CN109609544B - 一种提高乌菜外植体瞬时表达率的定向遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种操作简单、瞬时表达率高的乌菜外植体定向遗传转化方法。其特征包括以下步骤：(1)乌菜5天无菌苗，切取子叶‑子叶柄及下胚轴外植体。(2)乌菜外植体在预培养基上培养2天。(3)农杆菌(含有植物表达载体)在活化培养基上活化。(4)利用经液体共培养基湿润的无菌棉棒蘸取活化的农杆菌，定向涂抹于外植体切口处。(5)涂抹后的外植体，置于固体共培养基上，25℃暗培养2天完成共培养，即可检测瞬时表达率。本发明采用的定向遗传转化方法，具有无需液体培养农杆菌、操作简单、外植体的瞬时表达率高等优点，为高效获得乌菜转基因植株奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种操作简单、瞬时表达率高的乌菜外植体定向遗传转化方法。
背景技术
乌菜，原产我国，为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，是江淮地区种植面积最大的蔬菜之一。长期以来，乌菜品种改良主要通过品种杂交、远缘杂交等，存在育种年限长、成本高、亲本自交多代易退化、雄性不育转育困难等诸多弊端，并且至今尚无成熟的再生系统。目前，在白菜类作物中，多采用农杆菌介导法进行遗传转化，将外植体与一定浓度的液体农杆菌共培养15～20min后，去除农杆菌，再在共培养基上进行共培养。该方法，将外植体置于液体农杆菌中，会使外植体短时间内缺氧，造成外植体损伤，而且农杆菌会侵染外植体上不需侵染的部位，也同样造成外植体损伤；此外，该方法在乌菜上应用是，乌菜外植体的瞬时表达率非常低。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种无需对农杆菌进行液体培养、操作简单、瞬时表达率高的乌菜定向遗传转化方法，为高效获得乌菜转基因植株奠定了基础。
本发明的技术方案是：一种提高乌菜外植体瞬时表达率的定向遗传转化方法，其特征包括以下步骤：
(1)取5天苗龄的无菌苗，切取子叶-子叶柄或下胚轴外植体；
(2)将外植体置于预培养基上，25℃光照培养2天；
(3)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针均匀涂布在活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出；
(4)用液体共培养基，将无菌棉棒湿润；
(5)用湿润的棉棒蘸取活化的农杆菌，轻轻地定向涂抹于经过预培养的外植体切口处；
(6)在固体共培养基表层放置一张无菌滤纸；
(7)将涂抹后的外植体，平铺在固体共培养基上，25℃暗培养2天；
(8)暗培养结束后，GUS化学染色外植体。
所述步骤(2)中的预培养基由MS、蔗糖、6-BA、乙酰丁香酮(AS)和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、AS 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8；
所述步骤(3)中的活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O、6-BA、As和琼脂组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、6-BA 1mg、As 40mg和琼脂15g，pH为5.8；
所述步骤(4)中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和As组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；
所述步骤(6)中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8。
本发明的有益效果是：
(1)本发明对乌菜子叶-子叶柄、下胚轴外植体进行预培养，可以促进细胞分裂，使外植体处在感受态，容易接受外源基因，以提高外源基因的瞬时表达和转化率。
(2)本发明利用活化培养基培养农杆菌，不需要对农杆菌进行挑斑摇菌，也无需收集菌体、悬浮菌体等操作，减少了操作步骤，且通过活化培养基使农杆菌处在活化状态，提高侵染效率。
(3)本发明利用无菌棉棒蘸取活化的农杆菌，定向对乌菜外植体的切口处进行涂抹，无需浸在液体农杆菌中，减轻了农杆菌对乌菜外植体的伤害，且定向侵染，大大提高了侵染效率和效果，其所使用的菌量较少，减少农杆菌污染的概率。
(4)本发明在固体培养基上放置一层无菌滤纸，可减轻外植体共培养过程中农杆菌的生长速度及农杆菌对外植体的伤害，减少后续实验过程中农杆菌的污染几率。
说明书附图
图1为乌菜下胚轴GUS染色结果；
图2为乌菜子叶-子叶柄GUS染色结果；
图3为乌菜下胚轴切口处GUS染色显微观察；
图4为乌菜子叶-子叶柄GUS染色显微观察。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出的详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
(1)取5天苗龄的无菌苗，切取子叶-子叶柄及下胚轴外植体；
(2)将外植体置于预培养基上，25℃光照培养2天；
(3)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针均匀涂布在活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出；
(4)用液体共培养基，将无菌棉棒湿润；
(5)用湿润的棉棒蘸取活化的农杆菌，轻轻地定向涂抹于经过预培养的外植体切口处；
(6)在固体共培养基表层放置一张无菌滤纸；
(7)将涂抹后的外植体，平铺在固体共培养基上，25℃暗培养2天；
(8)暗培养结束后，GUS化学染色外植体。
上述步骤(2)中的预培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8；
上述步骤(3)中的活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O、6-BA、As和琼脂组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、6-BA 1mg、As 40mg和琼脂15g，pH为5.8；
上述步骤(4)中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和As组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；
上述步骤(6)中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8。
实验1
1)取5天苗龄的‘黄心乌’、‘徽乌1号’无菌苗，切取子叶-子叶柄及下胚轴外植体，分别为30个，放置于预培养基上，25℃光照培养2天后，用于侵染；另分别取外植体30个，不经过预培养基，直接用于侵染。
2)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针均分别匀涂布在活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出；
3)用液体共培养基湿润无菌棉棒，并蘸取农杆菌菌体，轻轻地定向涂抹于经过预培养与未经过预培养的外植体切口处；
4)将侵染的外植体放置于固体共培养基上，25℃暗培养2天后，进行GUS染色，统计瞬时表达率，以上实验重复三次。
上述步骤(1)中的预培养基由MS、蔗糖6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8；
上述步骤(2)中的活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O、乙酰丁香酮(As)和琼脂组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、6-BA、1mg、As 40mg和琼脂15g，pH为5.8；
上述步骤(3)中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和As组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；
上述步骤(4)中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8。
表1预培养对乌菜外植体GUS瞬时表达率的影响
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性外植体数/农杆菌侵染外植体总数×100％。
从表1中可知，乌菜子叶-子叶柄与下胚轴外植体经过预培养后，可显著提高GUS瞬时表达率，因此，乌菜外植体侵染之前经过预培养步骤。
实验2
1)取5天苗龄的‘黄心乌’、‘徽乌1号’无菌苗，切取子叶-子叶柄及下胚轴外植体，分别为30个，放置于添加不同6-BA与As浓度配比的预培养基上，25℃光照培养2天后，用于侵染；
2)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针分别均匀涂布在活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出；
3)用液体共培养基湿润无菌棉棒，并蘸取农杆菌菌体，轻轻地定向涂抹于经过预培养的外植体切口处；
4)将侵染的外植体放置于固体共培养基上，25℃暗培养2天后，进行GUS染色，统计瞬时表达率，以上实验重复三次。
上述步骤(1)中的预培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、和琼脂1.5g，pH为5.8，6-BA与As浓度配比见表2；
上述步骤(2)中的活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O、乙酰丁香酮(As)和琼脂组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、6-BA、1mg、As 40mg和琼脂15g，pH为5.8；
上述步骤(3)中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和As组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；
上述步骤(4)中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8。
表2不同6-BA/As配比的预培养基对乌菜外植体GUS瞬时表达率的影响
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性外植体数/农杆菌侵染外植体总数×100％。
从表1中可知，预培养基中添加2mg/L 6-BA与40mg/L As，可提高乌菜子叶-子叶柄与下胚轴外植体的瞬时转化效率。因此，将含有2mg/L 6-BA与40mg/L As的预培养基为后续实验中外植体的预培养。
实验3
1)取5天苗龄的‘黄心乌’、‘徽乌1号’无菌苗，切取子叶-子叶柄及下胚轴外植体，分别为30个，放置于预培养基上，25℃光照培养2天后，用于侵染；
2)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针均分别匀涂布在含有不同6-BA与As浓度配比的活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出；
3)用液体共培养基湿润无菌棉棒，并蘸取农杆菌菌体，轻轻地定向涂抹于经过预培养的外植体切口处；
4)将侵染的外植体放置于固体共培养基上，25℃暗培养2天后，进行GUS染色，统计瞬时表达率，以上实验重复三次。
上述步骤(1)中的预培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g；
上述步骤(2)中的活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O、乙酰丁香酮(As)和琼脂组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、和琼脂15g，pH为5.8，6-BA与As浓度配比见表3；
上述步骤(3)中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和As组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；
上述步骤(4)中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8。
表3不同6-BA/As配比的活化培养基对乌菜外植体GUS瞬时表达率的影响
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性外植体数/农杆菌侵染外植体总数×100％。
从表1中可知，活化培养基中添加1mg/L 6-BA与40mg/L As，可提高乌菜子叶-子叶柄与下胚轴外植体的瞬时转化效率。因此，将含有1mg/L 6-BA与40mg/L As的活化培养基为后续实验中农杆菌的培养。
实验4
1)取5天苗龄的‘黄心乌’、‘徽乌1号’无菌苗，切取子叶-子叶柄及下胚轴外植体，分别为30个，放置于预培养基上，25℃光照培养2天后，用于侵染；
2)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针均分别匀涂布在含有活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出；
3)用液体共培养基湿润无菌棉棒，并蘸取农杆菌菌体，轻轻地定向涂抹于经过预培养的外植体切口处；
4)将侵染的外植体放置于含有不同6-BA与As浓度配比的固体共培养基上，25℃暗培养2天后，进行GUS染色，统计瞬时表达率，以上实验重复三次。
上述步骤(1)中的预培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g；
上述步骤(2)中的活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O、乙酰丁香酮(As)和琼脂组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、6-BA 1mg、As 40mg和琼脂15g，pH为5.8；
上述步骤(3)中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和As组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；
上述步骤(4)中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g和琼脂1.5g，pH为5.8，不同6-BA与As浓度配比见表4。
表4不同6-BA/As配比的固体共培养基对乌菜外植体GUS瞬时表达率的影响
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性外植体数/农杆菌侵染外植体总数×100％。
从表1中可知，固体共培养基中添加2mg/L 6-BA与40mg/L As，可提高乌菜子叶-子叶柄与下胚轴外植体的瞬时转化效率。因此，将含有2mg/L 6-BA与40mg/L As的固体共培养基用于外植体与农杆菌共培养。
实验5
1)取5天苗龄的‘黄心乌’、‘徽乌1号’无菌苗，切取子叶-子叶柄及下胚轴外植体，分别为60个，放置于预培养基上，25℃光照培养2天后，用于侵染；
2)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针均分别均匀涂布在活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出；
3)用液体共培养基湿润无菌棉棒，并蘸取农杆菌菌体，轻轻地定向涂抹于经过预培养的外植体切口处，外植体数为30个；
4)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针接种至液体活化培养基上，28℃震荡培养，至菌体长出；
5)收集菌体，用液体共培养基将菌体悬浮至OD600＝0.3；
6)将外植体放于5)中悬浮菌体的液体共培养基中，28℃震荡培养20min后，去除菌液；
7)将侵染的外植体放置于固体共培养基上，25℃暗培养2天后，进行GUS染色，统计瞬时表达率，以上实验重复三次。
上述步骤(1)中的预培养基由MS、蔗糖、6-BA和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8；
上述步骤(2)中的活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O、6-BA、As和琼脂组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、6-BA 1mg、As 40mg和琼脂15g，pH为5.8；
上述步骤(3)中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和As组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；
上述步骤(4)中的液体活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O和As组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O0.5g、6-BA 1mg和As 40mg，pH为5.8；
上述步骤(7)中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8。
表5侵染方式对乌菜外植体瞬时表达率的影响
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性外植体数/农杆菌侵染外植体总数×100％。
从表5和图1-4中可知，侵染方式对乌菜外植体的瞬时表达率影响较大，用湿润棉棒蘸取农杆菌进行定向侵染的瞬时表达效率最高(表5)，并且定向侵染可深入组织中(图1-4)。因此，将定向侵染方式为后续试验中的侵染方式。
实验6
1)取5天苗龄的‘黄心乌’、‘徽乌1号’无菌苗，切取子叶-子叶柄及下胚轴外植体，放置于预培养基上，25℃光照培养2天后，用于侵染；
2)将含有植物表达载体(含有GUS报告基因)的农杆菌，用接种针均分别匀涂布在活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出；
3)用液体共培养基湿润无菌棉棒，并蘸取农杆菌菌体，轻轻地定向涂抹于经过预培养的外植体切口处；
4)将侵染的外植体放置于含有滤纸固体共培养基上或不含有滤纸的固体共培养基上，25℃暗培养2天后，进行GUS染色，统计瞬时表达率；
5)外植体共培养结束后，用液体诱导培养基漂洗3次，去除液体后，置于固体诱导培养基上，25℃光照培养2周后，统计农杆菌污染率，以上实验每个处理30个外植体，共重复三次。
上述步骤(1)中的预培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8；
上述步骤(2)中的活化培养基由酵母提取物(YE)、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O、6-BA、As和琼脂组成，其中每升中加入YE 1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、6-BA 1mg、As 40mg和琼脂15g，pH为5.8；
上述步骤(3)中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和As组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；
上述步骤(4)中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8；
上述步骤(5)中液体诱导培养基由MS、蔗糖、6-BA、卡那霉素(Kan)和羧苄青霉素(Carb)组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA2mg、Kan 50mg和Carb 500mg，pH为5.8；
上述步骤(5)中固体诱导培养基由MS、蔗糖、6-BA、卡那霉素(Kan)、羧苄青霉素(Carb)和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、Kan 50mg、Carb 500mg和琼脂1.5g，pH为5.8。
表6固体共培养基处理方式对乌菜外植体瞬时表达率的影响
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性外植体数/农杆菌侵染外植体总数×100％；
农杆菌表达率(％)＝农杆菌污染的外植体数/固体诱导培养基外植体总数×100％；
从表6中可知，固体共培养基上放置滤纸对外植体的瞬时表达率影响不大，但对后续实验外植体诱导过程中农杆菌污染外植体影响较大。因此，将固体共培养基上放置一张无菌滤纸为后续实验中固体共培养基处理方式。
以上实施例只是发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种提高乌菜外植体瞬时表达率的定向遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、取5天苗龄的乌菜无菌苗，切取子叶-子叶柄及下胚轴外植体；
步骤2、将外植体置于预培养基上，25℃光照培养2天；
步骤3、将含有植物表达载体的农杆菌，用接种针均匀涂布在活化培养基上，28℃恒温培养，至菌体长出，所述植物表达载体含有GUS报告基因；
步骤4、用液体共培养基，将无菌棉棒湿润；
步骤5、用湿润的棉棒蘸取活化的农杆菌，轻轻地定向涂抹于经过预培养的外植体切口处；
步骤6、在固体共培养基表层放置一张无菌滤纸；
步骤7、将涂抹后的外植体，平铺在固体共培养基上，25℃暗培养2天；
步骤8、暗培养结束后，GUS化学染色外植体；
所述步骤2中的预培养基由MS、蔗糖、6-BA、乙酰丁香酮As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、乙酰丁香酮40mg和琼脂1.5g，pH为5.8；
所述步骤3中的活化培养基由酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、MgSO4·7H2O、6-BA、As和琼脂组成，其中每升中加入酵母提取物1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O0.5g、6-BA 1mg、As 40mg和琼脂15g，pH为5.8；
所述步骤4中液体共培养基MS、蔗糖、6-BA和乙酰丁香酮组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg和As 40mg，pH为5.8；
所述步骤6中固体共培养基由MS、蔗糖、6-BA、As和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、6-BA 2mg、As 40mg和琼脂1.5g，pH为5.8。
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