KR101594977B1

KR101594977B1 - 전신 발현 프로모터 Ｂｒ１５

Info

Publication number: KR101594977B1
Application number: KR1020140063496A
Authority: KR
Inventors: 김영미; 이종열; 강상호; 임선형
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2016-02-18
Also published as: KR20150136269A

Abstract

본 발명은 전신 발현 프로모터 Br15에 관한 것으로, 구체적으로 배추에서 분리한 프로모터 Br15가 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현되며, 발현 정도가 기존의 프로모터보다 뛰어난 항구성 프로모터인 것을 확인하였으므로 이를 식물체에 도입하여 농업적 유용 유전자를 식물체 내에서 전신적으로 발현시켜 식물체를 생명공학적 방법으로 개량시키고자 할 때 유용하게 이용할 수 있다.

Description

전신 발현 프로모터 Ｂｒ１５{Constitutive promoter Br15}

본 발명은 전신 발현 프로모터 Br15, 이를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

육종(breeding) 우리들이 재배하고 있는 식물을 개량하여 종전보다 실용가치가 더 높은 작물을 육성, 증식 및 보급하는 농업기술이다. 육종의 방법으로는 분리육종, 교잡육종, 돌연변이, 배수체 육종 및 분자 육종법 등이 있으며, 최근 분자생물학 기술의 발전에 따라 분자 육종법이 주목을 받고 있다.

분자육종법은 분자생물학적 기법을 이용하여 새로운 형질을 생물에 도입하고 이를 선별하는 방법으로써 종래의 육종법에 비하여 시간 및 비용이 적게 들고, 종래 육종법으로는 얻을 수 없는 이종 간의 형질 도입이 가능하다. 이러한 분자 육종을 위하여서는 유용한 유전자를 발현시킬 수 있는 수단 및 형질전환기법 등 여러 가지 수단이 필요하며, 특히 원하는 유전자를 원하는 부위에서 발현시키기 위한 다양한 각 유전자의 상위 부위에 존재하는 프로모터 및 벡터의 개발이 필수적으로 요구된다.

현재 식물 형질전환의 80%를 차지할 정도로 가장 많이 사용되고 있는 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터이며 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 이용되어 왔다. 최근에 국내 연구진에 의해 개발된 애기장대 유래의 포스파타제 2A를 암호화하는 PP2A유전자의 프로모터(대한민국 특허 제803391) 등이 개발되어 이용예정 중에 있다. 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴 (actin) 및 옥수수 유비퀴틴 (ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크롬 C 유전자 (OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다 (대한민국 특허 제429335호). 이러한 전신발현 유도 프로모터들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 중요한 프로모터들이다.

이에, 본 발명자들은 전신발현 유도용 프로모터를 탐색하였으며, 배추 유래의 프로모터 Br15가 전신발현되며, 발현 정도도 기존의 35S 프로모터보다 훨씬 더 높은 것을 확인하였다. 따라서 전신 발현 프로모터 Br15를 이용하면 목적 유전자 발현을 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현시킬 수 있으므로 유용하게 이용될 것이다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 배추(Brassica rapa) 유래의 식물체 전신 발현(constitutive expression) 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물로 형질전환된 형질전환 쌍자엽 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 배추(Brassica rapa) 유래의 식물체 전신 발현(constitutive expression) 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물로 형질전환된 형질전환 쌍자엽 식물을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 배추(Brassica rapa) 유래의 식물체 전신 발현(constitutive expression) 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 pBGWFS7-PBr15로 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제조된 발현 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 아그로박테리움을 이용하여 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 배추 유래의 전신 발현 프로모터 Br15은 식물체 내에서 전신적으로 목적 단백질의 발현을 유도하며, 기존의 전신 발현 프로모터에 비하여 항구성이 뛰어난 우리나라 고유의 신규한 프로모터이므로 농업적 유용 유전자를 식물체 내에서 전신적으로 발현시켜 식물체를 생명공학적 방법으로 개량시키고자 할 때 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 배추 유래의 식물체 전신 발현프로모터 Br15의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2는 프로모터 활성분석용 벡터 pBGWFS7-PBr15 및 pBGWFS7-P35S(대조구) 모식도이다: (A) Br15 프로모터, (B) 35S 프로모터.
도 3은 Br15 프로모터 활성을 식물의 조직별로 확인한 도이다: 잎(Leaf), 꽃(Flower), 꼬투리(Silique), 줄기(Stem) 및 뿌리(Root) .
도 4는 RT-PCR 분석에 의한 Br15 프로모터의 조직 특이 발현을 확인한 도이다: R, 뿌리; St. 줄기; L, 잎; F, 꽃; Si, 꼬투리.
도 5는 MUG 분석에 의한 Br15 프로모터의 활성 강도를 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 배추(Brassica rapa) 유래의 식물체 전신 발현(constitutive expression) 프로모터를 제공한다.

프로모터는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 본 발명의 프로모터는 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등을 포함한다. 본 발명의 프로모터는 식물체 내에서 전신적으로 발현을 유도하는 특징이 있으며 그 발현은 상시적일 수 있으며, 성장 정도, 밤/낮, 온도, 계절 등의 환경에 따라 한시적일 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터는 도 2에 기재된 개열지도 pBGWFS7-PBr15를 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 발현 벡터는 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 발현벡터는 발현조절 서열 및 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한 발현벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있으며, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터에는 당업계에 알려진 다양한 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있으며, 이 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 프로모터와 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결(operablylinked) 된다는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

본 발명에 따른 목적단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 내에서 전신적으로 발현시키고자 하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질 일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 식물체의 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의하여 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 목적단백질은 항생제 저항성 단백질, 제초제 저항성 단백질, 바이러스 저항성 단백질, 해충 저항성 단백질, 대사 관련 단백질, 발광 단백질, GFP(green fluorescence 단백질), GUS(β-glucuronidase), GAL(β-galactosidase) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 발현 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 상기 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터는 공지의 재조합 발현 벡터로 특히 형질전환 식물의제조에 이용될 수 있는 식물 형질전환용 재조합 발현벡터일 수 있다. 그 예로는 대장균 유래 플라스미드, 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드, 효모 유래 플라스미드 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등일 수 있으나, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열 같은 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(centerfor the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제 센터 및 대학 연구소에서 입수 가능하다.

상기 재조합 발현 벡터는 pBGWFS7-PBr15인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 일실시예에서는 녹색형광단백질 유전자인 Egfp 및 청색발색 유전자인 Gus가 연결된 형태의 리포터시스템이 내재되어 있는 공지된 pBGWFS7 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 Br15 프로모터를 Egfp 및 Gus 유전자의 상류 부분에 작동 가능하게 연결한 재조합 발현 벡터인 pBGWFS7-PBr15을 제조하였다(실시예 2 및 도 2 참조).

본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주내로 도입할 수 있다. 그 예로는 이에 한정되지는 아니하나, 염화칼슘 및 열 쇼크법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법 및 진공침윤법등을 사용할 수 있다.

상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로 코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 및 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogene)로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법, 진공침윤법 및 화아침지법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)매개에 의한 방법을 사용할 수 있으며 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985; An et al., EMBOJ. 4:227-288, 1985).

상기 쌍자엽 식물은 콩, 감자, 팥, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 장미, 거베라, 카네이션, 국화, 레드클로버로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

아울러, 본 발명은

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 식물체 전신 발현 프로모터 분리

배추(Brassica rapa)로부터 식물체 내에서 전신적으로 발현하는 프로모터인 Br15을 확보하기 위하여 배추 조직별 마이크로어레이(microarray) 분석을 통해 조직 특이적 발현을 보이는 유전자를 탐색한 후, 배추 전체 염기서열로부터 조직특이 발현 유전자 중 하나인 단백질 미지의(unknown) 유전자의 개시코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 2kb 영역의 염기서열을 추출하였다. 배추 BAC 클론(KBrH006P22) DNA로부터 게이트 웨이 클로닝 시스템(gateway cloning system)을 이용하여 Br15 프로모터를 특이적으로 증폭할 수 있도록 Br15 B1: 5'-AAAAAGCAGGCTTGGGGGTAATGAAACAGGAG-3'(서열번호 3)와 Br15 B2: 5'-AGAAAGCTGGGTCATCTTCTTCAGGGAAACAA-3'(서열번호 4)를 제작하였다. 그런 다음 배추 BAC 클론으로부터 게놈 DNA를 추출한 다음 PCR을 수행하여 Br15 프로모터 약 2 Kb를 분리하였다. 이때, 상기 PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성 후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 68℃에서 2분간 반응을 1 사이클로 하여 30회 실시한 다음, 68℃에서 10분간 반응하였다. 이후 상기 PCR 반응에서 수득한 DNA의 전체 2000 bp의 Br15 프로모터 영역의 염기서열(서열번호 1)을 분석하였고 도 1에 나타내었다.

한편 전신 항구성 프로모터로 알려진 꽃양배추바이러스인 CaMV 35S 프로모터를 프로모터활성 분석을 위한 대조구로 사용하기 위하여 35S 프로모터를 특이적으로 증폭할 수 있도록 35S B1: 5'-AAAAAGCAGGCTTCGACCTGCAGGCATGCA-3'(서열번호 5)와 35S B2: 5'-AGAAAGCTGGGTGTGCGGCCGCCTGCAGGT-3'(서열번호 6)를 제작하였다. 35S 프로모터를 포함하고 있는 gateway vector인 pK2GW7(VIB, Belgium)을 주형으로 하여 95에서 10분간 변성 후 94℃에서 1분, 65℃에서 30초 및 65℃에서 2분간 반응을 1 사이클로 하여 30회 실시한 다음, 72℃에서 7분간 반응하였다. 그 결과 상기 PCR 반응에서 수득한 DNA의 전체 1077 bp의 35S 프로모터 영역의 염기서열(서열번호 2)을 분석하였다.

< 실시예 2> 전신 발현 프로모터를 포함하는 벡터 제작

상기 실시예 1에서 분리한 Br15 프로모터의 활성을 검정하기 위하여 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 배추로부터 분리한 서열번호 1의 Br15 프로모터의 활성을 검정하기 위하여 Egfp와 GUS 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBGWFS7(VIB, Belgium)을 이용하여 최종 식물 형질전환용 프로모터 검정용 운반체 pBGWFS7-PBr15를 제작하였다(도 2A). 또한, 대조구로써 항구성 프로모터인 35S 프로모터도 pBGWFS7에 클로닝하여 벡터를 제작하였다(도 2B).

상기 실시예 1에서 증폭 분리한 PCR 산물인 즉 Br15프로모터 및 35S 프로모터는 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 어댑터 프라이머 B1인 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'(서열번호 7) 와 B2인 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'(서열번호 8)를 사용하여 각각 PCR 반응을 하였다. PCR된 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산 서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터와 BP 재조합반응을 거쳐 pDONR-PBr15과 pDONR-P35S의 클로닝 벡터가 제작되었다. 서브 클로닝 된 두 종류의 이 운반체들은 최종 식물형질전환 운반체를 제작하기 위해 Egfp 와 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재 되어 있는 pBGWFS7 벡터와 다시 LR 재조합 반응을 거쳐 최종적인 pBGWFS7-PBr15 및 pBGWFS7-P35S 운반체가 완성되었다. 이때, 기본 운반체(binary vector)로 사용된 pBGWFS7는 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자를 가지며, 식물체 선발 인자로 제초제 저항성 Bar 유전자를 포함하고 있다.

< 실시예 3> 전신 발현 프로모터를 포함하는 형질전환 식물체 제작

상시 실시예 2에서 제작한 식물 형질전환용 프로모터::리포터 운반체인 pBGWFS7-PBr15 및 pBGWFS7-P35S를 아그로박테리아에 형질전환하고 파종 후 4주간 생육시킨 애기장대를 감염시켜 형질전환하였다. 애기장대 T0 형질전환체를 생육시킨 후 채종하고 채종한 종자는 파종하여 생육 10일째 1차, 17일째 2차로 0.3% 바스타(Basta)를 처리하여 생존한 T1세대의 형질전환체를 선발하여 2달간 생육시킨 후 채종하였다. 이후 같은 방법으로 T2 후대 형질전환체를 육성하여 프로모터 활성 검정에 이용하였다.

< 실험예 1> Br15 프로모터의 조직 특이적 활성 분석

<1-1> GUS 염색에 의한 조직 특이 발현 분석

전신 발현 프로모터를 형질전환 애기장대에서 식물의 조직별로 활성을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 3에서 제작한 전신 발현 프로모터 Br15를 형질전환한 T2 세대 애기장대 식물체, 35S 프로모터를 형질전환한 애기장대 식물체 및 대조군인 비형질전환 애기장대 식물체를 발아시킨 후 조직별로 GUS-assay 버퍼[Sol. I: 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-Dglucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc CHA salt) 20mM, Sol. II : NaH2PO4 H2O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton-X-100 0.1%, pH7.5]에 침지하고 37℃에서 24시간 처리 후, 70% 에탄올을 처리하여 클로로필(chlorophyll)을 제거하였다. 식물체는 광학 현미경을 이용하거나 육안으로 관찰하였다.

그 결과, 전신 발현 프로모터 Br15를 형질전환한 애기장대의 잎, 꽃, 뿌리 등 전 기관에서 GUS 발색을 확인하였다(도 3).

<1-2> RT - PCR 에 의한 Br15 프로모터의 조직 특이 발현 분석

pBGWFS7-PBr15 형질전환 애기장대 T2 세대 식물체의 꽃(F), 잎(L), 줄기(St), 꼬투리(Si) 및 뿌리(R)의 조직으로부터 RNA를 추출하고 GUS 특이 프라이머(GUS-F, 5'-ACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGC-3'(서열번호 9); GUS-R, 5'-CTCCCTGCTGCGGTTTTTCA-3'(서열번호 10))와 애기장대 하우스 키핑(house keeping) 유전자인 EF1a(elongation factor-1a) 유전자 특이 프라이머(EF1a-F, 5'-GTTTCACATTAACATTGTGGTCATT-3'(서열번호 11); EF1a-R, 5'-GAGGTACCAGTAATCATGTTCTTG-3'(서열번호 12))를 이용하여 RT-PCR를 수행하였다.

그 결과, 전신 발현 프로모터 Br15를 형질전환한 애기장대의 꽃(F), 잎(L), 줄기(St), 꼬투리(Si) 및 뿌리(R) 등 식물체의 모든 조직에서 GUS 밴드 및 EF1a 특이적 밴드가 검출되는 것을 확인하였다(도 4).

< 실험예 2> MUG 분석에 의한 Br15 프로모터의 조직 특이적 활성강도 분석

Br15 프로모터의 조직 특이적 활성 강도를 확인하기 위하여 MUG(4- methyl-umbelliferryl-gluconuride) 분석을 하였다.

pBGWFS7-pPBr15 벡터로 형질전환한 애기장대 T2 식물체와 대조구로 pBGWFS7-P35S 벡터로 형질전환된 애기장대와 비형질전환 애기장대의 잎, 뿌리, 줄기, 꼬투리와 꽃에서 전체 단백질을 각각 분리하였다. 전체 단백질을 분리하기 위해 액체질소를 이용하여 막자사발로 분쇄한 약 50mg의 조직별 시료를 1.5ml 튜브에 옮긴 다음 각 튜브에 100 ㎕의 단백질 추출 완충액(50mM sodium phosphate, pH 7.0, 10mM Dithiothreitol(DTT), 1mM disodium EDTA, 0.1% SDS, 0.1% triton X-100)을 넣고 혼합하였다. 혼합액은 4℃, 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 새 튜브에 옮긴 후 이 중 50㎕를 취하여 37℃로 맞춰진 50㎕의 분석용액(25mM 4-methylumbelliferyl glucuronide, 10mM β-mercaptoethanol)과 혼합하고 이를 37℃ 수조에서 30분간 반응시켰다. 위에 Stop buffer(0.2M sodium carbonate)를 각 샘플에 100㎕씩 잘 섞어주고 형광광도계(여기 필터 365nm, 방출 필터 455nm)를 이용하여 GUS 활성을 정량하였다.

그 결과, 꽃, 잎, 줄기, 꼬투리 조직에서 Br15 프로모터의 활성이 항구성 프로모터로 알려진 CaMV 35S 프로모터보다 3~8배 더 강함을 확인하였으므로 고발현 뿌리특이 프로모터임을 확인할 수 있었다(도 5).

<110> republic of korea <120> Constitutive promoter Br15 <130> P14R12D0139 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2000 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 tgggggtaat gaaacaggag tttggttgat gcattgtcac ttagatgttc atatcaagtg 60 gggccttggt atggcgtttt tggtcgagaa tggtgtcgga gagttggaaa ctcttgaagc 120 tgctcctcat gatctacctg tgtgctagta tcatcattct taatcgagat tcaagagtga 180 aagtcgctat ttttagaaga atattcaaat tttttgtatt gctttggatt aaatgtataa 240 tcctgtttcc ctttgcgtag taaatgtaag tgttcaatgt ttgtcatagt tcatattctc 300 tgtcttacca attattgtag tttgtctttg aaggaaattc aaaattatga aaagaatata 360 gaattttgag caccatgttt ttttttgttc acatgagcac catgtttata taattccatt 420 tgttcatctc aacaaagccc gccaaaacat taatgggctt tgaatgggtc atgtgcaacg 480 agaaaacaaa atgagactta gcaagagaga taggccttgg agtgcgtagg caatggcgta 540 gagtgacatg atcaatggcg ttggagacac gtagtggatg aagtggccac ggtatcgaaa 600 tgacacacga ctcacatgca aaggctatgg ctggctggta ctccctacaa ccatactatt 660 attatatgat taaggatcct cttgatctgg tcgaaactta gccacccaag tttgagctgc 720 cccaattgag acacggctct tgtaaatttt aatatttaat tcttgccaaa tattaaatgt 780 tagtgtgact ttttgatagc caatttgaga ttaaaattaa aaatacatca cattttgcat 840 ttaaataatg cagcaaaaat tagcacttaa aaaaaaaaac tgaaagaaat acaagggctt 900 acatcatcca ttaacttagc cattctgaat ttttaacatg cttttgataa aaatggcaag 960 gagaaggtcg agaaagaagg attcatatgc gaccataagc tatcacttgc cacttttgat 1020 agtgtgttaa tttcttttta aatgaattct tttagaaatt tatttaaata ttaaaatatg 1080 cagtagttct tgtgatctta tctataactc atttaaataa aaggtttaaa ttgtttactt 1140 tcccgtatca acagcgcgtt tcgggttagt tcgagaagta ttcgcgccac ccgtcaacag 1200 ttgaaaacgc ttaagctcca acgaccgaat caagtaacgc cacgtcacta ctcctcgcgc 1260 agataaataa aataaaaata aatatcagaa ctatccagag aaggctatat atactcctcc 1320 gtccttctcg tcctcagata tttttgattt ctggtaaaag cttactgacc aaaaacgaga 1380 gacaaagaga tatcactaga gaagaagacg cgagatagta aactgaacaa gaagatcaaa 1440 caagaaatcg attcatctcc gcaaagaaac atatttgatt tcgattagaa cctctgattc 1500 tgagttccct acgccaatag gtatgttgat ttctggaaat cgatcagttt ctctcatttc 1560 ccgtaatttg atctcctaaa atattagtct ttgtggttag ttggtgactc tgttcttcgt 1620 actctgtttt gtactctgtt tctttatcct ctgttttgta ctctgttttt gagttctcta 1680 caccaataga tatgttgatt tctgggtaat taccaaatct atgatgagtt tctttcattt 1740 cccctaattt tatctcgtaa aatactcgtc ttcgtggtta gttggtgatt ctatcgttct 1800 tcgtactctg tttctgtgtc ctctgttttt gggtcctctg tttttataac ctcaatttta 1860 agttttgatt tttttcccgt gtttgacgaa acccaacagc tcattgatta gattcgtgtt 1920 cagacacaca attgaactcg tgttctgata taaaaatgtt tcctttcttt gtagattgtg 1980 ttgtttccct gaagaagatg 2000 <210> 2 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S promoter <400> 2 tcgacctgca ggcatgcaag ctctcccata tggtcganat ctcctttgcc ccggagatca 60 ccatggacga ctttctctat ctctacgatc taggaagaaa gttcgacgga gaaggtgacg 120 ataccatgtt caccaccgat aatgagaaga ttagcctctt caatttcaga aagaatgctg 180 acccacagat ggttagagag gcctacgcgg caggtctcat caagacgatc tacccgagta 240 ataatctcca ggagatcaaa taccttccca agaaggttaa agatgcagtc aaaagattca 300 ggactaactg catcaagaac acagagaaag atatatttct caagatcaga agtactattc 360 cagtatggac gattcaaggc ttgcttcata aaccaaggca agtaatagag attggagtct 420 ctaagaaagt agttcctact gaatcaaagg ccatggagtc aaaaattcag atcgaggatc 480 taacagaact cgccgtgaag actggcgaac agttcataca gagtctttta cgactcaatg 540 acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 600 tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 660 cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 720 aaaaggaagg tggcacctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 780 atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 840 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 900 taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 960 catttcattt ggagaggact gcaggacgat ccgtattttt acaacaatta ccacaacaaa 1020 acaaacaaca aacaacatta caatttacta ttctagtcga cctgcaggcg gccgcac 1077 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Br15 amplifying primer <400> 3 aaaaagcagg cttgggggta atgaaacagg ag 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Br15 amplifying primer <400> 4 agaaagctgg gtcatcttct tcagggaaac aa 32 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S amplifying primer <400> 5 aaaaagcagg cttcgacctg caggcatgca 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S amplifying primer <400> 6 agaaagctgg gtgtgcggcc gcctgcaggt 30 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor primer <400> 7 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor primer <400> 8 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS primer <400> 9 cctgcgtcaa tgtaatgttc tgc 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS primer <400> 10 ctccctgctg cggtttttca 20 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a primer <400> 11 gtttcacatt aacattgtgg tcatt 25 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a primer <400> 12 gaggtaccag taatcatgtt cttg 24

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 배추(Brassica rapa) 유래의 식물체 전신 발현(constitutive expression) 프로모터.
제 1항의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 하기 도 2의 개열지도를 갖는 재조합 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
[도 2]
제 2항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물.
제 4항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로 코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 및 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogene)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 미생물.
제 4항의 미생물로 형질전환된 형질전환 쌍자엽 식물.
제 6항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 콩, 감자, 팥, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 장미, 거베라, 카네이션, 국화, 레드클로버로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 쌍자엽 식물.
1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 배추(Brassica rapa) 유래의 식물체 전신 발현(constitutive expression) 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 하기 도 2의 개열지도를 갖는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조된 발현 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 아그로박테리움을 이용하여 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 식물체 내에서 전신적으로(constitutively) 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법.
[도 2]