋白进行多重序列比对，并利用Mega7.0软件建立系统进化树，其中，算法采用Neighbour-Joining，bootstrap值设置为1000，Mode设为β-distance，Gaps选择Complete deletion，系统进化树如图1所示，如图1所示，AtNAC58转录因子与At2G24430基因同源性最高，相似度为72％。

本实验所用AtNAC58转录因子(即At3G18400)对应cDNA的长度为1400bp，其ORF为945bp，能够编码314个氨基酸，所述氨基酸中含3个外显子，2个内含子。

本申请人发现，拟南芥中的AtNAC58基因可诱导植体子叶发生异位分生化的现象，由所述AtNAC58基因制得的AtNAC58转化体能够以较为成熟的植物组织作为外植体进行组织培养，并且，能够促进外植体分化，缩短组织培养时间。

在本申请中，所述AtNAC58基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述AtNAC58基因可以通过人工合成方法进行合成，也可以从拟南芥植物体中提取，进一步地，获得所述AtNAC58基因后还可以通过PCR方法克隆。

在本申请中，人工合成AtNAC58基因的方法可以使用现有技术中任意一种根据已知序列合成相应基因的方法。

在本申请中，从拟南芥中提取所述AtNAC58基因的方法可以利用现有技术从植物材料中提取分离目标基因的方法。

例如，从植物体中提取所述AtNAC58基因并通过PCR方法克隆可以包括以下步骤：

步骤1-1，提取拟南芥RNA，反转生成cDNA；

步骤1-2，以步骤1-1获得的cDNA为模板，使用特异性引物进行扩增；

步骤1-3，将步骤1-2扩增所得产物进行筛选，获得AtNAC58基因。

在获得所述AtNAC58基因后，可使用特异性引物对来扩增所述AtNAC58基因，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

本申请人发现，所述AtNAC58基因所述AtNAC58基因可用于植物组织培养，例如，可用于缩短外植体分生化时间。

进一步地，在对AtNAC58基因进行扩增后，利用扩增所得AtNAC58基因制备AtNAC58重组载体，所述AtNAC58重组载体包括所述AtNAC58基因。

可选地，所述AtNAC58重组载体使用的载体为pCanG载体。

可以理解的是，所述AtNAC58重组载体还可以使用其它生物可接受的载体。

本申请人发现，所述AtNAC58重组载体用于植物组织培养的用途。

在本申请中，使用扩增后AtNAC58基因制备AtNAC58重组载体的方法可以使用现有技术中任意一种利用基因制备相应重组载体的方法。例如，通过双酶切连接AtNAC58与pCanG，获得AtNAC58重组载体。

在获得AtNAC58重组载体后，本申请利用所述AtNAC58重组载体制得AtNAC58转化体，可以理解，所述AtNAC58转化体包括所述AtNAC58重组载体，而所述AtNAC58重组载体包括所述AtNAC58基因，所述AtNAC58转化体采用的宿主可以为农杆菌。可以理解的是，所述AtNAC58转化体还可以使用其它生物可接受的宿主。

本申请可以采用现有技术中任意一种利用重组载体制备转化体的方法，例如，将AtNAC58重组载体嵌入宿主细胞中。

本申请人发现，所述AtNAC58转化体用于植物组织培养，使用所述AtNAC58转化体进行组织培养可降低对外植体选材幼嫩程度的要求，并且，能够缩短组织培养的时间。

可选地，所述转化体直接转染植物组织，能够促进外植体的植物组织分化。

下面通过具体的实施例对本申请提供的AtNAC58基因、AtNAC58重组载体、AtNAC58转化体以及它们在组织分化中的作用进行详细阐述。

实施例

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 AtNAC58基因的克隆

根据Tair数据库(https://www.arabidopsis.org/)上获得的拟南芥AtNAC58转录因子蛋白序列生成其对应的cDNA序列，并根据所述cDNA序列设计特异性引物对，所述特异性引物对的序列参见表1。

表1扩增引物列表

在表1中，AtNAC58-sense为AtNAC58基因的正向引物，其基因序列为cggatccAGAGAGAGCGAGGAGAAACC，其中，第一个碱基c为保护碱基，第二位至第七位碱基ggatcc为酶切位点，所述酶切位点的名称为BamHⅠ，其余为正向引物序列；AtNAC58-anti为AtNAC58基因的反向引物，其基因序列为cactagtAAAGGACGTCGAGATGCAT，其中，第一个碱基c为保护碱基，第二位至第七位碱基actagt为酶切位点，所述酶切位点的名称为SpeⅠ。

以拟南芥AtNAC58转录因子对应的cDNA为模板，使用表1所示引物对对AtNAC58基因进行PCR反应，并进行电泳检测，结果如图2所示。在图2中，泳道1与泳道2表示同一PCR产物，泳道M表示DL5 000bp DNA marker，如图2所示，PCR产物条带明亮，单一，整齐。

在本实施例中，PCR程序如下：

PCR扩增后，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。

回收PCR扩增后清晰且特异的扩增条带，提取所述扩增条带中的产物，将所述产物连接于pEASY-T1 Simple克隆载体，形成AtNAC58重组载体。

进一步地，将所述AtNAC58重组载体转化至大肠杆菌后进行测序，分析测序结果能够同基因的开放阅读框序列拼接无误，表明已获得序列准确的目的基因。

实施例2 AtNAC58重组载体以及AtNAC58转化体的制备

(一)AtNAC58重组载体的制备

利用引物中酶切位点BamHⅠ和SpeⅠ，将空载体pCanG进行酶切处理后，与目的片段通过T4连接酶连接，连接体系如下：

将上述连接体系中的各物质混匀后离心，在22℃温度下孵育1h，将孵育所得体系转化至大肠杆菌感受态DH5α，使用质粒小提试剂盒将重组质粒从大肠杆菌中提取，使用双酶切及菌落PCR进行验证，结果如图3所示。在图3中，泳道1与泳道2均为重组载体酶切产物电泳结果；M为DL2 000bp DNA marker。由图3可知，目的基因片段被限制性内切酶切下来，证明在该重组载体中有目的基因片段的插入。

在本实施例中，所述孵育、转化以及提取方法为本领域常规方法。

(二)AtNAC58转化体的制备

验证成功后，将pCanG-AtNAC58重组载体电转化至根癌农杆菌GV3101中，获得AtNAC58转化体。

在本实施例中，所述电转化的方法为本领域常规方法。

实施例3 AtNAC58转化体在组织培养中的应用

通常，对于植物叶片组织培养一般选取植株顶端未舒展开的幼嫩叶片，如图4A所示，秦静远.植物组织培养技术[M].重庆大学出版社，2014。

在本实施例中，选用的植物材料相较常规选材更为成熟(组织分化能力更弱)，为生长约3月的本氏烟草叶片，其取的部位为9-11节叶片，如图4B中圈定的叶片。

在本申请中，组织分化开始时萌出的芽称之为不定芽，如果不定芽萌出较多，则将所有不定芽称为丛生芽。

本实施例所采用的方法为叶盘法。

具体地，将实施例2获得的AtNAC58转化体接种到100mL LB培养液中，所述LB培养液中含有100μL卡那霉素(50μg/mL)和100μL庆大霉素(25μg/mL)，在28℃下，于160rpm摇床培养36小时。如果菌液OD 600值大约为1，则于500rpm下离心15min，离心后倒掉上清，加入1/2MS培养基进行重悬，获得重悬液，使重悬液OD 600值保持于0.6～0.8。将已经预损伤的烟草叶片放入所述重悬液中，使叶片与重悬液充分接触，在黑暗条件中于24℃培养10min。

取出培养后的外植体叶片接种到含有卡那霉素的MS培养基中于24℃温度下培养，图5A示出外植体叶片在培养第28天后的结果，图5B示出外植体叶片在培养第40天后的结果。如图5A所示，在培养28天后，使用AtNAC58转化体进行组织培养的外植体叶片上直接长出幼苗，而对照组无幼苗生长；如图5B所示，在培养40天后，使用AtNAC58转化体进行组织培养的外植体叶片新生幼苗的分化情况明显优于比对照。由图5A和图5B可知，AtNAC58转化体能够促进烟草叶片外植体的组织分化。

上述实验表明，用AtNAC58转化体(pCanG-AtNAC58-HA)侵染外植体后，可加速外植体组织分化，缩短组织分化时间。

在重复实验中，以空载体转化体(Mock)和pCanG-AtNAC58-HA各对60个外植体进行侵染。在侵染21天后，Mock组所有外植体均没有长不定芽，而pCanG-AtNAC58-HA组中已长不定芽的外植体数量达40％。

实施例4 AtNAC58基因诱导植物叶片发生异位分生化

本申请人认为，AtNAC58转化体能够以较成熟的植物组织作为外植体，并且能够促进外植体分化，可能是由于AtNAC58基因能够诱导植物组织异位分生。因此，本实施例以拟南芥为模型，使用浸花法转染野生型拟南芥，并使用卡那抗生素筛选转AtNAC58基因植株，结果发现转基因拟南芥确实发生了异位分生现象，结果如图6所示，其中，箭头示出异位分生组织。

本领域技术人员熟知的是，植物的几乎所有地上部分都是在茎尖分生组织(SAM)上连续产生的。只有细胞分裂速度与进入分化途径的速度达到动态平衡，SAM中才能够保持未分化细胞池中细胞数量的动态平衡，并且能够不断产生新器官。在拟南芥SAM中，影响细胞分裂速度与进入分化途径的速度的基因包括SHOOT MERISTEMLESS(STM)。研究结果表明，STM能够产生激活细胞分裂的非细胞自主信号，并且STM可以启动从干细胞到器官起始的进程。

因此，本申请人认为，这种异位分生现象的出现是由于AtNAC58转录因子调控了STM等基因在叶片部位表达所导致的。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

                         序列表

<110>  内蒙古农业大学

<120>  重组载体、转化体、用于扩增AtNAC58基因的引物及其制备方法和应用

<160>  3

<170>  SIPOSequenceListing 1.0

<210>  1

<211>  1400

<212>  DNA

<213>  2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400>  1

gaaaagcttt taagcagtta atctccttcg tcctcttcaa gagagagaga gagcgaggag 60

aaacccttct tcttcttctt ttgttgtctt gaatttagat ttgtaagaga caacaaaaaa 120

tggaagaaaa tcttcctccg gggttcagat ttcatcctac agacgaggag ctcataacgc 180

attatctatg tcggaaagtc tccgatatag gattcaccgg taaagctgtc gtcgacgttg 240

atctcaacaa gtgtgaacct tgggatttgc cagccaaggc ttcaatggga gagaaagagt 300

ggtatttctt cagccaaagg gatcggaaat atccaaccgg tttaagaaca aaccgggcaa 360

cagaagctgg ttactggaaa accaccggga aagataaaga aatataccga agtggagtgt 420

tggttgggat gaagaaaacc ctagttttct acaaaggaag agctcccaaa ggtgagaaaa 480

gcaattgggt tatgcatgag tacaggcttg agagcaaaca acctttcaac cccacgaata 540

aggaggaatg ggtagtgtgt agggttttcg aaaagagcac ggcagcaaag aaagcacaag 600

aacaacaacc tcaatcttct caaccatctt ttggatctcc atgcgatgca aactcatcaa 660

tggcaaatga gtttgaagat attgatgagc ttccgaatct gaattcaaac tcatcaacca 720

tcgattacaa taatcatatc catcaatatt cgcaacgcaa tgtttactca gaagacaaca 780

caacaagtac ggctggtctc aacatgaaca tgaacatggc tagtactaat cttcagtctt 840

ggacaacaag tctccttggt ccgcctttat ctccaatcaa ctctttgttg ctcaaggctt 900

tccaaatcag gaactcttat agtttcccaa aagagatgat ccccagtttc aatcattctt 960

ctcttcaaca aggagtctcc aatatgatcc aaaatgcttc aagttcgtct caagtgcaac 1020

cccaaccgca agaggaagcg tttaatatgg actccatatg gtgaagccgt gaatggattc 1080

aaatcacgta tattaaattt gaatttccca actttgctct tatatactct ccatcaattt 1140

tatcaattgt atcattacac acacatagat catttatggg atcaagtaaa ttaattagtg 1200

catcttatat gtgaaatgca gggaaaagtc tcccatgcat ctcgacgtcc ttttatgttt 1260

atatattaat gtcttatagc ttttgtagtt tttgtccatc ttttcttgat ttcaagtttt 1320

agtaatttaa ttttaagttt atttgtgaga ctgtaaattt tcagctactt ttccactaat 1380

aaattaatgt agcgagacag                                             1400

<210>  2

<211>  26

<212>  DNA

<213>  2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400>  2

ggatccagag agagcgagga gaaacc                                      26

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400>  3

actagtaaag gacgtcgaga tgcat                                        25

Claims (1)

1.AtNAC58基因、含有AtNAC58基因的重组载体或者含有AtNAC58基因的转化体在促进叶片外植体组织分化中的应用，所述AtNAC58基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

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