KR101293638B1 - 식물 조직 특이적인 ＢｒＬＲＰ1 프로모터 - Google Patents

식물 조직 특이적인 ＢｒＬＲＰ1 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물의 특정한 생장 발달 시기에 특정한 조직에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 신규한 프로모터에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식물의 유묘 발달 시기에 줄기 정단 분열조직, 잎의 주맥을 포함하는 잎맥, 배수조직 및 주근에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하며, 식물의 개화 및 종자 성숙 시기에 꽃받침, 암술대 및 꼬투리의 말단 조직에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 신규한 BrLRP1 프로모터에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 식물의 유묘 발달 시기에 줄기 정단 분열조직, 잎의 주맥을 포함하는 잎맥, 배수조직 및 주근에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하고, 식물의 개화 및 종자 성숙 시기에 꽃받침, 암술대 및 꼬투리의 말단 조직에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 형질전환 식물을 제조할 수 있다. 따라서 식물의 생장 발달 단계 중 상기 특정 조건 하에서 유전자 생성물의 효율적인 생산을 위해 유용하게 활용될 수 있다.

Description

식물 조직 특이적인 ＢｒＬＲＰ1 프로모터 {BrLRP1 promoter specific for plant tissue}
본 발명은 식물의 특정한 생장 발달 시기에 특정한 조직에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 신규한 프로모터에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식물의 유묘 발달 시기에 줄기 정단 분열조직, 잎의 주맥을 포함하는 잎맥, 배수조직 및 주근에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하며, 식물의 개화 및 종자 성숙 시기에 꽃받침, 암술대 및 꼬투리의 말단 조직에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 신규한 BrLRP1 프로모터에 관한 것이다.
조직 특이적인 발현 유도 활성을 지닌 프로모터를 개발하는 것은 매우 중요하다. 예를 들어, 이종 유전자가 조직 특이적으로 발현되기를 원하는 경우, 관심 있는 이종 유전자를 타겟 조직에 특이적인 발현 활성을 지닌 프로모터에 작동 가능하게 연결시킨 재조합 발현 벡터를 제작하여 식물에 도입하면, 타겟 조직 내에서 관심 있는 이종 유전자의 특이적인 발현이 가능하다. 이종 유전자의 식물 조직 특이적인 발현은 식물에 변형된 특성을 나타내도록 할 수 있기 때문에 연구 및 원예 산업 분야에 있어서 중요한 가치를 지닌다.
이러한 조직 특이적인 발현 유도 활성을 지닌 프로모터로서, 애기장대 잎의 털 (trichome), 떡잎 정맥 (cotyledon vein), 뿌리, 잎의 수술 및 암술에서 특이적으로 발현을 유도하는 애기장대 유래 AtPFP α2 유전자의 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0827553호), 암술 조직에 특이적인 발현 활성을 지닌 페튜니아의 ZPT2-10, ZPT2-11 및 ZPT3-3 유전자 유래의 신규한 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0443487호) 등이 개발된 바 있다.
본 발명은 식물의 특정한 생장 발달 시기인 식물의 유묘 발달 시기에 줄기 정단 분열조직, 잎의 주맥을 포함하는 잎맥, 배수조직 및 주근에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하고, 식물의 개화 및 종자 성숙 시기에 꽃받침, 암술대 및 꼬투리의 말단 조직에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 신규한 프로모터를 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 프로모터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 세포 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환 식물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 식물의 유묘 발달 시기에 줄기 정단 분열조직, 잎의 주맥을 포함하는 잎맥, 배수조직 및 주근에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하고, 식물의 개화 및 종자 성숙 시기에 꽃받침, 암술대 및 꼬투리의 말단 조직에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도할 수 있는 형질전환 식물을 제조할 수 있다. 따라서 식물의 생장 발달 단계 중 상기 특정 조건 하에서 유전자 생성물의 효율적인 생산을 위해 유용하게 활용될 수 있다.
도 1 은 배추의 생장 발달 단계에서 Semi-quantitative RT-PCR을 이용한 BrLRP1 유전자 발현 분석 결과를 나타낸 도면이다. (0d~7d: 배추의 종자 발아 전~발아 후 7일째 유묘, R: 뿌리(Root), ㅣ: 잎(Leaf), Sa: 줄기 정단 분열조직(Shoot apical region), Fb: 화아(Flower bud), F: 꽃(Flower), St: 줄기(Stem), Si: 꼬투리(Silique))
도 2 는 발현 벡터 pPBrLRP1의 개열 지도를 나타낸 도면이다.
도 3 은 형질전환 애기장대의 생장 발달 단계에서 GUS 발현을 통한 BrLRP1 프로모터 활성 분석 결과를 나타낸 도면이다. (0d~35d: 형질전환 애기장대의 종자 발아 전~발아 후 35일째 애기장대)
도 4 는 형질전환 애기장대의 조직별 GUS 발현을 통한 BrLRP1 프로모터 활성 분석 결과를 나타낸 도면이다. (15d: 형질전환 애기장대의 종자 발아 후 15일째, 35d: 형질전환 애기장대의 종자 발아 후 35일째, Ap: 정단분열조직(Apical region), R: 뿌리(Root), Rl: 근생엽(Rosette leaf), Ht: 배수조직(Hydathode), Mr: 주맥(Midrib), V: 잎맥(Vein), Cl: 경생엽(Cauline leaf))
도 5 는 형질전환 애기장대의 개화 및 종자 성숙 단계에서 GUS 발현을 통한 BrLRP1 프로모터 활성 분석 결과를 나타낸 도면이다. (35d: 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물의 성숙체, F: 꽃(Flower), Sty: 암술대(Style), Sp: 꽃받침(Sepal), Si: 꼬투리(Silique), Rc: 화탁(Receptacle))
본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 프로모터를 제공한다.
상기 서열번호 1의 핵산서열은 배추(브라시카 라파, Brassica rapa) 유래의 BrLRP1 (Brassica rapa Lateral Root Primodium 1) 유전자로부터 분리한 프로모터로서, 식물의 유묘 발달 시기에 줄기 정단 분열조직(shoot apical region), 잎의 주맥(midrib)을 포함하는 잎맥(vein), 배수조직(hydathode) 및 주근(primary root)에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하고, 식물의 개화 및 종자 성숙 시기에 꽃받침(sepal), 암술대(style) 및 꼬투리(silique)의 말단 조직에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서 상기 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 프로모터 외에도 상기 프로모터의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 상기 프로모터 변이체는 핵산서열은 변화되지만, 서열번호 1의 핵산서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 핵산서열로 이루어진 프로모터를 의미한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 프로모터는 서열번호 1의 핵산서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
또한 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 발현 벡터는 도 2에 개시된 개열 지도를 갖는 pPBrLRP1 벡터일 수 있다. 그러나 본 발명의 발현 벡터는 도 2에 기재된 벡터에 한정되지 않고, 식물의 형질전환에 유용한 임의의 공지된 벡터를 이용할 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환 시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 예를 들면 CAMBIA (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소 등에서 입수 가능하다. 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측 경계 부위에 형질전환체 선별 마커, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 "벡터(vector)"란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 목적한 DNA 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 상기 DNA 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산서열은, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호 등을 포함할 수 있다.
또한 상기 발현 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 동종 유전자 또는 이종 유전자를 포함하는 것일 수 있다. "작동 가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 따라서 본 발명의 발현 벡터는 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 프로모터의 영향으로 인해, 발현 벡터가 도입된 형질전환 식물 내에서 상기 동종 유전자 또는 이종 유전자의 발현을 식물의 유묘 발달 시기에 줄기 정단 분열조직, 잎의 주맥을 포함하는 잎맥, 배수조직 및 주근에서 시기 및 조직 특이적으로 유도하고, 개화 및 종자 성숙 시기에 꽃받침, 암술대 및 꼬투리의 말단 조직에서 시기 및 조직 특이적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 있어서 "동종 유전자"란 유전자가 숙주 식물 종에 내인성임을 의미한다. 즉, 동종 유전자는 숙주 식물 종에 고유한 것이고 비형질전환된 숙주 식물 종은 동종 유전자를 발현시켜 유전자 생성물을 생산할 수 있다.
본 발명에 있어서 "이종 유전자"란 유전자가 숙주 식물 종에 외인성임을 의미한다. 즉, 이종 유전자는 숙주 식물 종에 고유한 것이 아니고, 비형질전환된 숙주 식물 종은 이종 유전자를 발현시켜 유전자 생성물을 생산하지 않는다.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 형질전환 세포는 아그로박테리움속 미생물(Agrobacterium spp.), 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteusmirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 진균 (예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모 (예를 들어, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 생물 유래의 세포일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 재조합 벡터 pPBrLRP1를 아그로박테리움 투메파시언스 GV3101에 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 아그로박테리움에 의해 식물 세포 내로 본 발명의 발현 벡터가 도입되도록 하였다. 따라서 상기 형질전환 세포는 바람직하게는 아그로박테리움속 미생물 또는 식물 세포일 수 있다.
형질전환 세포의 제조는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 당업계에 공지된 임의의 형질전환 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 속(Agrobacterium spp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglyco l)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다 (Horsch et al. Science 227:1229-1231, 1985).
상기 형질전환 세포 중 형질전환 식물 세포는 통상적인 방법에 따라 배양되어 액체 배양물, 캘러스, 원형질 배양물이 될 수 있으며, 분화되어 식물의 조직 또는 식물이 될 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물 세포들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물로 재분화시킬 수 있으며, 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법 및 종자를 이용하여 유성번식방법에 의해 생산할 수 있다. 식물 세포의 배양은 식물의 일부를 모체로부터 분리하여 적당한 조건 아래에서 무균적으로 배양하여 생육시키는 것으로 조직 절편의 액체 배양, 조직 절편의 캘러스 배양, 원형질체 배양 등 당업자에게 공지된 어떠한 방식의 것에 의할 수 있으며, 그 배양 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 배양된 식물 세포를 식물로 분화시키는 것은 캘러스, 원형질체 형태의 배양된 식물 세포를 적당한 조건아래에서 분화를 유도하여 식물의 조직 또는 식물로 분화시키는 것으로서 그 분화 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환 식물을 제공한다.
구체적으로 발현 벡터를 형질전환 식물 내에 도입하는 방법은 앞서 설명한 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위한 다양한 형질전환 방법들을 동일하게 적용할 수 있다. 또는 전술한 바와 같이 형질전환 식물 세포로부터 재분화 시킴으로써 형질전환 식물을 제조할 수도 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 식물체는 예를 들어 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 애기장대, 십자화과, 더 넓게는 쌍자엽식물일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 식물 세포의 형질전환은 DNA를 식물 세포에 전이시키는 임의의 방법을 의미하는 것으로, 이러한 형질전환은 반드시 재생 및 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해서도 일반적이다. 식물 세포의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포라도 무방하며, 예를 들어 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물일 수 있다. 구체적인 형질전환은 앞서 설명한 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 형질전환 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화 하는 방법은, 앞서 설명한 바와 같이 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물로 재분화시키는 것일 수 있으며, 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법 및 종자를 이용하여 유성번식방법에 의해 생산하는 것일 수 있고, 이외에도 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 배추 유래의 BrLRP1 ( B rassica r apa L ateral R oot P rimodium 1 ) 유전자 발현 분석
배추 마이크로어레이 DB로부터 생육조절 관련 BrLRP1 유전자를 확보하여 배추 생장 발달 단계별로 RT-PCR를 이용하여 발현 분석하였다.
배추 각 조직으로부터 (유묘 발달단계, 뿌리, 줄기 정단 분열조직, 화아, 꽃, 줄기, 꼬투리) RNA를 분리한 후 하기와 같은 유전자 특이 프라이머를 사용하여 semi-quantitative RT-PCR을 통해 BrLRP1 유전자 발현 양상을 분석하였다. 이때, 상기 RT-PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 1 사이클, 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 45초로 35 사이클, 72 ℃에서 10분간 1 사이클 조건으로 식물체내 유전자 발현을 확인하였다.
- 유전자 발현 분석을 위한 특이 프라이머 핵산서열:
BrLRP1 - Forward : 5'-AACCTACCGATGTCGGATTCCGGTG-3' (서열번호 2)
BrLRP1 - Reverse : 5'-TATGGTTTAACTGTAAAACCCAGC-3' (서열번호 3)
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, BrLRP1 유전자는 종자를 제외한 유묘 발달 동안 서서히 발현이 증가하였으며, 또한 뿌리, 잎, 정단분열 조직, 줄기 조직에서 발현을 나타내었다. 이를 통하여 BrLRP1 유전자는 조직 특이적 발현 양상을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 2: BrLRP1 프로모터 영역 분리 및 핵산서열 분석
배추 BrLRP1을 포함하고 있는 배추 지부BAC (KBrB041J18)클론의 염기서열을 이용하여 BrLRP1유전자 개시 코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 -2.3 kb의 프로모터 부분이라 예상되는 영역을 검색하였고 유전자 프로모터 특이적 프라이머를 제작하여 BAC 클론으로부터 유전자 증폭반응 (PCR: polymerase chain reaction)을 수행하여 프로모터 영역을 분리하였다. 이때, 상기 PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후 95℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분간 반응을 1 사이클로 하여 35회 실시한 다음, 72℃에서 10분간 반응하였다. 이후 상기 PCR 반응에서 획득한 DNA의 염기서열을 확인 하였다.
- 프로모터 분리를 위한 특이 프라이머 핵산서열:
BrLRP1 - Pro - Forward : 5'-GGATCCAGAGGTAAATATACACGTATACCC-3' (서열번호 4)
BrLRP1 - Pro - Reverse : 5'-AAGCTTCGGTAGGTTATGCCTCCTCGTGG-3' (서열번호 5)
그 결과 BAC클론의 배추 BrLRP1유전자의 프로모터 예상부위의 서열과 100% 일치했으며, 이를 서열번호 1로 나타내었다.
실시예 3: 식물 형질전환용 발현 벡터 작성 및 형질전환
1) 식물 형질전환용 벡터 제작
상기 실시예 2에서 분리한 BrLRP1 프로모터는 pGEM-T-easy에 삽입시킨 후 BamH I과 Hind III로 절단한 후 BamH I과 Hind III로 절단 된 pCAMBIA1381 에 삽입시킴. BrLRP1 프로모터에 리포터 유전자 GUS가 융합된 식물 형질전환용 벡터 pPBrLRP1를 작성하였으며 지도는 도 2에 나타내었다.
2) 애기장대 형질전환체 제작
제작된 벡터인 pPBrLRP1을 애기장대에 도입하기 위하여 Agrobacterium tumefaciens GV3101에 freeze와 thaw를 2-3번 반복 한 후, 37℃의 heat shock 방법에 의해 형질전환 한 후 항생제 kanamycin 50 ㎎/ℓ이 포함된 YEP배지에서 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 유전자 도입이 확인된 콜로니를 애기장대 형질전환에 사용하였다. 형질전환된 GV3101 균주를 이용하여 야생형 애기장대 Col-o (Arabidopsis thaliana ecotype Col-o)를 형질전환하기 위해 먼저 애기장대를 파종 후 22℃ 생장상 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육시켰다. 4주된 애기장대 식물체의 일차 추대를 제거한 후 최소한 10 cm의 3-4개의 이차 추대를 유도하였다. 벡터 도입이 확인된 아그로박테리움을 kanamycin 50 ㎎/ℓ, rifampicin 10 ㎎/ℓ, gentamycin 40 ㎎/ℓ가 함유된 LB 배지에 접종하여 28 ℃에서 3-4일 정도 배양함. 완전히 자란 아그로박테리움을 원심분리하여 침전시킨 5% sucrose와 0.05% silwet77이 함유된 용액에 O.D 0.8 정도로 희석하여 현탁액을 제조하였다. 상기 제조한 현탁액을 애기장대 꽃봉오리에 분사한 후 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 24시간 배양한 다음 22℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 3-4일 더 배양시키고 상기와 동일한 방법으로 형질전환을 반복하였다. 이 후, 22℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 꼬투리 (silique)가 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 4-6주간 생육시킨 후 종자를 수확하였다. 수확된 종자를 30 μg/㎖ 하이그로마이신 (hygromycin)이 포함된 MS배지에 파종하여 형질전환체 선발한 후 선발된 형질전환체로부터 GUS염색을 통한 BrCYS7유전자 프로모터의 발현 양상 분석 하였다.
실시예 4: 형질전환 애기장대 생장 발달 단계별 BrLRP1 프로모터 활성 분석
배추 BrLRP1 유전자의 프로모터가 식물체 내에서 유전자 발현을 특이적으로 유도하는지 확인하기 위하여 배추 BrLRP1 유전자의 프로모터가 삽입된 재조합 발현 벡터로 형질전환된 애기장대의 생장 발달 단계와 각 조직에서 GUS 유전자 발현 양상을 분석하였다. 즉, 상기 실시예 3에서 형질전환된 애기장대로부터 독립된 3개 line을 선발하여 수확한 종자를 일부는 MS배지에서 발아시켜 유묘의 발달단계에서 GUS (청색 발색 유전자) 발현 양상을 관찰하였고, 일부는 상토에 파종하여 생육 15일과 35일째 식물체에서 잎, 줄기, 뿌리들의 여러 조직에서 생육 단계별로 GUS 유전자 발현 양상을 관찰하였다. 상기 발아시킨 유묘를 GUS-어세이 버퍼 (X-gluc (cyslohexyl ammonium salt) 20mM, NaH2PO4 H2O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton-X-100 0.1%, pH7.5)에 침지하고 37℃에서 24시간 처리 후, 70% 에탄올로 클로로필 (chlorophyll)을 완전히 제거하여 GUS 유전자 발현 양상을 실체현미경 (Olympus, SZX12)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 종자 발아 후 3일부터 GUS 발현이 나타나기 시작하여 35일 까지 뿌리를 제외한 조직에서 약하게 GUS가 발현되었다 (도 3). 15일째 BrLRP1 프로모터에 의한 GUS 발현은 줄기 정단 분열조직(shoot apical region)과 잎의 주맥(Midrib)을 따라 잎맥(Vein)에서 강하게 발현되었고 또한 잎 배수조직(Hydathode)에서 강한 발현을 나타내었다 (도 3, 4). 뿌리조직에서는 15일된 식물의 주근(Primary root)에서만 강하게 GUS 발현이 있었고 그 외의 생장 단계에서는 발현되지 않았다 (도 4). 또한 경생엽(cauline leaf)의 배수 조직에서 GUS 발현을 확인하였다 (도 4).
이를 통하여 BrLRP1 프로모터는 주근에서 특정한 생장 발달시기에서만 유전자의 발현을 유도하는 특이적 프로모터임을 확인하였다.
실시예 5: 형질전환 애기장대 개화 및 종자 성숙 등의 발달 단계에서 BrLRP1 프로모터 활성 분석
배추 BrLRP1 유전자의 프로모터가 식물체의 개화 및 종자 성숙 등의 발달 단계에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하는지를 확인하기 위하여 상토에서 35일째 배양된 형질전환 애기장대에서 화아 (flower bud), 꽃, 꼬투리 조직 (silique)을 포함한 각 조직에서의 GUS 발현 양상을 분석하였다
그 결과, BrLRP1 프로모터 형질전환 애기장대의 꽃받침 (Sepal), 암술대 (Style), 꼬투리의 끝조직에서 GUS 발현을 확인하였다 (도 5).
이를 통하여 BrLRP1 프로모터는 생식기관인 꽃과 꼬투리의 특정 부위에서 발현을 유도하는 조직 특이적 프로모터임을 알 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 BrLRP1(Brassica rapa Lateral Root Primodium 1) 프로모터를 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환 배추과 식물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 서열번호 1의 BrLRP1(Brassica rapa Lateral Root Primodium 1) 프로모터를 포함하고 도 2의 개열지도를 갖는 pPBrLRP1 벡터인 형질전환 배추과 식물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배추과 식물은 애기장대인 형질전환 배추과 식물.
  4. 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 BrLRP1(Brassica rapa Lateral Root Primodium 1) 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 배추과 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 배추과 식물 세포로부터 형질전환 배추과 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 배추과 식물의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 서열번호 1의 BrLRP1(Brassica rapa Lateral Root Primodium 1) 프로모터를 포함하고 도 2의 개열지도를 갖는 pPBrLRP1 벡터인 형질전환 배추과 식물의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 배추과 식물은 애기장대인 형질전환 배추과 식물의 제조방법.
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