KR101120603B1

KR101120603B1 - 전신발현 유도용 베타카로틴 수산화효소 1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터

Info

Publication number: KR101120603B1
Application number: KR1020090031765A
Authority: KR
Inventors: 하선화; 양영실; 김영미; 강상호; 이데레사; 김민갑
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2009-04-13
Filing date: 2009-04-13
Publication date: 2012-06-27
Also published as: KR20100113278A

Abstract

본 발명은 베타카로틴 수산화효소 1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터에 관한 것으로서 보다 상세하게는 식물체 내에서 전신 발현을 유도하는 새로운 프로모터인 베타카로틴 수산화효소 1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다. 본 발명의 프로모터 및 이를 이용한 재조합 벡터는 식물체 전 조직에 걸쳐서 목적단백질의 발현을 유도할 수 있으며, 종래에 흔히 사용되는 CaMV 35S 프로모터에 비해서 우수한 발현 유도 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터는 유용 유전자의 식물체 내에서의 발현의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

애기장대, 전신 발현 프로모터, 베타카로틴 수산화효소, AtBch1

Description

전신발현 유도용 베타카로틴 수산화효소 1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터{Constitutive Promoter PAtBch1 and expression vector comprising the same}

본 발명은 베타카로틴 수산화효소 1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터에 관한 것으로서 보다 상세하게는 식물체 내에서 전신 발현을 유도하는 새로운 프로모터인 베타카로틴 수산화효소 1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.

육종이란 가축이나 작물의 유전학적 형질을 개선하여 이용가치가 높은 새로운 품종을 육성하는 것으로, 단순히 기존 품종의 개량 또는 새 품종의 육성에만 그치는 것이 아니라 새로운 종(種)을 만들어내는 것도 포함된다. 육종 기술은 새로운 품종의 출현에 의한 재배작물의 다양성 획득, 다수확성 또는 저생산비성 품종으로 인한 경제적 이익, 작물재배의 지리적인 한계나 계절적인 한계의 극복, 품질의 개선, 냉해?병해?충해에 대한 저항성의 향상으로 인한 재배안전성의 증대, 그리고 여러 가지 작물의 조생종?만생종?단간종 등의 새 품종을 육성함으로써 윤작체계 의 조절이나 작업의 분배를 할 수 있게 되어 경영의 합리화에 유리하다기 때문에 농업의 발달과 더불어 시작되었으며 특히 19세기 이후에 활발하게 이루어졌다.

육종의 방법으로는 도입, 분리, 교잡(交雜), 잡종강세(雜種强勢), 배수성(倍數性), 돌연변이, 분자 육종법 등이 있으며, 종래에는 도입, 분리, 교잡(交雜), 잡종강세(雜種强勢), 배수성(倍數性), 돌연변이 육종법이 많이 사용되었으나, 최근 분자생물학 기술의 발전에 따라 분자 육종법이 주목을 받고 있다.

분자 육종법은 분자생물학적 기법을 이용하여 새로운 형질을 생물에 도입하고 이를 선별하는 방법으로써 종래의 육종법에 비해서 시간 및 비용이 적게 들어 경제적이며, 종래의 육종법으로는 얻을 수 없는 이종간의 형질 도입이 가능하여 각광을 받고 있다. 이러한 분자 육종을 하기 위해서는 대사 과정에 대한 이해, 유용한 유전자, 이를 발현시킬 수 있는 수단 및 다양한 동식물에 대한 형질전환기법 등의 여러 가지 수단들이 필요하며, 특히 원하는 유전자를 원하는 부위에서 원하는 시기에 발현시키기 위한 다양한 프로모터 및 벡터의 개발의 필요성이 지속적으로 요구되고 있다.

현재 식물 형질전환의 80%를 차지할 정도로 가장 많이 사용되고 있는 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터이며 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 이용되어 왔다. 최근에 국 내 연구진에 의해 개발된 애기장대 유래의 포스파타제 2A를 암호화하는 PP2A유전자의 프로모터(대한민국 특허 제803391) 등이 개발되어 이용예정 중에 있다. 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴 (actin) 및 옥수수 유비퀴틴 (ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크롬 C 유전자 (OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다 (대한민국 특허 제429335호). 이러한 전신발현 유도 프로모터들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 중요한 프로모터들이다.

본 발명자들은 형질전환 식물의 제조에 이용될 수 있는 프로모터를 개발하기 위하여 연구하여 오던 중, 베타카로틴 수산화효소 1 유전자의 프로모터가 종래에 사용하는 CaMV 35S 프로모터 보다 우수한 발현능을 가짐을 확인하여 이를 이용하여 AtBch1 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 AtBch1 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 전신 조직에서 특이적으로 발현되는 AtBch1 프로모터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 AtBch1 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 프로모터는 애기장대 AtBch1 유전자에서 유래된 프로모터로서, AtBch1 유전자는 카로티노이드 합성 경로에서 베타카로틴으로부터 베타크립토잔틴 (Crytoxanthin)을 합성하는 효소로써의 기능뿐만 아니라, 애기장대에서 과발현 시켰을 때 고온이나 강한 빛 등 환경적 스트레스로부터 식물체를 보호하는 기능이 있는 유전자이다(Davison et al., Nature, 418:203-206, 2002). 본 발명의 프로모터는 TATA box, CAAT box, 등의 모티프를 포함하고 있다. 본 발명의 프로모터는 형질전환체의 전신 조직 또는 상기 조직세포에서 항상 발현이 유도되며(constitutive promoter), 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 프로모터는 통상의 재조합 발현벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.

상기에서 “재조합 발현벡터”란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 당업계에 알려진 다양한 구조 유전자를 포함할 수 있으며, 이러한 구조 유전자는 상기 AtBch1 프로모터와 작동가능하게 연결된다. 본 발명에서 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

또한, 상기 구조 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein, AY598428) 유전자, GUS(β-glucuronidase, AF485783) 유전자, GAL(β-galactosidase, AAB49721) 유전자 등을 포함하지만 그것에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 AtBch1 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터는 공지의 재조합 발현 벡터, 특히 형질전환 식물의 제조에 이용될 수 있는 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등 일 수 있으나, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 AtBch1 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터는 도 2에 기재된 pBGWFS7-PAtBch1 벡터일 수 있으며, 이는 농용미생물보존센터에 2009년 1월 30일자로 KACC 95096P로 기탁되었다.

한편, 본 발명은 본 발명의 AtBch1 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합 법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있으며, 더 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다 (Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 예를 들면 벼에 대한 아그로박테리움-매개 형질전환법은 당업계의 문헌 등에 공지되어 있다(An et al., EMBO J., 4:227-288,1985).

상기 형질전환체는 이에 한정되지는 않으나, 미생물로서는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogene)일 수 있다.

또한, 상기 형질전환체는 이에 한정되지는 않으나, 식물 또는 식물세포일 수 있으며, 이 때, 상기에서 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함되며, 바람 직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스일 수 있다.

상기 식물세포로는 모상근 세포일 수 있으며, 추가적으로 상기 식물세포는 통상적인 방법에 따라 배양되어 액체 배양물, 캘러스, 원형질 배양물이 될 수 있으며, 분화되어 식물의 조직 또는 식물이 될 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 모상근들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있으며, 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법 및 종자를 이용하여 유성번식방법에 의해 생산할 수 있다.

식물세포의 배양은 식물의 일부를 모체로부터 분리하여 적당한 조건 아래에서 무균적으로 배양하여 생육시키는 것으로 조직 절편의 액체 배양, 조직 절편의 캘러스 배양, 원형질체 배양 등 당업자에게 공지된 어떠한 방식의 것에 의할 수 있으며, 그 배양 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 배양된 식물세포를 식물로 분화시키는 것은 캘러스, 원형질체 형태의 배양된 식물세포를 적당한 조건아래에서 분화를 유도하여 식물의 조직 또는 식물로 분화시키는 것으로 그 분화 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 AtBch1 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 구조유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물을 형질전환하여 식물 세포에서 상기 구조유전자의 발현을 유도하는 방법을 제공한다. 이 때, AtBch1 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있으며, 구조유전자, 재조합 발현벡터의 구성 및 형질전환 방법 등에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.

AtBch1 프로모터는 상기에서 언급한 것과 같은 식물에서 항상 발현되므로 AtBch1 프로모터 및 구조유전자를 포함하는 벡터의 경우 도입된 형질전환 식물 또는 이의 세포에서 구조유전자의 발현을 유도할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

본 발명의 일실시예에서는 애기장대의 여러 조직에서 추출한 전체 RNA를 이용하여 역전사 증폭반응(reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) 분석을 수행하여 in silico 조직특이 발현도와 비교하여 AtBch1 프로모터의 전신발현 유도 가능성을 검증한 다음, AtBch1 유전자의 5‘ 상위 약 2kb에 해당하는 프로모터 영역을 PCR로 분리하고 pBGWS7에 클로닝하였고, 대조군으로 CaMV 35S 프로모터를 가지는 벡터를 제조하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기에서 제조한 재조합 벡터 및 대조군 벡터 각각으로 아그로박테리움 GV3101 균주를 통해 애기장대 식물체에 도입한 다음 AtBch1 프로모터의 발현 특성을 분석하였다. 형질전환 식물체들로부터 RNA, 단백질을 추출하여 AtBch1 프로모터의 활성이 조사한 결과, 쌍자엽 식물의 형질전환에 주로 사용되는 CaMV 35S 프로모터 보다 RT-PCR(1.8 배), 웨스턴 블랏(2 배) 및 MUG 분석(2.8 배) 모두 우수한 프로모터 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 프로모터 및 이를 이용한 재조합 벡터는 식물체 전 조직에 걸쳐서 목적단백질의 발현을 유도할 수 있으며, 종래에 흔히 사용되는 CaMV 35S 프로모터에 비해서 우수한 발현 유도 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터는 유용 유전자의 식물체 내에서의 발현의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예1>

AtBch1 유전자의 식물체 내에서의 발현양상 분석

애기장대 유래 AtBch1 유전자(Genbank Accession No. At4g25700)의 발현양상을 조사하기 위해서 애기장대의 유묘, 근생엽, 경생엽, 줄기, 뿌리, 꽃, 꼬투리, 종자 등으로부터 전체 RNA (total RNA)를 분리하여 역전사 증폭반응(RT-PCR)을 다음과 같이 수행하였다. 우선, 전체 RNA의 분리를 위해, 각 조직별 시료 0.5g을 액체 질소가 담긴 막자사발에서 충분히 마쇄한 다음, 5ml의 RNA 추출액 [200mM Tris-HCl (pH 9.0), 400mM LiCl, 25mM EDTA (pH 8.2), 1% SDS]과 5ml 페놀을 첨가하여 충분히 혼합하였다. 상기 혼합액을 15ml 튜브에 옮긴 다음 3,000rpm에서 10분간 원 심분리한 후 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮겼다. 여기에 클로로포름 1ml과 페놀 1ml를 첨가하여 볼텍스(vortex) 기기로 잘 섞어준 후 다시 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 다시 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮기고 2ml의 클로로포름을 첨가하여 볼텍스 기기로 충분히 혼합하고 분리하는 작업을 2회 반복한다. 상등액을 새 튜브에 옮기고 2.5배 부피의 에탄놀과 10분 1 부피의 3M sodium acetate (pH 5.2) 첨가하여 -20℃에 1시간 보관하였다. 다음, 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 RNA와 DNA 침전물을 2M 리튬클로라이드 (LiCl)용액을 첨가하여 용해한 후 -20℃에 2시간 이상 보관하여 RNA만 침전시켰다. 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리 하여 얻은 RNA 침전물을 80% 에탄올로 한차례 씻어준 후 수득한 최종 RNA 침전물을 80-100㎕의 DEPC 용액에 녹였다. RNA 추출액은 자외선 흡광도 분석기 (UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량하여 mRNA selective RT-PCR에 이용하였다.

추출한 전체 RNA 1㎍을 주형으로 이용하고 mRNA selective RT-PCR kit(TAKARA)[1xRT buffer, 5mM MgCl₂, 1mM dNTP, 50μM Oligo dT primer, RNase inhibitor (0.8units/㎕), AMV RTase XL (0.1units/㎕)]를 사용하여 30℃에서 10분, 42℃에서 30분 반응시키고, 4℃에서 냉각시켜 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA를 AtBch1 유전자 특이 증폭 프라이머 세트(서열번호 2(5'-GATTCTCTCCGTCTCTTCG-3') 및 서열번호 3(5'-AATGAAAGAGGGACTTACG-3'))과 RNA의 상대적인 량이 균일함을 증명하기 위한 애기장대 AtEF1 유전자 특이 프라이머 세트(서열번호 4(5'-GTTCACATTAACATTGTGGTCATT-3') 및 서열번호 5(5'-CAGGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3'))를 사용하여 각각 560bp와 305bp의 PCR 산물이 증폭(25 cycles)되도록 수행하고 그 전기영동 이미지를 Quantity One 소프트웨어(버전 4.4.1, Bio-Rad)를 사용하여 정량화하였다.

그 결과, 도 1에서 보듯이, AtBch1 유전자는 실험을 수행한 모든 조직에서 발현되었으며 그 발현도는 유묘의 발현도를 기준(1)으로 볼 때 종자(6.6 배)>꼬투리(5.1 배)>경생엽(2.9 배)>꽃(2.5배)>뿌리(2.3 배)>근생엽(2.1 배)>줄기(2.0 배) 순이었으며 전반적으로 종자와 꼬투리 등의 생식조직에서 잎, 줄기, 뿌리 등의 영양성장조직보다 2?3배 정도 높은 발현도를 보였다. 이상의 AtBch1 유전자의 내재 발현도 조사 결과로부터 프로모터 영역의 전신발현 가능성이 예상됨으로 약 2kb 영역을 분리하여 기능 분석을 수행하였다.

<실시예2>

식물 형질전환용 운반체 제작

애기장대 베타카로틴 수산화효소 1 유전자(AtBch1)의 프로모터를 분리하기 위하여, 개시코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 약 2kb 영역을 증폭할 수 있도록 프라이머를 제작하여 PCR로 분리하고, 벨기에의 겐트대학으로부터 구입한 게이트웨 이 운반체 pBGWFS7 벡터(VIB, Gent, Belgium)를 이용하여 AtBch1 프로모터 기능 분석용 운반체를 다음과 같이 제작하였다.

애기장대 식물체의 잎 조직 소량을 E-튜브에 넣고 Genomic DNA Purification Kit (I.J.BIO DNA System)을 이용하여 분리 정제하였다. DNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기 (UV spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다. 애기장대로부터 분리한 게노믹 DNA를 주형으로 하고, 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아가 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위(attP1과 attP2)를 일부 포함하면서 AtBch1 프로모터를 특이적으로 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 6(5'-AAAAAGCAGGCTGCCTTAATCTTGTCTGC-3') 및 서열번호 7(5'-AGAAAGCTGGGTCCTAATGGAAGGAGGAG-3')의 프라이머를 제작하여 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 프로모터 부위를 분리하였다.

AtBch1 프로모터의 기능을 쌍떡잎식물의 형질전환에 주로 사용되는 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터의 활성과 비교하기 위하여 박테리아측 특이적 재조합 핵산서열 부위(attP1과 attP2)를 일부 포함하면서 약 781bp의 35S 프로모터를 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 8(5'-AAAAAGCAGGCTAGAGATAGATTTGTA-3') 및 서열번호 9(5'-AGAAAGCTGGGTATGGTGGAGCACGA-3')의 프라이머를 이용하고, pCAMBIA 벡터를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 35S 프로모터 부위를 분리하였다.

증폭된 AtBch1 프로모터 부위와 CaMV 35S 프로모터 부위에 대한 PCR 산물들을 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위(attP1과 attP2) 전체를 포함하는 서열번호 10(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3') 및 서열번호 11(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3')의 프라이머를 사용하여 각각 재 PCR 되었다.

2차로 PCR된 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터(Invitrogen)와 BP 재조합반응(BP clonase enzyme(Invitrogen) 사용)을 거쳐 각각 pENTR-PAtBch1와 pENTR-P35S의 클로닝 벡터를 제조하였다. 서브 클로닝 된 두 종류의 운반체들은 최종 식물형질전환 운반체를 제작하기 위해 Egfp 와 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템(Egfp:gus)이 내재되어 있는 pBGWFS7 벡터와 다시 LR 재조합 반응을 거쳐 최종적인 pBGWFS7-PAtBch1와 pBGWFS7-P35S 벡터를 완성하였다(도 2 참조).

이 때, 기본 운반체(binary vector)로 사용된 pBGWFS7는 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신 (spectinomycin) 저항성 유전자를 가지며, 식물체 선발인자로 제초제 저항성 Bar유전자를 포함하고 있다.

제작된 형질전환용 운반체들은 액체질소를 이용한 직접적인 아그로박테리아 형질전환 방법 (참조: Holster 등의 , 1978)에 따라 아그로박테리아 튜메파시엔스 균주 GV3101에 형질전환 시킨 후, 알카리 방법 (alkaline lysis)에 근거한 아그로박테리아 급속 선발 (quick-screen)을 이용하여 아그로박테리아 내 도입을 확인하였다.

<실시예 3>

식물 재료 및 애기장대 형질전환

파종한 후 23℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육된 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia, Col-0) 식물체의 일차 추대를 제거하여 최소한 3-4개의 이차 추대를 유도한 후, 식물 형질전환 운반체가 보유된 아그로박테리아 배양액을 5% sucrose와 0.05% silwet77이 함유된 용액에 OD 0.8 정도로 희석한 현탁액에 1분간 담구고 2분간 진공처리하여(vacuum) 침윤(infiltration) 시켰다. 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤동안 배양한 후 23℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직 (silique)이 갈색으로 완전히 성숙 할 때까지 약 3 내지 5주간 생육 시킨 후 채종하였다. 채종된 종자는 다시 파종하여 생육 2주째 일차, 4주째 이차로 0.3% 바스타를 살포함으로써 형질전환체를 선발하였다.

<실시예 4>

리포터 GUS 효소 (β-glucuronidase) 활성의 정량 분석

애기장대 형질전환체의 리포터 효소 GUS의 효소 활성을 정량적으로 조사하기 위해 MUG(4-methyl umbelliferyl-b-D-glucuronide) assay 분석 방법이 사용되었다. AtBch1 프로모터 및 35S 프로모터 형질전환체의 4주째 잎으로부터 조단백질을 분리하기 위해 액체질소를 이용하여 막자사발로 분쇄한 후 약 50mg의 시료를 1.5ml 튜브에 옮긴 다음 각 튜브에 100 ㎕의 단백질 추출 완충액 (50mM sodium phosphate, pH 7.0, 10mM Dithiothreitol (DTT), 1mM disodium EDTA, 0.1% SDS, 0.1% triton X-100)을 넣고 격렬하게 혼합하였다. 혼합액은 4℃, 12,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 새 튜브에 옮긴 후 Intron Biotechnology 사의 PRO-MEASURE solution kit를 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 이 중 2㎍를 취하여 Bio-Rad사의 FluorAce^TM β-glucuronidase Reporter Assay Kit의 분석 용액(1.2mM MUGluc, 10.0mM b-mercaptoethanol in 1x Reaction buffer) 500㎕와 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 여기에 1x Stop buffer를 각 샘플에 1000㎕씩 잘 섞어주고 형광광도계 (VICTOR³V^TM Multilabel Counter, PerkinElmer)를 이용하여 필터 355nm, 방출 필터 460nm조건에서 GUS 활성을 정량하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, AtBch1 프로모터 형질전환 식물체(라인 1, 2, 4)이 35S 프로모터 형질전환 식물체(9, 10, 15)보다 2.8 배 정도 높은 GUS 활성을 보여 본 발명의 AtBch1 프로모터의 활성이 더 우수함을 확인할 수 있었다.

<실시예 5>

형질전환체에서 리포터 유전자의 발현 분석

형질전환된 애기장대 식물체(T1 식물체)는 22℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙 할 때까지 약 2달간 생육 시킨 후 T2 종자를 채종하여 상기 실시예 3에서 기술한 방법으로 바스타 저항성을 통해 후대(T2 식물체)를 선발 하고 하기의 실험을 수행하였다.

비형질전환체(WT), 35S (라인 10, 15)와 AtBch1 (라인 1, 2, 4) 프로모터 형질전환체의 발아 후 4주째 잎을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하여 이를 주형으로 하여, 서열번호 12(5'-ACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGC-3') 및 서열번호 13(5'-CTCCCTGCTGCGGTTTTTCA-3')의 청색 발현 Gus 유전자 특이 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 서열번호 5의 애기장대 연장요소 (AtEF1, EF-1α: elongation factor-1α) 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 각각 478bp와 305bp의 PCR 산물이 증폭(25 cycles)되도록 수행하고 그 전기영동 이미지를 Quantity One 소프트웨어(버전 4.4.1, Bio-Rad)를 사용하여 정량화하였다.

그 결과, 도 4에서 보듯이, 전사체 수준에서의 Gus 유전자 발현도는 AtBch1 프로모터 형질전환 식물체(라인 1, 2, 4)에서 35S 프로모터 형질전환 식물체(10, 15)보다 1.2?1.8배 정도 높음을 확인하였다.

<실시예 6>

형질전환체에서 리포터 단백질의 축적도 분석

웨스턴 블랏 실험을 수행하기 위하여 발아 후 4주째 비형질전환체 (WT), 35S (라인 10, 15)와 AtBch1 (라인 1, 2, 4) 프로모터 형질전환 애기장대 T2 세대 식물체의 잎을 액체질소를 이용해 마쇄 후 sodium phosphate buffer (50mM sodium phosphate buffer, 10mM DTT, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.1% TritonX-100, 0.2% protease inhibitor)를 시료의 부피만큼 첨가하여 단백질을 분리하였다. 추출한 단백질을 정량하여 20㎍을 10% SDS-PAGE로 전기영동 후 PVDF 멤브레인(membrane)에 전이하였고 1% 탈지분유 용액으로 4시간 반응 후, 항-GUS 단일클론 항체 (Fitagerald RDI-BGLUCURabr)를 1:2500으로 희석한 용액을 사용하여 웨스턴 블럿(western blot)을 수행하였다. 반응 후 TBS 완충용액으로 3번 세정한 다음 항-토끼 알칼리 인산화효소(1:5000)을 2시간 처리하고 다시 TBS 완충용액으로 3번 세정한 다음 BCIP/NBT Color Development Substrate (Promega S3771)를 사용하여 현상하고 그 이미지를 Quantity One 소프트웨어(버전 4.4.1, Bio-Rad)를 사용하여 정량화하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, AtBch1 프로모터 형질전환 식물체(라인 1, 2, 4)에서 35S 프로모터 형질전환 식물체(10, 15)보다 1.4 내지 2.0배 정도의 높은 리포터 단백질 축적도를 보임을 알 수 있었다.

<실시예 7>

식물체 조직별 GUS 발색 반응 분석

형질전환 T2 종자를 파종하여 생육 10일째 1차, 17일째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 선발된 형질전환 애기장대 식물체의 유묘, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 꼬투리 등 여러 조직을 관찰하였다. 대조구로 비형질전환 애기장대 식물체는 바스타를 처리하지 않고 발아시켰다. 주로 발아 후 3주, 5주, 6주째 식물체를 이용하여 각 조직을 GUS-assay buffer [Sol. I: X-gluc (cyslohexyl ammonium salt) 20mM, Sol. II : NaH₂PO₄ H₂O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton-X-100 0.1%, pH7.5]에 담궈 37℃에서 24시간 처리 후, 70% 에탄올을 처리하여 클로로필 (chlorophyll)을 제거하였다. 염색된 조직들을 Olympus의 light microscope를 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 발아 후 3주째의 유묘단계에서 35S 및 AtBch1 프로모터의 형질전환체와 발아 후 5주째의 AtBch1 프로모터의 형질전환체는 전신에 GUS 발현에 의한 청색 발색이 관찰된 반면, 비형질전환 애기장대에서는 GUS 청색발 색이 전혀 보이지 않았다. 형질전환체 조직별 청색 발색 반응 결과, 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 꽃받침, 암술, 수술, 꼬투리 벽(silique wall) 및 종자에서 모두 발현되고 있음을 관찰하였고, 이로부터 AtBch1 프로모터는 35S 프로모터와 마찬가지로 전신발현 프로모터임을 확인하였다.

<실시예 8>

형질전환 식물체의 조직별 전사체 발현 및 GUS 효소 활성 정량 분석

AtBch1 프로모터에 의해 유도되는 리포터 Gus 유전자의 식물 조직별 발현도를 실시예 5에서 설명한 방법으로 Gus 유전자 특이 프라이머 세트 k와 l과 AtEF1 유전자의 특이 프라이머 세트 c와 d를 사용하여 분석하였고, AtBch1 프로모터에 의한 GUS 효소 활성을 실시예 4에서 설명한 MUG 분석 방법으로 조직별로 실험하였다.

그 결과, 도 7에서 보듯이, AtBch1 프로모터 형질전환 애기장대 식물체의 Gus 유전자의 전사 수준에서의 발현도를 근생엽(1)을 기준으로 비교해 보면, 경생엽(0.4 배), 유묘(0.2배), 줄기(0.2 배), 뿌리(0.2 배), 꽃(1.4 배), 꼬투리(1.2 배) 및 종자(1.7 배) 등 실험을 수행한 모든 조직에서 리포터 유전자의 발현이 확인되었고, 그 중에서 꽃과 종자 등의 생식조직에서 비교적 높은 발현도를 보였다(도 7A 참조). 동일한 식물체 조직 시료를 이용하여 AtBch1 프로모터에 의한 조직별 GUS 효소 활성을 비교해 본 결과, 리포터 유전자의 전사 수준에서의 발현 분석 결과와 유사하게 꽃과 종자에서 가장 높은 활성을 보였고, 잎, 줄기, 뿌리, 꼬투리에서는 비슷한 수준의 효소 활성이 확인되었다(도 7B 참조).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 프로모터 및 이를 이용한 재조합 벡터는 식물체 전 조직에 걸쳐서 목적단백질의 발현을 유도할 수 있으며, 종래에 흔히 사용되는 CaMV 35S 프로모터에 비해서 우수한 발현 유도 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터는 유용 유전자의 식물체 내에서의 발현의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 야생형 애기장대 각 조직에서 추출한 전체 RNA를 이용하여 내재 AtBch1 유전자의 발현 양상을 역전사 증폭반응(RT-PCR)를 통해 확인한 결과(A) 및 이를 정량화한 결과(B)이다.(M, 1kb DNA ladder; AtBch1: 애기장대 베타카로틴 수산화효소 유전자; AtEF1, 애기장대 연장요소 (elongation factor) 1α 유전자; Sd, 유묘(Seedling); RL, 근생엽(Rosette Leave); CL, 경생엽(Cauline Leave); S, 줄기; R, 뿌리; F, 꽃; Si, 꼬투리; Se, 종자)

도 2는 플라스미드 pBGWFS-PAtBch1(A)와 pBGWFS-P35S(B)의 유전자지도의 모식도이다.(LB, Left border; Bar, 제초제저항성 유전자; PAtBch1, 베타카로틴 가수분해효소 1 프로모터 유전자; P35S, 꽃양배추바이러스 35S 프로모터 유전자; Egfp, 녹색형광단백질(green fluorescent protein) 리포터 유전자; Gus, 청색발색(β-glucuronidase) 리포터 유전자; T35S, 꽃양배추바이러스 35S 터미네이터; RB - Right border)

도 3은 pBGWFS7-P35S와 pBGWFS7-PAtBch1 형질전환 애기장대 식물체에서 리포터 단백질 GUS(β-glucuronidase)의 효소 활성을 측정한 결과이다.(P35S, 35S 프로모터 형질전환 애기장대 식물체 라인; PAtBch1, AtBch1 프로모터 형질전환 애기장대 식물체 라인)

도 4는 대조구 및 형질전환체에서 RT-PCR을 통해 리포터 유전자의 발현을 확인한 것(A) 및 이를 정량화한 결과(B)이다.(WT, wild type 비형질전환 Col-0 애기장대 식물체)

도 5는 단백질 수준에서 대조구 및 형질전환체에서 리포터 유전자의 발현을 확인한 것이다.(CBB, coomassie brilliant blue 염색)

도 6은 음성대조군(a), CaMV 35S 프로모터에 의한 형질전환체(b) 및 본 발명의 형질전환체(c 내지 n)의 유묘 및 식물체 발달 과정 중 조직별 리포터 유전자의 발현을 확인한 것이다.(a, 발아 후 3주째 유묘; b, 발아 후 3주째 유묘; c, 발아 후 3주째 유묘; d, 발아 후 5주째 식물 전체; e, 발아 후 5주째 잎; f, 발아 후 5주째 뿌리; g, 발아 후 5주째 줄기; h, 발아 후 5주째 꽃; i, 발아 후 5주째 꽃받침; j, 발아 후 5주째 암술과 수술; k, 발아 후 5주째 꼬투리; l, 꽃핀 후 6주째 꼬투리 끝부분; m, 꽃핀 후 6주째 꼬투리병 부분; n, 채종된 성숙 종자)

도 7은 형질전환 애기장대 식물체 조직별 발현 정도를 AtEF1과 비교하여 mRNA 수준에서 확인한 것(A) 및 발현된 GUS 활성을 조직별로 비교한 것(B)이다. (RL: 발아 후 5주째 식물체의 근생엽(rosette leaf); CL: 발아 후 5주째 식물체의 경색엽(cauline leaf); S: 발아 후 5주째 식물체의 줄기(stem); R: 발아 후 5주째 식물체의 뿌리(root); F: 발아 후 5주째 식물체의 꽃(flower); Si: 발아 후 6주째 식물체의 꼬투리(silique); Se: 채종된 성숙 종자(seed))

<110> Republic of Korea <120> Constitutive promoter PAtBch1 and expression vector comprising the same <130> NP09-0020 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1981 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 tgccttaatc ttgtctgcaa tgtagggtat tgatgtcttg aacggcatag tgacaagcaa 60 cgcctatttg gtaataaatc tcgctatgca tgcgttttcg agtggtgttg actattttgc 120 tgacaaggag gatgttagct attgtgattt agtgccacca gctgaacccc ttttaagtat 180 aatgaaggaa ataccaccgc tgagataagg gtgttcaatg gagaagatgc aaactgcacg 240 accctaggaa cgtgaggcaa agagacgaaa gtttggcgct cttgttccag aggaccagtt 300 tctagctcaa aatccggtaa tgtttttgtt ttccttcctt gtgactagac tcgtgtatct 360 aactagcagt aatacatttt cagggtccct ttaggatcat gatcagagtt tctggtgcag 420 acgactatgt ggagtctttg aaatcacggt ggactcgtta tcacacagac agatgttaag 480 tggaaagctg gggttttaga ggacaacaag tcattgcaca ttacaatgtt ggagcaggag 540 aaattctaac agtgtcttgg tgacaaggtt tttgtgcaca ttagcaatag tccggtcatt 600 ctttaatgca aaccataatc tatattcatc ccaaaatctc agaatccaaa gcgcaagaga 660 atcaaacgtt tcatcatctt atatctacaa cggcctttag cagaagagtg taattgaagg 720 tccatgaccc aagttgcagt atccatatca caatttgagg tccaaaaaaa gaaaaaaaaa 780 ataataattc tataaaagaa ccaaaaaaca aagatactag gaggatttgt catagtgaat 840 agtgatgtga cacgtagaga aagcccatat ggcatcatca gcctcataaa tgggtgtaac 900 ttgtaaggaa cttgttgcgt tcgtttctgg tttggagcct aactttttgt ttctttgtct 960 ttcaccatcg ctgtttctgt gattttacgt ttatgccatt ttaagttaag gacttagtcc 1020 agacatctta gaattacatc attattcatc acgatatcga aaattataca aatgacgttt 1080 agaacaaacg gatataaaca atacaaaatc acacgcaata cacggaacta tgacaaccat 1140 gccacaagtc tccacatgta ctcatgtagt gatgatgtag cgtcctaaac atatccacat 1200 tccttaaaat gaaaaaatct actttttaga aaacgaatcc aaaacaatag acagtaaatg 1260 aatctagtag aatttctaca taagtttact ttctctatat atcttatatt ttataacaac 1320 aataatgttt ataaatttgt ttcaccttaa ttatggttta caaaatactg tatcttggat 1380 ttaattaaaa aagataaatc atttataaac taaattgatg tgattcatac taaaatacta 1440 aagtgttctt aagatattgt tagctttgta gacaagtgag aagaataaaa aaaggctttt 1500 gtatggttta agtcttatag taaatgctaa tttggtttat aaaacatatt tatactaaaa 1560 atctagaaat taataaatta aacataactg agcttatgtg aaaaaggtaa gcaaatacat 1620 ttttggtcaa agaaaagatg gaaaaaaatc caaaaaagaa aacaaatatt atcaaaaaat 1680 aagaaagtaa cccattttga gtgggggtaa taatgtaaat gtgatataag ggtggggtag 1740 gattagtcgc taaaaaaact tgagggcaat tttagtcaca cgaaactaaa ccatccttca 1800 cttgtttaat ttaattttga aaaggcaaaa aaaagagcac ttacttttac ccaaaaacaa 1860 aaaaatcgtg gcctcacttg catttaaatc catccacacc acatctctct ctctgtctat 1920 ctatctctct cgctcgcata aaaggttaac ctcaaaacaa gtagctcctc cttccattag 1980 g 1981 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtBch1 primer 1 <400> 2 gattctctcc gtctcttcg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtBch1 primer 2 <400> 3 aatgaaagag ggacttacg 19 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtEF1 primer 1 <400> 4 gttcacatta acattgtggt catt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtEF1 primer 2 <400> 5 caggtaccag tgatcatgtt cttg 24 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attp primer 1 <400> 6 aaaaagcagg ctgccttaat cttgtctgc 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attp primer 2 <400> 7 agaaagctgg gtcctaatgg aaggaggag 29 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S attp primer 1 <400> 8 aaaaagcagg ctagagatag atttgta 27 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S attp primer 2 <400> 9 agaaagctgg gtatggtgga gcacga 26 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attp primer 3 <400> 10 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attp primer 4 <400> 11 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS primer 1 <400> 12 acctgcgtca atgtaatgtt ctgc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS primer 2 <400> 13 ctccctgctg cggtttttca 20

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 전신 발현(constitutive expression) 유도용 AtBch1 프로모터.
제1항의 프로모터를 포함하는 전신 발현 유도용 재조합 벡터.
제2항에 있어서, 상기 벡터는 pBGWFS7-PAtBch1 벡터(KACC 95096P)임을 특징으로 하는 벡터.
제2항 또는 제3항의 벡터로 형질전환된 미생물.
제4항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 및 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogene)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 미생물.
제4항의 미생물로 형질전환된 형질전환 쌍자엽 식물.
제6항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 콩, 감자, 팥, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 장미, 거베라, 카네이션, 국화, 레드클로버로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 쌍자엽 식물.
서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 구조유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물을 형질전환하여 식물 세포에서 상기 구조유전자의 발현을 유도하는 방법.