KR102396572B1 - 벼 유래 OsRP2 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 뿌리 물관조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 목적유전자를 식물의 뿌리의 물관 조직부에 특이적으로 발현을 유도하는 OsRP2 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움, 형질전환 식물체 및 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 식물의 뿌리 물관 조직에서 특이적으로 발현되는 OsRP2 프로모터를 이용하며, 목적유전자를 뿌리조직에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 양분, 이온 및 물의 수송, 뿌리 형태 조절 등 뿌리 형질 개선을 통해 작물의 농업형질 개량에 활용 가능하다.

Description

벼 유래 OsRP2 프로모터 및 이의 용도{OsRP2 promoter derived from Oryza sativa and use thereof}

본 발명은 식물의 뿌리 물관조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 목적유전자를 식물의 뿌리의 물관 조직부에 특이적으로 발현을 유도하는 OsRP2 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움, 형질전환 식물체 및 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

기후 이상과 환경오염으로 인해 식물의 가뭄， 고염(high salt), 중금속, 냉해, 열충격 및 오존과 같은 비생물학적 스트레스 노출이 증가하고 있다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달을 제한하는 요인으로 작용한다. 주요한 비생물학적 스트레스는 물 부족의 결과로 알려져 있다. 식물들이 성장하기 위해서는 영양과 물의 흡수가 가장 중요하며, 그 역할을 뿌리가 수행하고 있다. 또한 뿌리는 식물체를 고정시키고 무기염류를 흡수하며, 호르몬을 분비하거나 그 2차 대사산물을 합성하여 식물의 성장에 중요한 역할을 한다. 따라서 뿌리의 양분, 이온 및 물의 수송, 뿌리 형태, 호르몬 분비 등의 형질조절을 통해 작물의 비생물학적 스트레스 내성을 증진시키고, 생산성을 증대시킬 수 있다.

벼는 세계에서 가장 중요한 식량작물의 하나로 과거 20여 년 동안 꾸준히 수량증대에 힘써왔으나 현재 인구증가로 인해 초과적인 수량을 더 생산해야만 될 형편에 놓여있다. 그러나 벼가 재배되는 농지는 세계 각국의 공업화 현상으로 갈수록 줄어들고 육종의 소재가 되는 새로운 유전자원은 고갈되어 외래 유용 유전자의 도입이 요구되고 있다. 다행히 유전공학 기술이 발달함에 따라 식물의 형질을 개량시키고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체로부터 얻고자 하는 기술들에 대해 많은 관심이 대두 되고 있는데 이러한 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터(promoter)가 요구된다.

일반적으로 프로모터란 유전자가 언제 어디서 어느 정도 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절영역의 일종이다. 그 동안 끊임없는 연구들을 통해 수많은 종류의 프로모터들이 밝혀진 바 있다. 종래 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분된다.

뿌리 특이 발현 프로모터로서 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하며, 당근 및 무에서는 뿌리 특이적으로 일시적 발현을 유도한다는 내용이 보고된 바 있다.

그러나 종래의 프로모터들은 조직 특이적으로 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 장점이 있으나, 그 발현 양이 미미한 단점이 있다. 따라서 식물체 내에서 목적 유전자의 발현을 조직 특이적이면서도 대량으로 발현시킬 수 있는 유용한 새로운 프로모터의 발굴이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터, 구체적으로 식물의 뿌리 조직에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 개발하기 위하여 노력한 결과, 벼에서 목적 유전자를 뿌리 조직에 특이적으로 발현시킬 수 있는 OsRP2 프로모터를 분리함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-2065491호

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물의 뿌리 물관조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium)의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터 또는 상기 아그로박테리움으로 형질전환된 형질전환 식물체의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적단백질을 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법의 제공을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물의 뿌리 물관조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium)을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터 또는 상기 아그로박테리움으로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식물체는 벼(Oryza sativa)인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적단백질을 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 목적단백질이 식물의 뿌리 물관조직에서 특이적으로 발현되는 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식물은 벼(Oryza sativa)인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 식물의 뿌리 물관 조직에서 특이적으로 발현되는 OsRP2 프로모터를 이용하여, 목적유전자를 뿌리조직에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 양분, 이온 및 물의 수송, 뿌리 형태 조절 등 뿌리 형질 개선을 통해 작물의 농업형질 개량에 활용 가능하다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 OsRP2 프로모터-GUS 벡터 모식도를 나타내는 것이다.
도 2는 OsRP2 프로모터-GUS 발현벡터 도입 형질전환 벼의 genomic PCR 분석결과이다. DJ는 대조구(야생형 동진벼)이며, T5-1 T8-2, T9-3은 형질전환 벼를 나타내는 것이다.
도 3은 OsRP2 프로모터-GUS 벡터가 삽입된 형질전환 벼 뿌리의 GUS 발현을 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 4는 OsRP2 프로모터-GUS 벡터가 삽입된 형질전환 벼 뿌리에서 호르몬 처리에 의한 GUS 염색 비교를 나타내는 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터, 구체적으로 식물의 뿌리 조직에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 개발하기 위하여 노력한 결과, 벼에서 목적 유전자를 뿌리 조직에 특이적으로 발현시킬 수 있는 OsRP2 프로모터를 분리함으로써 완성되었다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물의 뿌리 물관조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터에 관한 것이다.

본 발명에서 “뿌리”란 식물의 밑동으로서 보통 땅속에 묻히거나 다른 물체에 박혀 수분과 양분을 빨아올리고 줄기를 지탱하는 작용을 하는 기관이다.

본 발명에서 “물관”은 뿌리에서 흡수된 물이 이동하는 통로로 식물의 뿌리와 줄기의 관다발(vascular bundle)을 구성한다. 본 발명에서 물관은 구체적으로 뿌리에 위치한 물관을 의미한다.

본 발명에서 “프로모터”란 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.

본 발명의 프로모터는 식물체의 특정 부위, 특히 식물체의 뿌리 조직에서만 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터로, 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서“상동성”이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 발명의 프로모터는 식물체의 뿌리의 물관조직에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있으며, 바람직하게는 상기 식물체의 뿌리 조직에서 특이적으로 목적 단백질을 발현시킬 수 있다.

상기 식물체는 구체적으로 벼(Oryza sativa)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 OsRP2 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질(예, GUS)이 벼 뿌리, 구체적으로 뿌리의 관다발 조직에서 발현됨을 확인하였으며, 뿌리의 횡축 절편에서 상세하게 분석한 결과 중심주 안쪽 어린물관에서 목적유전자가 특이적으로 발현됨을 확인하였다(도 3).

본 발명의 위치 특이적 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.

본 발명의 다른 관점에서, 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 “재조합 발현 벡터”란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결(operably linked)되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는, 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 조직 특이 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.

상기 “작동 가능하게 연결(operably linked)”된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. “발현 조절 서열(expression control sequence)”이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드일 수 있고, 식물 바이러스 벡터일 수 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터(binary vector)를 사용할 수도 있다. 그러나 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 조직 특이적으로 발현되기를 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현되는 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다.

또한, 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택할 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당될 수 있다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, G418, 카나마이신(kanamycin), 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(cholramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 GUS가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 공지된 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 OsRP2 프로모터를 GUS 유전자의 상류 부분에 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터인 OsRP2 프로모터-GUS 발현벡터를 제조하였다(실시예 2 및 도 1).

본 발명의 또 다른 관점에서, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명에서 “형질전환(transformation)”이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 프로모터 도입에 의해 목적 유전자가 조직 특이적으로, 특히 뿌리의 물관조직에서 특이적으로 발현되는 것을 의미한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 형질전환체는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 의미한다.

상기 형질전환체는 미생물이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점은, 상기 벡터 또는 형질전환체로 형질전환된 식물체에 관한 것이며, 상기 형질전환체는 아그로박테리움을 의미할 수 있다.

본 발명에서 “식물체”는 식물 또는 식물세포를 의미한다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 특히 벼(Oryza sativa)가 바람직하다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 OsRP2 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 미생물 형질전환체인, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 벼(Oryza sativa)에 접종하여 형질전환 벼 식물체를 제작하였다(실시예 4).

본 발명에서 상기 식물은 벼(Oryza sativa)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점은, 상기 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적단백질을 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 제조방법은 상기 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적단백질을 식물체에 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 재조합 발현 벡터를 제조하고, 상기 발현 벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스를 형질전환시킨 후, 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼에 감염시켜 벼의 뿌리 물관 조직에서 특이적으로 목적단백질이 발현되는 것을 확인하였다.

따라서 상기 형질전환은 구체적으로 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼에 감염시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 목적단백질이 벼의 뿌리 물관조직에서 특이적으로 발현될 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[실시예 1] In silico 벼 전사체 분석을 통한 뿌리 발현 유전자 선발

벼의 뿌리는 다양한 조직으로 구성되어 있다. 벼 뿌리 전사체 Public DB(Rice XPro)에 등록된 45,151 유전자 probe 중에서 뿌리의 중심주 영역(endodermis, pericycle, stele)에서 유전자 발현정도(normalized intensity)가 8 이상이면서 중심주 이외의 다른 조직(epidermis, cortex 등)에서는 1 미만으로 발현 되는 유전자 23종을 1차 선발 한 후, 그 중에서 벼 조직 전사체 Public DB(Rice XPro)를 이용하여 줄기 등 다른 기관에 비교해서 뿌리에서 발현특이성이 매우 높은 유전자 Os07g0525100을 선발하였다.

[실시예 2] OsRP2(Os07g0525100) 프로모터 분리 및 GUS 융합 운반체 제작

Os07g0525100 유전자의 프로모터 영역을 분리하기 위하여 번역시작 상위염기서열 2,000bp의 염기서열 정보를 벼(Nipponbarre) 게놈 데이터베이스(genome database_에서 추출하고, 하기 표 1의 한 쌍의 특이 프라이머(Os07g0525100P-F, Os07g0525100P-R)를 이용하여 동진 벼의 게놈(genomic) DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다.

서열번호	프라이머 명칭	염기서열
서열번호2	Os07g0525100P-F	5’-GCCGCCCCCTTCACCTTAACAGTGAAACATAATTTATG-3’
서열번호3	Os07g0525100P-R	5’-TCGGCGCGCCCACCCTTCTTTGAGTTTCTTGATGAG-3’

PCR 산물을 게이트웨이 벡터(gateway donor vector)에 클로닝하고 하기 표 2의 전체 염기서열을 결정하였다.

서열번호 1 TTAACAGTGAAACATAATTTATGTTGACTGAAGCTTATACTGTAGTAGTGTGGTCTACTGTAAATGTTTATTGTAAGTTTTGTGCTAGTCAGGGTATCTAGTCAACTATATATATATATACTAAGTGAGAAAACTTTGGCCTAGGCAAAGGAAGCACACTGCTCAATCGGTATTAGTTAAAACTATCCCAATGGGAAGCACACTACTCAATTGCATTAGTTAAAACTTTGGCGAAGGCGAAGGAAGCACTCTACTCAATCGAAGTAGATAATATGATATTTTTATGAATTTGCCTAGTGGTAAACTCGTAGTCACACGATCGTATCTCCGGATCTCTTGCAGGGACAGGTGCGCGCGGCAAAAGTATATTTACAACAGATTTGGCCCAATAAAAAGTATTTTAAGGTACCGATACCTTATGGTACCAAATTGTTTTTGATCGCTAACAATGCACATCCTGCCCAGTTATATCGAAACGATCAGAAACGATTTAGCACCATGATATATTGGTACCTTGAGATATTTTTTTTTAGACCGGAGCACATCTCTATTTAAAAAACTATGTTGCACTGAGATTTTAGAAATCATTCTAATAACACTTGAAAATCACCACTGATGAATTAAAGGTAAGATAACAAAATACGATCAATTAATTCGTATTAAGGTATAATTAATTAATACCGAATGGTTAGCACAGATAATACATCCATGTGATTAAGTAGAGAAGTGATCCAACGGCTCTCCTTTTCTCAACGACGATGCGGCACAATGCATGCTGAATTTTTGTCTTCAGTTACAATCTTTGTAGAGTTTTTGTTTGAACTGATCAGAATCTTATTAGAACCTAATTAACTGTACTACTTGAAGAGATGGAAAAAAGTCATATCCAGCTATTGTCAATACTGAAATCTTGAACTGTAAATCCATATTCAGTCTAGACAATAGCATACAAATGCAGTTAAAATTAAACAGGAGAAGTGGTGGACAACACAAAAAATCTATCGCCATTGGTCTATGTCCAGCTAAGCTTAATTACTACTTTAATTTGCCTTTACTATCACGGAACCATCACAATTATTAGCTTCTAGAGAAGCAAAAATGAGCACAGTTTCCTCAGTATTACCTGCCTAAATGATCTTGATTTGTCCTACTTACCATTTAATTAAATTAAGAGGGATACATATCCATTATAAAGGAGCTGGCATACTAATTATATATTCTAGGTGCAAGCCAAACCTACTACCACTTCGATCACTGTACCTATAAATTTTCTCGTAATTAACTTTGATGGGAACTTGAAACAGATGCAAGCACTACCACCATCTATATCTCTGATACCCAACTAACACTTAATTAGAGGCAACATTCGGAAACAACACAACAAGCACTTCTGCAAGTTCAGTTTGCTTGTTCCATCTGTCACAAATTCTCATGTCCCTTTTTGTCATTAGTCATCACCCAAAAGAAACCAATGTGTACAAAAAAAAATGTTGACATGGAACAGTATGTCCCTAATTTGCCTTTGGGAAAGCAAAGTAGTGGCATTGGGGCTCCAAATGGTAAACGGAGAGCCACTAATGCTGCTGGCAAAAATAAGTTGGGATCGACTCAGATCACTAGCCTAGTAGCCTAGCTTGCTAACCATCTTTTCTTCCTCCATCAGTGGATGCTCAGATCACACATCACCGAATTTTCATCCCCATTATATTCTTCTAGCATGACTCATTTGCAGTGCCCAGCATTTTCCATCCTCTTTACTAATTAATTCTCCCTCCATTGGCTCATCACTGATTTATTAGGTGATGATGCACTAGCTATAAGGGAATTATCCATGTCCTGCACACCGGAACAAGGCATATGCTCTTACGAGGTTGCCGTTCCGGTGCTTTTAGCAATGTATATATAGCTGCAGCACAAGTCTGAGAGGACTCAAGATTCAGATAGTTAAGTTCAGAGAGACTCTCAGAGTTGCAGCAACTAACTCATCAAGAAACTCAAAG

그 결과 Nipponbarre의 유전체 데이터베이스에서 추출한 Os07g0525100 유전자의 프로모터 염기서열과 비교하였을 때 100% 일치하는 2,000bp의 프로모터를 확인하여 이를 OsRP2(Oryza sativa Root Promoter 2)로 명명하였다.

상기 프로모터를 이용하여 GUS 유전자를 발현시키기 위해 GUS 리포터 유전자를 포함하는 pBGWFS7 벡터에 클로닝하여 도 1과 같은 프로모터(promoter) 발현 분석 벡터(pBGWFS7-OsRP2)를 제작하였다.

[실시예 3] 프로모터 영역의 모티프(motif) 검색

OsRP2 프로모터에 존재하는 발현조절인자(cis-acting element)를 확인하기 위해 OsRP2 프로모터의 염기서열을 New PLACE(database of plant cis-acting regulatory DNA elements: http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)를 이용하여 분석하였다. 그 결과 OsRP2 프로모터에는 뿌리에서 발현을 지시하는 모티브(OSE1ROOTNODULE, ROOTMOTIFTAPOX1) 및 뿌리털 특이적 발현을 지시하는 모티브(RHERPATEXPA7) 및, 가뭄스트레스와 ABA 반응을 조절하는 전사인자 ABI5, Myb, HD-ZIP 등이 결합하는 모티브들(DPBFCOREDCDC3, MYB2AT, ATHB6COREAT)이 존재함을 확인하였다. 또한, 그 외에도 무기양분(sulfur, phosphorous)과 당(sugar) 결핍시 발현을 유도하는 모티브(SURECOREATSULTR11, Amy3D box 등), 무산소(anaerobic) 자극에 의해 발현을 유도하는 모티브(ANAERO3CONSENSUS), circadian regulation에 관여하는 모티브(EVENINGAT) 등이 존재함을 확인하였다(표 3). 표 3은 OsRP2 프로모터가 포함하는 시스 작용요소(cis-acting element)의 종류와 위치를 나타낸 것이다. 이러한 결과는 OsRP2 프로모터가 뿌리 특이적 발현을 유도할 가능성을 시사한다.

이름(Element name)	모티브 서열(Motif sequence)	수(Numbers)	위치(Positions)
ANAERO3CONSENSUS	TCATCAC	3	+1470, +1804, -1822
SURECOREATSULTR11	GAGAC	1	+1980
MYB2AT	TAACTG	3	-468, -800, +860
EVENINGAT	AAAATATCT	1	524
E2FBNTRNR	GCGGCAAA	1	+359
OSE1ROOTNODULE	AAAGAT	1	-1664
OSE2ROOTNODULE	CTCTT	5	+338, -875, -1184, +1772, +1884
ROOTMOTIFTAPOX1	ATATT	8	-273, +279, +370, +510, +526, +937, +1230, +1726
RHERPATEXPA7	KCACGW	5	-1943, -1775, -1580, -1470, -1019
ATHB6COREAT	CAATTATTA	1	+1085
AMYBOX2	TATCCAT	2	+1196, +1849
CANBNNAPA	CNAACAC	1	+1359
DPBFCOREDCDC3	ACACNNG	3	+157, +603, +1864

[실시예 4] OsRP2 프로모터-GUS 발현벡터가 삽입된 형질전환 벼 제작

OsRP2 프로모터의 기능을 연구하기 위하여 도 1의 발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 도입한 후 동진벼의 캘루스(callus)에 접종하여 감염시킨 후, 포스피노트리신(phosphinothricin, PPT) 6 ㎍/L의 조건에서 형질전환체를 선발하여 온실에서 생육하였다. 형질전환 벼의 잎에서 게놈(genomic) DNA를 분리하여 도입 벡터에 존재하는 부분(GUSA-anti)과 프로모터 부분(OsRP2-1906F)에 존재하는 표 4의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 도입한 벡터가 삽입되었는지 확인하였다(도 2).

서열번호	프라이머 명칭	염기서열
서열번호4	GUSA-Anti	5’-CGCGATCCAGACTGAATGCCC-3’
서열번호5	OsRP2-1906F	5’-GCTGCAGCACAAGTCTGAGAGG-3’

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군으로 사용한 동진벼(DJ)에서는 PCR 증폭 산물이 나타나지 않는 데 반해, OsRP2 프로모터-GUS 발현벡터가 삽입된 형질전환 벼에서는 PCR 증폭 밴드가 뚜렷하게 나타남을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, OsRP2 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리아 형질전환체를 이용하여 생산한 형질전환 벼에 OsRP2 프로모터 발현벡터가 제대로 삽입되었음을 확인하였다.

[실시예 5] OsRP2 프로모터의 뿌리 발현 유도성 검정을 위한 형질 전환 벼의 GUS 발현에 의한 염색 분석

OsRP2 프로모터-GUS 벡터 삽입이 확인된 형질전환 벼에서 발아 후 5일 된 유묘를 GUS 염색한 결과, 줄기와 어린 잎에서는 발현이 되지 않았고 뿌리에서만 염색되는 것을 확인하였으며(도 3C), 성숙 종자에서도 GUS 염색이 관찰되지 않았다(도 3F). 뿌리에서는 특히 관다발 조직(vascular cylinder)에서만 GUS 염색이 확인되었다(도 3B). 뿌리의 횡축 절편에서 GUS 염색 양상을 상세히 분석한 결과, 표피(epidermis), 피질(cortex) 등 중심주 바깥쪽의 주요 조직층을 구성하는 세포에서는 GUS 발현이 전혀 관찰되지 않았으며, 중심주 안쪽에서도 phloem, endodermis 또는 pericycle 조직에서도 GUS 염색이 나타나지 않았다(도 3A). 반면 중심주 안쪽의 어린 물관(protoxylem)에서 뚜렷한 GUS 염색이 확인되었다. 한편 뿌리와 달리 어린 잎의 관다발 조직에서는 GUS 염색이 전혀 관찰되지 않았다(도 3D 및 도 3E). 따라서 OsRP2 프로모터가 벼 뿌리의 물관에서 목적유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 확인하였다.

또한 OsRP2 프로모터-GUS 벡터 삽입이 확인된 형질전환 벼 유묘를 24시간 동안 다양한 식물호르몬을 처리한 후 GUS 염색을 확인하였다. 그 결과, ABA, Kinetin, NAA에 의해 뿌리에서 GUS 염색이 증가하는 것을 확인하였다(도 4). 반면 어린 잎과 줄기에서는 호르몬 처리구에서 GUS 염색이 전혀 관찰되지 않았다. 이를 통해 OsRP2 프로모터가 뿌리에서 스트레스 호르몬(ABA)과 생장조절 호르몬 예를 들어, 옥신(auxin), 사이토키닌(cytokinin)에 의해 발현을 유도하는 고유 특성이 있으며, 뿌리의 스트레스 반응과 생장조절에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> sRP2 promoter derived from Oryza sativa and use thereof <130> DP20200070 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRP2 promoter <400> 1 ttaacagtga aacataattt atgttgactg aagcttatac tgtagtagtg tggtctactg 60 taaatgttta ttgtaagttt tgtgctagtc agggtatcta gtcaactata tatatatata 120 ctaagtgaga aaactttggc ctaggcaaag gaagcacact gctcaatcgg tattagttaa 180 aactatccca atgggaagca cactactcaa ttgcattagt taaaactttg gcgaaggcga 240 aggaagcact ctactcaatc gaagtagata atatgatatt tttatgaatt tgcctagtgg 300 taaactcgta gtcacacgat cgtatctccg gatctcttgc agggacaggt gcgcgcggca 360 aaagtatatt tacaacagat ttggcccaat aaaaagtatt ttaaggtacc gataccttat 420 ggtaccaaat tgtttttgat cgctaacaat gcacatcctg cccagttata tcgaaacgat 480 cagaaacgat ttagcaccat gatatattgg taccttgaga tatttttttt tagaccggag 540 cacatctcta tttaaaaaac tatgttgcac tgagatttta gaaatcattc taataacact 600 tgaaaatcac cactgatgaa ttaaaggtaa gataacaaaa tacgatcaat taattcgtat 660 taaggtataa ttaattaata ccgaatggtt agcacagata atacatccat gtgattaagt 720 agagaagtga tccaacggct ctccttttct caacgacgat gcggcacaat gcatgctgaa 780 tttttgtctt cagttacaat ctttgtagag tttttgtttg aactgatcag aatcttatta 840 gaacctaatt aactgtacta cttgaagaga tggaaaaaag tcatatccag ctattgtcaa 900 tactgaaatc ttgaactgta aatccatatt cagtctagac aatagcatac aaatgcagtt 960 aaaattaaac aggagaagtg gtggacaaca caaaaaatct atcgccattg gtctatgtcc 1020 agctaagctt aattactact ttaatttgcc tttactatca cggaaccatc acaattatta 1080 gcttctagag aagcaaaaat gagcacagtt tcctcagtat tacctgccta aatgatcttg 1140 atttgtccta cttaccattt aattaaatta agagggatac atatccatta taaaggagct 1200 ggcatactaa ttatatattc taggtgcaag ccaaacctac taccacttcg atcactgtac 1260 ctataaattt tctcgtaatt aactttgatg ggaacttgaa acagatgcaa gcactaccac 1320 catctatatc tctgataccc aactaacact taattagagg caacattcgg aaacaacaca 1380 acaagcactt ctgcaagttc agtttgcttg ttccatctgt cacaaattct catgtccctt 1440 tttgtcatta gtcatcaccc aaaagaaacc aatgtgtaca aaaaaaaatg ttgacatgga 1500 acagtatgtc cctaatttgc ctttgggaaa gcaaagtagt ggcattgggg ctccaaatgg 1560 taaacggaga gccactaatg ctgctggcaa aaataagttg ggatcgactc agatcactag 1620 cctagtagcc tagcttgcta accatctttt cttcctccat cagtggatgc tcagatcaca 1680 catcaccgaa ttttcatccc cattatattc ttctagcatg actcatttgc agtgcccagc 1740 attttccatc ctctttacta attaattctc cctccattgg ctcatcactg atttattagg 1800 tgatgatgca ctagctataa gggaattatc catgtcctgc acaccggaac aaggcatatg 1860 ctcttacgag gttgccgttc cggtgctttt agcaatgtat atatagctgc agcacaagtc 1920 tgagaggact caagattcag atagttaagt tcagagagac tctcagagtt gcagcaacta 1980 actcatcaag aaactcaaag 2000 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os07g0525100P-F primer <400> 2 gccgccccct tcaccttaac agtgaaacat aatttatg 38 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os07g0525100P-R primer <400> 3 tcggcgcgcc cacccttctt tgagtttctt gatgag 36 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSA-Anti primer <400> 4 cgcgatccag actgaatgcc c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsRP2-1906F primer <400> 5 gctgcagcac aagtctgaga gg 22

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물의 뿌리 물관조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터.
2. 제1항의 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
3. 제2항의 벡터를 이용하여 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium).
4. 제2항의 벡터 또는 제3항의 아그로박테리움으로 형질전환된 형질전환 식물체.
5. 제4항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체.
6. 제2항의 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적단백질을 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 목적단백질이 식물의 뿌리 물관조직에서 특이적으로 발현되는 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법.

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