KR101985653B1

KR101985653B1 - 식물 호르몬 ａｂａ 유도성 최적화 프로모터 제작 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101985653B1
Application number: KR1020170120122A
Authority: KR
Inventors: 김범기; 윤인선; 권택윤; 김진애; 문석준; 민명기
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2019-06-04
Also published as: KR20190031881A

Abstract

본 발명은 식물 호르몬 유도성 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE) 및 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)가 상호결합된, 앱시스산(abscisic acid, ABA)에 의해 유도되는 벼 유래 프로모터, 상기 프로모터의 활성 측정을 위한 리포터 유전자로서 초파리 루시퍼라아제 유전자가 융합된 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터가 형질도입된 형질전환체 및 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 환경 스트레스 저항성 후보 유전자 또는 환경 스트레스 저항성 증진 후보 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE) 및 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)가 상호결합된 식물 호르몬 유도성 프로모터는 식물 원형질체(protoplast)에서 식물 호르몬인 앱시스산(abscisic acid, ABA)에 대한 반응성을 현저하게 증가시킬 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 ABA 유도성 프로모터를 이용하여 ABA와 관련된 다양한 유전자 및 화학물질 스크리닝 뿐만 아니라, 환경 재해 저항성 작물 개발에도 유용하게 활용될 수 있다.

Description

식물 호르몬 ＡＢＡ 유도성 최적화 프로모터 제작 방법 및 이의 용도{Manufacturing method of optimized promoters inducible by phytohormone abscisic acid and uses thereof}

본 발명은 식물 호르몬 유도성 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE) 및 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)가 상호결합된, 앱시스산(abscisic acid, ABA)에 의해 유도되는 벼 유래 프로모터, 상기 프로모터의 활성 측정을 위한 리포터 유전자로서 초파리 루시퍼라아제 유전자가 융합된 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터가 형질도입된 형질전환체 및 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 환경 스트레스 저항성 후보 유전자 또는 환경 스트레스 저항성 증진 후보 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

프로모터(promoter)는 구조유전자의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 유도성 프로모터에는 생물체의 발달과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화 된다.

유전자 전이(transformation)를 통한 형질전환 식물체를 개발함에 있어 상시적이면서 강한 발현을 하는 프로모터들, 예를 들어 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S(CaMV35S) 프로모터(Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985)가 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 프로모터에 연결된 특정 유전자의 상시적이고 과다한 발현(over-expression)은 생체대사에 불필요한 대량의 단백질이 주는 유독효과로 인하여 형질전환 식물체가 발아가 되지 않거나 왜소하게 되는 등의 부작용이 나타나는 경우가 많다. 대표적인 예로서, CaMV35S 프로모터를 사용하여 환경 스트레스 전사인자 유전자 DREB1A를 과발현시킨 애기장대가 저온 및 저수분 조건에 대하여 저항성을 증진되는 것은 관찰되었으나, 성장이 저해되어 왜소증(dwarfed phenotype)을 보이면서 아미노산 프롤린 및 수용성 당류의 생산이 함께 증가하는 것이 확인되었다(Lie et al., Plant Cell 10: 1391-1406, 1998; Gilmour et al., Plant Physiol. 124: 1854-1865, 2000). 이러한 부작용은 CaMV35S 프로모터 대신 환경 스트레스 관련 유전자인 rd29A의 유도성 프로모터를 사용함으로써 최소화할 수 있다(Kasuga et al., Nat. Biotechnol . 17: 287-291, 1999).

한편, 식물은 탈수, 고온, 저온 또는 염 스트레스와 같은 자연에 존재하는 다양한 유형의 환경적 스트레스에 대응하기 위한 내성 메카니즘을 보유하고 있다. 최근, 이러한 스트레스 내성 메카니즘이 분자 수준에서 규명됨에 따라서, 생명공학적 기법을 이용하여 스트레스 내성 식물이 제조되게 되었다. 예컨대, 세포가 스트레스에 노출될 때 세포에서 LEA(late-embryogenesis-abundant) 단백질과 같은 스트레스 단백질이 유도된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 보리의 LEA 단백질 또는 담배의 해독효소와 같은 유전자, 또는 삼투조절 물질(예컨대 프롤린(proline) 또는 글리신베타인(glycine betaine))에 대한 합성효소의 유전자를 숙주 식물에 도입하는 연구가 시도되어 왔다. 세포막 지질의 변형 효소인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 w-3 지방산 불포화화효소(desaturase), 남조류의 D9-불포화화효소 등을 암호화하는 유전자를 사용한 연구 또한 시도되어져 왔다. 전술한 연구에서, 유전자는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에 결합되어 식물에 도입되었다. 그러나, 형질전환 식물의 스트레스 내성도가 불안정하기도 하고, 도입 유전자의 발현 수준이 낮은 등의 문제 때문에 실용화에 이른 것은 없었다.

한편, 스트레스 내성 메카니즘은 몇 개 유전자와 복잡하게 연관되어 발견된다(Shinozaki K. et al., Plant Physiol ., 115(2): 327-334, 1997). 따라서, 전사인자를 암호화하고 그와 동시에 유전자의 발현을 활성화시키는 유전자를 구성적 프로모터에 결합시키고 식물에 도입함으로써 식물의 스트레스 내성을 향상시키는 연구도 시도되어왔다(Liu et al., The Plant Cell, 10: 1391-1406, 1998). 그러나, 몇 개의 유전자가 동시에 활성화되면, 숙주 식물의 에너지가 유전자 산물의 생합성 또는 유전자 산물에 기인한 세포 간 대사에만 집중되게 된다. 따라서, 식물 자체의 성장이 지연되거나 왜소화 된다.

아울러, 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 스트레스 응답성 엘리먼트에 결합되어 이 엘리먼트 하류 유전자의 전사를 특이적으로 활성화하는 전사인자를 코드화하는 유전자, DREB1A, EREB1B, DREB1C, DREB2A, DREB2B가 단리된 바 있다(일본 공개특허 제2000-60558호). 또한 이들 유전자를 스트레스 유도성 rd29A 프로모터에 연결하여 식물에 도입하는 것에 의해 왜소화되지 않는 스트레스 내성 식물을 작성할 수 있음이 보고된 바 있다(일본 공개특허 제2000-116260호).

그러나, 쌍자엽 식물인 애기장대 유래의 rd29A 프로모터는 단자엽 식물 중에서 작용은 하여도 그 활성이 약하다. 따라서, 단자엽 식물에서 강한 활성을 갖는 스트레스 유도성 프로모터가 요망되고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 환경 스트레스에 대한 식물의 반응 기작에서 가장 중요한 조절 인자인 앱시스산(abscisic acid, ABA) 유도성 프로모터를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE) 및 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)가 상호결합된 합성 프로모터를 제작하고, 벼 원형질체에서 상기 프로모터의 우수한 ABA 반응성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

일본 공개특허 제2000-60558호 일본 공개특허 제2000-116260호

Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985 Lie et al., Plant Cell 10: 1391-1406, 1998 Gilmour et al., Plant Physiol. 124: 1854-1865, 2000 Kasuga et al., Nat. Biotechnol. 17: 287-291, 1999 Shinozaki K. et al., Plant Physiol., 115(2): 327-334, 1997 Liu et al., The Plant Cell, 10: 1391-1406, 1998

본 발명의 목적은 식물 호르몬 유도성 프로모터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터를 구조 유전자에 기능적으로 연결시켜서 앱시스산(abscisic acid)에 의하여 구조 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물 호르몬 유도성 프로모터 및, 상기 프로모터에 융합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터 및 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물 세포를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 상기 재조합 발현 벡터 및 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물 세포에 환경 스트레스 저항성 후보 유전자를 공도입(Co-transformation)하거나, 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 후보 물질을 처리하는 단계; b) 상기 환경 스트레스 저항성 후보 유전자가 공도입되거나, 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 후보 물질이 처리된 식물세포에 환경 스트레스를 가하는 단계; 및 c) 상기 환경 스트레스가 가해진 식물세포의 원형질체를 분리하여 발현된 형광 단백질의 형광 및 레닐라 루시퍼라아제의 형광을 측정하는 단계;를 포함하는 환경 스트레스 저항성 후보 유전자 또는 환경 스트레스 저항성 증진 후보 물질 스크리닝 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 식물 호르몬 유도성 프로모터를 제공한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프로모터를 구조 유전자에 기능적으로 연결시켜서 앱시스산(abscisic acid)에 의하여 구조 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 식물 호르몬 유도성 프로모터 및, 상기 프로모터에 융합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터 및 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물 세포를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 상기 재조합 발현 벡터 및 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물 세포에 환경 스트레스 저항성 후보 유전자를 공도입(Co-transformation)하거나, 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 후보 물질을 처리하는 단계; b) 상기 환경 스트레스 저항성 후보 유전자가 공도입되거나, 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 후보 물질이 처리된 식물세포에 환경 스트레스를 가하는 단계; 및 c) 상기 환경 스트레스가 가해진 식물세포의 원형질체를 분리하여 발현된 형광 단백질의 형광 및 레닐라 루시퍼라아제의 형광을 측정하는 단계;를 포함하는 환경 스트레스 저항성 후보 유전자 또는 환경 스트레스 저항성 증진 후보 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE) 및 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)가 상호결합된 식물 호르몬 유도성 프로모터는 식물 원형질체(protoplast)에서 식물 호르몬인 앱시스산(abscisic acid, ABA)에 대한 반응성을 현저하게 증가시킬 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 ABA 유도성 프로모터를 이용하여 ABA와 관련된 다양한 유전자 및 화학물질 스크리닝 뿐만 아니라, 환경 재해 저항성 작물 개발에도 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 벼 유래 Rab16a 프로모터 염기서열 및 시스 작용 요소(cis-acting element) 위치를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 벼 유래 Rab16a 프로모터 부위별 ABA 반응성 분석을 위한 루시퍼라아제(luciferase) 결합 벡터 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 벼 유래 Rab16a 프로모터 부위별 결실(deletion) 유형(A) 및 부위별 결실(deletion) Rab16a 프로모터의 ABA에 대한 반응성(B)을 분석하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 벼 유래 Rab16a 프로모터 시스-요소(cis-element)별 결합 유형(A) 및 시스-요소(cis-element)별 Rab16a 프로모터의 ABA에 대한 반응성(B)을 분석하여 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 벼 유래 Rab16a 프로모터에 존재하는 ABRE와 DRE 시스-요소(cis-element)를 다양한 단위로 구성하여 합성한 재조합 프로모터의 ABA에 대한 반응성을 조사하여 나타낸 도이다.

본 발명은 식물 호르몬 유도성 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE) 및 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)가 상호결합된, 앱시스산(abscisic acid, ABA)에 의해 유도되는 벼 유래 프로모터, 상기 프로모터의 활성 측정을 위한 리포터 유전자로서 초파리 루시퍼라아제 유전자가 융합된 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터가 형질도입된 형질전환체 및 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 환경 스트레스 저항성 후보 유전자 또는 환경 스트레스 저항성 증진 후보 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 식물 호르몬 유도성 프로모터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "프로모터(promotor)"란 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.

본 발명의 프로모터는 식물 호르몬에 의해 유도되는 벼 유래 프로모터로, 상기 식물 호르몬(phytohormone)은 앱시스산(abscisic acid, ABA)이다. 앱시스산은 저온, 고온, 건조, 염 등의 비생물학적 환경 스트레스에 대한 식물의 반응 기작에서 가장 중요한 조절 인자로, 씨앗의 발아, 기공의 개폐, 유묘의 성장과 같은 다양한 발달 과정에도 관여하고 있다.

한편, 본 발명의 프로모터는 ABA-반응성 마커 유전자(ABA-responsive marker gene)로 알려져 있는 벼 유래 Rab16a(Loc_Os11g26790) 프로모터를 토대로 재조합한, ABA에 대한 반응성이 현저하게 증가된 합성 프로모터로, 적어도 1단위 이상의 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE) 및 적어도 2단위 이상의 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)를 포함할 수 있다.

상기 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE)는 ACGTGGC로 이루어진 염기서열을 하나의 단위로 구성되며, 상기 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)는 GCCGAC로 이루어진 염기서열을 하나의 단위로 구성된다.

상기 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE) 및 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)는 시스-작용 요소(cis-acting element)로서, 상기 시스-작용 요소는 특정 유전자의 프로모터 부위에 존재하면서 그 유전자의 발현 조절에 관여하는 염기서열을 의미하며, 자외선, 앱시스산, 저온, 건조, 염 등 다수의 비생물학적 환경 요인에 대한 발현 유도성에 주요한 역할을 하는 부위이다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 적어도 1단위 이상의 ABRE와 적어도 2단위 이상의 DRE element로 구성된 본 발명의 식물 호르몬 유도성 프로모터는 ABA에 대해 현저하게 우수한 반응성을 유도함을 확인할 수 있었다. 또한, ABRE와 DRE element 사이의 거리가 멀어지면 두 element의 상호의존적인 영향이 일어나지 않아 ABA에 대한 반응성이 감소됨을 확인하였다(도 5).

본 발명의 식물 호르몬 유도성 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 식물 호르몬 유도성 프로모터를 구조유전자에 기능적으로 연결시켜서 앱시스산(abscisic acid)에 의하여 구조유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "구조유전자"란 전사, 번역의 단계를 통하여 유전암호에 따라 단백질의 아미노산 배열을 결정하는 유전자로, 본 발명의 식물 호르몬 유도성 프로모터에 기능적으로 연결되어 유전자 발현이 조절된다. 한편, 전술한 바와 같이, 본 발명의 식물 호르몬 유도성 프로모터는 식물 호르몬인 앱시스산에 의해 유도되며, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 형광 단백질은, 이에 제한되지는 않으나, 초파리 루시퍼라아제(firefly luciferase) 일 수 있다.

본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제(α-Amy1 A) 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다.

본 발명은 나아가, 상기 재조합 발현 벡터 및 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 벡터가 공도입(co-transfection)된 형질전환 식물 세포를 제공한다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 제한되지는 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 벡터에 있어서, 상기 레닐라 루시퍼라아제는 본 발명에 따른 식물 호르몬 유도성 프로모터가 ABA에 의해 활성화되어 발현된 초파리 루시퍼라아제의 세기를 측정할 때 표준 형광 물질로서 이용된다. 형광 세기는 루미노미터를 이용하여 측정할 수 있으며, 측정된 초파리 루시퍼라아제의 형광 세기는 식물 세포에 공도입된 레닐라 루시퍼라아제의 형광의 세기로 표준화하여 정량화할 수 있다.

상기 식물 호르몬 유도성 프로모터는 전술한 바와 같이, 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 식물 호르몬 유도성 프로모터일 수 있으며, 식물 호르몬인 ABA에 의해 유도된다.

본 발명의 일실시예에서, 본 발명에 따른 식물 호르몬 유도성 프로모터 및 상기 프로모터에 융합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터와, 레닐라 루시퍼라아제 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 공도입(co-transfection)된 벼 원형질체에 ABA를 처리하고, 루시퍼라아제 어세이(luciferase assay)를 수행하여 ABA 반응성 정도를 측정한 결과, 적어도 1단위 이상의 ABRE와 적어도 2단위 이상의 DRE element로 구성된 본 발명의 식물 호르몬 유도성 프로모터는 ABA에 대해 현저하게 우수한 반응성을 유도함을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 5).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다. 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있으며, 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파와 같은 단자엽 식물일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 상기 재조합 발현 벡터 및 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물 세포에 환경 스트레스 저항성 후보 유전자를 공도입(Co-transformation)하거나, 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 후보 물질을 처리하는 단계; b) 상기 환경 스트레스 저항성 후보 유전자가 공도입되거나, 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 후보 물질이 처리된 식물세포에 환경 스트레스를 가하는 단계; 및 c) 상기 환경 스트레스가 가해진 식물세포의 원형질체를 분리하여 발현된 형광 단백질의 형광 및 레닐라 루시퍼라아제의 형광을 측정하는 단계;를 포함하는 환경 스트레스 저항성 후보 유전자 또는 환경 스트레스 저항성 증진 후보 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 a)에서 환경 스트레스 저항성 후보 유전자의 도입 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 상기 환경 스트레스 저항성 후보 유전자는 건조 스트레스, 염 스트레스 또는 저온 스트레스 등의 비생물학적 스트레스에 대한 저항성을 증진시킬 수 있는 유전자라면 어떠한 식물체 유래의 유전자 또는 인공 합성 유전자라도 무관하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 후보 물질은 건조 스트레스, 염 스트레스 또는 저온 스트레스 등의 비생물학적 스트레스에 대한 저항성을 증진시킬 수 있는 물질이라면 천연적으로 또는 합성적으로 수득되는 어떠한 화학물질이라도 사용될 수 있다.

상기 환경 스트레스는, 이에 제한되지는 않으나, 건조 스트레스, 염 스트레스 또는 저온 스트레스일 수 있다.

상기 단계 a)에서 도입된 스트레스 저항성 후보 유전자 또는 처리된 스트레스 저항성 증진 후보 물질에 의해 상기 재조합 발현 벡터 및 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물 세포의 ABA 반응성이 조절될 수 있다.

이에, 스트레스 저항성 후보 유전자가 도입되지 않은 대조군 또는 스트레스 저항성 증진 후보 물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 상기 단계 c)에서 측정되는 형광 세기로 환경 스트레스 저항성 후보 유전자 또는 스트레스 저항성 증진 후보 물질의 활성 여부를 판단할 수 있다. 예컨대, 형광 세기가 증가된 경우, 도입된 후보 유전자가 환경 스트레스 민감성 유전자인 것으로 예측할 수 있으며, 처리된 후보 물질에 의해 형광 세기가 높게 측정된 경우, ABA 유사 물질인 것으로 판단할 수 있다.

상기 형광 세기는 전술한 바와 같이, 루미노미터를 이용하여 측정할 수 있으며, 레닐라 루시퍼라아제의 형광의 세기로 표준화하여 정량화할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 식물 호르몬 유도성 프로모터 및 상기 프로모터에 융합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터와, 레닐라 루시퍼라아제 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 공도입(co-transfection)된 식물 세포 또는 식물을 환경 스트레스 저항성 유전자 또는 환경 스트레스 저항성 증진 후보 물질 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 식물 호르몬 유도성 프로모터 선정 및 분석

앱시스산(abscisic acid, ABA)은 식물 호르몬(phytohormone)의 하나로서, 환경 스트레스에 대한 식물의 반응 기작에서 가장 중요한 조절 인자이다. 앱시스산은 씨앗의 발아, 기공의 개폐, 유묘의 성장과 같은 다양한 발달 과정에도 관여하고 있다.

이에, ABA에 의한 유전자 발현 조절 메커니즘을 이해하고 벼 원형질체를 이용한 일시발현시스템(transient expression system)에서 효과적으로 적용할 수 있는 ABA 유도성 프로모터를 개발하고자, ABA-반응성 마커 유전자(ABA-responsive marker gene)로 알려져 있는 벼 유래 Rab16a 프로모터를 선정하고, 이의 구성요소들을 분석하였다.

실시예 1-1: 앱시스산 ( abscisic acid, ABA) 유도 유전자인 벼 유래 Rab16a 유전자의 프로모터 분석

벼 게놈 어노테이션 프로젝트(Rice Genome Annotation Project, http://rice.plantbiology.msu.edu/)를 이용하여 Rab16a 유전자의 프로모터 염기서열을 확인하고, 벼 게놈 DNA(genomic DNA)를 이용하여 1.6 Kb 프로모터 영역을 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 분리하였다.

분리된 Rab16a 프로모터에는, 하기 도 1에 나타난 바와 같이, 건조, 염 그리고 ABA 등에 대한 발현 유도성에 주요하게 역할을 하는 부위로 알려진 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE), 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE), Myb(myeloblastosis related proteins) 그리고 커플링 요소(coupling element, CE)들이 존재하고 있음을 확인하였다.

실시예 1-2: Rab16a 프로모터 부위별 ABA 반응성 분석

상기 실시예 1-1에서 확인된 Rab16a 프로모터에 존재하는 시스-요소(cis-element)에 대한 ABA 반응성을 분석하기 위해, 각각의 요소(element)가 포함되도록 5개의 부위로 프로모터 영역을 구분하고 분리하여 초파리-루시퍼라아제(firefly-luciferase) 발현 벡터에 구축하였다(도 2).

구체적으로, Rab16a 유전자 부위별 결실(deletion) 프로모터는 벼로부터 분리한 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 각 부위별 특이적인 프라이머(표 1)를 작성하고, 이를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 제작하였다.

PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성(denaturation) 시킨 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초~2분간의 반응시간을 주어 총 30회(cycle) 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 반응된 PCR 산물(product)들은 1.2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 확인하였고, 겔 추출 키트(gel extraction kit; Qiagen, USA)를 이용하여 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA들은 T-easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 최종적으로 확인된 DNA, 즉, Rab16a 유전자 부위별 결실(deletion) 프로모터들은 BamHI와 NcoI 제한효소 사이트를 이용하여 루시퍼라아제(Luciferase) 결합 벡터에 구축하였다(도 2의 A).

부위별 결실(deletion) 프로모터 제작 프라이머

프로모터 (promoter)	정방향(Forward, 5'-3')	서열번호	역방향(Reverse, 5'-3')	서열번호
promoter 1	GGATCCCATCCACGGCGAGCACTCATCCA	29	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGA	30
promoter 2	GGATCCCTGACCACCAGTTGAAAGGT	31	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGA	32
promoter 3	GGATCCCAGCTTGCTTATCTCTCCCAT	33	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGA	34
promoter 4	GGATCCGACCACGCTAGTGACCATGA	35	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGA	36
promoter 5	GGATCCCTGTAGAGAGGATGACCCTTGTCACC	37	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGA	38

* GGATCC: BamHI, * CCATGG: NcoI

상기 구축된 부위별 결실(deletion) 프로모터를 대상으로 벼 원형질체를 분리하여 형질전환한 뒤 ABA에 대한 반응성을 조사하였다.

구체적으로, 벼 원형질체 분리 및 형질전환은 하기와 같이 수행하였으며, 형질전환 후 루시퍼라아제 어세이(luciferase assay)를 실시하여 Rab16a 프로모터에 존재하는 시스-요소(cis-element)에 대한 ABA 반응성을 분석하였다.

우선, 벼 원형질체를 분리하고 상기 구축된 부위별 결실(deletion) 프로모터-루시퍼라아제 결합 벡터를 형질전환하기 위해, 껍질을 제거한 볍씨를 70% 에탄올과 40% 차아염소산 나트륨을 이용하여 소독을 한 후 고형 배지(1/2MS, 0.8% agar, pH5.7)가 들어있는 식물배양용기에 심고, 28℃ 배양실에서 7일간 암배양 처리하였다. 벼의 잎집(leaf sheath) 부분을 1~2㎜ 크기로 잘게 자른 후 효소 용액(enzyme solution; 1.5% cellulose R-10, 0.75% macerozyme R-10, 0.6M mannitol, 10mM MES, 0.1% BSA, 3.4mM CaCl₂, 5mM β-mecaptoethanol, pH5.7)에 4시간 처리하여 세포벽을 제거하였다.

0.45㎛ 크기의 체를 이용하여 벼의 잎집(leaf sheath)을 제거한 후 현탁액을 W5 용액(W5 solution; 0.1% glucose, 0.9% NaCl, 2mM MES, 0.08% KCl, 125mM CaCl₂, pH5.7)을 이용하여 세척(washing) 한 후 원심분리를 이용하여 원형질체를 침전시켰다. 상기 침전된 원형질체를 MaMg 용액(MaMg solution; 600mM mannitol, 15mM MgCl₂, 5mM MES, pH5.6)을 이용하여 풀어주고 최종적으로 300㎕의 원형질체를 상기 구축된 부위별 결실(deletion) 프로모터 DNA(4㎕, 초파리 루시퍼라아제(Firefly luciferase))와 내재적 대조군(internal control)으로서 UBQ10 프로모터 DNA(1㎕, 레닐라 루시퍼라아제(Renillia luciferase))와 잘 섞고 330㎕의 PEG를 이용하여 형질전환하였다.

최종적으로, 상기와 같이 Rab16a 유전자 부위별 결실(deletion) 프로모터를 제작하고, 이를 대상으로 벼 원형질체를 분리하여 형질전환한 뒤, 루시퍼라아제 어세이(luciferase assay)를 수행하여 Rab16a 프로모터에 존재하는 시스-요소(cis-element)에 대한 ABA 반응성을 분석하였다.

루시퍼라아제 활성(luciferase activity)을 검정하기 위해 Rab16a 유전자 부위별 결실(deletion) 프로모터 DNA가 형질전환된 벼 원형질체를 100㎕ 패시브 용해 버퍼(passive lysis buffer; Promega, USA)를 이용하여 현탁 및 용해하였다. 용해된 원형질체 10㎕를 Promega사의 Dual luciferase assay kit를 이용하여 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)을 조사하였다.

그 결과, 하기 도 3에 나타난 바와 같이, Promoter 1, Promoter 2, Promoter 3, Promoter 5는 ABA에 대해 현저하게 우수한 반응성을 나타내지 못한 반면, Promoter 4는 다른 프로모터에 비해 월등하게 우수한 ABA 반응성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 1-3: Rab16a 프로모터 시스 -요소(cis-element)별 ABA 반응성 분석

상기 실시예 1-2의 결과를 토대로 Rab16a 프로모터 부위에 존재하는 각각의 시스-요소(cis-element)만 있는 프로모터 영역을 루시퍼라아제(luciferase) 결합 벡터에 구축하여 ABA에 대한 반응성을 조사하였다.

구체적으로, Rab16a 프로모터 시스-요소(cis-element)별 결합 프로모터는 Rab16a 유전자 부위별 결실(deletion) 프로모터 DNA를 주형으로 하여 각 부위별 특이적인 프라이머(표 2)를 작성하고, 이를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 제작하였다.

먼저, Rab16a 미니멀(minimal) 프로모터 영역과 특정 시스-요소(cis-element)가 포함된 영역과의 연결을 위하여 1^st 프라이머와 2^st 프라이머를 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 두 PCR 산물(product)을 주형으로 다시 3^st 프라이머를 이용하여 최종적으로 두 부위가 연결된 PCR 산물을 얻었다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성(denaturation) 시킨 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 20초~1분간의 반응시간을 주어 총 30회(cycle) 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 반응된 PCR 산물(product)들은 1.2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 확인하였고, 겔 추출 키트(gel extraction kit; Qiagen, USA)를 이용하여 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA들은 T-easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 최종적으로 확인된 DNA, 즉, Rab16a 프로모터 시스-요소(cis-element)별 결합 프로모터들은 BamHI와 NcoI 제한효소 사이트를 이용하여 루시퍼라아제(Luciferase) 결합 벡터에 구축하였다.

미니멀 프로모터(Minimal promoter; TATA)와 시스-요소(cis-element) 결합 프로모터 제작 프라이머

프로모터 (promoter)		정방향(Forward, 5'-3')	서열번호	역방향(Reverse, 5'-3')	서열번호
Minimal (TATA)		GGATCCGCCACCGTCCACCGGCTCC	39	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGAA	40
Mninimal (Myb)	1st	(ATGAGTCACCACCCG)GCCACCGTCCACCGGCTCC	41	GGGCGCAACTGCAACTCCGA	42
	2st	GGATCCCTGACCACCAGTTGAAAGGT	43	(CCGGTGGACGGTGGC)CGGGTGGTGACTCATCGGG	44
	3st	GGATCCCTGACCACCAGTTGAAAGGT	45	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGAA	46
Minimal (371bp)	1st	(AGTCCCCAAGTGAAA)GCCACCGTCCACCGGCTCC	47	GGGCGCAACTGCAACTCCGA	48
	2st	GGATCCCAGCTTGCTTATCTCTCCCAT	49	(CCGGTGGACGGTGGC)TTTCACTTGGGGACTGCTATG	50
	3st	GGATCCCAGCTTGCTTATCTCTCCCAT	51	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGAA	52
Minimal (DRE)	1st	(CCTCATGTACACAAT)GCCACCGTCCACCGGCTCC	53	GGGCGCAACTGCAACTCCGA	54
	2st	GGATCCGACCACGCTAGTGACCATGA	55	(CCGGTGGACGGTGGC)ATTGTGTACATGAGGACAAGGG	56
	3st	GGATCCGACCACGCTAGTGACCATGA	57	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGAA	58
Minimal (ABRE+DRE)	1st	(CCTCATGTACACAAT)TGTCTTCGAGAAACGCCTCG	59	GGGCGCAACTGCAACTCCGA	60
	2st	GGATCCGACCACGCTAGTGACCATGA	61	(CGTTTCTCGAAGACA)ATTGTGTACATGAGGACAAGGG	62
	3st	GGATCCGACCACGCTAGTGACCATGA	63	CCATGGCCTGCTTAAGCTAAAGCTGAA	64

* GGATCC: BamHI, * CCATGG: NcoI

Rab16a 프로모터 시스-요소(cis-element)별 결합 프로모터를 루시퍼라아제(luciferase) 결합 벡터에 구축하여 ABA에 대한 반응성을 조사한 결과, 미니멀(Minimal) TATAAAT 영역에 ABRE, Myb, DRE cis-element가 단독으로 연결된 프로모터에서는 ABA에 대한 특이적인 반응을 보이지 않았다. 하지만 ABRE와 DRE cis-element를 포함하고 있는 영역이 동시에 결합된 프로모터에서는 ABRE, DRE, Myb cis-element가 단독으로 결합된 프로모터와는 달리 ABA 처리시 루시퍼라아제(luciferase)의 활성이 무처리에 비해 10배 이상 증가함을 확인하였다(도 4). 이를 통해, ABRE와 DRE cis-element는 단독으로 존재시 ABA에 대한 반응성을 유도하지 못하지만, 두 element가 동시에 결합 되었을 때 상호의존적으로 작용하여 ABA에 대한 반응성을 보임을 알 수 있었다.

실시예 2: ABRE와 DRE 시스 -요소(cis-element)를 이용한 합성 프로모터 제작 및 ABA 반응성 분석

상기 실시예 1-3의 ABRE와 DRE의 상호의존적인 영향 실험 결과를 토대로, 벼 원형질체에서 ABA에 대한 반응성을 최대화할 수 있는 프로모터를 제작하기 위해 ABRE와 DRE cis-element를 다양한 수로 조합을 하여 루시퍼라아제(luciferase) 결합 벡터에 구축하였다.

벼 원형질체를 이용하여 모든 조합의 프로모터를 대상으로 ABA에 대한 반응성을 조사한 결과, 하기 도 5에 나타난 바와 같이, ABRE(ACGTGGC) element는 수에 관계없이 단독으로 구성된 경우 ABA에 대한 반응성을 보이지 않음을 확인하였다. DRE element도 ABRE element와 마찬가지로 ABA 처리시 루시퍼라아제(luciferase)의 활성을 유도하지 못하였다. 하지만 2 단위 이상의 DRE element로 구축된 프로모터는 ABA 무처리 시에도 루시퍼라아제 활성을 유도하였는데, 이는 벼 원형질체 형질전환에 사용되는 PEG(Polyethylene glycol)의 영향으로 인한 삼투 스트레스(osmotic stress)를 유발하여 이러한 스트레스에 DRE element가 반응하여 나타난 현상으로 유추되었다.

또한, 1×, 2×, 3× ABRE와 1× DRE 조합에서도 ABA 처리시 루시퍼라아제 활성 유도는 관찰되지 않았고, ABRE의 단위 수에 관계없이 2 단위 이상의 DRE element가 ABRE element에 조합이 되었을 때만 ABA 처리시 루시퍼라아제의 활성이 유도됨을 확인하였다. 더욱이, ABRE와 DRE element 사이의 거리가 멀어지면(3× ABRE + 3× DRE 1× 스팬(span)) 두 element의 상호의존적인 영향이 일어나지 않아 ABA에 대한 반응성이 감소됨을 확인하였다(도 5).

따라서 상기 결과를 통해, 벼 유래 Rab16a 프로모터에 존재하는 ABRE와 DRE element 단독으로 구성된 프로모터는 ABA에 대한 반응성을 유도하지 못하며, 두 element가 상호 조합, 즉, ABRE와 2 단위 이상의 DRE element가 상호 조합되어 구성되어지는 것만이 ABA에 대해 현저하게 우수한 반응성을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Republic of Korea <120> Manufacturing method of optimized promoters inducible by phytohormone abscisic acid and uses thereof <130> P17R12C0425 <160> 64 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1601 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rab16a_Promoter 5 <400> 1 ctgtagagag gatgaccctt gtcaccaccg tcatgtacga ggctgctcca ccactgcctc 60 actcgccacc agcgtctccc gccgcgtgca atacaagaag aaacatcgaa cggtcatata 120 aggtaagacc cactaccgat ttaacctatc cttcccacaa tctaatccac tcatttctcc 180 tcccacgatc ttattctctc atttctcctc actatttttg catttgtagg aaacacaatg 240 acaccgtcga agaaagctgg tggagcaccg tagccagcaa tcaccaaaac acagagggga 300 ggaggtcggc agcggccatg cggacggcga cgagacaacg tgacgcaaag agggaggagg 360 acgttggcga tcatgctggt gttggcggag gaggtcactg gccacgcgga tgacagcggg 420 gcagcgcaac acaaaaaggg gggaggatgc cggcgaccac gctagtgacc atgaagcaag 480 atgatgtgaa agggaggacc ggacgagggt tggacctctg ctgccgacat gaagagcgtg 540 atgtgtagaa ggagatgtta gaccagatgc cgacgcaact agccctggca aggtcacccg 600 actgatatcg ctgcttgccc 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300 ccgtggcaat cgagctcatc tcctcgcctc ctccggctta taaatggcgg ccaccacctt 360 cacctgcttg cacaccacag caagagctaa gtgagctagc cactgatcag aagaacacct 420 cgatctccga gagttttttt tcagctttag cttaagcagg 460 <210> 25 <211> 548 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3x ABRE + 3x DRE promoter <400> 25 atgaagagcg tgatgtgtag aaggagatgt tagaccagat gccgacatga agagcgtgat 60 gtgtagaagg agatgttaga ccagatgccg acatgaagag cgtgatgtgt agaaggagat 120 gttagaccag atgccgacgc aactagccct ggcaaggtca cccgactgat atcgctgctt 180 gcccttgtcc tcatgtacac aattgtcttc gagaaacgcc tcgcccgaca ccgtacgtgg 240 ctgtacacaa ttgtcttcga gaaacgcctc gcccgacacc gtacgtggct gtacacaatt 300 gtcttcgaga aacgcctcgc ccgacaccgt acgtggcgcc accgtccacc ggctcccgca 360 cacgtctccc tgtctccctc cacccatgcc gtggcaatcg agctcatctc ctcgcctcct 420 ccggcttata aatggcggcc accaccttca cctgcttgca caccacagca agagctaagt 480 gagctagcca ctgatcagaa gaacacctcg atctccgaga gttttttttc agctttagct 540 taagcagg 548 <210> 26 <211> 538 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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ttgtcttcga gaaacgcctc gcccgacacc gtacgtggcc tgctttttta atttcatgta 240 cgtggcggac acgtccggct cctcttacgt ggcgccaccg ccgcgcctgc cgcctggaca 300 cgtccggctc ctctccacgc cgcgctggcc accgccgcgc ctgccgcctg gacacgtccg 360 gctcctctcc acgccgcgct gcgtccaccg gctcccgcac acgtctccct gtctccctcc 420 acccatgccg tggcaatcga gctcatctcc tcgcctcctc cggcttataa atggcggcca 480 ccaccttcac ctgcttgcac accacagcaa gagctaagtg agctagccac tgatcagaag 540 aacacctcga tctccgagag ttttttttca gctttagctt aagcagg 587 <210> 28 <211> 1144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3x ABRE + 3x DRE + 755bp span promoter <400> 28 gtgaccatga agcaagatgc cgacgatgtg aaagggagga ccggacgagg gttggacctc 60 tgctgccgac atgaagagcg tgatgtgtag aaggagatgt tagaccagat gccgacgcaa 120 ctagccctgg caaggtcacc cgactgatat cgctgcttgc ccttgtcctc atgtacacaa 180 ttgtcttcga gaaacgcctc gcccgacacc gcagcttgct tatctctccc atactggtcg 240 tttgtttccc gtggccgaaa tagaagaaga cagaggtagg ttttgttaga gaattttagt 300 ggtattgtag cctatttgta attttgttgt actttattga aaaaaacaat aaaggtgttt 360 cattctattt tgactcaatg ttgaatccat tgatctcttg gtgttgcact cagtatgtta 420 gaatattaca ttccgttgaa acaatcttgg ttaagggttg gaacattttt atctgttcgt 480 gaaacatccg taatattttc gttgaaacaa tttttatcga cagcaccgtc caacaattta 540 caccaatttg gaaaaatgat acatagcagt ccccaagtga aactgaccac cagttgaaag 600 gtatacaaag tgaacttatt catctaaaag accgcagaga tgggccgtgg gccgtggcct 660 gcgaaacgca gcgttcaggc ccatgagcat ttatttttta aaaaaatatt tcacaacaaa 720 aaagagaacg gataaaatcc atcgaaaaaa aaaactttcc tacgcatcct ctcctatctc 780 catccacggc gagcactcat ccaaaccgtc catccacgcg cacagtacac acacatagtt 840 atcgtctctc cccccgatga gtcaccaccc gtacgtggcc tgctttttta atttcatgta 900 cgtggcggac acgtccggct cctcttacgt ggcgccaccg tccaccggct cccgcacacg 960 tctccctgtc tccctccacc catgccgtgg caatcgagct catctcctcg cctcctccgg 1020 cttataaatg gcggccacca ccttcacctg cttgcacacc acagcaagag ctaagtgagc 1080 tagccactga tcagaagaac acctcgatct ccgagagttt tttttcagct ttagcttaag 1140 cagg 1144 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 1_F primer <400> 29 ggatcccatc cacggcgagc actcatcca 29 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 1_R primer <400> 30 ccatggcctg cttaagctaa agctga 26 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 2_F primer <400> 31 ggatccctga ccaccagttg aaaggt 26 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 2_R primer <400> 32 ccatggcctg cttaagctaa agctga 26 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 3_F primer <400> 33 ggatcccagc ttgcttatct ctcccat 27 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 3_R primer <400> 34 ccatggcctg cttaagctaa agctga 26 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 4_F primer <400> 35 ggatccgacc acgctagtga ccatga 26 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 4_R primer <400> 36 ccatggcctg cttaagctaa agctga 26 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 5_F primer <400> 37 ggatccctgt agagaggatg acccttgtca cc 32 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter 5_R primer <400> 38 ccatggcctg cttaagctaa agctga 26 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_TATA_F primer <400> 39 ggatccgcca ccgtccaccg gctcc 25 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_TATA_R primer <400> 40 ccatggcctg cttaagctaa agctgaa 27 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_Myb_1st_F primer <400> 41 atgagtcacc acccggccac cgtccaccgg ctcc 34 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_Myb_1st_R primer <400> 42 gggcgcaact gcaactccga 20 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_Myb_2st_F primer <400> 43 ggatccctga ccaccagttg aaaggt 26 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_Myb_2st_R primer <400> 44 ccggtggacg gtggccgggt ggtgactcat cggg 34 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_Myb_3st_F primer <400> 45 ggatccctga ccaccagttg aaaggt 26 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_Myb_3st_R primer <400> 46 ccatggcctg cttaagctaa agctgaa 27 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_371bp_1st_F primer <400> 47 agtccccaag tgaaagccac cgtccaccgg ctcc 34 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_371bp_1st_R primer <400> 48 gggcgcaact gcaactccga 20 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_371bp_2st_F primer <400> 49 ggatcccagc ttgcttatct ctcccat 27 <210> 50 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_371bp_2st_R primer <400> 50 ccggtggacg gtggctttca cttggggact gctatg 36 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_371bp_3st_F primer <400> 51 ggatcccagc ttgcttatct ctcccat 27 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_371bp_3st_R primer <400> 52 ccatggcctg cttaagctaa agctgaa 27 <210> 53 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_DRE_1st_F primer <400> 53 cctcatgtac acaatgccac cgtccaccgg ctcc 34 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_DRE_1st_R primer <400> 54 gggcgcaact gcaactccga 20 <210> 55 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_DRE_2st_F primer <400> 55 ggatccgacc acgctagtga ccatga 26 <210> 56 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_DRE_2st_R primer <400> 56 ccggtggacg gtggcattgt gtacatgagg acaaggg 37 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_DRE_3st_F primer <400> 57 ggatccgacc acgctagtga ccatga 26 <210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_DRE_3st_R primer <400> 58 ccatggcctg cttaagctaa agctgaa 27 <210> 59 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_ABRE + DRE_1st_F primer <400> 59 cctcatgtac acaattgtct tcgagaaacg cctcg 35 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_ABRE + DRE_1st_R primer <400> 60 gggcgcaact gcaactccga 20 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_ABRE + DRE_2st_F primer <400> 61 ggatccgacc acgctagtga ccatga 26 <210> 62 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_ABRE + DRE_2st_R primer <400> 62 cgtttctcga agacaattgt gtacatgagg acaaggg 37 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_ABRE + DRE_3st_F primer <400> 63 ggatccgacc acgctagtga ccatga 26 <210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal_ABRE + DRE_3st_R primer <400> 64 ccatggcctg cttaagctaa agctgaa 27

Claims

서열번호 10의 염기서열로 이루어지는, 식물 호르몬 유도성 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 식물 호르몬은 앱시스산(abscisic acid)인 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 벼 유래인 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 적어도 1단위의 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE) 및 적어도 2단위의 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)를 포함하는 것인 프로모터.
제4항에 있어서, 상기 앱시스산 반응성 요소(ABA-responsive element, ABRE)는 ACGTGGC로 이루어진 염기서열을 하나의 단위로 하는 것인 프로모터.
제4항에 있어서, 상기 탈수 반응성 요소(dehydration responsive element, DRE)는 GCCGAC로 이루어진 염기서열을 하나의 단위로 하는 것인 프로모터.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프로모터를 구조유전자에 기능적으로 연결시켜서 앱시스산(abscisic acid)에 의하여 구조유전자의 발현을 조절하는 방법.
서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 식물 호르몬 유도성 프로모터 및, 상기 프로모터에 융합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제8항에 있어서, 상기 형광 단백질은 초파리 루시퍼라아제(firefly luciferase)인 재조합 발현 벡터.
제8항의 재조합 발현 벡터 및 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물 세포.
제10항에 있어서, 상기 식물 세포는 원형질체(protoplast)인 식물 세포.
제10항의 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
제12항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물.
제13항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 형질전환 식물.
a) 제10항의 식물세포에 환경 스트레스 저항성 후보 유전자를 공도입(Co-transformation)하거나, 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 후보 물질을 처리하는 단계;
b) 상기 환경 스트레스 저항성 후보 유전자가 공도입되거나, 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 후보 물질이 처리된 식물세포에 환경 스트레스를 가하는 단계; 및
c) 상기 환경 스트레스가 가해진 식물세포의 원형질체를 분리하여 발현된 형광 단백질의 형광 및 레닐라 루시퍼라아제의 형광을 측정하는 단계;를 포함하는 환경 스트레스 저항성 후보 유전자 또는 환경 스트레스 저항성 증진 후보 물질 스크리닝 방법.
제15항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 건조 스트레스, 염 스트레스 또는 저온 스트레스인 방법.