KR101029314B1 - 조직특이적 프로모터 ｐＰＬｉｍ3, 이를 포함하는 발현벡터및 이를 이용한 형질전환체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 화분에서 특이적으로 발현하는 pPLim3 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 벼에서 분리한, 화분 조직에서 특이적으로 발현하는 pPLim3 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용하여 제조한 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명은 화분 조직에서 특이적으로 발현되는 pPLim3 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 이러한 본 발명의 프로모터 및 재조합 발현 벡터는 화분 조직에서 유용유전자의 발현을 유도하여 새로운 품종의 형질전환체를 개발하는 데에 이용할 수 있다.
발현 벡터, 형질전환체, 조직 특이적, 화분

Description

조직특이적 프로모터 ｐＰＬｉｍ3, 이를 포함하는 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환체{Tissue-specific promoter pPLim3, recombinant expression vector comprising pPLim3 promoter and transformant transformed therewith}
본 발명은 화분에서 특이적으로 발현하는 pPLim3 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 벼에서 분리한, 화분 조직에서 특이적으로 발현하는 pPLim3 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용하여 제조한 형질전환체에 관한 것이다.
육종이란 가축이나 작물의 유전학적 형질을 개선하여 이용가치가 높은 새로운 품종을 육성하는 것으로, 단순히 기존 품종의 개량 또는 새 품종의 육성에만 그치는 것이 아니라 새로운 종(種)을 만들어내는 것도 포함된다. 육종 기술은 새로운 품종의 출현에 의한 재배작물의 다양성 획득, 다수확성 또는 저생산비성 품종으로 인한 경제적 이익, 작물재배의 지리적인 한계나 계절적인 한계의 극복, 품질의 개선, 냉해·병해·충해에 대한 저항성의 향상으로 인한 재배안전성의 증대, 그리고 여러 가지 작물의 조생종·만생종·단간종 등의 새 품종을 육성함으로써 윤작체계 의 조절이나 작업의 분배를 할 수 있게 되어 경영의 합리화에 유리하다기 때문에 농업의 발달과 더불어 시작되었으며 특히 19세기 이후에 활발하게 이루어졌다.
육종의 방법으로는 도입, 분리, 교잡(交雜), 잡종강세(雜種强勢), 배수성(倍數性), 돌연변이, 분자 육종법 등이 있으며, 종래에는 도입, 분리, 교잡(交雜), 잡종강세(雜種强勢), 배수성(倍數性), 돌연변이 육종법이 많이 사용되었으나, 최근 분자생물학 기술의 발전에 따라 분자 육종법이 주목을 받고 있다.
분자 육종법은 분자생물학적 기법을 이용하여 새로운 형질을 생물에 도입하고 이를 선별하는 방법으로써 종래의 육종법에 비해서 시간 및 비용이 적게 들어 경제적이며, 종래의 육종법으로는 얻을 수 없는 이종간의 형질 도입이 가능하여 각광을 받고 있다. 이러한 분자 육종을 하기 위해서는 대사 과정에 대한 이해, 유용한 유전자, 이를 발현시킬 수 있는 수단 및 다양한 동식물에 대한 형질전환기법 등의 여러 가지 수단들이 필요하며, 특히 원하는 유전자를 원하는 부위에서 원하는 시기에 발현시키기 위한 다양한 프로모터 및 벡터의 개발의 필요성이 지속적으로 요구되고 있다.
특히, 자가 불화합성인 품종, 꽃이 작아 임성의 판별이 어려운 품종, 교배에 의한 종자 생산이 어려운 품종 또는 일대잡종 종자에 의한 우량종자 생산 등을 위해 활용되고 있는 교배에 의한 웅성불임유도에 많은 시간 및 노동력이 필요한 단점 이 있어 이의 개선을 위해 화분에 대해서 특이적으로 발현하는 프로모터의 개발이 특히 요구되어 왔다.
이에 본 발명자들은 형질전환 식물의 제조에 이용될 수 있는 화분 조직 특이적 프로모터를 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 벼의 pPLim3 프로모터가 화분 조직에서 특이적으로 발현된다는 점을 확인하고, 이를 이용하여 pPLim3를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 pPLim3 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 화분 조직에서 특이적으로 발현되는 pPLim3 프로모터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 pPLim3 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 조직특이적 프로모터는 벼에서 유래되었으며, TATA box, CAAT box, GATA 박스, AMYBOX2 CBFHV, POLLEN1LELAT52 등의 모티프를 포함하고 있다. 본 발명의 조직특이적 프로모터는 화분 조직 또는 상기 조직세포에서 특이적으로 발현을 유도하며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 조직특이적 프로모터는 통상의 재조합 발현벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.
상기에서 “재조합 발현벡터”란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 당업계에 알려진 다양한 구조 유전자를 포함할 수 있으며, 이러한 구조 유전자는 상기 pPLim3 프로모터와 작동가능하게 연결된다. 본 발명에서 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.
또한, 상기 구조 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein, AY598428) 유전자, GUS(β-glucuronidase, AF485783) 유전자, GAL(β-galactosidase, AAB49721) 유전자 등을 포함하지만 그것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 pPLim3 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터는 공지의 재조합 발현 벡터, 특히 형질전환 식물의 제조에 이용될 수 있는 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등 일 수 있으나, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 pPLim3 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터는pBGWFS7-OspPLIM3 벡터일 수 있으며, 이는 농용미생물보존센터에 2008년 12월 5일 KACC95095P로 기탁되었다.
한편, 본 발명은 본 발명의 pPLim3 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있으며, 더 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예 시된 방법을 사용할 수 있다 (Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 예를 들면 벼에 대한 아그로박테리움-매개 형질전환법은 당업계의 문헌 등에 공지되어 있다(An et al., EMBO J., 4:227-288,1985).
상기 형질전환체는 이에 한정되지는 않으나, 미생물로서는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 또는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.
또한, 상기 형질전환체는 이에 한정되지는 않으나, 식물 또는 식물세포일 수 있으며, 이 때, 상기에서 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함되며, 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 벼를 사용하였다.
상기 식물세포로는 모상근 세포일 수 있으며, 추가적으로 상기 식물세포는 통상적인 방법에 따라 배양되어 액체 배양물, 캘러스, 원형질 배양물이 될 수 있으며, 분화되어 식물의 조직 또는 식물이 될 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 모상근들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있으며, 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법 및 종자를 이용하여 유성번식방법에 의해 생산할 수 있다.
식물세포의 배양은 식물의 일부를 모체로부터 분리하여 적당한 조건 아래에서 무균적으로 배양하여 생육시키는 것으로 조직 절편의 액체 배양, 조직 절편의 캘러스 배양, 원형질체 배양 등 당업자에게 공지된 어떠한 방식의 것에 의할 수 있으며, 그 배양 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 배양된 식물세포를 식물로 분화시키는 것은 캘러스, 원형질체 형태의 배양된 식물세포를 적당한 조건아래에서 분화를 유도하여 식물의 조직 또는 식물로 분화시키는 것으로 그 분화 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 pPLim3 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 구조유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물을 형질전환하여 식물 세포에서 상기 구조유전자의 발현을 유도하는 방법을 제공한다. 이 때, pPLim3 프로모터는 각각 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있으며, 구조유전자, 재조합 발현벡터의 구성 및 형질전환 방법 등에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
pPLim3 프로모터는 상기에서 언급한 것과 같은 식물 조직에서 특이적으로 발현되므로 pPLim3 프로모터 및 구조유전자를 포함하는 벡터의 경우 화분 조직 세포에서 특이적으로 구조유전자의 발현을 유도할 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).
본 발명의 일실시예에서는 PLACE(a database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) 프로그램을 이용하여 PLim 유전자의 프로모터 부위의 모티프(Motif) 검색하여 TATA box, CAAT box, GATA 박스, AMYBOX2 CBFHV, POLLEN1LELAT52 등의 모티프를 포함하는 영역이 증폭 가능하도록 프라이머를 디자인한 후, PCR을 통해 PLim3 프로모터 영역(pPLim3)을 분리하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 게이트웨이 시스템(Gateway system)을 이용한 pPLim3 프로모터를 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, pPLim3 프로모터 영역에 attB 단편을 PCR을 통해 부착한 다음 BP 반응시켜 pDONR221 벡터에 형질전환 한 후 다시 LR 반응하여 목적 벡터인 pBGWFS7 벡터에 형질전환하여 pPLim3 프로모터를 포함하는 발현벡터를 제조하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기에서 제조한 pPLim3 프로모터를 포함하는 발현벡터를 이용하여 형질전환체(벼)를 제조한 다음, pPLim3 프로모터의 발현 특성을 분석하였다. 그 결과, pPLim3 프로모터는 화분 조직에서의 발현을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 화분 조직에서 특이적으로 발현되는 pPLim3 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용하여 형질전환된 형질전환체를 제공한 다. 이러한 본 발명의 프로모터 및 재조합 발현 벡터는 화분 조직에서 유용유전자의 발현을 유도하여 새로운 품종의 형질전환체를 개발하는 데에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
pPLim3 프로모터 영역의 클로닝 및 염기서열 분석
<1-1> 모티프(motif) 검색 및 프로모터 영역의 PCR 증폭
PLACE(a database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) 프로그램을 이용하여 PLim 유전자의 프로모터 부위의 모티프(Motif) 검색하여 TATA 박스(box), CAAT 박스, GATA 박스, AMYBOX2 CBFHV, POLLEN1LELAT52 등(Prestridge, D.S, A computer program that scans DNA sequences for eukaryotic transcriptional elements, 1999)의 모티프를 포함하는 영역이 증폭 가능하도록 프라이머를 디자인한 후, PCR을 통해 PLim 유전자의 프로모터 영역(pPLim3)을 다음과 같이 분리하였다.
벼의 잎에서 전체 DNA를 상용의 키트(Qiagen 사, DNeasy Plant Mini kit)를 이용하여 추출하고, 이를 주형으로 하여, 서열번호 2(sense primer pPLim-S : 5-ACAACGTGAGACGCATAGATGAACA-3') 및 서열번호 3(antisense primer pPLim-AS: 5-TCGAGGAATCACCGTAGCTATAGC-3')을 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 10 분간 변성한 후 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 2분을 25회 반복한 후 다시 확장 반응을 위하여 72℃에서 10 분간 처리하였다. 증폭된 PCR 산물(약 2.1kbp)을 1% agarose에 전기영동 한 후 해당 밴드를 아가로스 겔에서 잘라내어 상용의 키트(QIAquick gel extraction kit)를 이용하여 정제한 후 클로닝에 이용하였다.
상기에서 분리한 DNA 단편을 Topo 2.1 벡터(Invitrogen 사, TOPO TA Cloning kit)에 제조사의 지침에 따라 클로닝한 다음 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석결과 서열번호 1의 염기서열을 가짐을 알 수 있었으며, NCBI의 BLAST 검색에 의해 PLim3 유전자의 프로모터 영역(pPLim3)임을 확인하였다.
<실시예 2>
게이트웨이 시스템(Gateway system)을 이용한 벼 형질전환용 벡터 제작
Gateway system을 이용한 벡터 클로닝을 위해 상기 실시예 1에서 클로닝한 pPLim3 단편을 주형으로 하고, 서열번호 4(pPLim3-S : 5-AAAAAGCAGGCTTGTGAAGAAGGACCACA-3', Forward primer) 및 서열번호 5(pPLim3-AS: 5- AGAAAGCTGGGTGTCACCGTAGCTATAGC-3', Reverse primer)의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃ 10분간 변성한 후 94℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 2분 조건으로 30회 반복하고 다시 72℃ 10분간 확장 반응으로 하였다. 증폭된 단편에 다시 어댑터 프라이머(adapter primer)를 붙이기 위해 서열번호 6(attB1: 5-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3') 및 서열번호 7(attB2: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3')를 이용하여 95℃ 3분; 94℃ 30초, 45℃ 3초, 68℃ 2분 조건으로 2회 반복; 94℃ 3초, 55℃ 3초, 68℃ 2분 조건으로 19회 반복; 및 68℃ 10분의 조건으로 PCR을 수행하여 pPLim3 유전자의 양 말단에 각각 어댑터 프라이머가 부착된 단편을 완성하였다.
상기 어댑터가 부착된 단편을 BP(Invitrogen 사) 반응시켜 pDONR221 벡터에 형질전환 한 후 다시 LR(Invitrogen 사) 반응하여 목적 벡터인 pBGWFS7 백터(PSB 사, Plant System Biology)에 형질전환하여 바이너리 벡터(binary vector)를 제조하고, 이를 pBGWFS7-OspPLIM3 벡터라고 하였다(도 1 참조). 제조된 바이너리 벡터는 염기서열분석으로 재확인하였다.
완성된 바이너리 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)에 형질전환하기 위하여 냉동(freeze)과 해동(thaw)을 2-3번 반복 한 후, 37℃의 열충격(heat shock)방법에 의해 형질전환한 후 YEP배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L) 에서 밤새 배양 하여 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K2HPO4 60g, NaH2PO4 20g/1L), AB Salts(NH4Cl 60g, MgSO4ㆍ7H2O 6g, KCl 3g, CaCl2ㆍ2H2O 0.265g, FeSO4.7H2O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.
<실시예 3>
아그로박테리움을 이용한 벼의 형질전환
벼의 캘러스를 유도하기 위하여 종자를 락스에 세척한 후 적당히 건조시켜 MS 배지(Duchefa사, Murashinge and Skoog vitamin 포함 배지)에 2,4-D 호르몬이 첨가된 배지에 치상 하였다. 27℃에서 3-4주간 암배양하여 캘러스를 유도한 후, MS에 2,4-D 호르몬이 첨가된 새 배지에서 배발생 캘러스(embryogenesis callus)를 서브-컬쳐(sub-culture)하였다.
상기에서 제조한 배발생 캘러스와 상기 실시예 2에서 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404를 AB 액체배지에 배양하여 20분간 감염(disinfection) 시킨 후 3일간 암 배양 하였다. 멸균수에 세포탁심(cefotaxime)을 첨가하여 아그로박테리움이 완전히 제거될 때까지 씻은 후 다시 MS 배지에 세포탁심과 포스피노트리신(ppt, phosphinothricin)이 첨가된 배지에서 3주간 암 배양 하였다. 상기 배지 에서 갈변되지 않고 살아 남은 캘러스를 다시 MS 배지에 세포탁심과 포스피노트리신이 첨가된 배지에 옮겨 2 주간 암 배양 하였다. 캘러스에서 줄기형성(shooting) 유도를 위해 MSR-세포탁심과 ppt가 첨가된 배지에 옮겨 4주간 양 배양하여 줄기형성된 후 뿌리가 나오면 5일 내지 7일간 순화처리를 실시한 다음 온실로 옮겼다.
얻어진 형질전환체(T0)를 온실에서 재배하여 종자를 수확한 후 후대 고정을 위하여 바스타(bastar) 선발하여 3:1 의 분리비를 확인하였다. pPLim3 프로모터의 작용의 분석은 형질전환체를 재배하여 T2세대의 종자에서 GUS 염색에 의해 발현분석에 이용하였다.
<실시예 4>
pPLim3 프로모터의 GUS 염색에 의한 발현 분석
상기 실시예 3에서 제조한 pPLim3를 포함하는 형질전환체(T2)를 이용하여 pPLim3 프로모터의 발현 분석을 위하여 28℃, 배양실에서 MS배지에 ppt 항생제를 첨가한 배지에 파종하여 발아 2일부터 단계별로 GUS 염색액(X-gluc 20mM, NaH2PO4ㆍH2O 100mM, NaㆍEDTA 10mM, 0.1% Triton-X / pH7.5)에 담구어 37℃에 16시간 정도 암 상태에서 처리하여 발현 상태를 관찰하였다.
그 결과, 도 3에서 보듯이, GUS 염색 부위가 개화 전 및 후에서 화분에서 강하게 나타나, 이들 부위에서 pPLim3 프로모터가 강하게 발현됨을 알 수 있었다.
아울러, 도 4에서 보듯이, 화분이 포함된 약을 채취하여 GUS 염색에 의해 발현 양상을 분석한 결과 상기 결과와 마찬가지로 약 부위와 화분에서 발현됨을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 화분 조직에서 특이적으로 발현되는 pPLim3 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 이러한 본 발명의 프로모터 및 재조합 발현 벡터는 화분 조직에서 유용유전자의 발현을 유도하여 새로운 품종의 형질전환체를 개발하는 데에 이용할 수 있다.
도 1은 게이트웨이 시스템을 이용하여 제조한 본 발명의 형질전환용 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 형질전환 벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 형질전환체의 꽃에서 수분 전/후의 발현을 GUS 염색을 통해서 확인한 것이다.
도 4는 본 발명의 형질전환체의 화분에서의 발현을 GUS 염색을 통해서 확인한 것이다.
<110> Republic of Korea <120> Tissue-specific promoter pPLim3, recombinant expression vector comprising pPLim3 promoter and transformant transformed therewith <130> NP08-0103 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 724 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 tgaagaagga ccacagccgg agttgagcgc gcgcgacatg agcgcgcgcc cccgtgtgaa 60 ggcctgggaa aatattttct atacccaaat atcatggcgt ctaggtgtat gcatgtagtt 120 taaataattt tataaaaata ttataaaatt agataagata gactgcgata atataagata 180 ctatacaaac atgtaagtct aaaatcaatc tacatatgaa gaaataaaaa taacaaattt 240 tatctgcgtt gtacgggtac tattcactgt ctgatattat tatttttgtt tctctagttc 300 agttcttgta tgattgtgta tagacttgta tcatcataat tgattgtttt aattttttct 360 ataactattt aaatcacatg caaatgatgg atgccatgac acctaggcat agaataggca 420 tagaaaattc ttgtccgctc gcccctccca aaattaaaca agcctctctc ccggtttgca 480 cgaccgggtt cgtccgtctg tcatctgtgt ggcccggagc ccatcccgtc tcctatcttt 540 gctcccgtgc tcacgccgcc ccgcccttta aaccatcgcc cgttgctgtc tgcccatctc 600 tcctccctcc cttctctgga gacgccacgc ccacgttcct ctcgtctcgc cctgaatcga 660 tctcctccgt cgatcgatcg gaagagttgg gagttgggaa gctatagcta cggtgattcc 720 tcga 724 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer pPLim-S <400> 2 acaacgtgag acgcatagat gaaca 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer pPLim-AS <400> 3 tcgaggaatc accgtagcta tagc 24 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPLim3-S <400> 4 aaaaagcagg cttgtgaaga aggaccaca 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPLim3-AS <400> 5 agaaagctgg gtgtcaccgt agctatagc 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 <400> 6 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 <400> 7 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

Claims (10)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지며, 식물의 화분 조직에서 특이적으로 구조유전자를 발현시키는 화분 조직특이적 발현 유도용 프로모터.
  2. 제1항의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 식물의 화분 조직에서 구조 유전자의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 구조 유전자, 오퍼레이터, 폴리아데닐화 신호, 인핸서, 분비 신호, 선택 마커 및 복제 기원으로 이루어진 군에서 선택된 하나이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 pBGWFS7-OspPLIM3 벡터(KACC95095P)인 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제2항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 형질전환체.
  8. 제6항에 있어서, 상기 형질전환체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  9. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 구조유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물을 형질전환하여 식물 세포에서 상기 구조유전자의 발현을 유도하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식물 세포는 화분 조직 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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