CN104561084B

CN104561084B - 促进大白菜提前结球的转录因子spl9‑2及其应用

Info

Publication number: CN104561084B
Application number: CN201310493306.0A
Authority: CN
Inventors: 何玉科; 王亚丽; 吴斐婕; 白金娟
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2033-10-18
Also published as: CN104561084A

Abstract

本发明提供了一种叶球结球进程相关基因及其应用。具体地，本发明提供了通过促进或抑制BrpSPL9‑2基因或其蛋白来调节叶球类植物的结球进程的方法。所述方法可用于控制叶球类植物的结球进程。本发明的BrpSPL9‑2基因(尤其是突变型基因)具有广泛的应用价值，为转基因技术改良叶球类植物提供了新的途径。

Description

促进大白菜提前结球的转录因子SPL9-2及其应用

技术领域

本发明属于作物遗传学领域，具体地，本发明涉及一种新的叶球结球进程相关基因及其在调控叶球类植物的结球进程中的应用。

背景技术

现今农业上的蔬菜品种从食用部位来看，可以分为叶类蔬菜，根茎类蔬菜和果实类蔬菜。其中在叶类蔬菜中，叶球类蔬菜是一个重要的组成部分，其中较为常见的有结球白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)，结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitataL)和结球生菜(Lactuca sativa var.capitata L.)。结球白菜(又称大白菜)，是亚洲地区传统的蔬菜作物

叶球作为该类蔬菜的储存器官，是其可食用部分，具有重要的农业价值和商品价值。从形态上看，叶球是一种变态器官，由轮生的叶片相互抱合而成，叶子向内弯曲是叶球发生的显著特征。

已经知道，许多因素会影响植物叶球的发生和发育过程。生长素在叶片内的不均衡分布、较低的温度和较大的昼夜温差、弱光、短日照以及充足的碳素营养都可以促进叶球的发生和发育(Ito，1957)。因此，叶球的发生是一个复杂的生物学过程，是在环境因子诱导下的形态学反应。在此过程中表达的基因是调控植物接受外界信号和展开发育活动的关键环节。

以大白菜为例，在栽培条件下，大白菜需要一个长时间的营养生长来形成叶球，通常可以分为4个时期：幼苗期，莲座期，包心期和结球期，通过叶形态的特点来划分。在幼苗期，幼态叶生长并分化为成熟叶；在莲座期，展开的叶片通过提供光合作用产物的方式辅助叶球形成。包心的叶片分化并向内弯曲为叶球形成提供架构和遮蔽，而叶球的叶片紧紧地围绕茎尖形成储存营养物质的叶球。通常来说，诸如温度，光照，生长素浓度以及碳氮比都认为和叶球形成有关(等，1988；He等，2000)。由于叶球是大白菜的主要食用器官，因此大白菜叶球发育的好坏决定了大白菜的品质和农业价值。我国育种家采用传统的育种方法广泛开展大白菜类蔬菜品种的选育工作，扩大资源来源途径，开展多种品种间的杂交组合，一定程度提高了白菜类蔬菜叶球性状，并选育了大量抗虫抗病，快速生长的品种，在生产上已经发挥了作用。然而，传统的育种学在原有的基础上进行品种的优选优育，但由于现有品种的局限性，传统的配置杂交组合的育种方法受到了一定的限制性，为了适应农业生产的需要，采用新的技术手段来开发更为早熟，结球品种更为多样化的的大白菜品种变得日益重要。此外，除了大白菜以外，对结球甘蓝，结球生菜等其他叶球类蔬菜的叶球农业性状的改良，也具有十分重要的意义。

植物体基因表达具有时空特异性，即在不同的时间、空间条件下，有不同的功能基因表达，从而调控不同的生理进程。对于叶球类植物而言，其结球进程也是受基因、环境等因素影响的。在环境基本恒定的情况下，结球进程主要受基因的调控。

目前研究发现，miR156及其调控的SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE(SPL)基因家族调控拟南芥从幼苗期到成年期的时期转换(Wu等，2009；Schwab等，2005)。过量表达miR156基因能够延长拟南芥的幼苗期并延迟开花，与此相对的，过量表达SPL促进拟南芥更早的进入成熟期并提早开花(Wang等，2009；Wu等，2009)。SPL能够直接结合到miR172b的启动子上，激活miR172b的表达，从而抑制APETALA2(AP2)蛋白的活性，促进拟南芥开花(Aukerman等，2003；Wang等,2009)。

相对于拟南芥的营养生长的2个时期，结球白菜在营养生长阶段具有4个时期：幼苗期，莲座期，包心期和结球期。这4个时期构成了白菜的一个结球进程。结球白菜只有完成了这4个时期，才能发育出一个完整的叶球。然而，迄今为止，本领域对于影响白菜结球进程的基因或调控机理了解甚少，因此本领域迫切需要开发调节叶球类植物结球进程的相关基因及其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种可调节叶球类植物结球进程的相关基因及其应用。

在本方面的第一方面，提供了一种BrpSPL9-2基因或其蛋白在调控叶球类植物的结球进程中的应用。

在另一优选例中，所述的调控叶球类植物的结球进程指促进结球。

在另一优选例中，所述的叶球类植物包括叶球类蔬菜，较佳地为结球白菜、结球甘蓝(卷心菜)或结球生菜。

在另一优选例中，所述的应用是用于制备调控叶球类植物的结球进程的试剂。

在本发明的第二方面，提供了一种调控叶球类植物的结球进程的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将促进或拮抗BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质给予所述叶球类植物、植物种子、植物细胞、组织或器官；和

(b)培养步骤(a)获得的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官，从而调控叶球类植物的结球进程。

在另一优选例中，在步骤(a)中，给予促进BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质，从而加速结球进程。

在另一优选例中，在步骤(a)中，给予拮抗BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质，从而延缓结球进程。

在另一优选例中，所述的促进BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质包括特异性与miR156结合的反义序列，或表达所述反义序列的载体。

在另一优选例中，所述的拮抗BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质包括miR156。

在另一优选例中，所述步骤(a)是将编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸转入所述叶球类植物、植物种子、植物细胞、组织或器官，获得转化入编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。

在另一优选例中，所述步骤(a)是将植物、植物种子、植物细胞、组织或器官与携带含有编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接触，从而使编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸转入植物细胞，并整合到植物细胞的染色体上。

在另一优选例中，所述的编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸具有以下特征：

(i)所述多核苷酸编码野生型的BrpSPL9-2蛋白或具有与野生型的BrpSPL9-2相同功能的突变蛋白；和

(ii)所述编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸中不存在与miR156结合的结合区。(注：在对应的野生型BrpSPL9-2基因中，存在与miR156结合的结合区)

在本发明的第三方面，提供了BrpSPL9-2基因或其蛋白在筛选叶球类植物的结球进程促进剂或拮抗剂中的应用。

在本发明的第四方面，提供了一种筛选叶球类植物的结球进程促进剂或拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将待测物质给予某植物；

b)检测该植物中BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达情况；

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达上调，则所述待测物质是结球进程促进剂；

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达下调，则所述待测物质是结球进程拮抗剂。

在本发明的第五方面，提供了一种不受miR156调控的突变型BrpSPL9-2蛋白的编码基因，所述的编码基因具有以下特征：

(i)所述突变型编码基因编码野生型的BrpSPL9-2蛋白或具有与野生型的BrpSPL9-2相同功能的突变蛋白；和

(ii)所述突变型编码基因的核苷酸中不存在与miR156结合的结合区。

在另一优选例中，“不存在与miR156结合的结合区”指缺失野生型BrpSPL9-2的miR156结合区，或者对应区域是与miR156序列不互补，从而不发生结合。

在另一优选例中，在对应于野生型BrpSPL9-2与miR156结合的结合区，所述的编码基因的相应序列为GCGCCTTAAGCTTGTTAAGC,即SEQ ID NO.:3中第743-762位。

在另一优选例中，所述的与miR156结合的结合区所对应于的RNA序列为GCGCCUUAAGCUUGUUAAGC(SEQ ID NO.:21)。

在另一优选例中，所述的突变型BrpSPL9-2蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述的序列为cDNA序列、mRNA序列、或基因组序列。

在另一优选例中，所述的基因组序列是如SEQ ID NO.:4所示的序列，并且其1716-1735位为对应于SEQ ID NO.:1中第743-762所示的核苷酸序列(对应于SEQ ID NO.:21所示的RNA序列)。

在本发明的第六方面，提供了一种植物细胞，所述植物细胞中含有外源的BrpSPL9-2蛋白的编码基因是不受miR156抑制。

在另一优选例中，所述的编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸(即BrpSPL9-2蛋白的编码基因)具有以下特征：

(ii)所述编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸中不存在与miR156结合的结合区。

在本发明的第七方面，提供了一种制备转基因叶球类植物的方法，其特征在于，包括步骤：从本发明第六方面所述的植物细胞再生成植株，所述的植物细胞为叶球类植物的细胞。

在另一优选例中，所述方法还包括：对所述转基因的白菜，进行叶球结球进程或叶球形状测定，并与野生型白菜进行比较。

在另一优选例中，所述方法还包括：对于选出的叶球进程提前的白菜，测量其叶球形状发生变化，从而挑选出改良的白菜品种。

在另一优选例中，所述的叶球形状测定包括测量叶球高度、叶球直径、以及叶球高度直径比。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了miR156、miR156靶基因SPL基因和miR172在大白菜不同营养生长时期的表达。图1(A)为大白菜不同时期顶端分生组织的小RNA杂交，检测miR156和miR172b的表达情况；图1(B)为大白菜Bre的BrpSPl3、BrpSPL9-1、BrpSPL9-2、BrpSPL10、BrpSPL10-2、BrpSPL10-3和BrpSPL15的qRT-PCR分析；图1(C)为BrpSPL9-2的在大白菜不同时期的RNA原位杂交；图1(D)为BrpSPL9-2的RT-PCR分析。其中，d代表天数。

图2显示了大白菜BrpSPL与miR156结合位点处的序列，以及突变后的序列。其中，经该基因片段编码的氨基酸序列没有改变。

图3显示了rBrpSPL9-2促进大白菜结球的具体情况。图3(A)为野生型(Wt)和rBrpSPL9-2转基因植株T2代在莲座期的表型，标尺为5cm；图3(B)为野生型(Wt)和rBrpSPL9-2转基因植株T2代的叶表型，标尺为2cm；图3(C)为野生型(Wt)和rBrpSPL9-2转基因植株T2代的叶指数统计。

图4显示了rBrpSPL9-2促进大白菜结球的具体情况。图4(A)为野生型(Wt)和rBrpSPL9-2转基因植株T2代在包心期早期的表型，标尺为5cm；图4(B)为野生型(Wt)和rBrpSPL9-2转基因植株T2代第4片叶和第14片叶的叶表型，标尺为1cm；图4(C-H)为野生型(Wt)和rBrpSPL9-2转基因植株T2代在大田中的表型，C,D,E分别是野生型的的幼苗期，莲座期和结球期，F,G,H分别是rBrpSPL9-2的幼苗期，莲座期和结球期。图4(I)为野生型(Wt)和rBrpSPL9-2转基因植株T2代在大田中的叶包心天数和结球天数的统计。

图5显示rBrpSPL9-2提高了BrpFUL和BrppremiR172b的表达。

图6显示了BrpSPL9-2野生型CDS核苷酸序列(SEQ ID NO.:1)，其中CDS位于第1-1110位，而黑色加粗带下划线的序列为miR156结合位点(第743-762位)。

图7显示了BrpSPL9-2野生型氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)。

图8显示了BrpSPL9-2突变型核苷酸序列(SEQ ID NO.:3)，其中，突变的“miR156结合区”用下划线标出。

图9显示了BrpSPL9-2野生型基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO.:4)，其中加粗带下划线的序列为miR156结合位点(第1716-1735位)。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现BrpSPL9-2基因与叶球类植物的结球进程相关，利用BrpSPL9-2基因可调节叶球类植物(如大白菜)的结球进程。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人通过从不同时期的大白菜植株以及不同结球品种的白菜中提取mRNA，并与含有代表大白菜所有功能基因的芯片进行杂交，测知不同时期大白菜样品中功能基因的表达情况。通过基因芯片技术对大白菜不同时期的基因表达进行了筛选，以及对不同结球时期的大白菜品种的基因表达分析，结合小RNA原位杂交技术，RealTime定量PCR技术和原位杂交技术，首次鉴别出一个白菜类蔬菜促进结球基因。本发明人还通过转基因试验证实了该BrpSPL9-2基因的功能，并获得过表达该基因的转基因株系。试验证明，导入BrpSPL9-2的转基因大白菜，其结球进程明显早于野生型。

叶球类植物

本文所用的术语“植物”是指可以借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质等来维系生存，并通常不发生移动的生物。典型地，在本发明中，植物指“叶球类植物”。

如本文所用，术语“叶球类植物”指任何具有叶球结构的植物。

在本发明中，优选的叶球类植物是叶球类蔬菜植物，代表性例子包括(但并不限于)：结球白菜、结球甘蓝(卷心菜)、结球生菜。

鉴于本发明的教导，本领域技术人员应该明白，本文所述的植物是其中的BrpSPL9-2基因或其蛋白的表达或活性得到抑制或增强的植物。本领域技术人员还应明白，除了成体植物本身，本文所述的植物还包括植物种子、植物细胞、植物组织或器官。

在具体的实施方式中，本发明的植物包括：转入了BrpSPL9-2基因或其同源基因的转基因植物；或者BrpSPL9-2蛋白表达量升高或降低(包括低表达或不表达)或表达无活性BrpSPL9-2蛋白的植物，等等。

BrpSPL9-2蛋白及基因

如本文所用，术语“叶球结球进程相关基因”和“促进大白菜提前结球的转录因子SPL9-2”可互换使用。SPL9-2基因编码一转录因子。

在本发明中，术语“BrpSPL9-2蛋白”指具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。然而，鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白该术语包括BrpSPL9-2蛋白的变异形式，所述变异形式具有与BrpSPL9-2蛋白相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与BrpSPL9-2蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗BrpSPL9-2蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含BrpSPL9-2蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了BrpSPL9-2蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有BrpSPL9-2蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供BrpSPL9-2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然BrpSPL9-2蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“BrpSPL9-2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表1所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。

表1

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro;Ala	Ala
			His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
			Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
			Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

如本文所用，术语“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

任何一种BrpSPL9-2蛋白的生物活性片段都可以应用于本发明。在本文中，BrpSPL9-2蛋白的生物活性片段是指BrpSPL9-2蛋白的片段，但其仍然能保持全长BrpSPL9-2蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长BrpSPL9-2蛋白的50%的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长BrpSPL9-2蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。

本发明还提供了编码本发明BrpSPL9-2蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2所示成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码BrpSPL9-2蛋白的多聚核苷酸。

此外，应理解，虽然本发明的BrpSPL9-2基因优选获自结球白菜，但是获自其它植物，例如拟南芥或结球甘蓝(卷心菜)、结球生菜等叶球类植物中与BrpSPL9-2基因高度同源(如具有70%以上的序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。因此，本发明亦适用其它植物，例如结球甘蓝、结球生菜。换言之，本文所述的“BrpSPL9-2基因或其蛋白”还包括来自其它植物的BrpSPL9-2基因或其蛋白。

突变型的BrpSPL9-2基因

一种特别优选的BrpSPL9-2基因是“不存在与miR156结合的结合区”但仍可编码与野生型BrpSPL9-2具有相同活性的BrpSPL9-2蛋白的编码基因。其中，“不存在与miR156结合的结合区”指缺失野生型BrpSPL9-2的miR156结合区，或者对应区域是与miR156序列不互补，从而不发生结合。

在本发明中，这种不受miR156调控的突变型BrpSPL9-2蛋白的编码基因，具有以下特点：

一种获得这种突变型BrpSPL9-2编码基因的方法是，在野生型BrpSPL9-2与miR156结合的结合区，用简并密码子进行替换，从而获得所编码的氨基酸序列(结合区氨基酸序列)保持不变，但与miR156的互补性下降的核苷酸“非结合区”。

在野生型BrpSPL9-2中，与miR156结合的结合区位于SEQ ID NO.:1的第743-762位。对于该结合区，例如，可参考下表进行简并密码子替换，从而能产生不被miR156所识别的突变BrpSPL9-2序列，且其序列所编码的氨基酸没有变化。

表2miR156结合区的可用碱基替换表

野生型	rBrpSPL9-2	其他变体	所编码氨基酸
				UGU	UGC	无	半胱氨酸(C)
GCU	GCC	GCA,GCG	丙氨酸(A)
				CUC	UUA	UUG,CUU,CUA,CUG	亮氨酸(L)
UCU	AGC	AGU,UCC,UCA,UCG	丝氨酸(S)
				CUU	UUG	UUA,CUC,CUA,CUG	亮氨酸(L)
CUG	UUA	UUG,CUU,CUC,CUA	亮氨酸(L)
				UCA	AGC	AGU,UCU,UCC,UCG	丝氨酸(S)

所述的突变型基因的miR156结合区的序列为SEQ ID NO.:3中第743-762位所示。

转基因重组操作

本发明的BrpSPL9-2蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或BrpSPL9-2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的BrpSPL9-2蛋白。

本发明中，BrpSPL9-2蛋白多核苷酸序列可插入重组表达载体。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含BrpSPL9-2蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、农杆菌、植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得叶片颜色性状发生改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

BrpSPL9-2基因及其蛋白的应用

本发明提供了所述BrpSPL9-2蛋白和基因的用途，用于调节叶球类植物的结球进程。在本发明中，所述的BrpSPL9-2蛋白和基因还可用于制备促进植物结球进程的组合物。本发明还涉及BrpSPL9-2的促进剂或拮抗剂及其用途。由于BrpSPL9-2的促进剂或拮抗剂可调节BrpSPL9-2的表达和/或调节BrpSPL9-2的活性等，因此，所述的BrpSPL9-2的促进剂或拮抗剂也可通过对BrpSPL9-2的影响来调节结球进程，从而达到改良植物的目的。

任何可提高BrpSPL9-2蛋白的活性、提高BrpSPL9-2蛋白的稳定性、促进BrpSPL9-2蛋白的表达、延长BrpSPL9-2蛋白有效作用时间、或促进BrpSPL9-2的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于促进植物结球进程的有效物质。任何可降低BrpSPL9-2蛋白的活性、降低BrpSPL9-2蛋白的稳定性、抑制BrpSPL9-2蛋白的表达、减少BrpSPL9-2蛋白有效作用时间、或降低BrpSPL9-2的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为BrpSPL9-2的拮抗剂，例如干扰所述BrpSPL9-2蛋白的编码基因表达的干扰分子(如miR156干扰分子)。所述的拮抗剂可用于延缓结球进程。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

转基因植物及应用

本发明提供调控叶球类植物的结球进程的方法，所述方法包括以下步骤：a)将促进或拮抗BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质给予叶球类植物、植物种子、植物细胞、组织或器官；和b)培养步骤a)获得的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。

在优选例中，本发明方法是对叶球类植物进行品种改良的方法。

在优选的实施方式中，所述促进BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达指使BrpSPL9-2基因或其蛋白的表达量升高或过表达，或表达活性更高的蛋白变体；而所述拮抗BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达指使BrpSPL9-2基因或其蛋白的表达量降低或不表达，或表达无活性的BrpSPL9-2蛋白。

在具体的实施方式中，所述促进或拮抗BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质包括但不限于：BrpSPL9-2基因本身(尤其是不受miR156调控的突变型基因)、BrpSPL9-2基因的反义RNA或BrpSPL9-2蛋白的抗体。

在得知BrpSPL9-2蛋白的功能后，本领域人员可采用多种熟知的方法来增强BrpSPL9-2蛋白的表达或活性。例如，可通过本领域人员已知的途径将携带BrpSPL9-2基因(尤其是本发明的突变型基因)的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的BrpSPL9-2蛋白。例如，将编码BrpSPL9-2蛋白的基因通过常规方法克隆至适当载体，将带有外源基因的重组载体导入可表达BrpSPL9-2蛋白的植物细胞，进而使所述植物细胞表达BrpSPL9-2蛋白。将所述植物细胞再生成植物，便可获得过量表达BrpSPL9-2蛋白的植物。

其它增加BrpSPL9-2基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动来增强BrpSPL9-2基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该BrpSPL9-2基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低BrpSPL9-2蛋白的表达或使之不表达。

在具体的实施方式中，可将编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸转入植物、植物种子、植物细胞、组织或器官，获得转化入编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。

在优选的实施方式中，可将植物、植物种子、植物细胞、组织或器官与携带含有编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接触，从而使编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸转入植物细胞，并整合到植物细胞的染色体上。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明提供了与结球进程相关的基因BrpSPL9-2；

(2)本发明还提供了一种有针对性地调节叶球类植物结球进程从而对白菜作物进行品种改良的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

通用材料与方法

材料：大白菜(Brp)99Bre种子获自上海农业科技种子有限公司。Col为拟南芥野生型，获自中国科学院植物生理生态研究所。

1.植物组织总RNA提取

试剂：Invitrogen公司Trizol抽提试剂。

10步骤：

a)将材料于液氮中充分研磨，以100mg材料/ml抽提缓冲液的量加入样品中，充分混匀，室温静置10分钟。

b)13000rpm离心5分钟，将上清转入新的离心管中，加入200μl氯仿，充分混匀，室温静置10分钟使其分层。

c)13000rpm离心5分钟，小心吸取上清于新的离心管中。

d)加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10分钟。

e)13000rpm离心5分钟，弃上清后用1ml75%乙醇洗一次。

f)7800rpm离心5分钟，弃上清后低速离心，用枪头吸去残留液体，室温晾干，待RNA刚刚干燥后加入适量的无RNase的水，65℃10分钟充分溶解20后存于-70℃。

2.半定量RT-PCR

RT-PCR引物如下：

BrpSPL9-1：正向：5'TGATCATCATCATCCTCAACATC3'(SEQ ID NO.:5)

反向：5'TGATATTGATGATCATAATGCTC3'(SEQ ID NO.:6)

BrpSPL9-2：正向：5'ATGAGACGGCCACCGTC3'(SEQ ID NO.:7)

反向：5'AGTCGTTCCACCGCTTATC3'(SEQ ID NO.:8)

BrpSPL3:'正向：5'ATGAGACGGCCACCGTC3'(SEQ ID NO.:9)

反向：5'GACTTGACAGAAGAGAGCAAGC3'(SEQ ID NO.:10)

BrpSPL5:正向：5'ACCCGATCCATCATCAACA3'(SEQ ID NO.:11)

反向：5'TGGTGTAGGATTCACTTTTCTTG3'(SEQ ID NO.:12)

BrpSPL15:正向：5'AGCAACAAGTGAAACCAGCA3'(SEQ ID NO.:13)

反向：5'GTTAAGAAAAAAGTGTTTTAGAGGG3'(SEQ ID NO.:14)

BrpFUL：正向：5'ACCAAGCTATGTTCGAATCC3'(SEQ ID NO.:15)

反向：5'TCAAGTCACCAAAAATGCTG3'(SEQ ID NO.:16)。

BccUBQ5：正向：5'TCCGTCCACCTTGTAGAACTG3'(SEQ ID NO.:17)

反向：5'TGAAAACCCTAACGGGGAAA3'(SEQ ID NO.:18)

试剂如下：

AMV反转录酶(TAKARA)；

RNase抑制剂(TAKARA)；

DNase I(RNase free)(TAKARA)。

步骤如下：

a)分别提取不同时期的大白菜叶片的总RNA，用DNase I(RNase free)处理30分钟之后酚氯仿抽提，沉淀，吹干，无RNase的水溶解。

b)测OD260及电泳定量后，取1μg总RNA，按说明书操作，42℃反应251小时，94℃5分钟以使反转录酶失活。

c)十倍稀释反转录产物后各取3μl做Realtime-PCR。PCR反应条件：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec。

于RT-PCR反应的模板量，以Ubiquitin(BccUBQ5)和Actin的引物进行平行PCR反应作为内对照。

3.实时定量PCR(qRT-PCR)

qRT-PCR所用引物和RT-PCR相同。然后按照试剂盒说明书加样，20μl体系。

按照以下程序反应：

循环结束制作融解曲线，同时分别制定特定基因和内对照UBQ的标准曲线。

4.CTAB法植物组织总DNA的提取

试剂如下：

2×CTAB缓冲液(100ml)：10ml1M Tris pH8.0；4ml0.5M EDTA；pH8.0；8.19g NaCl；2g CTAB；1g PVP K30定容至100ml。

1×CTAB缓冲液(100ml)：5ml1M Tris pH8.0；2ml0.5M EDTA；pH8.0；1gCTAB定容至100ml。

高盐TE(100ml)：1ml1M Tris pH8.0；200μl0.5M EDTA pH8.0；5.844g NaCl定容至100ml。

10%(w/v)CTAB(50ml)：5g CTAB；2.045g NaCl定容至50ml。

步骤如下：

a)取5g植物材料液氮中研磨粉末后转入40ml离心管中。

b)加入15ml65℃预热的2×CTAB缓冲液(1:1)，上下混匀后于65℃温育10min，其间不断上下颠倒几次。

c)加入1倍体积的氯仿:异戊醇(24:1)，混匀后11000rpm离心5min。

d)吸取上清至新的离心管中，补入1/10体积10%CTAB，然后加入1倍体积的氯仿:异戊醇，混匀后离心5min。

e)取上清，重复d)步骤2-3次，最后一次离心后将上清转入新的离心管，加入大于2倍体积的沉淀缓冲液(1×CTAB)，温和的混匀，于室温下放置30min。

f)离心并收集沉淀，将沉淀重悬于65℃的5ml高盐TE中，此时可加一些Rnase，37℃温育30min。

g)11000rpm离心10min后将上清转移至新的1.5ml离心管中。

h)加入2倍体积无水乙醇，混匀后于-20℃放置30min，离心，弃上清，用70%(v/v)乙醇洗涤后晾干，溶于100μl TE中。

5.pAA6::BrpSPL9-2转基因载体构建

从大白菜cDNA中扩增pAA6::BrpSPL9-2DNA的引物如下：

正向：5'CGCGGATCCTCTCGTCTCTTTTCTTGCTTCTG3'(SEQ ID NO:19)；

反向：5'ACGCGTCGACTTGCAGAATCATTCATGGTAACA3'(SEQ ID NO:20)。

a)用PCR的方法从大白菜cDNA中分离BrpSPL9-2CDS片段。

b)用BamHI和SalI双酶切出该片断，克隆到pCAMBIA1300载体(获自CAMBIA公司)上(PCR片段连在pAA6启动子和tAA6终止子中间)，测序验证。pAA6启动子和tAA6终止子获自荷兰Keygene公司，是来自于番茄的一个细胞半胱氨酸合成酶基因(PCT/NL2006/050314)，在植物中具有高效组成性表达的作用。

c)利用冻融转化方法将pCAMBIA1300-BrpSPL9-2正向基因载体导入农杆菌

5GV3101(购自Invitrogen)中，并PCR鉴定。

6.冻融法农杆菌感受态细胞的制备及转化

a)从28℃培养48小时的新鲜平板中挑取GV3101单菌落，转到20ml LB

液体培养基(rif50mg/l，GM5050mg/l)中，于28℃250rpm振荡培养过夜。(下面全部操作均在无菌条件下进行)。

b)冰浴20分钟后，将菌液分装5ml的离心管(每管4ml)中，冰浴10分钟。

c)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃菌液。

d)每管加入1ml充分预冷的20mM CaCl2以重悬菌体。冰浴10分钟。

e)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃上清。

f)每管加入300μl20mM CaCl2(视菌体浓度而定)，合并后分管于1.5ml的离心管中。

g)每管加入1μl质粒或所有连接产物，冰浴5分钟，再放入液氮中4-5分钟。

h)37℃放5分钟，每管加入400μl LB培养基于28℃温育2小时使细菌复苏，并表达相应的抗生素抗性基因。

i)各取200μl体积涂板，室温放置一会儿，于28℃培养。

浸花法转化拟南芥及筛选

试剂：

转化缓冲液(1L)：大量元素(50×)：10ml；微量元素(1000×)：0.5ml；CaCl₂(100×)：5ml；铁盐(200×)：2.5ml；有机(100×)：10ml；蔗糖：50g；6-BA(1mg/ml)：10μl；SilwetL-77：400μl(真空抽滤则用200μl)；用KOH调至pH5.8，定容1L。

筛选培养基平板：3%(w/v)蔗糖MS0固体培养基(pH5.8)加入卡那霉素(Kan)至50mg/l(用于Nossen背景拟南芥的筛选)。

步骤：

a)当拟南芥抽苔后茎高约5厘米时可以进行转化，若待转化的植株结实率低则要在植株打顶4天后进行。

b)转化前，将已授粉的花和角果去除掉。并使土壤吸水过夜。

c)将已培养过夜的农杆菌1:100稀释于大瓶培养基中，280C培养24小时后，4℃5000rpm离心20分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于原菌液的两倍体积的转化缓冲液中，使OD600在0.8左右。

d)拟南芥的地上部分完全浸入菌液中30秒，取出平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日移入人工气候室正常竖直培养。收种子后干燥2周。

10e)种子经无菌消毒后铺于含50mg/l Kan的Ms0固体平板中，经4℃春化两天后移到组培室，除草剂basta抗性苗移到土中继续生长。

f)取叶片提取基因组DNA经PCR检测得到阳性苗，再经两代筛选得到转基因的纯系，用于进一步分析。

7.真空抽滤法转化白菜及筛选

(1)大白菜的转化

a)将大白菜种子放在浸湿水的滤纸上4℃春化2个月(经过春化的大白菜可在小苗期抽薹开花，便于转化)，然后把下胚轴已伸长的大白菜小苗移入土中，待其抽薹并开第一朵花时可以进行转化。转化前要将土壤浸湿过夜。

b)含农杆菌的转化液的准备同拟南芥转化方法。

c)将大白菜的地上部分倒置并完全浸入菌液中，放在带真空泵的干燥器中，真空抽5分钟两次(2分钟间隔)至大白菜的叶片透明化，放气后取出植株平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日将大白菜移栽入大盆中，正常培养。开花期于蕾期人工授粉，套袋。收种子后干燥2周。

d)经无菌消毒的大白菜种子于无菌滤纸上吸干水，用镊子转入含Kan50mg/l培养基的三角瓶中。4℃春化2到3天，移入恒温室培养。

e)大白菜的转化子要等到真叶长出才能鉴别出来：绿色的真叶，根正常发育。而非转化子的大白菜真叶为白色，无根。待转化子长出3-4片真叶后，经过3天炼苗后可以移入土中。

实施例1

BrpSPL9-2与结球进程的相关性

在本实施例中，采用“通用方法”中所述的方法，对处于不同发育阶段的大白菜和对照植物(不结球品种乌塌菜，获自上海农业科技种子有限公司)进行植物总RNA提取，用市售的核酸芯片(购自华大基因)进行检测。

此外，还通过RT-PCR和qRT-PCR进行检测，对各种可能的基因进行检测。

结果

本发明人用基因芯片检测了大白菜中的基因表达情况，并与一个不结球小白菜亚种乌塌菜的表达水平做了比较。

结果如图1所示，发现在白菜中也具有类似的现象，SPL基因家族的大部分成员在大白菜中的同源基因(以下称为BrpSPL)在大白菜3个月的花序中表达比幼苗时期高；在不同品种的白菜中，大部分的BrpSPL表达也比不结球白菜乌塌菜中高。

为了进一步确认基因芯片的结果，本发明人采用小RNA的Norhtern杂交和实时定量PCR(qRT-PCR)检测了它们的表达水平，其中，qRT-PCR的引物基于大白菜全基因组数据库(http://www.Brassicadb.org)设计。按照大白菜的生长状况，本发明人在不同时期取样，从发芽到开花，分别为第10天，第20天,第30天,第40天,第50天,第60天,第80天,第100天,第130天。其中，MiR156的积累在20天达到最高点，然后逐渐的降低，miR172具有相反的表达谱。而miR156靶基因SPL基因家族成员的表达水平定量PCR(qRT-PCR)结果显示，大白菜BrpSPLs的表达变化可以分为2个类别，其中一类是BrpSPL3，BrpSPL9,BrpSPL10-1,BrpSPL10-2，其表达具有一个明显的变化。另一类是BrpSPl9-2,BrpSPL10-3,BrpSPL15，其表达随着时间逐渐的变化，显示出和miR156所相反的趋势。此外，当植物进入开花以后，BrpSPL的变化除了BrpSPL15-1以外没有明显的上升，而BrpSPL9-2和BrpSPL10-3反而有了下降(figure1B)。

BrpSPL9在大白菜中有两个拷贝，分别是BrpSPL9-1(拷贝a)和BrpSPL9-2(拷贝b)。其中，BrpSPL9-2的基因组序列如SEQ ID NO:4所示，其CDS序列如SEQ ID NO:2所示，编码一个369aa的蛋白(SEQ ID NO.:2)；突变的BrpSPL9-2CDS序列如SEQ ID NO:3所示。

经过以上实验分析，本发明人认为BrpSPL9-2是促进大白菜结球的关键基因，

实施例2

转基因试验验证BrpSPL9-2可促进结球进程

在本实施例中，以BrpSPL9-2作为研究的对象，通过转基因试验考察其对大白菜结球的作用。

具体地，在本实施例中，采用“通用方法”中所述的方法，将构建的携带外源基因的载体导入植物细胞，用真空抽滤法转化白菜(Bai等，2013)并进行观察结球进展情况，从而挑选出结球进展有变化的白菜。

由于BrpSPL9-2受到miR156的调控，在SEQ ID NO.:2的743-762位核苷酸处有miR156的结合位点，可以被miR156特异性剪切而降解，因此在本实施例中，本发明人设计了核苷酸突变但是所编码的氨基酸没有突变的SPL9-2的变异体(图2)，该变异体不能被miR156所识别而降解，在植物体内具有较高的表达量。

此外本发明人还列出了所有可供替换的突变碱基替换表(见上表2)，利用该表中所列出的其他碱基组合，同样能产生不被miR156所识别的突变BrpSPL9-2序列，且其序列所编码的氨基酸没有变化。在启动子选择上本发明人采用用组成性表达启动子AA6(番茄胞质半胱氨酸合成酶启动子)(国际专利号PCT/NL2006/050314)；该启动子是植物内源启动子，具有比CaMV35S(花椰菜花叶病毒)更稳定的组成性表达，且不容易被植物体内的RNA沉默体系所沉默，更有利于获得稳定的转基因大白菜株系。

结果

利用农杆菌侵染法转化后，本发明人获得了7个转基因大白菜株系，被命名为rBrpSPL9-2(图3A)。其中各个株系被命名为BS9-1、BS9-2、BS9-3、BS9-4、BS9-5、BS9-6、BS9-7，其中5个株系具有相同的表型。在5个有表型的株系中，RT-PCR显示，BrpSPL9-2的表达有了提高(图5A，以及未出示的数据)。

我们选取BS9-2株系做详细的表型观察。在人工控制条件的温室中，BS9-2所有的初生叶产生更多的近轴面叶毛，叶脉比野生型更为复杂，叶色更绿，叶片更厚，更像野生型莲座期的叶(图3B)，第一和第二片叶是圆形的而不是椭圆形的，叶柄比野生型短(图3B)。其他的叶形态指数也发生了变化(图3C)。在结球进程上，BS9-2比野生型更早进入包心期，其第14片开始向内卷曲形成包心叶(图4A,B)

田间实验的结果表明，rBrpSPL9-2转基因株系开始包心的天数比野生型提前11天，

叶球开始形成的天数比野生型提前10天，叶球成熟的所需要的天数比野生型缩短12天。在叶球品质上，转基因株系与野生型没有明显差异，比野生型多2片叶(图4C-I)。的最显著表型是是叶球形成的时间，比野生型提前了6片叶。在时间上，比野生型提前了10天。所有的特征显示BrpSPl9-2加速了营养生长时期的时期转换，该转基因株系的叶球发育提前了。

本发明人还同时检测了SPL下游基因的表达(方法同实施例1)。qRT-PCR的结果显示，rBrpSPl9-2转基因株系中，BrpmiR172b和BrpFUL的表达比野生型有了提高(图5中B,C,D)。而AP2和FUL在拟南芥中都是花发育时期表达的基因。在转基因大白菜中，本发明人检测到了这些基因表达的升高，说明其发育时期比野生型植株有了提前，从而证明BrpSPL9-2能够促进大白菜的营养时期的发育，促进大白菜结球时间的提前。

参考文献

1.Aukerman,M.J.,and Sakai,H.(2003).Regulation of flowering time andfloral organ identity by a microRNA and its APETALA2-like target genes.PlantCell,15,2730-2741.

2.Bai,J.,Wu,F.,Mao,Y.,and He,Y.(2013)In planta transformation ofBrassica rapa and B.napus via vernalization-infiltration methods.ProtocolExchange,doi:10.1038/protex.2013.067

3.He,Y.K.,Xue,W.X.,Sun,Y.D.,Yu,X.H.,and Liu,P.L.(2000).Leafy headformation of the progenies of transgenic plants of Chinese cabbage withexogenous auxin genes.Cell Res10,151-160.

4.Ito,H.and T,Kato.(1957)Studies on the head formation of Chinesecabbage.Histological and physiological studies of headformation.J.Jpn.Soc.Hort.Sci.26:154-162

5.R.T.,C.G.Kuo and J.Y.Yoon.(1988)Breeding and Seed Producionof Chinese Cabbage in Tropics and Subtropics.p13-p15.

6.Wang,J..W.,Czech,B.,Weigel,D.(2009)miR156-Regulated SPLTranscription Factors Define an Endogenous Flowering Pathway in Arabidopsisthaliana.Cell138,738-49.

7.Wu,G.,Park,MY.,Conway,S.R.,Wang,J.W.,Weigel,D.,and Poethig R.S.(2009)The sequential action of miR156and miR172regulates developmental timingin Arabidopsis.Cell138,750-759.

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.BrpSPL9-2基因或其蛋白在调控叶球类植物的结球进程中的应用，其中所述的调控叶球类植物的结球进程指促进结球,所述BrpSPL9-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的叶球类植物包括叶球类蔬菜。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的叶球类植物为结球白菜、结球甘蓝或结球生菜。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是用于制备调控叶球类植物的结球进程的试剂。

5.一种调控叶球类植物的结球进程的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)将促进BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质给予所述叶球类植物、植物种子、植物细胞、组织或器官；和

(b)培养步骤(a)获得的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官，从而调控叶球类植物的结球进程，其中所述的调控叶球类植物的结球进程指促进结球；

并且所述BrpSPL9-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，给予促进BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质，从而加速结球进程。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，给予拮抗BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质，从而延缓结球进程。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的促进BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质包括特异性与miR156结合的反义序列，或表达所述反义序列的载体。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的拮抗BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达的物质包括miR156。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)是将编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸转入所述叶球类植物、植物种子、植物细胞、组织或器官，获得转化入编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸的植物、植物种子、植物细胞、组织或器官。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)是将植物、植物种子、植物细胞、组织或器官与携带含有编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸的农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)接触，从而使编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸转入植物细胞，并整合到植物细胞的染色体上。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的编码BrpSPL9-2蛋白的多核苷酸具有以下特征：

13.BrpSPL9-2基因或其蛋白在筛选叶球类植物的结球进程促进剂或拮抗剂中的应用，所述BrpSPL9-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

14.一种筛选叶球类植物的结球进程促进剂或拮抗剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)将待测物质给予某植物；

b)检测该植物中BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达情况；

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述BrpSPL9-2基因或其蛋白的活性或表达下调，则所述待测物质是结球进程拮抗剂；

并且所述BrpSPL9-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。