KR101687106B1 - 감귤 유래 CuCRTISO-like 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직특이적, 발달특이적으로 발현하고 식물호르몬과 스트레스에 특이적으로 반응하는 감귤 유래 CuCRTISO -like 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

Description

감귤 유래 CuCRTISO-like 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터{CuCRTISO-like Promoter derived from Citrus unshiu and Recombinant Vector comprising the Same}

본 발명은 식물호르몬과 스트레스에 특이적으로 반응하는 감귤 유래 CuCRTISO-like 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

카로티노이드는 중요한 자연 색소의 일종으로 식물에 노랑, 오렌지 그리고 빨강의 색을 부여하고, 광합성 및 ABA와 스트리고락톤(strigolactone)과 같은 아포카로티노이드 호르몬의 생성에 필수적인 기능을 담당한다. 또한, 카로티노이드는 인간의 건강에도 밀접하게 관여하고 있다. 최근 연구에 의하면 카로티노이드는 비타민 A의 전구체로 작용할 뿐만 아니라 항산화 능력, 면역력 개선, 항암 효과 등의 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려지고 있다.

카로티노이드 생합성은 식물 전생활사에 걸쳐 발달단계와 환경자극에 반응하여 조절된다. 카로티노이드 이소머라제(CRTISO)는 프로리코펜(prolycopene)을 리코펜 시클라아제(lycopene cyclase)의 기질인 전-트랜스-리코펜(all-trans-lycopene)으로의 이성질화를 촉매한다. CRTISO는 탄제린 토마토와 애기장대 ccr2 돌연변이체에서 처음으로 동정되었다. 이들 식물돌연변이체는 시스-카로틴(cis-carotene)을 과실의 잡색체와 암조건에서 키운 묘목의 백색체에서 축적하였다. CRTISO 발현은 묘발달 시기 동안 염색질 변형 히스톤메틸기 전이효소를 필요로 하며, 이들 두 유전자의 프로모터는 하배축과 정단분열조직, 엽맥, 화분에서의 동일한 조직특이적인 표지유전자의 발현 양상을 일으켰다.　

이에, 본 발명자들은 외래 유전자를 조직특이적이면서 발달특이적으로 발현시키고 식물호르몬과 스트레스에 반응하는 감귤 유래 CuCRTISO -like 프로모터를 분리한 후, 이 프로모터가 식물호르몬과 스트레스에 반응하여 발현하는 결과를 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

국내특허등록번호 제10-0797644호, 2008년 01월 23일 공개

본 발명의 목적은 본 발명은 식물호르몬과 스트레스에 특이적으로 반응하는 감귤 유래 CuCRTISO -like 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1(도 2)로 표시되는 식물 호르몬에 반응하여 발현이 조절되는 프로모터를 제공한다. 또한, 서열번호 1로 표시되는 스트레스에 반응하여 발현이 조절되는 프로모터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 감귤 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 프로모터는 시스-작용 영역을 포함하고, 이는 생물학적 주기 조절 요소, 지베렐린 반응 요소, 혐기성 반응 요소, 살리실산 반응 요소, AT-rich DNA 결합 단백질의 결합 부위, 에틸렌 반응 요소, 지베렐린 반응 요소, 스트레스 반응 요소, 빛 반응 요소, 열스트레스 반응 요소, 건조 유도에 작용하는 MYB 결합 부위 또는 곰팡이 유도인자 반응요소를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 프로모터는 살리실산, 에틸렌, 앱시스산, 오옥신, 브라시노스테로이드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 식물호르몬에 반응하여 발현이 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 프로모터는 열, 건조, 상처, 활성산소, 홍수, 고온, 저온, 화학물질, 빛 및 병해충로 구성된 군에서 선택되는 스트레스에 반응하여 발현이 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프로모터를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 프로모터의 하류에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자가 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 할 수 있고, pCRTL-Prom1, pCRTL-Prom2, pCRTL-Prom3, pCRTL-Prom4 및 pCRTL-Prom5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이에 따른 종자를 제공한다.

상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터의 하류에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물체에 식물 호르몬을 처리하여 목적 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, (a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터의 하류에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물체에 스트레스 처리하여 목적 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 온주 감귤로부터 카로티노이드 이소머라제(carotenoid isomerase)를 암호화하는 cDNA( CuCRTISO )를 분리하였다. 이를 이용하여 식물호르몬과 스트레스에 반응하는 몇 개의 중요한 시스-작용영역(cis-acting elements)을 포함하고 있는 CuCRTISO 프로모터 부위을 클로닝 하였다. 이 프로모터를 GUS유전자와 융합한 벡터를 제작하고, 형질전환 애기장대를 생성하였다. 그 결과, CuCRTISO 프로모터가 조직 특이적이고 발달단계 특이적인 GUS의 발현을 유도하였고, 식물호르몬과 환경스트레스에 반응하는 것을 확인하였다.

또한, 온주 감귤로부터 CuCRTISO 유전자 이외에 다른 식물들에서 발견된 카로티노이드 이소머라제 유전자와 상동성이 높고 아직 그 기능이 밝혀지지 않은 CuCRTISO-like 유전자를 분리하였다. CuCRTISO 유전자의 경우와 같이 식물호르몬과 스트레스에 반응하는 몇 개의 중요한 시스-작용영역을 포함하고 있는 CuCRTISO -like 프로모터 부위을 클로닝하였다. 이 CuCRTISO -like 프로모터 부위는 CuCRTISO 프로모터에는 없는 몇 개의 중요한 시스-작용영역을 포함하고 있다.

이 프로모터를 GUS유전자와 융합한 벡터를 제작하고, 형질전환 애기장대를 생성하였다. 그 결과, CuCRTISO -like 프로모터가 조직 특이적이면서 발달단계 특이적인 GUS의 발현을 유도하였고, CuCRTISO 프로모터에는 없는 시스-작용영역에 의해서 다른 식물호르몬과 환경스트레스에 반응하는 특징을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 CuCRTISO -like 프로모터에 보고되지 않은 억제요소(repressor elements)가 존재하는 것을 확인하였다.

본 발명에서 사용된 GUS(β-glucuronidase) 유전자는 형질전환체에서 유전자 발현 분석을 위한 유전자 융합 마커로 개발 되었으며, 그 후 다양한 프로모터 연구를 위해 사용되어왔다. GUS의 조직화학적인 발현은 담배, 페튜니아, 감자, 십자화과, 옥수수, 콩, 밀, 벼, 보리 그리고 애기장대에서 유전자 발현에 중요하게 연구되어 왔다.

본 발명에서는 CuCRTISO -like 프로모터와 GUS 유전자를 융합한 재조합벡터를 애기장대에 형질전환 시켰다. 애기장대는 형질전환이 쉽고 생활주기가 두 달로 짧기 때문에 유전자의 발현을 확인하기 위한 식물로 사용하였다.

본 발명에서 사용된 용어 “프로모터”는 전형적으로 유전자의 전사 개시점의 업스트림에 있으며, RNA 중합효소 및 다른 단백질의 인지 및 결합에 관여하여 작동가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 “벡터”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “형질전환”은 전달에 사용된 방법에 관계없이 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포로의 전달을 포함한다. 형질전환 방법은 리포좀, 전기천공법, 유리 DNA 흡수를 증가시키는 화학물질, 식물체 내로 DNA의 직접적인 주입, 입자총 충격법, 바이러스 또는 화분을 이용한 형질전환 및 미세주입(microprojection)을 포함한다. 방법은 원형질에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜법(Krens, F.A. 등, (1982) Nature 296, 72-74;Negrutiu I 등(1987), Plant Mol Biol 8: 363-373); 원형질의 전기천공법 (Shillito R.D. 등(1985), Bio/Technol 3, 1099-1102); 식물로 미세주사 (microinjection) (Crossway 등(1986), Mol. Gen Genet 202: 179-185); DNA 또는 RNA 코팅된 입자 충격법 (Klein TM 등(1987), Nature 327: 70) (비통합적) 바이러스로 감염 등으로부터 선택할 수도 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “조직 특이적”은 잎, 뿌리, 종자 조직 등과 같이 특정 기관 또는 조직에서 우선적으로 발현 개시가 가능한 것이다. 예를 들면, "뿌리 특이적 프로모터"는 식물의 다른 부위에 약간 누설된(leaky) 발현을 허용하지만, 사실상 식물의 다른 부위를 제외하고 식물 뿌리에서 우세하게 전사적으로 활성이 있는 프로모터이다.

본 발명은 감귤 유래 CuCRTISO -like 유전자로부터 분리된 프로모터 및 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

도 1은 PlantCARE 프로그램에 의해 유추된 CuCRTISO -like 프로모터 지역의 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 CuCRTISO -like 프로모터 지역의 서열(서열번호 1) 및 시스-작용 조절 요소를 나타낸 것이다.
도 3는 CuCRTISO -like프로모터-GUS로 형질전환된 애기장대의 GUS와 대조구 유전자의 비율을 겔 이미지로 나타낸 것이다.
도 4는 CuCRTISO -like프로모터-GUS로 형질전환된 애기장대와 야생형 애기장대(Col-O)에서의 발단 단계에 따른 GUS 염색을 나타낸 것이다.
도 5는 CuCRTISO -like프로모터-GUS로 형질전환된 애기장대에서의 발단 단계에 따른 GUS 염색을 나타낸 것이다.
도 6은 CuCRTISO -like프로모터-GUS로 형질전환된 애기장대에서의 식물호르몬과 환경스트레스에 반응하는 GUS 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 CuCRTISO -like프로모터-GUS로 형질전환된 애기장대와 야생형 애기장대(Col-O)에서의 발단 단계에 따른 GUS 염색을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 온주 감귤로부터 CuCRTISO -like 유전자의 5' 상위지역(upstream region)의 클로닝

실험재료로 사용한 온주 감귤은 제주대학교 아열대농업생명과학연구소에서 제공되었다. 상기 온주 감귤에 잎에서 CTAB 방법(Cheng 등(2003))을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 온주 감귤로부터 5' 비번역 부위와 3' 비번역 부위를 포함하는 전체 염기서열의 CuCRTISO -like cDNA를 분리하였다. 그 후, 염기서열 정보로부터 5' 비번역부위 단편을 제조사의 지시사항에 따라 DNA Walking SpeedUp◎Kit (Seegene)와 LA PCR in vitro cloning kit(Takara)를 이용하여 획득하였다. 5' 단편은 Promega사의 pGEM-T easy vector에 연결한 뒤에 연속적으로 염기서열을 결정하였다.

그 결과, CuCRTISO -like 유전자의 상위지역(개시코돈으로부터 2577 염기쌍의 상위지역)까지 획득하였다. 5'단편은 CuCRTISO-Prom1의 5'말단을 포함하는 CRT-2Protgg-F 프라이머(서열번호 2)와 CuCRTISO -like 유전자의 개시코돈으로부터 -20로부터 -1 상위지역까지 포함하는 2proORFttg-R 프라이머(서열번호 3)를 사용한 PCR에 의해 확보할 수 있었으며 구체적인 프라이머를 하기 표 1에 기재하였다.

프라이머 이름	서열번호	프라이머 서열(5'-3')
CRT-1Procac-F	2	CACCACATCCTTAACCAATT
1proORFttc-R	3	GAAATGTGTTTGAAATTGAA

실시예 2: CuCRTISO -like 프로모터 지역의 클로닝과 염기서열 분석

상기 실시예 1에서, CuCRTISO -like cDNA를 온주 감귤로부터 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 전사개시부위는 5' RACE를 수행하였고, 이를 통해 번역 개시코돈인 ATG로부터 94bp 상위지역에 위치하고 있는 것을 확인하였다. CuCRTISO -like 서열의 정보를 이용해서 2,483-bp 프로모터 지역(도 1, 및 도 2)을 분리하였다. CuCRTISO -like 유전자의 2,483-bp 프로모터 지역과 94-bp의 5' UTR(비번역지역)으로부터 PlantCARE 프로그램을 사용하여 시스-작용(cis-acting) 조절요소를 추정하기 위해 분석하였다. CuCRTISO -like 프로모터 지역에 생물학적 주기(circadian)-조절요소(circadian) (Rawat et al. 2005), 지베렐린 반응 요소(P-box), 살리실산 반응 요소(TCA), AT-rich DNA 결합 단백질(ATBP-1)의 결합 부위(AT-rich), 에틸렌 반응 요소(ERE) (Itzhaki et al. 1994; Rawat et al. 2005), 방어, 스트레스 반응 요소(TC-rich), 빛 반응 요소(as-2-box), 열스트레스 반응 요소(HSE), 건조 유도에 작용하는 MYB 결합 부위(MBS) (Baranowskij et al. 1994; Gubler et al. 1999; Sablowski et al. 1994), 곰팡이 유도인자 반응요소(Box-W1)를 포함하여 여러 개의 환경스트레스 반응과 식물 호르몬 반응 시스-작용 조절요소가 있음을 추정하였고, 추정되는 두 개의 TATA와 한개의 CAAT 상자는 각각 전사개시부위로부터 -12 bp, -27 bp와 -106 bp에 위치하고 있음을 확인하였다. 위치 +1은 5' RACE에 의해 분리된 가장 긴 서열의 첫 번째 뉴클레오티드를 나타낸다.

실시예 3: GUS 표지유전자 융합 재조합 DNA의 형질전환 애기장대 제작

<3-1> CuCRTISO -like 프로모터-GUS 융합 재조합 DNA를 제작

상기 실시예 2에서 CuCRTISO -like의 2,483-bp의 5' 상위지역(Prom1)(서열번호4)을 본 발명의 전체 길이의 프로모터인 것을 확인하였고, 상기 상위지역의 프로모터 활성을 측정하기 위해서 5종류의 프로모터-GUS 융합 재조합 DNA를 제작하였다. 구체적으로, 전체 길이의 2,483-bp 길이의 프로모터 Prom 1(서열번호 4), 1,853-bp 길이의 일부 절단한 단편인 Prom2(서열번호 5), 1,580-bp길이의 절단한 단편인Prom 3(서열번호 6), 609-bp길이의 절단한 단편인Prom 4(서열번호 7), 81-bp길이의 절단한 단편인Prom 5(서열번호 8)을 하기 표 3에 나타낸 프라이머 조합을 사용하여 PCR을 통해 증폭하였다. Prom1부터 Prom5의 염기배열은 표 2에 나타내었다. Prom1(서열번호 2)은 Pst1cacL(서열번호 9)과 BamHIttcR(서열번호 14)을 사용하였고, Prom2(서열번호 3)은 Pst1cacML(서열번호 10)과 BamHIttcR(서열번호 14)을 사용하였고, Prom3(서열번호 4)은 Pst1ttgL(서열번호 11)과 BamHIttcR(서열번호 14)을 사용하였고, Prom4(서열번호 5)은 Pst1ttgML(서열번호 12)과 BamHIttcR(서열번호 14)을 사용하였고, Prom5(서열번호 6)은 Pst1atgL(서열번호 13)과 BamHIttcR(서열번호 14)을 사용하였다. PCR 산물은 pGEM-T easy vector(Promega사 제품)를 사용하여 클로닝한 후, pCAMBIA2300-GUS vector의 BamHI과 PstI 제한효소 부위에 연결하여 GUS 5' 말단에 프로모터를 연결하였다. 이러한 5종류의 재조합 DNA는 pCRTL-Prom1, pCRTL-Prom2, pCRTL-Prom3, pCRTL-Prom4, 및 pCRTL-Prom5로 명명하였으며, 각각의 CuCRTISO -like-프로모터-GUS는 다음과 같이 상대적인 위치의 상위지역을 포함하고 있으며 도 1B에 나타내었다.

프로모터 이름	서열번호	프로모터 서열(5'-3')
Prom1	4	GTTATTAATTTAAGAAATCCGTTTAATTATAATACAAAATATAAATCGTTCTTCGTGTTTTTTTTGGGTACAAAATGTTTAAGAAATTTTATAAATTGTCTGTGCTCATGTAGATTAACTGGAAGAAATATTTTTTTCTTGAAGTGGGCTAATATCCATTTTAGTACAGAAGGTCGAAAATTTATGTGATAATAAATATGTTAGTGTAAATTAGAAAAAAAAAGGGACTGTGGGGGTCAAGTGGCCTATTGTTGCAATCGCAGTATCACACACATTCACATGCTCCCCCACGTCCAGTTATTTTATTTTATCATTTTGTTTTTTTCGATTGAGTTTAAAAATATGCAAAAAGATGGAGCCAGACAGTGGGTACAGACGTGGCCAGTATCAGAACTACAAAGTAATAAGTCATATTATCATTTAATAAGTAGAGAAACGGTGAACCAAATAATTAAAGATACTTGAATCGTCTTTCAATATCTCTGAAGCTCTCACTCTCGGGATTCAATTTCTTTCAAACACATTTC
Prom2	5	TAGAAGCTGCTAATCGGGTCTGTCTTGTTTTGTTTGTATTTTTCAGTGTGGCTGAAATATTTAACATGATATTGGTCCTATTTATACAGATGATGATGGTGCTGAATATCTTTCTCGGCCTGTGTGTAGTGTGTGTGGGTATGTTGGTGTTGTAGTAATACGAGTCCTTTTGTTTTTGCTTAATTTTGAAAGTTTGGTTGGAGGCGAATGCCTTATTTGATGCGGAGCTGTTGTGGACACATGGTTTTTAGTCAAAGATATTGTGGGGAAAAAAAATTGTAGTCATAAAATAAAAACTGAATTTTTTTTTTGAAGTGAAATAAAAACTGATTTGATAATACATAGTAAATATAATTTTGAAATAATAATTTCAAGAAAATAATAAAGAAGTAACTGTTATTAATTTAAGAAATCCGTTTAATTATAATACAAAATATAAATCGTTCTTCGTGTTTTTTTTGGGTACAAAATGTTTAAGAAATTTTATAAATTGTCTGTGCTCATGTAGATTAACTGGAAGAAATATTTTTTTCTTGAAGTGGGCTAATATCCATTTTAGTACAGAAGGTCGAAAATTTATGTGATAATAAATATGTTAGTGTAAATTAGAAAAAAAAAGGGACTGTGGGGGTCAAGTGGCCTATTGTTGCAATCGCAGTATCACACACATTCACATGCTCCCCCACGTCCAGTTATTTTATTTTATCATTTTGTTTTTTTCGATTGAGTTTAAAAATATGCAAAAAGATGGAGCCAGACAGTGGGTACAGACGTGGCCAGTATCAGAACTACAAAGTAATAAGTCATATTATCATTTAATAAGTAGAGAAACGGTGAACCAAATAATTAAAGATACTTGAATCGTCTTTCAATATCTCTGAAGCTCTCACTCTCGGGATTCAATTTCTTTCAAACACATTTC
Prom3	6	AAATTGTAGTCATAAAATAAAAACTGAATTTTTTTTTTGAAGTGAAATAAAAACTGATTTGATAATACATAGTAAATATAATTTTGAAATAATAATTTCAAGAAAATAATAAAGAAGTAACTGTTATTAATTTAAGAAATCCGTTTAATTATAATACAAAATATAAATCGTTCTTCGTGTTTTTTTTGGGTACAAAATGTTTAAGAAATTTTATAAATTGTCTGTGCTCATGTAGATTAACTGGAAGAAATATTTTTTTCTTGAAGTGGGCTAATATCCATTTTAGTACAGAAGGTCGAAAATTTATGTGATAATAAATATGTTAGTGTAAATTAGAAAAAAAAAGGGACTGTGGGGGTCAAGTGGCCTATTGTTGCAATCGCAGTATCACACACATTCACATGCTCCCCCACGTCCAGTTATTTTATTTTATCATTTTGTTTTTTTCGATTGAGTTTAAAAATATGCAAAAAGATGGAGCCAGACAGTGGGTACAGACGTGGCCAGTATCAGAACTACAAAGTAATAAGTCATATTATCATTTAATAAGTAGAGAAACGGTGAACCAAATAATTAAAGATACTTGAATCGTCTTTCAATATCTCTGAAGCTCTCACTCTCGGGATTCAATTTCTTTCAAACACATTTC
Prom4	7	ATGCGGAGCTGTTGTGGACACATGGTTTTTAGTCAAAGATATTGTGGGGAAAAAAAATTGTAGTCATAAAATAAAAACTGAATTTTTTTTTTGAAGTGAAATAAAAACTGATTTGATAATACATAGTAAATATAATTTTGAAATAATAATTTCAAGAAAATAATAAAGAAGTAACTGTTATTAATTTAAGAAATCCGTTTAATTATAATACAAAATATAAATCGTTCTTCGTGTTTTTTTTGGGTACAAAATGTTTAAGAAATTTTATAAATTGTCTGTGCTCATGTAGATTAACTGGAAGAAATATTTTTTTCTTGAAGTGGGCTAATATCCATTTTAGTACAGAAGGTCGAAAATTTATGTGATAATAAATATGTTAGTGTAAATTAGAAAAAAAAAGGGACTGTGGGGGTCAAGTGGCCTATTGTTGCAATCGCAGTATCACACACATTCACATGCTCCCCCACGTCCAGTTATTTTATTTTATCATTTTGTTTTTTTCGATTGAGTTTAAAAATATGCAAAAAGATGGAGCCAGACAGTGGGTACAGACGTGGCCAGTATCAGAACTACAAAGTAATAAGTCATATTATCATTTAATAAGTAGAGAAACGGTGAACCAAATAATTAAAGATACTTGAATCGTCTTTCAATATCTCTGAAGCTCTCACTCTCGGGATTCAATTTCTTTCAAACACATTTC
Prom5	8	ATGGAGCCAGACAGTGGGTACAGACGTGGCCAGTATCAGAACTACAAAGTAATAAGTCATATTATCATTTAATAAGTAGAGAAACGGTGAACCAAATAATTAAAGATACTTGAATCGTCTTTCAATATCTCTGAAGCTCTCACTCTCGGGATTCAATTTCTTTCAAACACATTTC

프라이머 이름	서열번호	프라이머 서열(5'-3')
Pst1cacL	9	CATCTGCAGCACCACATCCTTAACCAATT
Pst1cacML	10	CATCTGCAGACCTTGATCTGAATCTAAGGAG
Pst1ttgL	11	CATCTGCAGTTGGATGAGTTTGTAGAGTAAGAG
Pst1ttgML	12	CATCTGCAGATGCGGAGCTGTTGTG
Pst1atgL	13	CATCTGCAGATGGAGCCAGACAGTGG
BamHIttcR	14	AGGATCCGAAATGTGTTTGAAATTGAA

<3-2> GUS 표지유전자 융합 재조합 DNA의 형질전환 애기장대 제작 및 선발

상기 실시예 3-1에서 제작한 재조합 벡터는 Agrobacterium tumefaciens 균주 LBA4404에 얼림-녹임(freeze-thaw) 방법을 사용하여 형질전환하였다(Hofgen and Willmitzer　1988). 형질전환된 애기장대를 사용하여 애기장대(Col-0)에 화기침치 방법을 통해 형질전환하였다. 형질전환된 애기장대는 1.5% 설탕, 0.8% micropropagation-grade plant agar (Maxim Bio, KOrea), 50 ㎍/mL 카나마이신(kanamycin)을 첨가한 Murashige-Skoog(MS) 평판 배지에서 2-4주 동안 선발하였다. 선발된 식물체는 21℃, 16시간 명조건, 8시간 암조건의 배양기에서 생육하였다. 그 다음, 단일 사본의 CuCRTISO -like-프로모터-GUS를 가지고 있는 동형접합 형질전환계통을 획득하기 위하여 각각 재조합 체의 T2식물체를 대상으로 Kihara 등(2006)에 제시한 quantitative dual-target PCR(Qd-PCR) 방법을 수행하였다.

구체적으로, 게놈 DNA 시료(20 ng)를 개별적인 PCR 튜브 내의 20㎕ PCR 반응에서 주형으로 사용되었다. PCR 반응 혼합물은 1 Unit의 Taq DNA polymerase (BIONEER, Korea), 250μM dNTPs, 10mM Tris-HCl(pH 9.0), 30mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.5μM GUS 유전자 증폭용 2종류의 프라이머(Gus144-F; TGCTGTCGGCTTTAACCTCTC 서열번호 15)와 Gus144-R; TTTTGTCACGCGCTATCAGC 서열번호 16), 이미 알고 있는 단일 사본 유전자[DNA polymerase lambda subunit; Pol λ NM_100926)의 2종류 프라이머(Poll-F; GGTGTACAAACCACCCGATTT 서열번호 17와 Poll-R; GTGTGCGATGTCCTTTCTCAT 서열번호18)로 이루어졌다. PCR은 2분간 94℃에서 수행한 후, 30초 동안 94℃, 30초 동안 60℃에서 30초, 20초 동안 68℃을 22회 반복하였고, 마지막의 신장은 1분간 68℃에서 수행하였다. 반응생성물은 전기영동에 의해 분석되었고, 각 밴드의 강도는 NIH Image software (ImageJ)를 사용하여 정량하였다. 그 결과, 단일사본의 pCRTL-Prom1 (4 계통), pCRTL-Prom2 (4 계통), pCRTL-Prom3 (5 계통), pCRTL-Prom4 (4 계통) 및 pCiso-Prom5(5 계통) 등 총 22개의 동형접합 T2 계통을 얻었다(도 3).

실험예 1: CuCRTISO -like 프로모터의 발달특이적 및 조직특이적 활성 분석

<1-1> CuCRTISO -like 프로모터의 발달단계별 발현 특이성 분석

상기 실시예 3-2에서 얻은 pCRTL-Prom1, pCRTL-Prom2, pCRTL-Prom3, pCRTL-Prom4 및 pCRTL-Prom5 각각의 프로모터가 형질전환된 식물체에서 각각의 프로모터에 의해 조절되는 발달단계별 발현 특이성을 GUS가 발현되는 것을 통하여 확인하였다.

구체적으로, pCRTL-Prom1, pCRTL-Prom2, pCRTL-Prom3, pCRTL-Prom4 및 pCRTL-Prom5를 발현하고 있는 여러 발달단계의 애기장대 형질전환체의 GUS 활성을 조사하기 위한 조직학적 염색에 사용하였다.

그 결과, 모든 형질전환 유묘 식물체의 발아 후(DAG) 5일 경과 후 자엽에서 GUS 염색이 관찰되었고 그 중에 pCRTL-Prom4를 발현하고 있는 형질전환체에서 가장 진한 GUS염색이 관찰되었다 (도 4A). 발아 후 10일 경과된 유묘 식물체에서의 GUS 염색도 자엽에서만 관찰되며 pCRTL-Prom4를 발현하고 있는 형질전환체에서 가장 진한 GUS염색이 관찰되었지만. 발아 후 5일보다 조금 약하게 염색되었다(도 4B). 발아 후 15일 경과 후에는 GUS 염색이 관찰되지 않았다(도 4C). 어린 잎과 성숙한 잎의 경우에는 모든 형질전환 계통의 성숙에 잎에서 GUS 염색이 관찰되지 않았다(도 4D, 4E). 꽃 조직의 경우에는 GUS염색은 약에서 관찰되었다(도 4F). 이러한 결과는 CuCRTISO -like 프로모터가 발달특이적인 활성을 나타내는 것을 나타내며, pCRTL-Prom4 프로모터가 발달단계별 유전자의 발현을 활성화하는데 충분하다는 것도 제시해준다. 각각 재조합체에 대한 2개의 추가적인 형질전환 계통에서도 유사한 GUS 염색 양상을 나타내는 것을 확인하였다(도 7).

<1-2> CuCRTISO -like 프로모터의 조직특이적 활성 분석

CuCRTISO -like 프로모터의 조직특이성을 조사하기 위해서, GUS 유전자에 대한 RT-PCR을 5개의 다른 CuCRTISO -like-프로모터-GUS 융합 재조합체를 발현하는 상기 실시예 3-2에서 얻은 형질전환 애기장대의 서로 다른 조직을 대상으로 수행하였다. 대조구로 AtACT1 유전자를 이용하였다.

그 결과, GUS 발현은 5개의 형질전환 계통의 발아 후 10일 경과된 유묘의 자엽과 꽃에서 검출되었다. 그러나 하배축과 뿌리, 줄기, 어린잎, 성숙한 잎에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과는 CuCRTISO -like 프로모터가 조직특이적으로 발현되는 것을 나타낸다(도 5).

시험예 2: CuCRTISO -like 프로모터의 시스 -작용(cis-acting )요소의 기능 분석

<2-1> 호르몬과 비생물적 스트레스 처리 방법

밀폐된 플라스틱 식물 배양 용기에 있는 형질전환체 애기장대 어린식물체(유묘)에 에틸렌을 처리하였다(Phytohealth; SPL Life Science; Cat. No. 310120) (Zarei 등, 2011). 에틸렌은 배양용기에 주입하여 최종농도가 10ppm으로 희석되었다. 2주 경과 유묘는 48시간 동안 10ppm의 에틸렌에 노출되었다. 살리실산 처리는 2주된 유묘를 1mM 살리실산 용액을 적신 여과지에 올려 6시간 처리하였다. 고온 스트레스 처리는 2주된 유묘를 MS배지로 포화된 여과지 위에 옮긴 뒤에 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 건조 스트레스 처리는 2주 경과 유묘를 마른 여과지 표면에 놓음으로서 수행되었고, 22℃에서 6시간 동안 배양기에서 배양함으로써 수행되었다. 상처 처리는 2주된 유묘를 칼로 상처를 낸 후 MS 배지에 48시간 배양하였다. 식물호르몬을 첨가하지 않은 MS 배지로 적신 여과지상에서 자란 유묘를 대조구로 사용하였다.

<2-2> GUS 활성을 조사하기 위한 조직학적 염색

형질전환 애기장대 계통에서 GUS활성분석을 위한 조직학적 염색은 Cho와 Cosgrove (2000)에 의한 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 여러 프로모터 재조합체를 발현하고 있는 형질전환식물체를 염색용액[1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide, 50 mM NaPO₄, 0.5 mM K₄Fe(CN)₆, 0.5 mM K₃Fe(CN)₆, and 0.1% Triton X-100]에서 16-24시간 동안 37℃에서 위치하였다. 이후 시료를 70% 에탄올에 담궈 엽록소와 카로티노이드를 제거하였다.

<2-3> GUS 유전자발현의 RT- PCR ( 역전사효소 - PCR ) 분석

형질전환 애기장대의 전체 RNA를 AccuZol Total RNA Extraction Solution (BIONEER, Korea)을 제조사의 지시에 따라 분리하였다. RNA 추출물은 5 units의 DNase I(TaKaRa, Japan)으로 37℃에서 1시간 동안 처리한 후, 동일 부피의 페놀: 클로로폼: 이소아밀알콜 (25:24:1, v/v/v)과 혼합하였고, 12,000×g에서 4℃, 20분 동안 원심분리하였다. 상층액을 RNase가 전혀 없는 새 튜브에 옮기고 동일 부피의 이소프로필 알콜을 첨가하였다. 그 이후에 용액을 몇 번 뒤집어서 혼합하였다. 시료를 12,000×g에서 4℃, 10분간 원심분리 하였다. 침전물을 80% 에탄올로 씻어준 후 건조하였다. 건조한 침전물은 DEPC로 처리한 물로 용해하였다.

형질전환 애기장대에서 GUS유전자의 발현을 확인하기 위하여 cDNA 합성과 RT-PCR의 수행에 필요한 모든 성분을 포함하고 있는 단일 튜브에 AccuPower RT-PCR PreMix (BIONEER, Korea)을 사용하여 역전사효소-PCR(RT-PCR)을 수행하였다. 이들 반응에15 ml의 희석된 프라이머 혼압핵과 5 ml의 RNA 주형(약 1.0 mg)을 각 반응에 첨가하였다. 역전사반응은 42℃에서 60분 동안 수행하였고, 이어서 94℃에서 5분간 처리하여 반응을 종결하였다. RT-PCR을 위한 나머지 유전자 증폭 반응은 다음과 같은 회로를 통해 진행하였다. 즉, Taq polymerase 활성화를 위해 94℃에서 5분간 처리하고, 94℃에서 30초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 혼성화, 72℃에서 1분간 신장(중합반응) 과정을 35회 반복하여 수행한 후 마지막 신장단계를 72℃에서 5분간 수행하였다. GUS-F(TGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACC; 서열번호 19)과 GUS-R(TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC; 서열번호 20) 프라이머를 GUS 특이적 생성물을 증폭하기 위해 사용하였다. AtACT1특이 생성물은 내부 대조구로서 AtACT1-F(GTATTGTGGGTCGTCCTCGT; 서열번호 21)과 AtACT1-R(TGAACAATCGATGGACCTGA; 서열번호 22) 프라이머를 사용하여 증폭하였다.

<2-4> CuCRTISO -like 프로모터의 시스 -작용 요소의 기능 분석

CuCRTISO -like 프로모터 지역은 2개의 호르몬 반응시스-작용 요소, P-box 와 TCA, 3개의 환경스트레스 반응 요소, MBS, HSE, TC-rich를 보유하고 있었다(도 1A). 이들 시스-작용 요소가 기능하는지를 평가하기 위해서, 형질전환 CuCRTISO -like-프로모터-GUS 계통의 2주된 유묘를 사용하여 상기 실험예 2-1에서와 같이 호르몬과 환경스트레스를 처리하여 실험예 2-2 및 2-3에서와 같이 조직학적 GUS 염색과 RT-PCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 오직 pCRTL-Prom1만이 TCA cis-acting 요소를 가지고 있었고, 나머지 4개 재조합체에서는 이 요소가 삭제되었다(도 1). 따라서 pCRTL-Prom1 형질전환체에서만 살리실산 처리에 의해 GUS 염색이나 발현이 유도되었다. pCRTL-Prom5 재조합 식물체를 제외하고 나머지 4개의 형질전환체는 P-box 시스-작용 요소를 포함하고 있었다. 그러나 GUS 염색과 발현은 오직 pCRTL-Prom4 재조합 식물체에서만 검출되었다(도 6A 및 6B).

또한, 고온 스트레스에 대한 발현양상을 조사한 결과, pCRTL-Prom5 재조합 식물체를 제외하고 나머지 4개의 형질전환체는 HSE 시스-작용 요소를 포함하고 있었다. GUS 염색과 발현은 37℃에서 6시간 동안 암조건에서 배양한 pCRTL-Prom1, pCRTL-Prom2, pCRTL-Prom3 및 pCRTL-Prom4 재조합 식물체의 잎표면에서 검출되었다. 그러나, 염색과 발현 수준은 pCRTL-Prom4에서 가장 높았다.

pCRTL-Prom5 재조합 식물체를 제외하고 나머지 4개의 형질전환체는 MBS 시스-작용 요소를 포함하고 있었다. 모든 프로모터 재조합체는 저온 요소를 함유하고 있었다. 그러나 오직 pCRTL-Prom4프로모터를 발현하고 있는 형질전환 계통에서만 4℃에서 24시간 동안 어둠에서 배양하였을 때 GUS 염색과 발현을 유도하였다.

방어, 스트레스 반응요소는 pCRTL-Prom1, pCRTL-Prom2, pCRTL-Prom3 재조합 식물체에서만 존재하고 있었다. 그러나 상처 처리는 pCRTL-Prom3 재조합 식물체에서만 GUS 염색과 발현을 유도하였다.

상기 결과들을 통하여 pCRTL-Prom1 융합 재조합체를 발현하고 있는 형질전환 식물체는 살리시란 및 고온 스트레스에 반응하여 조절되었고 pCiso-Prom2 융합 재조합체를 발현하고 있는 형질전환 식물체는 고온 스트레스에 반응하여 조절되었고, pCiso-Prom3 융합 재조합체를 발현하고 있는 형질전환 식물체는 고온 및 상처 스트레스에 반응하여 조절되었고, pCiso-Prom4 융합 재조합체를 발현하고 있는 형질전환 식물체는 에틸렌, 고온 및 건조 스트레스에 반응하여 조절되는 것을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation JEJU National University <120> CuCRTISO-like Promoter derived from Citrus unshiu and Recombinant Vector comprising the Same <130> CuCRTISO <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2580 <212> DNA <213> Citrus unshiu <400> 1 caccacatcc ttaaccaatt tcttgataaa tgaattaggg gtgttcaaga tccaatccaa 60 tcaaaccaat caatccaatc caaagcagaa ccttttgatt ggatttattg gattgcaaaa 120 tggaaaatcc aatgttattg gattggttta tggatctatg tgttaaaatc atatataaag 180 caatccaact gattaatttt tattttgttt atttaaaaaa agaagaagct acatattgct 240 tttatattta acttgctaaa gaaaaaacct gattttcctt ttaaaaaaaa tggtataact 300 ataaatacac aattacatag agtattaatt gcgacctatg attgttttct atattcaaat 360 ttcaattttt tttttaacca tatatatata tataaaatgt tttcaattgt taataactag 420 aactgtggag agtaattgat gatttttgtt tgtaaatttt tattttaatc agattgatgg 480 gatcagattg aattggatct ggctttttat tgctttggat tatattgagt gacctccaag 540 atcgaaggaa tatgtatatg tcccgcattc aacatatttt gcatttgaaa gaatatttat 600 gtatatggct aggcctacga tcaaatctga accttgatct gaatctaagg agttacaaca 660 ccatttatgt atatggctag gcctacgacc aaatctgaac cttgatctga atctaaggag 720 ttacaacacc aatcttgaat cttaataagc tttgggaatt attacgtaac gcaatatgac 780 ataagaattg tgaatatttt atgggtgtag agagaaaata attagttaat ggaataattt 840 taatgaagga taactttgac atgtaaaaga gtatacagag tagaaaatac cttttgaaat 900 gtattggatg agtttgtaga gtaagagtat tcaaagtaga ttttggtgtg caaataatcc 960 cacccaatga tgagtctttt gttaaggttg attttccatt ttttaattta ttattgtttt 1020 gcagtgaact gcttatccat tttgaaaatt tggagcatgc acttgctgtt ttgtggagac 1080 tgtcttggtt tgcttcacac ttgatgaggt gtagacaatg tttcagcagt gataaagagg 1140 aaaggtttag ttaacctgac tggttcagat accaatgtaa ttaaatacat ggtgggttga 1200 agaatcccga tcttggtaac aaatggctcg gataggagga aaaagacaaa gaaaagcgag 1260 atcatctttt acagtcctat ataataccac agttatcatc atggtgacct ttaggaggtg 1320 ttttgctggg ggagtgaagg acatcctcaa tcttgccatt gactctgtat aggtactggg 1380 atattctgct tttggcaggt ggattcttcc attagctgga actgtaaata taattgcaga 1440 ccgaaatttc agcagtcgcg gtctgccata 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cagtatcaca cacattcaca tgctccccca 2340 cgtccagtta ttttatttta tcattttgtt tttttcgatt gagtttaaaa atatgcaaaa 2400 agatggagcc agacagtggg tacagacgtg gccagtatca gaactacaaa gtaataagtc 2460 atattatcat ttaataagta gagaaacggt gaaccaaata attaaagata cttgaatcgt 2520 ctttcaatat ctctgaagct ctcactctcg ggattcaatt tctttcaaac acatttcatg 2580 2580 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 caccacatcc ttaaccaatt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaaatgtgtt tgaaattgaa 20 <210> 4 <211> 2577 <212> DNA <213> Citrus unshiu <400> 4 caccacatcc ttaaccaatt tcttgataaa tgaattaggg gtgttcaaga tccaatccaa 60 tcaaaccaat caatccaatc caaagcagaa ccttttgatt ggatttattg gattgcaaaa 120 tggaaaatcc aatgttattg gattggttta tggatctatg tgttaaaatc atatataaag 180 caatccaact gattaatttt tattttgttt atttaaaaaa agaagaagct acatattgct 240 tttatattta acttgctaaa gaaaaaacct gattttcctt ttaaaaaaaa tggtataact 300 ataaatacac aattacatag agtattaatt gcgacctatg attgttttct 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<210> 6 <211> 1674 <212> DNA <213> Citrus unshiu <400> 6 ttggatgagt ttgtagagta agagtattca aagtagattt tggtgtgcaa ataatcccac 60 ccaatgatga gtcttttgtt aaggttgatt ttccattttt taatttatta ttgttttgca 120 gtgaactgct tatccatttt gaaaatttgg agcatgcact tgctgttttg tggagactgt 180 cttggtttgc ttcacacttg atgaggtgta gacaatgttt cagcagtgat aaagaggaaa 240 ggtttagtta acctgactgg ttcagatacc aatgtaatta aatacatggt gggttgaaga 300 atcccgatct tggtaacaaa tggctcggat aggaggaaaa agacaaagaa aagcgagatc 360 atcttttaca gtcctatata ataccacagt tatcatcatg gtgaccttta ggaggtgttt 420 tgctggggga gtgaaggaca tcctcaatct tgccattgac tctgtatagg tactgggata 480 ttctgctttt ggcaggtgga ttcttccatt agctggaact gtaaatataa ttgcagaccg 540 aaatttcagc agtcgcggtc tgccataagt gactggggag catttgtcta tagccctcct 600 tgacattcat agggttctct ataaatggtt ttgtgcctaa aatagattaa aagctggggc 660 cttttccaaa accagcagca tgttttgagt tttgtttcac tgattggcat tggagtgact 720 ttggagaaaa aagtaaaaag gatggagttt agtagaagct gctaatcggg tctgtcttgt 780 tttgtttgta tttttcagtg tggctgaaat 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ttcaatttct ttcaaacaca tttc 1674 <210> 7 <211> 703 <212> DNA <213> Citrus unshiu <400> 7 atgcggagct gttgtggaca catggttttt agtcaaagat attgtgggga aaaaaaattg 60 tagtcataaa ataaaaactg aatttttttt ttgaagtgaa ataaaaactg atttgataat 120 acatagtaaa tataattttg aaataataat ttcaagaaaa taataaagaa gtaactgtta 180 ttaatttaag aaatccgttt aattataata caaaatataa atcgttcttc gtgttttttt 240 tgggtacaaa atgtttaaga aattttataa attgtctgtg ctcatgtaga ttaactggaa 300 gaaatatttt tttcttgaag tgggctaata tccattttag tacagaaggt cgaaaattta 360 tgtgataata aatatgttag tgtaaattag aaaaaaaaag ggactgtggg ggtcaagtgg 420 cctattgttg caatcgcagt atcacacaca ttcacatgct cccccacgtc cagttatttt 480 attttatcat tttgtttttt tcgattgagt ttaaaaatat gcaaaaagat ggagccagac 540 agtgggtaca gacgtggcca gtatcagaac tacaaagtaa taagtcatat tatcatttaa 600 taagtagaga aacggtgaac caaataatta aagatacttg aatcgtcttt caatatctct 660 gaagctctca ctctcgggat tcaatttctt tcaaacacat ttc 703 <210> 8 <211> 175 <212> DNA <213> Citrus unshiu <400> 8 atggagccag acagtgggta cagacgtggc cagtatcaga actacaaagt aataagtcat 60 attatcattt aataagtaga gaaacggtga accaaataat taaagatact tgaatcgtct 120 ttcaatatct ctgaagctct cactctcggg attcaatttc tttcaaacac atttc 175 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 catctgcagc accacatcct taaccaatt 29 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 catctgcaga ccttgatctg aatctaagga g 31 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 catctgcagt tggatgagtt tgtagagtaa gag 33 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 catctgcaga tgcggagctg ttgtg 25 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 catctgcaga tggagccaga cagtgg 26 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aggatccgaa atgtgtttga aattgaa 27 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgctgtcggc tttaacctct c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ttttgtcacg cgctatcagc 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggtgtacaaa ccacccgatt t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gtgtgcgatg tcctttctca t 21 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgttacgtcc tgtagaaacc ccaacc 26 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tcattgtttg cctccctgct gc 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gtattgtggg tcgtcctcgt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tgaacaatcg atggacctga 20

Claims (19)

1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 식물 호르몬에 반응하여 발현이 조절되는 프로모터.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 프로모터는 감귤 유래인 것을 특징으로 하는 프로모터.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 프로모터는 살리실산, 에틸렌, 지베렐린, 앱시스산, 오옥신, 브라시노스테로이드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 식물호르몬에 반응하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 프로모터는 시스-작용 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 시스-작용 영역은 생물학적 주기 조절 요소, 지베렐린 반응 요소, 혐기성 반응 요소, 살리실산 반응 요소, AT-rich DNA 결합 단백질의 결합 부위, 에틸렌 반응 요소, 지베렐린 반응 요소, 스트레스 반응 요소, 빛 반응 요소, 열스트레스 반응 요소, 건조 유도에 작용하는 MYB 결합 부위 또는 곰팡이 유도인자 반응요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
6. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 스트레스에 반응하여 발현이 조절되는 프로모터.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 프로모터는 감귤 유래인 것을 특징으로 하는 프로모터.
8. 제 6항에 있어서,
   상기 프로모터는 열, 건조, 상처, 활성산소, 홍수, 고온, 저온, 화학물질, 빛 및 병해충으로 구성된 군에서 선택되는 스트레스에 반응하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
9. 제 6항에 있어서,
   상기 프로모터는 시스-작용 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 시스-작용 영역은 생물학적 주기 조절 요소, 지베렐린 반응 요소, 혐기성 반응 요소, 살리실산 반응 요소, AT-rich DNA 결합 단백질의 결합 부위, 에틸렌 반응 요소, 지베렐린 반응 요소, 스트레스 반응 요소, 빛 반응 요소, 열스트레스 반응 요소, 건조 유도에 작용하는 MYB 결합 부위 또는 곰팡이 유도인자 반응요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 프로모터를 함유하는 재조합 벡터.
12. 제 11항에 있어서,
    상기 벡터는 상기 프로모터의 하류에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자가 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
13. 제 11항에 있어서,
    상기 벡터는 pCRTL-Prom1, pCRTL-Prom2, pCRTL-Prom3, pCRTL-Prom4 및 pCRTL-Prom5로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
14. 제 11항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
15. 제 14항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
16. (a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터의 하류에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (b) 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환된 식물체에 식물 호르몬을 처리하여 목적 유전자의 발현을 조절하는 방법.
17. 제 16항에 있어서,
    상기 식물 호르몬은 살리실산, 에틸렌, 지베렐린, 앱시스산, 오옥신, 브라시노스테로이드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. (a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터의 하류에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (b) 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환된 식물체에 스트레스 처리하여 목적 유전자의 발현을 조절하는 방법.
19. 제 18항에 있어서,
    상기 스트레스는 열, 건조, 상처, 활성산소, 홍수, 고온, 저온, 화학물질 빛 및 병해충으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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