CN105624188A - 一种spl18基因在提高植物产量中的应用 - Google Patents

一种spl18基因在提高植物产量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种SPL18基因在提高植物产量中的应用，所述SPL18基因来自玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、黑麦、小米、大豆、油菜或向日葵中的一种；本发明首次提供利用SPL18基因促进穗分支，提高单穗粒数或/和粒重，提高产量的方法，通过在作物中过表达SPL基因，能有效促进穗分支，提高单穗粒数或/和粒重3％以上，增产5％以上。该技术能有效提高单株产量和单位面积产量，增加粮食生产，为国家粮食安全提供新思路。

Description

一种SPL18基因在提高植物产量中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种SPL18基因的应用，特别是在水稻、玉米和小麦等作物上用来调控农作物单穗粒数和粒重以及提高产量的应用。
(二)背景技术
人口的不断增加和可耕种面积的减少，必须依靠提高农作物单位面积产量才能满足人类的需求。转基因技术已经被广泛用来改良农作物的性状，如获得抗虫能力、抗除草剂能力、增强抗干旱、抗病能力等。高产也是转基因农作物改良的重要内容。例如，利用转基因表达一种植物的转录因子(Transcriptionfactor)可以提高农作物的产量(U.S.Pat.No.7,598,529,4)。但是，农作物产量是一个复杂的数量性状，受到很多基因的调控(XingandZhang,(2010)AnnualReviewofPlantBiology,61:421-442)。研究和发掘更多有重大应用价值的新基因，并利用这些基因提高农作物产量是目前农作物研究的重中之重。
“绿色革命”中，矮杆化提高了作物的抗倒伏性和收获指数，通过合理密植和肥料的大量使用，使得农作物，特别是水稻和小麦的产量大幅提高(Monnaetal.,(2002)DNAResearch,9(1):11-17；Sasakietal.,(2002)Nature,416(6882):701-702；Spielmeyer,(2002)Sciences,99(13):9043-9048)。近年来，随着收获指数逐渐接近瓶颈值，育种家在水稻上提出了理想株型(IdealPlantArchitecture)的概念。理想株型的主要性质包括分蘖数适中且无效分蘖少，单穗粒数增加，茎干更厚更结实(Khush,G.S.,(1995)Geojournal,35:329-332)。因此，研究作物的穗粒数的调控机制，分离出关键基因并应用到作物培育中，是获得高产作物的重要途径。
SQUAMOSA(SQUA)promoter-binding-like(SPL)基因是在植株生长发育过程中起关键作用的一类转录因子。SPLs是植物特有，具有一个保属的大小约为78个氨基酸的SBP(SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN)结构域。这个结构域包含3个重要的功能基序，即锌指1(Zn1)、锌指2(Zn2)和核定位信号(NLS)(Yamasakietal.,(2004)JournalofMolecularBiology,337(1):49-63；Birkenbihletal.,(2005)JournalofMolecularBiology,352(3):585-596；PrestonandHileman,(2013)FrontiersinPlantScience4)。目前，在大多数植物中都发现了多个SPL基因，其中拟南芥、水稻、小立碗藓、玉米、番茄和杨树中分别含有16，19，13，31，15和28个(LiandLu,(2014)BMCPlantBiology14).。
目前，对AtSPL基因已经展开了很多研究，很多基因的功能及其调控机理也已经清楚。拟南芥中的16个SPL基因分别被命名为AtSPL1-AtSPL16。其中AtSPL1，AtSPL7，AtSPL12，AtSPL14和AtSPL16编码的蛋白的分子量相对较大，且为组成型表达；另外的编码的蛋白分子量相对较小，且主要在花器官中表达(Cardonetal.,(1999)Gene,237(1):91-104)。AtSPL基因中大多数基因的表达都受MIR156家族的miRNAs调控。在这些基因中，AtSPL3，AtSPL4和AtSPL5，能促进营养生长期转换和开花(Cardonetal.,(1997)PlantJournal,12(2):367-377；Gandikotaetal.,(2007)PlantJourna,l49(4):683-693)。AtSPL2，AtSPL和AtSPL11调控茎生叶和花的表型(Shikataetal.,(2009)PlantandCellPhysiology,50(12):2133-2145)。AtSPL9和AtSPL15类似，都具有调控植株从幼苗生长期到成熟生长期转换和叶片生长速率的功能(Schwarzetal.,(2008)PlantMolecularBiology,67(1-2):183-195.)。另外，六个AtSPL基因，包括AtSPL1，AtSPL7，AtSPL8，AtSPL12，AtSPL14和AtSPL16，不是miR156的靶标基因。其中，AtSPL7能直接和铜反应元件(CuRE)结合，调控拟南芥中铜离子的动态平衡(Yamasakietal.,(2009)PlantCell,21(1):347-361)。AtSPL8参与调控花粉囊的发育、雄性育性和GA的生物合成和信号转导(Zhangetal.,(2007)PlantMolecularBiology,63(3):429-439)。AtSPL14在植物发育和对伏马菌素B1的敏感度中起到关键作用(Stoneetal.,(2005)PlantJournal,41(5):744-754)。
近年来，水稻中的OsSPL基因的功能研究也取得了很多重要进展。OsSPL14调控水稻分蘖和单穗粒数，OsSPL14高表达能减少无效分蘖，促进穗分支，增加单穗粒数，提高谷粒产量(Jiaoetal.,(2010)NatureGenetics,42(6):541-544；Miuraetal.,(2010)NatureGenetics,42(6):545-549)。进一步研究表明，OsSPL14可能是通过和反向调控分蘖芽生长的TEOSINTEBRANCHED1基因的启动子直接结合，来抑制分蘖；通过直接和正向调控一个穗形态的重要调控基因DENSEANDERECTPANICLE1，来影响株高和穗长(Luetal.,(2013)PlantCell,25(10):3743-3759)。OsSPL16(即GW8)蛋白正向调控细胞分裂，在水稻中过表达该基因促进细胞分裂和灌浆，使得种子变宽切谷物产量增加(Wangetal.,(2012)NatureGenetics44(8):950-954)。GW7是另外一个促进谷粒变得细长的基因，OsSPL16通过和GW7的启动子结合抑制其表达来调控谷粒宽度(Wangetal.,(2015)NatureGenetics47(8):949-954)。但是，水稻中还有很多OsSPL基因的功能未知，更为深入和全面的研究这些SPL基因对发掘更多产量性状调控基因和培育高产作物都非常重要。
(三)发明内容
本发明目的是通过调控一种SPL18基因的表达，减少水稻无效分蘖，促进穗分支，单穗谷粒数增加且产量增加。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种SPL18基因在提高植物产量中的应用，所述的应用是将SPL18基因与表达元件连接构建表达框，然后将表达框导入植物中，减少无效分蘖，促进穗分支，增加单穗粒数，实现植物增产；所述表达元件包括启动子、增强子和终止子；具体优选方法为：将SPL18基因、启动子和终止子进行功能性连接，获得一个能够在植物中表达的SPL18基因表达框，然后通过植物转化的方法将SPL18基因表达框导入植物的基因组中使之表达，从而实现植物高产，获得谷物产量提高的改良转基因植物。改良的转基因植物是指与非转基因的亲本植物相比，单穗粒数、产量至少增加3％。
本发明提供的SPL18基因可以是来自任何植物，优选自禾本科植物(单子叶植物或双子叶植物)，比如来自玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、黑麦、小米、大豆、油菜或向日葵，特别优选来自水稻、玉米或大豆。一般可以预见这些来自不同植物的同源蛋白具有相同或者相似的功能，因此同样可以利用这些基因改良植物的农艺性状。进一步，即使不能预见这些蛋白的功能，本领域的一般技术人员可以根据本发明提供的方法和现有技术测定它们是否具有促进植物提早成熟的功能。
本发明所述的SPL18为具有一个保属的大小约为78个氨基酸的SBP(SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN)结构域的转录因子。本发明所述的SPL18基因包含的SBP结构域的氨基酸序列如SEQIDNO：1或者具有与其至少92.5％的序列一致性氨基酸序列。本发明最优选SPL基因为下列来源之一的基因或下列任一序列的同源序列，其编码的SPL为下列氨基酸序列之一或具有下列任一序列58％或70％或80％或90％以上同源性的序列：水稻(Oryzasativa)中籼稻的OsSPL18基因(氨基酸序列为SEQIDNO：2所示，核苷酸序列为SEQIDNO:6所示)；粳稻的OsSPL18基因(氨基酸序列为SEQIDNO：3所示，核苷酸序列为SEQIDNO:7所示)；玉米(Zeamaize)的ZmSPL18基因(氨基酸序列为SEQIDNO：4所示，核苷酸序列为SEQIDNO:8所示)。
编码本发明SPL18基因的多核苷酸序列可以有多种不同的变异，多核苷酸序列的变异包括但不限于：1)由于编码同一个氨基酸的密码子不同而获得不同的多核苷酸序列，这些序列编码具有相同活性的蛋白质多肽；2)来源于生物的遗传多态性(GeneticPolymorphism)，即同一种植物的不同个体或者群体之间的多样性；3)通过人工操作导入多核苷酸序列的变异。人工导入的这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的定向变异。本领域的一般技术人员就能通过分子生物学的方法产生点突变，插入或者缺失变异等。通过人工操作导入多核苷酸序列的变异也包括通过GeneShuffling等方法获得仍然具有正常功能的杂合基因。例如U.S.Pat.No.2002/0058249；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature,370:389-391；Cramerietal.(1997)NatureBiotech.,15:436-438；Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.,272:336-347；Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4504-4509；Cramerietal.(1998)Nature,391:288-291；andU.S.Pat.NOs.5,605,793and5,837,458。
本发明所述SPL18基因的多核苷酸序列，本领域的一般技术人员通常可以利用PCR方法、DNA杂交方法等从一种植物中克隆到相应的同源基因。根据本发明提供的多核苷酸序列设计引物，可以通过PCR方法获得同源基因的部分或者全部序列。而一旦获得该基因的部分序列，就可以通过不同的方法克隆得到全长基因。另一方面，利用本发明提供的多核苷酸制备探针，可以通过DNA杂交方法从一种植物的DNA文库中克隆获得其同源基因。
本发明所述SPL18基因编码的多肽可以用于促进植物的穗分支数和提高单穗谷粒数，优选的SPL基因编码的多肽为下列之一或具有58％以上同源性的氨基酸：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4。本发明所述SPL18促进穗分支数和提高单穗粒数的应用方法包括提高水稻中SPL18基因的表达或活性，具体方法包括：1)构建包含本发明提供的多核苷酸序列的SPL基因表达框；表达框可以通过一个或者几个控制表达的多核苷酸序列(即表达元件，包括启动子、增强子和终止子)与SPL18基因功能性连接而获得；本发明特别提供了利用SPL18基因本身的表达框，即包含这些基因本身的启动子和终止子的整个DNA片段，如SEQIDNO:5；2)将表达框导入到植物中，并获得表达，获得SPL18基因过表达植株；特别是通过利用基因表达调控序列(启动子和增强子的选择)，使导入的基因在时间和空间上的表达特点与其内生基因相同或者类似，以减少非组织特异性过量表达SPL18基因可能对植物产生的不利影响。
本发明提供的多核苷酸(SPL18基因)可以被克隆到质粒载体中，在细胞中获得大量复制。利用这种DNA重组技术，本发明获得的多核苷酸可以和控制基因表达的启动子和终止子功能性地连接而构成表达框。所谓功能性地连接指启动子和终止子能够发挥控制与它连接的多核苷酸的表达。通常启动子连接在5’端，终止子连接在3’端。
控制基因表达的启动子是本领域的技术人员都已经知道的技术。Potenza等的综述详细介绍和总结了有关启动子的研究(Potenzaetal(2004)InVitroCellDevBiol-Plant,40:1-22)。启动子包括组成型表达的启动子、组织特异表达的启动子、可以诱导表达的启动子等。
本发明特别提供了在植物幼穗中特异性表达的启动子，来源于水稻SPL18基因、GA20ox-1基因、水稻ARGOS基因、水稻的OsTEL基因(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069)或其同源基因的启动子。启动子的区域可以通过试验得到确定。一般启动子可以是编码蛋白质的阅读框5’端外面至少0.25kb、0.5kb、1.0kb、2.0kb或3.0kb的DNA片段。上述基因的天然启动子除了可以用来控制其本身基因的表达以外，也可以与其他植物的同源基因功能性地连接，在其他植物中控制这些基因的表达，以获得改良的转基因植物。例如水稻SPL18基因的启动子可以用来控制玉米SPL18基因在玉米中的表达。
控制本发明提供的基因表达的启动子还可以是其它组织特异的启动子，例如STM特异启动子(U.S.Pat.No.5880330)、ARSK1根特异表达启动子(UnitedStatesPatentApplication20040067506)、AP1花分生组织启动子(Sasaki,Katsutomo,etal.(2011)Plantbiotechnology,28:181-188)。这些启动子也可以导致GA生物合成关键酶基因在一些组织中特异性表达，从而促进这些器官的成熟提早。
控制本发明提供的基因的启动子还可以是组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子(TeradaandShimamoto,(1990)Molecular&GeneralGenetics,220:389-392)，水稻的actin1启动子(Mcelroyetal.,(1990)ThePlantCell,2:163-171)，玉米的Ubi启动子。这些启动子可以导致SPL18基因在植物的大部分组织中组成型表达，从而促进穗分支增加，单穗粒数增多。
本发明优选所述启动子为下列之一：SEQIDNo:11、SEQIDNo:12、pOsGA20ox1、pOsTEL或pOsARGOS。
控制基因表达的终止子可以是提供基因的天然终止子，也可以是同种植物的其他基因或者其他植物基因的终止子。常用的终止子包括来源于农杆菌的Octopine合成酶终止子和nopaline合成酶终止子等。参考文献包括：Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.,262:141-144；Proudfoot(1991)Cell,64:671-674；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.,5:141-149；Mogenetal.(1990)PlantCell,2:1261-1272；Munroeetal.(1990)Gene,91:151-158；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.,17:7891-7903；andJoshietal.(1987)NucleicAcidsRes.,15:9627-9639。
为了提高基因在目标植物中的表达水平，基因的多核苷酸序列可以进一步修饰和改变。这些改变包括删除内含子、清除一些可能影响基因正常表达的序列，如隐藏的非成熟的PolyA信号序列等。根据目标植物的密码子使用情况，编码相同蛋白质多肽的多核苷酸序列可以优化，以提高其在目标植物中的表达量。
本发明同时还提供了增强SPL18基因在目标植物中表达的调控序列，如CaMV的35S增强子。将增强子连接在基因表达框的上游或者下游20kb以内的位置，以提高基因的表达水平。利用本发明提供的基因，找到这个基因在基因组中的位置，然后通过DNA定点插入技术，将基因表达的调控序列，如CaMV的35S增强子，插入到可以增强本发明基因表达的位点上。一个增强子往往能够影响附近基因的表达，有的增强子可以提高相距20kb或更远的基因的表达。目前植物的DNA定点插入技术已经很成熟(Townsend,JeffreyA.,etal.(2009)Nature,459:442-445；Jiang,W.,etal.(2013).Nat.Biotechnol.,31:233–239；Cong,L.etal.(2013)Science,339:819–823)。因此，利用定点插入的方法，将增强子插入到SPL18基因附近就可能提高这个基因的表达。
本发明同时还提供了通过调节目标植物中SPL18的内源性调节元件来提高其表达的方法。SPL18基因的表达受microRNA的调控，microRNA通过剪切SPL18基因下调SPL18基因的表达量(Xieetal.,(2006)PlantPhysiology,142(1):280-293)。通过表达与调控SPL18基因的microRNA对应的Targetmimicry可以抑制该microRNA对靶标基因的活性，从而使得目标基因SPL18的表达量提高(Franco-Zorrillaetal.,(2007)NatureGenetics,39(8):1033-1037)。
本发明用于构建基因表达框的载体也可以同时包含一个选择标记基因表达框。这个选择标记基因可以用来选择转化了的细胞，常用的基因包括抗生素抗性基因，如neomycinphosphotransferaseII(NEO)和hygromycinphosphotransferase(HPT)、抗除草剂基因，如抗草甘膦基因EPSPS等。其他选择标记基因同样可以用作本发明转化的选择基因。
本发明提供的SPL基因通过导入植物从而获得转基因的高产植物，提早植物成熟期。这些植物包括但不限于玉米、小麦、大麦、高粱、水稻、甘蔗、大豆、胡萝卜、马铃薯、棉花、向日葵、油菜、橡树、草坪草、牧草。
由于同一个家族中的基因在不同植物中往往具有类似的功能，因此可以在一个物种中过量表达另一个物种的SPL18基因来实现本发明所述的提早植物成熟的目的，也属于本发明提供的内容。比如，在玉米中过表达水稻的SPL基因。
目前本领域的一般技术人员能够利用现有技术将本发明所述的SPL18多核苷酸导入到植物中进行表达。比较常用的方法是基因枪方法(Kleinetal,1987,Nature(London),327:70-73；U.S.Pat.No.4,945,050))或农杆菌介导方法((DeBlaereetal,1987,Meth.Enzymol.,143:277)。但是本发明不限于这些方法。
不同植物的转化方法和步骤有所不同。通常使用较广的方法是通过农杆菌或基因枪导入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体。然后用相应的筛选培养基进行筛选培养。再进行分化而获得转化芽，通过生根培养基培养就可以获得可以种植的转基因苗。进一步，抗除草剂转基因植物可以通过喷施除草剂筛选，例如喷施烟嘧磺隆可以杀灭非转基因的水稻。本发明涉及的植物包括但不限于水稻、玉米、高粱、甘蔗、棉花、小麦、大豆、油菜、草坪草或牧草。
本发明获得的SPL18基因过表达植株鉴定的方法包括：观察植株表型、喷洒除草剂、分子物学方法等，当然，在实际应用中可以多种方法一起使用。由于本发明提供的SPL18基因过表达植株和对照植株有比较明显的表型差异，可以通过肉眼辨别。SPL18基因过表达的水稻植株与非转基因对照植株相比其平均单穗粒数至少增加3％。如果标记基因和目的基因紧密连锁，可以用喷洒除草剂的方法来鉴定目的基因。例如，SPL18基因构建在以抗草甘膦基因(EPSPS)为筛选标记的载体上，抗草甘膦的植株很可能就是SPL18基因过表达的植株。鉴定SPL18基因过表达植株还可以用分子生物学方法，这些方法主要包括Southern杂交法和PCR等技术，检测目标基因的DNA；荧光定量PCR或者定量PCR等技术，在mRNA的水平检测目标基因的表达；Western杂交法和酶联免疫吸附实验(ELISA)等技术，在蛋白水平检测目标基因的表达。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明首次提供利用SPL18基因促进穗分支，提高单穗粒数或/和粒重，提高产量的方法，通过在作物中过表达SPL基因，能有效促进穗分支，提高单穗粒数或/和粒重3％以上，增产5％以上。该技术能有效提高单株产量和单位面积产量，增加粮食生产，为国家粮食安全提供新思路。
(四)附图说明
图1：水稻SPL18基因OsSPL18过表达载体pCambia1300-pOsSPL18-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174(geno)的T-DNA结构示意图。
图2：水稻SPL18基因cDNA过表达载体pCambia1300-pZmUbi-1174-p35S-OsSPL18-ter的T-DNA结构示意图。
图3：水稻SPL18基因cDNA过表达载体pCambia1300-pOsSPL18-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsGA20ox1-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsTEL-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pOsARGOS-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA结构示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology，和J.Sambrook等编写ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALabortoryManual,3rdED.等文献均有详细的说明。
实施例1水稻SPL18基因OsSPL18过表达载体的构建
OsSPL18基因表达框基因组序列(核苷酸序列为SEQIDNO.5所示)的获得：设计PCR引物：
OsSPL18-geno-F(5’TGGTACCGATCTCACGTAAATACAATTCTCC)和OsSPL18-geno-R(5’CGGGTACCAATGATATATTTCTGCATAAGTTT)，以商业水稻品种秀水-134基因组为模板，通过PCR扩增获得推测的包括OsSPL18基因启动子、表达序列和终止子序列的大小为7.4kb的基因组片段，序列如SEQIDNO:5所示。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃7.5分钟，重复33个循环；然后72℃10分钟。
农杆菌T-DNA载体的构建：双元载体pCambia1300-p35S-G10载体(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069:SEQIDNO.47)包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)(作为转化的标记基因)和p35S启动子(作为目标基因的增强子)。经过KpnI酶切以后，去磷酸化，作为克隆的载体与经过同样酶切的大小为7.4kb的OsSPL18基因组片段连接。获得的T-DNA结构为：“启动子-OsSPL18基因-终止子-增强子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174(geno)图1)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例2水稻SPL18基因cDNA过表达载体的构建
1、cDNA的克隆
水稻OsSPL18基因cDNA的克隆：设计PCR引物OsSPL18-CF(5’GGATCCAACAATGGATTGGGATCTCAAGATG)和OsSPL18-CR(5’GAGCTCCTACTGCCACGAGAATGGGAGCG)，以自交系9311的总RNA反转录成的cDNA为模板，通过PCR扩增获得OsSPL18的cDNA序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃90秒，重复33个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.5kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过BamHI和SacI双酶切得到相应的cDNA(SEQIDNO：6)，并且DNA序列测定表明cDNA的核苷酸序列正确。然后以pCambia1300为过渡载体，用BamHI和SacI双酶切获得测序正确的OsSPL18cDNA片段，用SacI和KpnI双酶切获得人工合成的终止子片段，然后再把上述两个片段和用BamHI和KpnI双酶切后的pCambia1300载体连接，获得的包含OsSPL18cDNA和人工合成终止子(SEQIDNO：9)的过渡载体，命名为pCambia1300-OsSPL18-ter。保菌，用于构建转化植物的终载体。
2、启动子的克隆
2.1组成型启动子的获得及其调控OsSPL18基因表达的载体构建
启动子的获得
花椰菜花叶病毒35S启动子为人工合成序列p35S(SEQIDNO：11)，两端分别连接有HindIII和BamHI酶切位点。
载体构建
农杆菌T-DNA载体的构建：双元载体pCambia1300-G10载体(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069:SEQIDNO.49)包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)(作为转化的标记基因)。用BamHI和KpnI对之前构建好的pCambia1300-OsSPL18-ter进行双酶切，回收获得OsSPL18-ter片段；用HindIII和BamHI酶切含有p35S的质粒，获得p35S片段；用HindIII和KpnI对pCambia1300-G10载体进行双酶切，回收得到酶切后的载体。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-OsSPL18基因-终止子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-p35S-OsSPL18-pZmUbi-1174(图2)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
2.2组织特异性启动子的克隆
水稻SPL18基因OsSPL18启动子(pOsSPL18)的克隆：设计PCR引物pOsSPL18-F(5’GGTACCGATCTCACGTAAATACAATTCTC)和pOsSPL18-R(5’GGATCCGGCTCCACTCCACGCCACTT)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsSPL18的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过KpnI和BamHI双酶切得到相应的启动子pOsSPL18，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQIDNO：12)。
水稻GA20ox1基因OsGA20ox1启动子(pOsGA20ox1)的克隆：设计PCR引物pOsGA20ox1-F(5’CAAGCTTCTCTCTTCTATGCCACCAGTTC)和pOsGA20ox1-R(5’TGGATCCTGTTGATAATCTAGCTATCAATCAATTA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsGA20ox1的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子pOsGA20ox1，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(中国专利201510612568.3:SEQIDNO：2)。
水稻(Oryzasativa)Mei2-like基因启动(pOsTEL)子的克隆：设计PCR引物pOsTEL-F(5’AAGCTTGAAACTAGTACTAGACATTACTCTTCCAATGCA)和pOsTEL-R(5’AGAGGATCCTGCAGCAGCACTTACCTACCCTACCA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得pOsTEL。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物OsTE-PRO-DELF(5’AGATCCGAGCAAAAAACAGGGCC)和OsTE-PRO-DELR(5’TCTATAGCGATAGAACTGTTTGATCTGGGTAGC)进行点突变，去除启动子内部BamHI位点。最后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069:SEQIDNO：52)。
水稻ARGOS基因OsARGOS启动子(pOsARGOS)的克隆：设计PCR引物pOsARGOS-F(5’CAAGCTTCGGCAGCAACGGACTGAGAG)和pOsARGOS–R(5’TGGATCCAGCGAGCTTGAGCTAGCTTAGCTC)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsARGOS的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物pOsARGOS-MF(5’CTATGCGTAAGCTATACGTAGGACAGGTCACATTAT)和pOsARGOS-MR(5’GTGACCTGTCCTACGTATAGCTTACGCATAGATAGATAG)进行点突变，去除启动子内部HindIII位点。最后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(中国专利201510612568.3:SEQIDNO：6)。
3、农杆菌T-DNA载体的构建
农杆菌T-DNA载体的构建：
pOsSPL18调控OsSPL18基因表达的载体构建
pCambia1300-p35S-G10经过KpnI酶切以后，去磷酸化后获得用于连接的载体；用KpnI和BamHI分别对pOsSPL18和pCambia1300-OsSPL18-ter，分别获得pOsSPL18和OsSPL18-ter片段。然后，把上述载体和两个片段连接起来，即获得最终的载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-OsSPL18基因-终止子-增强子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-pOsSPL18-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174(图3)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
pOsGA20ox1、pOsTEL和pOsARGOS分别介导OsSPL18基因表达的载体构建
pCambia1300-p35S-G10经过HindIII和KpnI酶切以后，获得用于连接的载体；用HindIII和BamHI分别对pOsGA20ox1、pOsTEL和pOsARGOS进行双酶切，获得上述三个酶切后的启动子片段；用BamHI和KpnI酶切pCambia1300-OsSPL18-ter，获得OsSPL18-ter片段。然后，把上述启动子片段分别和载体以及OsSPL18-ter进行三段连接，分别获得最终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-OsSPL18基因-终止子-增强子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。获得的3个载体分别命名为：pCambia1300-pOsGA20ox1-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pOsTEL-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pOsARGOS-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174(图3)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例3、水稻的转化
转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取实施例1和实施例2中构建的载体(pCambia1300-pOsSPL18-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174(geno)；
pCambia1300-p35S-OsSPL18-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsSPL18-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174、
pCambia1300-pOsGA20ox1-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsTEL-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsARGOS-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174)的农杆菌划板。挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6左右的农杆菌菌液中(农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种至培养基，培养至OD为0.6左右；培养基组成：3g/LK2HPO4、1g/LNaH2PO4、1g/LNH4Cl、0.3g/LMgSO4·7H2O、0.15g/LKCl、0.01g/LCaCl2、0.0025g/LFeSO4·7H2O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/LABA+1mg/LNAA+5mg/L6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite)上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/LNAA+20g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。分别获得含上述转化载体和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株。
实施例4、转基因水稻的鉴定
将实施例3方法制备的转基因水稻植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因水稻植株和空载体对照植株的成熟时间进行比较分析。我们获得的89个转pCambia1300-p35S-OsSPL18-pZmUbi-1174载体的转基因植株(命名为SOsSPL18)中有54个植株的单穗粒数明显增加，其中三个典型品系单穗粒数增加幅度如下如表1。
表1：三个典型品系的单穗粒数增长幅度
品系 单穗粒数增长幅度(％)
SOsSPL18-20 5.4±0.44
SOsSPL18-39 6.5±0.56
SOsSPL18-66 8.9±0.78
*CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株；SOsSPL18为载体pCambia1300-p35S-OsSPL18-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中SOsSPL18后面的编号(20，39，66)是对不同品系随机编号，以便于区分不同的转化事件。
pCambia1300-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174(geno)；
pCambia1300-pOsSPL18-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsGA20ox1-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsTEL-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsARGOS-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174载体转基因玉米植株的表型变化和SOsSPL18类似，50％以上的转基因植株和空载体对照植株相比单穗粒数增加3％以上。
另外，还有在获得的转基因植株中还有40个转基因品系的谷粒粒重增加3％以上，其中三个典型品系单穗粒数增加幅度如下如表2。
表2：三个典型品系的粒重增长幅度
品系 粒重增长幅度(％)
SOsSPL18-16 6.5±0.54
SOsSPL18-27 7.9±0.66
SOsSPL18-78 9.2±0.89
*CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株；SOsSPL18为载体pCambia1300-p35S-OsSPL18-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中SOsSPL18后面的编号(16，27，78)是对不同品系随机编号，以便于区分不同的转化事件。
pCambia1300-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174(geno)；pCambia1300-pOsSPL18-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pOsGA20ox1-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pOsTEL-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pOsARGOS-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174载体转基因水稻植株的表型变化和SOsSPL18类似，40％以上的转基因植株和空载体对照植株相比谷粒粒重增加3％以上。
单穗粒数或/和粒重的增加使得植株的产量增加，在获得的89个转基因植株中有30个转基因品系的谷粒粒重增加5％以上，其中三个典型品系单穗粒数增加幅度如下如表3。
表3：三个典型品系的粒重增长幅度
品系 粒重增长幅度(％)
SOsSPL18-24 5.5±0.45
SOsSPL18-66 6.2±0.55
SOsSPL18-72 8.8±0.70
*CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株；SOsSPL18为载体pCambia1300-p35S-OsSPL18-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中SOsSPL18后面的编号(24，66，72)是对不同品系随机编号，以便于区分不同的转化事件。
pCambia1300-OsSPL18-p35S-pZmUbi-1174(geno)；
pCambia1300-pOsSPL18-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsGA20ox1-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsTEL-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174；
pCambia1300-pOsARGOS-OsSPL18-ter-p35S-pZmUbi-1174载体转基因水稻植株的表型变化和SOsSPL18类似，30％以上的转基因植株和空载体对照植株相比谷粒产量增加5％以上。
实施例5玉米SPL18基因cDNA过表达载体的构建
1、cDNA的克隆
玉米SPL基因ZmSPL18cDNA的获得：设计PCR引物ZmSPL18-F(5’GGATCCAACAATGGATTGGGATCTCAAGAT)和ZmSPL18-R(5’GGTACCAGGCTTATACAATAACTTTGTAAAGT)，以商业玉米品种郑单958的总RNA反转录的cDNA为模板，通过PCR扩增获得ZmSPL18的编码序列和3’端的终止子序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃100秒，重复32个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.7Kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过BamHI和KpnI双酶切得到相应的ZmSPL18cDNA-ter，并且DNA序列测定表明cDNA的核苷酸序列正确(SEQIDNO：10)。保菌，用于构建转化植物的终载体。
农杆菌T-DNA载体的构建
花椰菜花叶病毒35S启动子为人工合成序列p35S(SEQIDNO：11)，两端分别连接有HindIII和BamHI酶切位点。
双元载体pCambia1300-G10载体(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069:SEQIDNO.49)包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)(作为转化的标记基因)。用BamHI和KpnI对之前构建好的包含ZmSPL18-ter的T载体进行双酶切，回收获得ZmSPL18-ter片段；用HindIII和BamHI酶切酶切含有p35S的质粒，获得p35S片段；用HindIII和KpnI对pCambia1300-G10载体进行双酶切，回收得到酶切后的载体。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-ZmSPL18基因-终止子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-p35S-ZmSPL18-pZmUbi-1174(图3)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例6、玉米的转化
玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:VladimirSidorov&DavidDuncan(inM.PaulScott(ed.),MethodsinMolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；YujiIshida,YukohHiei&ToshihikoKomari(2007)Agrobacterium-mediatedtransformationofmaize.NatureProtocols2:1614-1622。基本方法如下：
取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将含有T-DNA载体(pCambia1300-p35S-ZmSPL18-pZmUbi-1174)的农杆菌与未成熟胚在共培养培养基上(MS+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite+5mg/LAgNO3+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/Lkinetin+2.5g/Lgelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。分别获得含转化载体(pCambia1300-p35S-ZmSPL18-pZmUbi-1174)和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株。
实施例7、转基因玉米的鉴定
将实施例6获得的转基因玉米植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因玉米植株和空载体对照植株的成熟时间进行比较分析。我们获得的56个转pCambia1300-p35S-ZmSPL18-pZmUbi-1174载体的转基因植株(命名为SZmSPL18)中有30个植株的单穗粒数明显增加(大于等于3％)。其中三个个典型品系单穗粒数增加幅度如下如表4。
表4：三个典型品系成熟时间
品系 单穗粒数增长幅度(％)
SZmSPL18-5 5.8±0.47
SZmSPL18-14 6.9±0.55
SZmSPL18-42 8.1±0.78
*CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株；SZmSPL18为载体pCambia1300-p35S-ZmSPL18-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中SZmSPL18后面的编号(5，14，42)是对不同品系随机编号，以便于区分不同的转化事件。
我们获得的56个转pCambia1300-p35S-ZmSPL18-pZmUbi-1174载体的转基因植株(命名为SZmSPL18)中有18个植株的产量明显增加(大于等于5％)。其中三个典型品系成熟时间如下如表5。
表5：三个典型品系成熟时间
品系 单穗粒数增长幅度(％)
SZmSPL18-8 5.2±0.41
SZmSPL18-25 6.4±0.53
SZmSPL18-51 7.5±0.69
*CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株；SZmSPL18为载体pCambia1300-p35S-ZmSPL18-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中SZmSPL18后面的编号(8，25，51)是对不同品系随机编号，以便于区分不同的转化事件。
实施例8、调控植物中SPL18基因的内源性调节元件的载体构建
根据水稻中SPL18基因的核苷酸序列分析，该基因的表达受内源性的miR-156k调控。我们设计了与miR-156k互补的序列(5’TGTGCTCTCTTCTATCTTCTGTCA)，用其取代IPS1中的核心序列，并加上了终止子。我们人工合成了上述序列(MIM156k)，两端分别设计有BamHI和KpnI位点(SEQIDNO：13)。
花椰菜花叶病毒35S启动子为人工合成序列p35S(SEQIDNO：11)，两端分别连接有HindIII和BamHI酶切位点。
双元载体pCambia1300-G10载体(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069:SEQIDNO.49)包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)(作为转化的标记基因)。用BamHI和KpnI对之前合成好的包含MIM156k的T载体进行双酶切，回收获得MIM156k片段；用HindIII和BamHI酶切酶切含有p35S的质粒，获得p35S片段；用HindIII和KpnI对pCambia1300-G10载体进行双酶切，回收得到酶切后的载体。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-ZmSPL18基因-终止子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-p35S-MIM156k-pZmUbi-1174。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种SPL18基因在提高植物产量中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述SPL18基因来自玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、黑麦、小米、大豆、油菜或向日葵中的一种。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述SPL18基因编码蛋白的氨基酸序列具有下列之一氨基酸序列58％以上同源性：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3或SEQIDNO：4。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述SPL18基因编码蛋白具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列92.5％以上同源性。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述SPL18基因的核苷酸序列为下列之一：SEQIDNO：6、SEQIDNO：7或SEQIDNO：8。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用是将SPL18基因与表达元件连接构建表达框，然后将表达框导入植物中，实现植物增产；所述表达元件包括启动子、增强子和终止子。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述启动子来源于水稻SPL18基因、GA20ox-1基因、水稻ARGOS基因或水稻OsTEL基因。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述启动子为pOsGA20ox1、pOsTEL、pOsARGOS或SEQIDNo:11、SEQIDNo:12所示核苷酸序列之一。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述增强子连接在基因表达框的上游或者下游20kb以内的位置。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述增强子为来自CaMV的35S增强子。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399513A (zh) * 2016-09-28 2017-02-15 中国农业科学院作物科学研究所 小麦基因TaSPL20‑7D分子标记及其在鉴定小麦产量相关性状中的应用
CN109207508A (zh) * 2018-08-03 2019-01-15 浙江大学 一种提高农作物产量的方法
CN109706155A (zh) * 2018-08-30 2019-05-03 南京农业大学 pOsHEN1::OsSPL14基因表达盒及其构建方法和应用
CN109880845A (zh) * 2019-03-07 2019-06-14 华中农业大学 一种提高植物结瘤固氮效率的方法
CN111172173A (zh) * 2020-02-21 2020-05-19 未米生物科技(江苏)有限公司 降低玉米株高或延迟开花的方法
CN113005126A (zh) * 2020-12-28 2021-06-22 四川农业大学 DgSPL3基因及其克隆方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103145818A (zh) * 2013-03-07 2013-06-12 华南农业大学 水稻OsAT1蛋白及其编码基因与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103145818A (zh) * 2013-03-07 2013-06-12 华南农业大学 水稻OsAT1蛋白及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "NCBI Reference Sequence：NM_001152261.1", 《NCBI》 *
RICE GENOME ANNOTATION PROJECT: "LOC_Os09g32944 OsSPL18", 《RICE GENOME ANNOTATION PROJECT》 *
李明等: "植物SPL转录因子研究进展", 《植物学报》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399513A (zh) * 2016-09-28 2017-02-15 中国农业科学院作物科学研究所 小麦基因TaSPL20‑7D分子标记及其在鉴定小麦产量相关性状中的应用
CN109207508A (zh) * 2018-08-03 2019-01-15 浙江大学 一种提高农作物产量的方法
CN109706155A (zh) * 2018-08-30 2019-05-03 南京农业大学 pOsHEN1::OsSPL14基因表达盒及其构建方法和应用
CN109880845A (zh) * 2019-03-07 2019-06-14 华中农业大学 一种提高植物结瘤固氮效率的方法
CN111172173A (zh) * 2020-02-21 2020-05-19 未米生物科技(江苏)有限公司 降低玉米株高或延迟开花的方法
CN111172173B (zh) * 2020-02-21 2022-05-03 未米生物科技(江苏)有限公司 降低玉米株高或延迟开花的方法
CN113005126A (zh) * 2020-12-28 2021-06-22 四川农业大学 DgSPL3基因及其克隆方法和应用
CN113005126B (zh) * 2020-12-28 2022-06-24 四川农业大学 DgSPL3基因及其克隆方法和应用

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