CN103865936B - 控制植物叶片转绿的基因及其使用方法和应用 - Google Patents

Abstract

控制植物叶片转绿的基因及其使用方法和应用，本发明公开了通过促进或抑制EMB2279基因或其蛋白来调节植物叶绿体成熟的方法及其应用。所述方法可用于控制植物叶片转绿性状。本发明的EMB2279基因或其蛋白及方法对于植物培植领域具有广泛的应用价值，为转基因技术改良农作物或者园艺植物提供了很好的基因资源。

Description

控制植物叶片转绿的基因及其使用方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及利用EMB2279基因及其蛋白控制植物叶片转绿的方法及其应用。

背景技术

众所周知，叶绿体是植物进行光合作用的场所，因此，改进叶绿体的功能，例如增强或促进叶绿体的活性对于提高农作物，特别是粮食作物产量或者经济作物产量有极其重要的意义。

目前，农业生产中主要是通过延缓叶绿体衰老的途径来提高作物产量。由于叶绿体发育受到包括低温、阴雨等环境因子的影响，如果植物能在各种逆境条件下都能保障叶绿体顺利发育，必将有利于植物的生长。但实际生产中尚未展开这样的应用研究。其次，各种不同类型的质体，包括叶绿体也是许多营养物质积累的场所，例如氨基酸、维生素、抗氧化剂等等，因此调控叶绿体发育也与品质密切相关。但是，迄今还没有运用生物技术调控叶绿体发育来提高作物品质的先例。例如，某些蔬菜栽培中，为了使叶绿体退化变成黄化质体，往往采用，诸如培土、遮光等传统手段，而这些传统的栽培措施往往具有成本过高、操作繁琐、结果不稳定、成功率不高等等缺点。因此，如果能通过调控植物体内本身关键基因表达就能改变叶绿体发育的状态，就可以简单、高效实现作物的品质改良。

另外，在园艺观赏植物中，观叶植物也是越来越受到人们的重视。目前，这些观赏植物都是从自然突变体或者通过人工诱变后筛选获得的突变体。随着生物技术的不断发展，通过转基因定向培育植物新品种具有快速、效率高等特点。

因此，本领域急需能够控制叶绿体的成熟程度，进而调节植物的产量以及叶片颜色等各种性状的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供调控植物叶绿体成熟的方法。

在第一方面，本发明提供EMB2279基因或其蛋白在调控植物叶绿体成熟中的应用。

在优选的实施方式中，所述植物包括十字花科、禾本科、豆科、脂麻科、菊科、藜科、山茶科、茜草科、梧桐科、茄科、五加科、多孔菌科、百合科、壳斗科、棕榈科、龙舌兰科。

在优选的实施方式中，所述植物包括：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦、水稻、玉米、燕麦、黑麦、大麦、粟、高粱、青稞、棉花、麻类、花生、油菜、芝麻、大豆、向日葵、甜菜、甘蔗、茶叶、咖啡豆、可可、烟草、人参、灵芝、贝母、橡胶、椰子、油棕和剑麻。

在优选的实施方式中，所述应用是调节植物叶片颜色。

在优选的实施方式中，EMB2279蛋白包括

(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述蛋白的功能的由(a)衍生的蛋白。

在第二方面，本发明提供调控植物叶绿体成熟的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将促进或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质给予植物、植物种子、植物细胞、组织或器官；和

b)培养步骤a)获得的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。

在优选的实施方式中，所述促进EMB2279基因或其蛋白的活性或表达是指与对照相比，EMB2279基因或其蛋白的表达量升高或过表达，或表达活性更高的蛋白变体；所述拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达是指与对照相比，EMB2279基因或其蛋白的表达量降低或不表达，或表达活性降低或无活性的EMB2279蛋白。

在优选的实施方式中，所述促进或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质包括：EMB2279基因本身、EMB2279基因的反义RNA或EMB2279蛋白的抗体。

在优选的实施方式中，拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质是SEQ IDNO:3所示的microRNA。

在另一优选的实施方式中，所述步骤a)是将编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入植物、植物种子、植物细胞、组织或器官，获得转化入编码EMB2279蛋白的多核苷酸的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。

在进一步优选的实施方式中，所述步骤a)是将植物、植物种子、植物细胞、组织或器官与携带含有编码EMB2279蛋白的多核苷酸的农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)接触，从而使编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入植物细胞，并整合到植物细胞的染色体上。

在优选的实施方式中，所述方法用于调节植物叶片的颜色变化。

在第三方面，本发明提供EMB2279基因或其蛋白在筛选植物叶绿体成熟促进剂或拮抗剂中的应用。

在第四方面，本发明提供筛选植物叶绿体成熟促进剂或拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将待测物质给予某植物；

b)检测该植物中EMB2279基因或其蛋白的活性或表达情况；

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达上调，则所述待测物质是叶绿体成熟促进剂；

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达下调，则所述待测物质是叶绿体成熟拮抗剂。

在第五方面，本发明提供一种植物细胞，所述植物细胞中EMB2799蛋白的编码基因失活。

在优选的实施方式中，通过基因剔除、基因中断或基因插入造成EMB2799基因失活。

在另一优选的实施方式中，所述的失活还包括EMB2799基因不表达，或表达没有活性的EMB2799蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了野生型拟南芥(WT)和突变型拟南芥(130)的表型、130图位克隆结果、误剪切产物、130T-DNA插入突变体emb2279-1表型以及emb2279-1与130等位测试结果。

图2显示了在突变型拟南芥中转化野生型的EMB2279基因后获得的转基因拟南芥(35S:EMB2279/130)，在野生型拟南芥中转入干扰野生型拟南芥中EMB2279基因表达的干扰分子后获得的转基因拟南芥(Ami-EMB2279/Col)的表型。

图3显示了拟南芥AtEMB2279-GFP融合蛋白定位于叶绿体中。

图4显示了野生型拟南芥以及AtEMB2279功能缺失的突变型拟南芥的叶绿体超微结构。

图5显示了野生型拟南芥以及AtEMB2279功能缺失的突变型拟南芥光和特性的比较。

图6显示了拟南芥EMB2279的靶标。

图7显示了在突变型拟南芥中转化EMB2279-GFP（35S:EMB2279-GFP/130）以及EMB2279-FLAG（35S:EMB2279-FLAG/130）后获得的转基因拟南芥的表型。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现EMB2279基因与植物的叶片转绿过程以及叶绿体的成熟相关，进而发现EMB2279蛋白是定位于叶绿体中的特异性加工叶绿体基因表达的调控因子，利用EMB2279基因可调节植物叶片颜色性状。在此基础上完成了本发明。

植物

本文所用的术语“植物”是指可以借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质等来维系生存，并通常不发生移动的生物。在具体的实施方式中，本文所述的“植物”通常包括粮食作物和经济作物。所述粮食作物指以收获成熟果实为目的，经去壳、碾磨等加工程序而成为人类基本食粮的一类作物，例如谷类作物、薯类作物和豆类作物。而所述经济作物，又称技术作物、工业原料作物，其指具有某种特定经济用途的农作物，包括蔬菜、瓜果、花卉等园艺作物。

在优选的实施方式中，本文所述的“植物”包括但不限于：十字花科、豆科、脂麻科、菊科、藜科、山茶科、茜草科、梧桐科、茄科、五加科、多孔菌科、百合科、壳斗科、棕榈科、龙舌兰科。

在进一步优选的实施方式中，本文所述的“植物”包括但不限于：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦、水稻、玉米、燕麦、黑麦、大麦、粟、高粱、青稞、棉花、麻类、花生、油菜、芝麻、大豆、向日葵、甜菜、甘蔗、茶叶、咖啡豆、可可、烟草、人参、灵芝、贝母、橡胶、椰子、油棕和剑麻，等等。

鉴于本发明的教导，本领域技术人员应该明白，本文所述的植物是其中的EMB2279基因或其蛋白的表达或活性得到抑制或增强的植物。本领域技术人员还应明白，除了成体植物本身，本文所述的植物还包括植物种子、植物细胞、植物组织或器官。

在具体的实施方式中，本发明的植物包括：转入了EMB2279基因或其同源基因的转基因植物；或者EMB2279蛋白表达量降低(包括低表达或不表达)或表达无活性EMB2279蛋白的植物，等等。

EMB2279基因及其蛋白

在本发明中，术语“EMB2279蛋白”指具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。然而，鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白该术语包括EMB2279蛋白的变异形式，所述变异形式具有与EMB2279蛋白相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ IDNO:2所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与EMB2279蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗EMB2279蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EMB2279蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了EMB2279蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有EMB2279蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供EMB2279蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然EMB2279蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“EMB2279蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu

Cys(C)	Ser	Ser
			Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro;Ala	Ala
His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
			Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
			Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
			Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
			Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本领域技术人员明白，本发明的EMB2279蛋白还包括EMB2279蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的EMB2279蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种EMB2279蛋白的生物活性片段都可以应用于本发明。在本文中，EMB2279蛋白的生物活性片段是指EMB2279蛋白的片段，但其仍然能保持全长EMB2279蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长EMB2279蛋白的50%的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长EMB2279蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的EMB2279蛋白”或“分离的EMB2279多肽”是指EMB2279蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EMB2279蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。“At EMB2279蛋白”或“AtEMB2279多肽”是指拟南芥的“EMB2279蛋白”或“EMB2279多肽”。

本发明还提供了编码本发明EMB2279蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2所示成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EMB2279蛋白的多聚核苷酸。

此外，应理解，虽然本发明的EMB2279基因优选获自拟南芥，但是获自其它植物，例如水稻、玉米、大豆、葡萄、蓖麻、杨树、高粱中与拟南芥EMB2279基因高度同源(如具有70%以上的序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。因此，本发明亦适用其它植物，例如水稻、玉米、大豆、葡萄、大豆、蓖麻、杨树、高粱。换言之，本文所述的“EMB2279基因或其蛋白”还包括来自其它植物的EMB2279基因或其蛋白。

本发明的EMB2279蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或EMB2279蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的EMB2279蛋白。一般来说有以下步骤：

1.用本发明的编码EMB2279蛋白的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

2.在合适的培养基中培养的宿主细胞；

3.从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，EMB2279蛋白多核苷酸序列可插入重组表达载体。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含EMB2279蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得叶片颜色性状发生改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

EMB2279基因及其蛋白的应用

本发明的EMB2279蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或拮抗EMB2279蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组EMB2279蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的抑制或刺激EMB2279蛋白功能的多肽分子。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用EMB2279蛋白的特异性引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测EMB2279蛋白的转录产物。

本发明提供了所述EMB2279蛋白的用途，用于调节植物叶绿体成熟。在具体的实施方式中，可调节植物叶片的颜色性状(如促进植物叶片转绿)；或用于筛选对于调节植物叶片的颜色性状有用的物质(即：所述物质通过调节EMB2279蛋白的表达来调节植物叶片的颜色性状)。作为一种优选方式，所述的EMB2279蛋白可用于促进植物叶片转绿。比如，对于某些EMB2279蛋白表达低下的植物或植株，可通过制备该种植物或植株的EMB2279蛋白表达提高的转基因植株，来促进植物叶片转绿，达到改良植物的目的。

所述的EMB2279蛋白还可用于制备促进植物叶片转绿的组合物。

本发明还涉及EMB2279的促进剂或拮抗剂及其用途。由于EMB2279的促进剂或拮抗剂可调节EMB2279的表达和/或调节EMB2279的活性等，因此，所述的EMB2279的促进剂或拮抗剂也可通过对EMB2279的影响来调节植物叶片的颜色性状，从而达到改良植物的目的。

任何可提高EMB2279蛋白的活性、提高EMB2279蛋白的稳定性、促进EMB2279蛋白的表达、延长EMB2279蛋白有效作用时间、或促进EMB2279的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于促进植物叶片转绿的有效物质。任何可降低EMB2279蛋白的活性、降低EMB2279蛋白的稳定性、抑制EMB2279蛋白的表达、减少EMB2279蛋白有效作用时间、或降低EMB2279的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为EMB2279的拮抗剂，例如抗所述EMB2279蛋白的抗体，干扰所述EMB2279蛋白的编码基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述的拮抗剂可用于制备叶片颜色性状改变的植物，如叶片黄化的植物。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

再例如，在EMB2279基因或其蛋白的活性或表达不足或不表达的植物中转入外源性EMB2279基因可调节其叶片颜色等性状。因此，在具体的实施方式中，促进EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质可以是EMB2279基因或其蛋白本身。在具体的实施方式中，干扰或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质包括但不限于：EMB2279基因的反义RNA或EMB2279蛋白的抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。

由于本发明人出乎意料地发现EMB2799基因或其蛋白在调控植物叶绿体成熟，促进或拮抗EMB2799基因或其蛋白的功能均能对植物产生有益的作用。如果抑制或拮抗植物中EMB2799基因或其蛋白的功能，就可以控制植物的各种性状，例如观赏植物叶片的颜色等性状，从而获得更有价值的植物。本发明提供一种植物细胞，所述植物细胞中EMB2799基因失活。

本领域技术人员熟知如何使得细胞，例如植物细胞中的EMB2799基因失活。例如，通过基因剔除、基因中断或基因插入而造成EMB2799基因失活。在另一优选例中，所述的失活还包括EMB2799基因不表达，或表达没有活性的EMB2799蛋白。

本发明方法

本发明提供调控植物叶绿体成熟的方法，所述方法包括以下步骤：a)将促进或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质给予植物、植物种子、植物细胞、组织或器官；和b)培养步骤a)获得的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。

在优选的实施方式中，所述促进EMB2279基因或其蛋白的活性或表达指使EMB2279基因或其蛋白的表达量升高或过表达，或表达活性更高的蛋白变体；而所述拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达指使EMB2279基因或其蛋白的表达量降低或不表达，或表达无活性的EMB2279蛋白。

在具体的实施方式中，所述促进或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质包括但不限于：EMB2279基因本身、EMB2279基因的反义RNA或EMB2279蛋白的抗体。

在得知EMB2279蛋白的功能后，本领域人员可采用多种熟知的方法来增强EMB2279蛋白的表达或活性。例如，可通过本领域人员已知的途径将携带EMB2279基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的EMB2279蛋白。例如，将编码EMB2279蛋白的基因通过常规方法克隆至适当载体，将带有外源基因的重组载体导入可表达EMB2279蛋白的植物细胞，进而使所述植物细胞表达EMB2279蛋白。将所述植物细胞再生成植物，便可获得过量表达EMB2279蛋白的植物。

其它增加EMB2279基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动来增强EMB2279基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该EMB2279基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低EMB2279蛋白的表达或使之不表达。例如可将携带反义EMB2279基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达EMB2279蛋白。本领域技术人员知晓抑制EMB2279基因或其同源基因表达的方法。本领域技术人员还知晓抑制或降低EMB2279蛋白活性的方法，例如，利用EMB2279蛋白的抗体，包括但不限于：EMB2279蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清。

在具体的实施方式中，可将编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入植物、植物种子、植物细胞、组织或器官，获得转化入编码EMB2279蛋白的多核苷酸的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。

在优选的实施方式中，可将植物、植物种子、植物细胞、组织或器官与携带含有编码EMB2279蛋白的多核苷酸的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接触，从而使编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入植物细胞，并整合到植物细胞的染色体上。

在另一方面，本发明提供利用EMB2279基因或其蛋白筛选叶绿体成熟促进剂或拮抗剂的方法，包括：

a)将待测物质给予某植物；

b)检测该植物中EMB2279基因或其蛋白的活性或表达情况；

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达上调，则所述待测物质是叶绿体成熟促进剂；

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达下调，则所述待测物质是叶绿体成熟拮抗剂。

本发明的主要优点

1.本发明首次发现EMB2279基因或其蛋白具有调节植物叶绿体成熟的功能；

2.本发明的EMB2279基因或其蛋白调节叶片颜色性状的效果明显，为转基因技术改良农作物或者园艺植物提供了很好的基因资源；

3.使用本发明的EMB2279基因可以通过转基因技术快速培育出植物叶片颜色性状改变(如叶片颜色变绿或黄化)的各种新品种。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.植物叶片转绿调控基因的鉴定

本发明人用0.2%(V/V)的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变拟南芥野生型Col-0生态型(获自美国ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center))，经M2代筛选与M3代鉴定，获得一个稳定的叶色逐渐转绿株系（突变体）。与Col-0相比，突变体的新叶为黄色，而老叶则转为绿色，在整个生长过程中均如此，并且其叶缘呈锯齿型，植株生长速率相对较慢。

将野生型Col-0作为父本、突变体作为母本杂交得到的F1代或将突变体作为父本、野生型Col-0作为母本杂交得到的F1代，植株均同野生型一样，无叶片黄化表型，表明该基因为细胞核编码的隐性基因。播种从F1代植株上收获的种子得到F2代植株，在随机取的植株中，叶片逐步转绿植株与正常植株的比例为1比3，表明该基因为单位点隐性突变。

将该突变体与拟南芥野生型Ler生态型（获自美国ABRC(ArabidopsisBiologicalResource Center)）杂交得到F1代，F1代自交获得F2代图位克隆群体，利用基于拟南芥DNA多态性数据库(http://www.arabidopsis.org/)中简单序列长度多态性(simple sequencelength polymorphism，SSLP)的InDel标记对突变基因进行定位。随机选取60个突变植株抽提DNA，每30个突变体DNA混成一个DNA池，进行基因的BSA(分群分析法，Bulk segregateanalysis)分析。用覆盖基因组的20对分子标记进行PCR扩增，同时扩增Col-0、Ler、F1的DNA作为对照，将突变基因初步定位在1号染色体上臂。然后扩大群体进行精细定位，检测到一个点突变，该突变位点位于EMB2279基因第七个内含子的第一个碱基，从而导致该基因的部分转录本的第7内含子不能被正常剪切，因此在突变体中，可以检测到两个转录本，EMB2279蛋白是一个叶绿体PPR蛋白，含有11个PPR结构域，其T-DNA插入突变体emb2279-1(salk_088420)的杂合子中有约25%的败育种子，纯合子表现出胚胎致死的表型。将我们的等位基因——130与emb2279-1杂交得到的F1代植株呈现更白化的表型，进一步证明了130是EMB2279的一个亚效的等位突变。

AtEMB2279基因编码区基因组(genomic DNA)序列如下(SEQ ID NO:1；其中小写斜体字为5’UTR、内含子和3’UTR，大写正体字为外显子序列)：

ATGGCGGTGACGATTTCGACGAATGCTTTCGTAAATGCATCGCTTTTAGATGAAAGTCGGAATTCTTTCTGGAGACCATTGTTTCATCAGCCATACTATAATTGCCGACGAGTCGTTCGTCTTAATTCGAGGAAATTGAATTCAAAGGTAATGTTTTGCTTGAATTTGAACACGAAGGAGGTTGGTTTGCAAAAACCCGGTGATAAAGGTTTTGAATTCAAACCCAGTTTTGATCAGTACCTGCAAATCATGGAATCGGTTAAAACAGCAAGGAAGAAGAAGAAATTCGACAGATTGAAAGTTGAGGAAGATGATGGTGGAGGTGGGAATGGTGATAGTGTTTATGAAGTGAAAGATATGAAGATTAAGAGTGGTGAGCTAAAAGATGAAACTTTCAGGAAGAGATACTCAAGGCAGGAGATTGTAAGTGATAAACGTAATGAGAGAGTTTTCAAGAGGAATGGAGAAATTGAAAATCATAGAGTGGCTACAGATTTGAAATGGAGTAAGAGTGGTGAATCTTCAGTGGCTCTGAAATTGAGTAAGAGTGGTGAATCTTCAGTGACTGTGCCTGAAGATGAGAGTTTCAGGAAAAGGTACTCTAAGCAGGAGTATCACCGTTCCTCTGATACATCGAGAGGGATTGAAAGAGGTTCGAGAGGTGATGAATTGGATCTTGTTGTTGAAGAAAGGAGAGTTCAGAGAATAGCCAAAGATGCAAGATGGAGTAAAAGTCGTGAATCTTCAGTGGCTGTGAAATGGAGTAATAGTGGTGAATCTTCAGTGACTATGCCTAAAGATGAGAGCTTTAGGAGAAGATACTCTAAGCAGGAGCATCACCGTTCCTCTGATACATCCAGAGGGATTGCAAGAGGTTCAAAAGGTGATGAATTGGAGCTTGTTGTTGAAGAAAGGAGAGTTCAGAGAATAGCCAAAGATGTAAGATGGAGTAAGAGTGATGAATCTTTAGTGCCTGTGTCAGAAGATGAGAGTTTCAGGAGAGGGAATCCGAAGCAGGAGATGGTGAGGTATCAGCGTGTCTCTGATACATCGAGAGGGATTGAGAGAGGTTCCAAAGGAGATGGATTGGATCTTCTTGCTGAAGAAAGGCGGATTGAGAGATTAGCCAATGAGAGGCATGAGATAAGAAGTAGCAAATTGAGTGGAACCAGGAGAATTGGTGCTAAGAGAAATGATGATGATGATGATAGCTTGTTTGCCATGGAAACTCCTGCCTTTAGGTTTTCTGATGAGTCCAGTGACATAGTGGACAAGCCAGCTACTTCACGAGTCGAAATGGAAGACAGAATCGAGAAGTTAGCAAAAGT GTTGAATGGTGCAGACATCAATATGCCTGAGTGGCAGTTTTCCAAGGCGATCAGGAGTGCAAAAATCAGATATACGGATTACACAGTAATGAGACTGATCCACTTTCTAGGGAAACTAGGAAACTGGAGACGAGTTCTTCAAGTCATTGAGTGGCTTCAAAGGCAAGACCGTTACAAATCTAACAAGATAAG AATCATCTATACAACTGCACTAAATGTTCTTGGTAAATCAAGGAGGCCTGTGGAAGCTCTCAATGTATTCCACGCTATGCTG TTACAAATTTCATCATATCCGGATATGGTAGCATACCGTTCAATTGCAGTCACACTTGGACAAGCTGGGCATATCAAGGAACTCTTCTATGTGATTGACACAATGAGGTCTCCACCTAAAAAGAAGTTCAAGCCAACAACACTTGAAAAATGGGATCCCCGGCTTGAACCAGATGTTGTTGTTTACAATGCG GTGCTCAACGCATGTGTTCAACGAAAGCAATGGGAAGGAGCATTCTGGGTATTGCAACAGTTGAAGCAACGAGGGCAAAAACCTTCTCCTGTAACCTATGGCCTCATCATGGAG GTAATGTTAGCATGTGAGAAGTACAATTTAGTTCATGAATTCTTCAGGAAGATGCAGAAATCTTCTATCCCTAATGCTCTAGCATATAGAG TTCTTGTTAATACTCTATGGAAAGAAGGTAAAAGCGACGAGGCCGTACATACGGTTGAGGATATGGAAAGCCGTGGTATTGTTGGATCAGCTGCTCTTTACTACGACCTTGCTCGCTGTCTATGTAGCGCAGGAAGGTGTAATGAAGGGCTCAATATG CTTAAGAAGATATGTAGAGTTGCAAATAAACCTCTCGTGGTGACTTACACTGGCCTGATCCAAGCATGCGTCGACTCGGGAAACATCAAGAATGCAGCTTACATCTTCGATCAGATGAAGAAGGTCTGCAGCCCTAACCTAGTCACTTGCAACATAATGCTAAAAGCTTATCTACAAGGCGGATTGTTTGAAGAAGCAAGGGAACTTTTCCAGAAGATGTCAGAAGACGGAAATCATATAAAAAACAGCTCGGATTTCGAATCAAGAGTATTGCCAGACACGTACACGTTCAACACGATGCTAGACACGTGTGCTGAACAAGAAAAGTGGGATGATTTTGGTTATGCGTATCGGGAGATGTTGCGTCATGGATACCATTTCAATGCGAAACGCCATCTCAGAATGGTACTTGAAGCTAGCAGAGCAGGAAAG GAGGAGGTGATGGAAGCGACATGGGAACACATGAGACGAAGTAATAGAATTCCGCCATCGCCTCTAATCAAAGAAAGATTCTTCAGGAAACTCGAGAAAGGCGATCATATTTCGGCTATATCATCTCTTGCTGATCTTAATGGAAAAATTGAGGAGACTGAGTTACGAGCATTTTCAACTTCCGCATGGTCCAGAGTCTTGTCCCGATTTGAGCAAGATTCAGTTTTGAGGTTAATGGACGATGTGAACAGACGCCTAGGTTCGAGAAGTGAGTCTTCGGATTCGGTTTTGGGGAATCTATTGAGTTCTTGTAAAGATTATCTGAAGACCAGAACACATAACTTGTAA

AtEMB2279蛋白序列如下(SEQ ID NO:2)：

MAVTISTNAFVNASLLDESRNSFWRPLFHQPYYNCRRVVRLNSRKLNSKVMFCLNLNTKEVGLQKPGDKGFEFKPSFDQYLQIMESVKTARKKKKFDRLKVEEDDGGGGNGDSVYEVKDMKIKSGELKDETFRKRYSRQEIVSDKRNERVFKRNGEIENHRVATDLKWSKSGESSVALKLSKSGESSVTVPEDESFRKRYSKQEYHRSSDTSRGIERGSRGDELDLVVEERRVQRIAKDARWSKSRESSVAVKWSNSGESSVTMPKDESFRRRYSKQEHHRSSDTSRGIARGSKGDELELVVEERRVQRIAKDVRWSKSDESLVPVSEDESFRRGNPKQEMVRYQRVSDTSRGIERGSKGDGLDLLAEERRIERLANERHEIRSSKLSGTRRIGAKRNDDDDDSLFAMETPAFRFSDESSDIVDKPATSRVEMEDRIEKLAKVLNGADINMPEWQFSKAIRSAKIRYTDYTVMRLIHFLGKLGNWRRVLQVIEWLQRQDRYKSNKIRIIYTTALNVLGKSRRPVEALNVFHAMLLQISSYPDMVAYRSIAVTLGQAGHIKELFYVIDTMRSPPKKKFKPTTLEKWDPRLEPDVVVYNAVLNACVQRKQWEGAFWVLQQLKQRGQKPSPVTYGLIMEVMLACEKYNLVHEFFRKMQKSSIPNALAYRVLVNTLWKEGKSDEAVHTVEDMESRGIVGSAALYYDLARCLCSAGRCNEGLNMLKKICRVANKPLVVTYTGLIQACVDSGNIKNAAYIFDQMKKVCSPNLVTCNIMLKAYLQGGLFEEARELFQKMSEDGNHIKNSSDFESRVLPDTYTFNTMLDTCAEQEKWDDFGYAYREMLRHGYHFNAKRHLRMVLEASRAGKEEVMEATWEHMRRSNRIPPSPLIKERFFRKLEKGDHISAISSLADLNGKIEETELRAFSTSAWSRVLSRFEQDSVLRLMDDVNRRLGSRSESSDSVLGNLLSSCKDYLKTRTHNL

实施例2.拟南芥EMB2279功能缺失的表型与遗传互补鉴定

1.遗传互补鉴定

为证实叶色逐步转绿的表型确实与EMB2279基因有关，本发明人进行了遗传互补分析。通过PCR扩增，克隆了它的全长cDNA，构建花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的重组表达载体。

以5’-CACCATGGCGGTGACGATTTCGAC-3’(SEQ ID NO:4)和5’-TTACAAGTTATGTGTTCTGGTCTTC-3’(SEQ ID NO:5)为引物，从拟南芥野生型Col-0生态型的cDNA文库中PCR扩增获得EMB2279基因的全长cDNA，利用Getaway克隆系统导入pENTR/SD/D-TOPO克隆载体(购自Invitrogen公司)，测序正确后通过LR反应(LR CLONASE Enzyme Mix，购自Invitation公司)至表达载体PGWB2(Invitrogen)，获得重组表达质粒。将重组表达质粒常规方法转入农杆菌GV3101(购自Invitrogen)。

拟南芥转化采用喷洒法，将含有重组表达质粒的农杆菌均匀喷洒拟南芥，至叶片上有液滴落下，将植物避光过夜。之后将植物转移到正常条件下生长。7天后按上述方法重复转化1次。待种子成熟后将植株混合采收，在干燥器中放置7天。T1代种子消毒后播种在含有50μg/ml Kan的1/2×MS培养基上，4℃放置72h，然后正常光照培养。

结果，在实施例1获得的突变体植物中转化野生型的EMB2279基因后，获得了多个叶色转绿恢复的转基因株系，其表型见图2。

2.功能缺失表型的建立

针对EMB2279基因的序列特异性，根据WMD 2-Web MicroRNA Designer设计了产生人工microRNA(AmiRNA)的PCR引物如下：

MIR-EMB2279-I miR-s(SEQ ID NO:6)：

5’-gaTGAGACACGCTGATACCCCACtctctcttttgtattcc-3’；

MIR-EMB2279-II miR-a(SEQ ID NO:7)：

5’-gaGTGGGGTATCAGCGTGTCTCAtcaaagagaatcaatga-3’；

MIR-EMB2279-III miR*s(SEQ ID NO:8)：

5’-gaGTAGGGTATCAGCCTGTCTCTtcacaggtcgtgatatg-3’；

MIR-EMB2279-IV miR*a(SEQ ID NO:9)：

5’-gaAGAGACAGGCTGATACCCTACtctacatatatattcct-3’。

通过对出发质粒pRS300(参见WO2009001398)的PCR突变(参见The PlantCell,Vol.18,1121-1133,2006年5月提供的方法)，获得了含针对EMB2279的人工回文序列的片段，然后用A、B引物扩增出含有EMB2279靶向序列的片段克隆到pENTR/SD/D-TOPO载体，LR反应至表达载体PGWB2。

A引物(SEQ ID NO:10)：

5’-CACCCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’；

B引物(SEQ ID NO:11)：

5’-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’。

将上述载体通过农杆菌转化野生型Col-0生态型，结果获得了多个叶片转绿明显变慢的转基因T1株系，其表型见图2(Ami-EMB2279/Col)，其新生叶片显示黄色。

其中，EMB2279目标microRNA的特异性序列为：5’-GAGACACGCTGATACC-3’(SEQ IDNO:3)。

实施例3.拟南芥AtEMB2279-GFP融合蛋白定位于叶绿体中

本发明人用前述方法克隆AtEMB2279N端96AA的信号肽到pENTR/SD/D-TOPO载体，引物序列为5’-CACCATGGCGGTGACGATTTCG-3’(SEQ ID NO:12)和5’-GAATTTCTTCTTCTTCCTTGCTG-3’(SEQ ID NO:13)，LR反应至P2GWY7表达载体。将此融合表达载体进行原生质体转染。

原生质体转染方法参考Wu等，Plant Methods,2009。称取1%的纤维素酶和0.25%的果胶酶的粉末，加入10ml预先配好的酶溶液底液制成10ml酶溶液，放于一干净的培养皿中。取成熟叶片7-10张，正面粘在双面胶上,反面粘在隐型胶带上，用镊子轻压一下，撕去隐型胶带（带下表皮），暴露出叶肉细胞，朝下放在装有酶溶液的培养皿中，室内光下40rpm水平摇转1-2h后可看到叶片上的绿色细胞释放进入到溶液中。将溶液吸到10ml离心管，100g离心3min，弃上清，先加入少量预冷的W5溶液(154mM NaCl,125mM CaCl₂,5mM KCl,5mM葡萄糖,2mM MES,pH5.7)，轻轻悬浮细胞，再加入10ml W5溶液，颠倒一下，100g离心3min。弃上清，重复洗涤一次后加入~500ul W5溶液，轻轻悬浮细胞，冰上孵育30min，此时可用血球计数器在光学显微镜下对分离得到的细胞进行计数。离心细胞并将其悬浮在MMg溶液(0.4M甘露醇,15mM MgCl₂,4mM MES,pH5.7)中，浓度在2-5×10⁵细胞/毫升。100ul MMg溶液中约含2.5×10⁴个原生质体，加入3~5ug质粒(10ul)，室温下慢慢加入相等体积的新鲜PEG溶液(110ul)并孵育5~15min，慢慢加入1.5ml W5(分为200ul，400ul，800ul三次加入，加入后轻轻混匀，分别孵育1-2min)，100g离心3min弃上清，重复洗涤1次，重悬于500~1ml W5溶液，转移到12孔细胞培养板进行避光培养过夜，Confocal观察。

YFP荧光通过激光共聚焦扫描显微镜(FITC488，Zeiss LSM500)观察。YFP荧光检测激发波长为488nm，发射波长为505至545nm。叶绿素自发荧光检测激发波长为488nm，发射波长为585nm。

结果如图3所示，可见拟南芥AtEMB2279N_1-96Aa-YFP融合蛋白定位于叶绿体中。

实施例4.拟南芥AtEMB2279功能缺失对叶绿体超微结构的影响

利用透射电镜对野生型Col-0和突变体拟南芥的叶绿体进行观察，Col-0的叶绿体可以观察到完整的双层膜结构，以及内部相互连接的基粒与间质类囊体；来自突变体15天幼嫩叶片(130-15d)的叶绿体发育有缺陷，叶绿体变小，片层垛叠变少。而来自30天的成熟叶片(130-30d)的叶绿体超微结构与野生型没有明显区别。见图4。

实施例5.拟南芥AtEMB2279突变对光合特性的影响

将叶片暗适应20min，用Imagining-Pum M-Series叶绿素荧光仪系统(Walz,德国)测定野生型和130叶片的叶绿素荧光，发现Fv/Fm(指征PSII光合效率)在130新叶中远低于成熟叶片。与之对应的是NPQ(非光化学淬灭，也叫热耗散，指征用于非光合作用的光能)在新叶中要高于老叶。这些都说明130新叶的光合能力低于成熟叶片，暗示其叶绿体的发育变缓。见图5。

实施例6.寻找拟南芥EMB2279的靶标

PPR蛋白家族成员在植物基因组中的为数众多，现有的研究表明它们大多定位于线粒体或叶绿体，参与其RNA的加工包括剪切、成熟、编辑和稳定等过程。我们推测EMB2279参与叶绿体RNA的加工过程。通过RT-PCR检测野生型和130突变体中叶绿体基因的表达模式，我们发现一个含内含子的质体基因rpl2在130突变体中积累了未剪切的转录本，同时发现在EMB2279敲减植株-AmiREMB2279中也积累了未剪切的rpl2转录本，而其它质体基因的剪切未受影响，说明EMB2279可能特异调控了质体基因rpl2的剪切。见图6。

本发明人在拟南芥AtEMB2279基因功能研究过程中发现，基因下调及上调植株表型明显，性征可以遗传。并且，对AtEMB2279基因的调节作用还可用于其它植物例如水稻、烟草、蔬菜、油菜等的叶片颜色调控。

实施例6.EMB2279蛋白突变体

发明人还制备了带有FLAG-tag以及GFP的EMB2279蛋白的变异形式。在突变型拟南芥中转化EMB2279-GFP（35S:EMB2279-GFP/130）以及EMB2279-FLAG（35S:EMB2279-FLAG/130）后，转基因植株均可以恢复表型(实验结果参见图7)。因此对SEQ ID NO:2所示氨基酸序列作少量突变得到的突变蛋白亦能具备原EMB2279蛋白的功能。

实施例9.利用EMB2279基因或其蛋白改变叶片颜色

发明人将EMB2279蛋白的编码基因导入观赏植物，培养后发现转基因植物可以改变叶色，从而提高了植物的观赏性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.EMB2279基因或其蛋白在调控拟南芥叶绿体成熟中的应用，其中EMB2279蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。

2.一种调控拟南芥叶绿体成熟的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)将促进或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表达的物质给予拟南芥、拟南芥种子、拟南芥细胞、组织或器官；和

b)培养步骤a)获得的拟南芥、拟南芥种子、拟南芥细胞、组织或器官；

其中EMB2279蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤a)是将编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入拟南芥、拟南芥种子、拟南芥细胞、组织或器官，获得转化入编码EMB2279蛋白的多核苷酸的拟南芥、拟南芥种子、拟南芥细胞、组织或器官。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a)是将拟南芥、拟南芥种子、拟南芥细胞、组织或器官与携带含有编码EMB2279蛋白的多核苷酸的农杆菌接触，从而使编码EMB2279蛋白的多核苷酸转入拟南芥细胞，并整合到拟南芥细胞的染色体上。

5.EMB2279基因或其蛋白在筛选拟南芥叶绿体成熟促进剂或拮抗剂中的应用，其中EMB2279蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。

6.一种筛选拟南芥叶绿体成熟促进剂或拮抗剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)将待测物质给予拟南芥；

b)检测该拟南芥中EMB2279基因或其蛋白的活性或表达情况；

如果与未给予待测物质的对照拟南芥相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达上调，则所述待测物质是叶绿体成熟促进剂；

如果与未给予待测物质的对照拟南芥相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表达下调，则所述待测物质是叶绿体成熟拮抗剂；

其中EMB2279蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。