DE112009001405T5

DE112009001405T5 - Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE112009001405T5
Application number: DE112009001405T
Authority: DE
Inventors: Yves Hatzfeld; Valerie Frankard; Steven Vandenabeele
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-06-26
Filing date: 2009-06-22
Publication date: 2011-07-28
Also published as: CN102131934B; US20140345002A1; AU2009264386B2; EP2975130A3; EP2975130A2; EP2304037A1; AR072386A1; US20110107464A1; CA2727310A1; MX2010013622A; CN103789343A; AU2009264386A1; BRPI0914689A2; US8779237B2; CN102131934A; WO2009156360A1

Abstract

Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, codierend für ein Root-Hairless-Polypeptid, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener pflanzenertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein RHL1 (Root Hairless 1) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein RHL1 codiert, wobei die Pflanzen verschiedene gesteigerte pflanzenertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzensamenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Transglutaminase-(TGase-)Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt zusätzlich Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenzen enthalten, bereit.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumscharakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like-(Tryptichon-)Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen. Die vorliegende Erfindung betrifft spezifischer ein Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein BZR-(BRASSINAZOLE-RESISTANT-)Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein BZR-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte für BZR-codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die diese enthalten, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenwerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantität und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Früh-Wuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Setzlinge). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Stellvertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf viele Arten gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stängelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht für eine Auswahl an diversen Genotypen wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Früh-Wuchskraft. Die Verbesserung der Früh-Wuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Früh-Wuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Früh-Wuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais-(Zea Mais L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
Der Ernteindex, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stängels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Einschränkungen auf den Ertrag wegen geringer Bestäubung aufgrund des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügendem Raum für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth) die Anwendung dieser regulierten Umgebungen zum Testen von Ertragsunterschieden begrenzen. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile bereitzustellen.
Ein weiteres wichtiges Merkmal ist das einer verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Plants 218: 1–14). Abiotische Stressfaktoren können durch Dürre, Salzgehalt, Temperaturextreme, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstigen Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen wie Futtermittel- oder Holzproduktion oder Biotreibstoff-Ressourcen ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen wie Mehl Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegt.
Ein möglicher Ansatz zur Erhöhung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
Was BZR betrifft, so kann abhängig von der Endanwendung die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen wie Futtermittel- oder Holzproduktion oder Biotreibstoff-Ressourcen ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße, einer Samenzahl erhöhten Samenzahl oder einer erhöhten Anzahl an Blütenständen.
Es ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die für ein RHL1 (Root Hairless 1) codiert, in einer Pflanze moduliert.
Weiterhin wurde jetzt gefunden, dass sich verschiedene samenertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhen lassen, indem man in einer Pflanze die Expression einer für ein Transglutaminase-(TGase-)Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz erhöht. Die erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen und erhöhtem Ernteindex.
Weiterhin wurde jetzt auch gefunden, dass sich verschiedene Wachstumscharakteristika verbessern lassen, indem man in einer Pflanze die Expression einer für ein TRY-like (Tryptichon) codierenden Nukleinsäure moduliert.
Weiterhin wurde jetzt außerdem gefunden, dass sich der Samenertrag in Pflanzen verbessern lässt, indem man in einer Pflanze die Expression einer für ein BZR-(BRASSINAZOLE-RESISTANT-)Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
Hintergrund
1. Root Hairless 1 (RHL1)
Ein RHL1-Polypeptid wurde zuerst 1998 von Schneider at al. (Genes Dev. 12, 2013–2021) als ein auf den Kern zielendes Protein beschrieben, dass für die Wurzelhaarinitiierung in Arabidopsis thaliana erforderlich ist. RHL1-Polypeptide sind im Reich der Chloroplastida ubiquitär. Ein Sequenzvergleich von aus verschiedenen Organismen stammenden RHL1 zeigt, dass RHL1-Polypeptide eine Gesamtsequenzähnlichkeit von etwa 30–80% Identität aufweisen. RHL1-Polypeptide umfassen eine Reihe putativer nukleärer Lokalisierungssignale sowie Phosphorylierungsstellen und eine PEST-Sequenz, bei der es sich um ein putatives Motiv für den proteasomabhängigen Proteinabbau handelt. Das Vorhandensein eines solchen Motivs kann, wie beschrieben wurde, durch Modulieren der subzellulären Lokalisierung von Topos und/oder ihrer Wechselwirkung mit anderen Proteinen einige Steuerfunktionen verleihen. Der C-Terminus von RHL1-Proteinen weist eine schwache, jedoch signifikante Sequenzähnlichkeit zum C-Terminus des Togo-II-alpha-Proteins von Säugetieren auf (Sugimoto-Shirasu et al. 2005 PNAS 102, 18736–17741). Eukaryotische Topo-II-Proteine gehören zur Unterklasse des Typs II Topo (Typ IIA), die benötigt wird, um replizierende doppelsträngige DNA zu entwinden. Es wurde eine physikalische Wechselwirkung zwischen einem RHL1-Polypeptid und einem Topo-VI-Protein aus Pflanzen, At TOP6B, beschrieben (Sugimoto-Shirasu et al. 2005). Es wurde nahegelegt, dass RHL1-Polypeptide in Pflanzen in einem Topo-VI Komplex während des mitotischen Zellzyklus und des Endozyklus der Pflanzenzellen aktiv sind. Arabidopsisthaliana-Pflanzen, hyp7, die Mutationen auf einem RHL1-Gen tragen, zeigen einen extremen Zwergenwuchs-Phänotyp und Defekte bei der Endoreduplikation (Sugimoto-Shirasu et al. 2005).
2. Transglutaminasen (TGasen)
Transglutaminasen (TGasen, EC 2.3.2.13; Proteinglutamin-gamma-Glutamyltransferase) bilden eine Familie von Enzymen, die eine Reihe von calcium-(Ca-)abhängigen katalytischen Wirkungen aufweisen, von denen die meisten die posttranslationale Modifikation von Proteinen betreffen. Sie katalysieren die kovalente Anbindung an Proteine und Polypeptide einer Reihe von Primäre Amingruppen enthaltenden Substanzen, d. h. sie fördern die Bildung von Amidbindungen, im Allgemeinen in einer Ca-abhängigen Weise, zwischen dem primären Amin eines Amindonorsubstrats und der y-Carbonsäureamidgruppe von peptidgebundenen endo-Glutaminresten in Proteinen oder Polypeptiden, bei denen es sich um die Aminakzeptoren handelt: Proteinglutamin + Alkylamin = Protein-N5-alkylglutamin + NH3.
Es wurde gezeigt, dass Polyamine als physiologische Substrate von TGasen dienen. Polyamine scheinen eine wesentliche Rolle bei Wachstums- und Zellteilungsprozessen in Tieren, Mikroorganismen und Pflanzen zu spielen. Eine der Rollen der Polyamine ist ihre regulierende Wirkung bei einem durch TGase vermittelten Prozess der posttranslationalen Modifizierung (Addition von Polyamingruppierungen) von Enzymen und Strukturproteinen.
TGase-Enzyme finden sich intrazellulär und extrazellulär, und sie sind in Bakterien, Tieren und Pflanzen weit verbreitet. Bei Pflanzen findet sich die TGase-Aktivität in Chloroplasten. Es wurde gezeigt, dass es sich bei Rubisco und Apoproteinen des Antennenkomplexes um Substrate der TGase-Aktivität handelt, was eine Rolle dieser Enzyme bei mit der Photosynthese in Zusammenhang stehenden Prozessen wie dem Schutz von Antennenproteinen des Photosystems nahelegt (Villalobos et al. (2004) Gene 336: 93–104).
Transgene Reispflanzen (Claparols et al. (2004) Transgenic Research 13: 195–199), die ein Gen, das für ein calciumabhängiges Transglutaminasepolypeptid aus der Prostata von Ratten codiert, unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors aus Mais exprimieren, reicherten das rekombinante Enzym in nicht aktiver Form an.
In der internationalen Patentanmeldung WO 2003/102128 werden eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Mais-TGase-Polypeptid codiert, Vektoren, Mikroorganismen und Pflanzen, die solche Nukleinsäuresequenzen enthalten, und die Verwendung von Polypeptiden mit einer solchen TGase-Aktivität in der Manipulation, Verarbeitung und Transformation von Nahrungsmitteln beschrieben.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Erhöhen der Expression einer für ein wie hier definiertes TGase-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze der Pflanze erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleihen kann.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein wie hier definiertes TGase-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze erhöht. Die erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eine oder mehrere der folgenden: erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Anzahl angefüllten Samen oder erhöhter Ernteindex.
3. Tryptichon (TRY-like)
Das Arabidopsis-Gen Tryptichon codiert für ein Protein, das, wie beschrieben wurde, die Trychom-Entwicklung negativ kontrolliert und die Wurzelhaarentwicklung positiv kontrolliert. Bei dem Trichom-Patterning in Arabidopsis handelt es sich um ein Modell für die Erzeugung eines Abstandsmusters aus ursprünglich äquivalenten Zellen. Schellmann et al. (EMBO J. 21, 5036–5046, 2002) zeigen, dass das Tryptichon-Gen, das bei der lateralen Inhibierung wirkt, für einen mit MYB verwandten Single-repeat-Transkriptionsfaktor codiert, dem eine erkennbare Aktivierungsdomäne fehlt. Es weist große Sequenzähnlichkeit mit dem Wurzelhaar-Patterning-Gen Caprice auf. Beide Gene werden in Trichomen exprimiert und wirken während der lateralen Inhibierung zusammen. Sie zeigen weiter, dass Tryptichon und Caprice bei der positionsabhängigen Bestimmung des Schicksals der Zelle redundant wirken. Somit scheint der gleiche laterale Inhibierungsmechanismus sowohl am de-novo-Patterning als auch an der positionsabhängigen Zellbestimmung beteiligt zu sein (Schellmann et al., 2002).
4. BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1)
Die Steuerung der Genexpression ist der Schlüssel zur Lebensfähigkeit aller Zellen. An der Steuerung der Gentranskription sind mehrere hundert Proteine beteiligt. Insbesondere Transkriptionsfaktoren spielen eine zentrale Rolle und wirken direkt auf Genpromotoren. In den Genomen von Pflanzen sind ungefähr 7% ihrer Codierungssequenz Transkriptionsfaktoren gewidmet (TFs; Rushton et al. 2008 Plant Physiology 147: 280–295 (2008).
Pflanzen codieren für eine bestimmte Klasse von Transkriptionsfaktoren, die BES- oder BZR-Proteine, die die Genreaktion auf Fluktuationen bei den Pflanzensteroidhormonen wie Brassinosteroiden (BRs) modulieren. BZR-Transkriptionsfaktoren (BZR-TFs) sind durch das Vorliegen einer konservierten BZR1-Repressor-Domäne gekennzeichnet, die sich typischerweise am N-Terminus des Proteins befindet und an der Bindung zum Genpromotor-Taget beteiligt sind. Pflanzen codieren typischerweise für eine kleine Anzahl an BZR-TFs. Das Arabidopsis-Genom beispielsweise enthält nur etwa 6 für BZR-TFs codierende Gene, während Tabak, eine Pflanze, bei der diese Familie von TFs expandiert ist, für 19 BZR-TFs kodiert. Alle TFs enthalten eine konservierte BZR1-Repressor-Domäne und wirken vermutlich bei der Modulierung der BR-Signalvermittlung.
Bei Arabidopsis thaliana wird die Ereigniskaskade bei der BR-Signalvermittlung bei der Bindung von BRs an den BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1(BRI1)/BKI1-Rezeptorkomplex an der Plasmamembrane, die die Freisetzung von BKI1 bewirkt, ausgelöst. Durch die anschließende Dimerisierung von BRI1 und BRI1 ASSOCIATED RECEPTOR KINASE1 (BAK1) wird ein downstream liegender Signalübertragungspfad aktiviert, der zu BRI1 EMS SUPPRESSOR1 (BES1) und BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1) führt. Die Phosphorylierung von BES1 und BZR1 durch die Kinase BIN2 scheint ihre Aktivität bei der Signalvermittlung zu steuern, indem sie auf die subzelluläre Lokalisierung und Stabilität des Proteins wirkt. Dephosphoryliertes BZR1 reichert sich in den Zellkernen an, die sich an der Stelle befinden, an der die Transkriptionsfunktion durchgeführt wird (Wang et al., 2006 Cell Res. 16: 427–434). Mechanistisch binden Transkriptionsfaktoren der BZR1-Familie direkt an den Promotor des Ziel-Gens und können wirken, indem sie eine Expression aktivieren oder unterdrücken.
Methoden zur Modulation des Brassinosteroid-Reaktionspfades zur Modifikation einer Reihe von Eigenschaften in Pflanzen wurden offenbart ( US6,921,848 ). Die wie in US6,921,848 definierten Eigenschaften schließen ein erhöhtes Wachstum und eine Verlängerung der Zellen in verschiedenen Organen und Geweben ein. Diese Effekte führten jedoch zu keiner Zunahme bei der Anzahl an Organen wie der Anzahl an produzierten Samen und/oder keiner Zunahme beim Samenertrag der Pflanze.
Kurze Darstellung der Erfindung
1. Root Hairless 1 (RHL1)
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein RHL1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein RHL1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert. Die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eine erhöhte Früh-Wuchskraft, einen erhöhten Samenertrag, eine erhöhte Anzahl an Samen und einen erhöhten Ernteindex einer Pflanze.
2. Tryptichon (TRY-like)
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein TRY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einer erhöhten Auflauf-Wuchskraft und/oder einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein TRY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert. Die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen einen erhöhten Samenertrag einschließlich des Gesamtgewichts an Samen.
3. BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1)
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Erhöhen des Pflanzensamenertrags im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
Homolog(e)
”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen über konservative Substitution sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	Konservative Substitutionen	Rest	Konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
Derivate
”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um ihren Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(e)/Paralog(e)
Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet.
Domäne
Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges fragliches Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wobei eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithographie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von T_m liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb von T_m liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
Der T_m ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Der T_m ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter dem T_m erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäure-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplices. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt der T_m um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Der T_m kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6 × log₁₀[Na⁺]^a + 0,41 × %[G/C^b] – 500 × [L^c]^–1 – 0,61 × %Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58(%G/C^b) + 11,8(%G/C^b)² – 820/L^c
3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2(I_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46(I_n)

^a

^b

^c

^d

_n

Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nichtspezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
Spleiß-Variante
Der Begriff ”Spleiß-Variante”, wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Spleiß-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Spleiß-Varianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelische Variante
Allele oder allelische Varianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine – 35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende – 10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und beim erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, geassayt werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripte bis etwa 1/100 Transkripte bis etwa 1/1000 Transkripte pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
Funktionsfähig verbunden
Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
Konstitutiver Promotor

Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele von konstitutiven Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
Actin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO2004/070039
CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Alfalfa H3-Histon	Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
kleine Rubisco-Untereinheit	US 4 962 028
OCS	Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
nos	Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Super-Promotor	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promotor
Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
Induzierbarer Promotor
Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele wurzelspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
RCc3	Plant Mol. Biol., Jan. 1995; 27(2): 237–48
Arabidopsis PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Medicago-Phosphat-Transporter	Xiao et al., 2006
Arabidopsis Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
wurzelexprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
Tabakauxin-induzierbares Gen	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988.
tabakwurzelspezifische Gene	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
B. napus G1-3b-Gen	US-Patent Nr. 5 401 836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993.
LRX1	Baumberger et al. 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 Brassica napus	US 20050044585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991.
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W. Song (1997) Doktorarbeit, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2; 1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, wobei diese Offenbarung, als ob sie vollständig dargelegt ist, hierin durch den Bezug darauf einbezogen wird. Tabelle 2c: Beispiele von samenspezifischen Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
Weizen-LMW- und HMW-Glutenin-1	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
Weizen, α-, β-, γ-Gliadine	EMBO J. 3: 1409–5, 1984
Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
Gerste B1, C, D-Hordein	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
Gerste DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998
Reis Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis a-Globulin Glb-1	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
Reis α-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis ADP-Glucose-Pyrophos-phorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
Sorghum α-Kafirin	DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblumen-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, putatives Reis 40S ribosomales Protein	WO 2004/070039
PRO0136, Reis Alanin-Aminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38,1998

Tabelle 2d: Beispiele von endospermspezifischen Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al. (1987) FERS Letts. 221: 43–47
Zein	Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
Weizen SPA	Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
Weizen Gliadine	Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
Gerste B1, C, D, Hordein	Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al. (1993) Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
Gerste DOF	Mena et al, (1998) Plant J. 116(1): 53–62
blz2	Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629–640
Reis Prolamin NRP33	Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis Globulin Glb-1	Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. (1997) Plant Molec. Biol. 33: 513–522
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157–68
Mais ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235–46
Sorghum Kafirin	DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

Tabelle 2e: Beispiele von embryospezifischen Promotoren:

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
Reis-OSH1	Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

Tabelle 2f: Beispiele von aleuronspezifischen Promotoren:

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.

Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren

Gen	Expression	Literatur-Bezugsstelle
Mais, Orthophosphat-Dikinase	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Kausch et al., 2001
Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Liu et al., 2003
Reis, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
Reis, beta-Expansin EXBP9	sprossspezifisch	WO 2004/070039
Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
Erbse RBCS3A	blattspezifisch

Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von für grünes Meristem spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren

Genquelle	Expressionsmuster	Literatur-Bezugsstelle
Reis-OSH1	Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Setzlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Reis-Metaliothionein	meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK 2	Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

Terminator
Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Modulierung
Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachstum der Pflanzen führt.
Expression
Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem genetischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N. Y. (1994).
Endogenes Gen
Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder) eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
Verringerte Expression
Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, mit zunehmender Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen. Verfahren für die Verringerung der Expression sind im Fachgebiet bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen, kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, mit zunehmender Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen hierin erörterten Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
Beispiele von verschiedenen Verfahren zur Verringerung oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze, oder zur Verminderung der Spiegel und/oder Aktivität eines Proteins, sind dem Fachmann bekannt. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder substantielle Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist.
In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines ”Inverted Repeat” einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker etc.) ist zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden, befindlich. Nach der Transkription des ”Inverted Repeat” wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten, siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stumm gemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an, für ein Polypeptid codierende genomische DNA und/oder mRNA-Transkripte, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215, 327–330) umfassen.
Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., US-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., US-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 , und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angelt und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem/einer isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzungen) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenken von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L. J., Bioassays 14, 807–15, 1992.
Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaute-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Basenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welche sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transinten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die für einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen elimiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den IoxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
Transgenisch/Transgen/Rekombinant
Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgenisch”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
(b) genetische Steuerungssequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
(c) a) und b),

US 5 565 350

WO 00/15815

Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
Transformation
Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutezutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), wobei diese Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargelegt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielsweise ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143, sowie in Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet) oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen Genet. 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol., 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungs-Tagging
T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder einen Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor gestört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom insertiert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der insertierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
TILLING
Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP, und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.), Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz, EM, Somerville, CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods on Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
Homologe Rekombination
Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84), sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; lida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertrag
Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließend sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
Früh-Wuchskraft
”Früh-Wuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieressourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Früh-Wuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besserem und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Früh-Wuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
Erhöhen/Verbessern/Steigern
Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
Samenertrag
Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der Folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; und f) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), und g) erhöhte Anzahl an Hauptrispen, was aus der gezählten Zahl gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Samenertrag kann auch zu modifizierter Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur auftreten.
Grünheits-Index
Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
Pflanze
Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, die aus der Liste ausgewählt sind, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, arissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emanginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. umfasst.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein RHL1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein RHL1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
Weiterhin wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man durch eine Erhöhung der Expression einer für ein wie hier definiertes TGase-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein TGase-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz erhöht.
Weiterhin wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein TRY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein TRY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften selektiert.
Weiterhin wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation (vorzugsweise zum Erhöhen) der Expression einer für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz erfolgt durch Einführen einer für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze und durch deren Exprimieren darin.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so stellt die Erfindung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zum Erhöhen des Samenertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert, wobei diese Modulation durch Einführen einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines von einer Pflanze gewonnenen Promotors erfolgt.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes RHL1-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches RHL1-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”RHL1-Nukleinsäure” oder ”RHL1-Gen” bezeichnet wird.
Ein wie hier definiertes ”RHL1-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, welches eine Sequenz mit, mit zunehmender Präferenz, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz eines der Polypeptide von Tabelle A1 umfasst.
Ein bevorzugtes RHL1-Polypeptid, welches sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, umfasst eine Sequenz mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz eines der Polypeptide von SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 10 und umfasst besonders bevorzugt SEQ ID NR: 2.
In RHL1-Polypeptiden finden sich verschiedene konservierte Proteinmotive. Verfahren zum Auffinden von konservierten Proteindomänen in einer Gruppe verwandter Sequenzen sind im Stand der Technik gut bekannt. In Beispiel 4 ist ein solches Verfahren, das MEME-System, für die Identifizierung konservierter Proteinmotifve in RHL1-Polypeptiden ausführlich beschrieben.
Ein weiteres bevorzugtes, für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes RHL1-Polypeptid umfasst eines oder mehrere der folgenden Motive:

(i) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 1: [IV]R[RK][KG][SG]QRK[NS][RK][FY]LFSFPGLLAP (SEQ ID NR: 29);
(ii) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 2: SGG[KR][IV]G[ED]L[KA]DL[GD]TKNP[ILV]LYLDFPQG[RQ]MKL] (SEQ ID NR: 30);
(iii) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 3: TP[VS]RQSARTAGKK[FL][KN][FY][AT]ExSS (SEQ ID NR: 31);
(iv) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 4: GTK[ED]ENPEE[LA][RK]L[DE]FPKE[LF]Q[ENQ][GD] (SEQ ID NR: 32);
(v) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 5: [SN][GN][NL]L[LQV][SR][EDG]xP[AS][KA]PR[SA][APS]LAPSK[TAG]VL[KR][HL][HQ]G[KR]D (SEQ ID NR: 33);
(vi) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 6: HA[ED][CY]DFKGGAGAA[CS]D[ES][KA]Q (SEQ ID NR: 34);
(vii) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 7: [KSN][KEP]P[GEK][EKT][KTE][VT][VT][EG][EPST][ELQ]SP[KE][IT][ED][SLV][ED][DI][DV][LS]S[ED][DE][SD][NDS][LD]K[DK] (SEQ ID NR: 35);
(viii) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 8: KG[PA]AAKKQRASP[EM][EA]K[HQ]P[TA]G[KI]K (SEQ ID NR: 36);

Alternativ dazu umfasst ein bevorzugtes, für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes RHL1-Polypeptid:

A. ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz eines oder mehrerer der folgenden Motive:

B. eines oder mehrere der folgenden Motive:

Noch weiter bevorzugte RHL1-Polypeptide, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen, sind paraloge oder orthologe Proteine eines der Polypeptide von Tabelle A.
Alternativ dazu hat das Homolog eines RHL1-Proteins, mit zunehmender Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebenen Aminosäure, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein eines der wie oben umrissenen konservierten Motive umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, verwendet wird, lieber Kluster mit einem der aus einer dikotyledonen Pflanze stammenden RHL1-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
Was TGase betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes TGase-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäuresequenz” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches TGase-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäuresequenz handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die für den im Folgenden beschriebenen Polypeptidtyp codiert, und die im Folgenden auch als ”TGase-Nukleinsäuresequenz” oder ”TGase-Gen” bezeichnet wird.
Ein wie hier definiertes ”TGase-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, welches (i) ein plastidisches Transitpeptid; (ii) mit zunehmender Präferenz 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Domäne, die wenigstens eine wie durch SEQ ID NR: 70 wiedergegebene Coiled Coil umfasst (iii) und einen Integrated relational Enzyme-Datenbankeintrag EC 2.3.2.13 als Protein-Glutamin-γ-Glutamyltransferase umfasst.
Alternativ dazu oder zusätzlich bezieht sich ein wie hier definiertes ”TGase-Polypeptid” auf eine beliebige Polypeptidsequenz mit (i) einem plastidischen Transitpeptid; (ii) mit zunehmender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem wie in SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen Polypeptid.
Alternativ dazu oder zusätzlich bezieht sich ein wie hier definiertes ”TGase-Polypeptid” auf ein beliebiges Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem wie in SEQ ID NR: 2 wiedergegebenen TGase-Polypeptid oder zu einer anderen der hier in Tabelle A angeführten Polypeptidsequenzen.
Alternativ dazu oder zusätzlich bezieht sich ein wie hier definiertes ”TGase-Polypeptid” auf eine beliebige Polypeptidsequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 1 abgebildet ist, verwendet wird, lieber Kluster mit der Klade von TGase-Polypeptiden bildet, die die durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebene Polypeptidsequenz (in 44 durch einen Pfeil gekennzeichnet; TGasen aus anderen Pflanzen sind durch eine Klammer in 1 abgegrenzt) umfassen, als mit einer der anderen Kladen.
Alternativ dazu oder zusätzlich handelt es sich bei einem ”TGase-Polypeptid” um ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität, die in einer Katalyse der Bildung von Amidbindungen, im Allgemeinen in einer Ca-abhängigen Weise, zwischen dem primären Amin eines Amindonorsubstrats und der y-Carbonsäureamidgruppe von peptidgebundenen endo-Glutaminresten in Proteinen oder Polypeptiden, bei denen es sich um die Aminakzeptoren handelt, besteht.
Im Folgenden soll jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes TRY-like-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches TRY-like-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”TRY-like-Nukleinsäure” oder ”TRY-like-Gen” bezeichnet wird.
Ein wie hier definiertes ”TRY-like-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das eine Myb-like-DNA-Bindungsdomäne (PFam-Domäne PF00249.17, SMART-Domäne SM00717, ProfileScan-Domäne PS50090, Panther PTHR10641:SF26) umfasst.
Vorzugsweise umfasst das TRY-like-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive:
wobei X an Position 6 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für I, V, L, Y, S, F, C oder T steht; und wobei X an Position 10 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für R, K, E, S, T oder N steht; und wobei X an Position 17 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für S, D, A, E, P oder T steht. Vorzugsweise handelt es sich bei Motiv 15 um EE[DT][LI][IV]XRM[HY][RKN]LVG[NED]RWX[LI]IA[GR]R[IV][PV]GR[TKEQ][AP][NEKG]E[IVQ]
wobei X an Position 6 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für Y, S, F, C oder T steht; and wobei X an Position 17 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch vorzugsweise für D, A, E, P oder T steht.
Besonders bevorzugt umfasst das TRY-like-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 2, mindestens 3 oder alle 4 Motive.
Alternativ dazu hat das Homolog eines TRY-like-Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur durch SEQ ID NR: 76 wiedergegebenen Aminosäure, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein die wie oben umrissenen konservierten Motive umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Vorzugsweise haben die Motive in einem TRY-like-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu den durch SEQ ID NR: 229 bis SEQ ID NR: 232 wiedergegebenen Motiven (Motive 12 bis 15).
Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines mit den Polypeptidsequenzen aus Tabelle A3 konstruierten phylogenetischen Baums verwendet wird, lieber Kluster mit der die durch SEQ ID NR: 76 wiedergegebene Aminosäuresequenz (At5g53200) umfassenden Gruppe von TRY-like-Polypeptiden als mit irgendeiner anderen Gruppe.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes BZR-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches BZR-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”BZR-Nukleinsäure” oder ”BZR-Gen” bezeichnet wird.
Ein wie hier definiertes ”BZR-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Transkriptionsfaktorpolypeptid, welches eine BZR1-Transkriptionsrepressordomäne (Interpro-Zugangsnummer: IPR008540) umfasst. Typischerweise enthält der N-Terminus von BZR-Polypetiden ein oder mehrere nukleäre Lokalisierungssignale und eine bHLH-like-DNA Bindungsdomäne (Yin et al. (2008) Plant Physiology 147: 280–295.
BZR-Transkriptionsfaktoren sind im Stand der Technik gut bekannt. BZR-Polypeptide gehören zu einer kleinen Familie von Proteinen pflanzlichen Ursprungs, die als an der Steuerung der Reaktion auf Brassinosteroide (BRs) beteiligte Transkriptionsmodulatoren fungieren.
Das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete BZR-Polypeptid umfasst eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zur BZR1-Transkriptionsrepressordomäne in SEQ ID NR: 238 befindlich an der Aminosäureposition (Koordinaten) 10 bis 157 in SEQ ID NR: 238 oder zu einer BZR-Transkriptionsrepressordomäne, die in einem der Polypeptide von Tabelle A4 enthalten ist.
Typischerweise haben die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten BZR-Polypeptide eine am N-Terminus des Proteins befindliche konservierte bHLH-like-Domäne; eine solche Domäne entspricht zum Beispiel der Sequenz RERRRRAIAAKIFTGLRSQGNYKLPKHCDNNEVLKALCLEAGWIVHEDGT: (SEQ ID NR: 326) befindlich in den Positionen 27 bis 76 von SEQ ID NR: 238.
Darüber hinaus kann das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete BZR-Polypeptid eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer durch SEQ ID NR: 326 wiedergegebenen bHLH-like-Domäne umfassen.
Darüber hinaus kann das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete BZR-Polypeptid auch eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen:

(i) Motiv 16: SAPVTPPLSSP (SEQ ID NR: 323), wobei 1, 2, 3 oder 4 Reste durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.
(ii) Motiv 17: VKPWEGERIHE (SEQ ID NR: 324), wobei 1, 2, 3 oder 4 Reste durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.
(iii) Motiv 18: DLELTLG (SEQ ID NR: 325), wobei 1, 2, 3 oder 4 Reste durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.

Alternativ dazu hat das Homolog eines BZR-Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 20%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur durch SEQ ID NR: 238 wiedergegebenen Aminosäure, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein die wie oben umrissene konservierte BZR-Domäne umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es existieren Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (in:) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so sind die Begriffe ”Domäne” und ”Motiv” im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es existieren Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (in:) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden. Ein Alignment der Polypeptide von Tabelle A2 hierin ist in 6 gezeigt. Solche Alignments eignen sich zum Identifizieren der zwischen den wie hier definierten TGase-Polypeptiden am meisten konservierten Domänen oder Motive. Eine solche Domäne ist eine Domäne, die wenigstens eine Coiled Coil umfasst, in 6 durch Kreuze gekennzeichnet, und wiedergegebenen durch SEQ ID NR: 70.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei Coiled Coils um für die Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Oligomerisierung, entweder von identischen Proteinen, Proteinen der gleichen Familie oder von nicht miteinander verwandten Proteinen, wichtige Domänen. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage von Coiled Coils aus Sequenzdaten gemacht. Unter den dem Fachmann gut bekannten Algorithmen stehen bei ExPASy Proteomics, gehosted vom Schweizer Institut für Bioinformatik, die Werkzeuge COILS, PAIRCOIL, PAIRCOIL2, MULTICOIL bzw. MARCOIL zur Verfügung. In Beispiel 4 und 5 sind die nummerischen beziehungsweise graphischen Ergebnisse für SEQ ID NR: 45, generiert durch Analyse mit dem COILS-Algorithmus, gezeigt. Eine eine Coiled Coil enthaltende Domäne ist in der durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen TGase-Polypeptidsequenz identifiziert und wird wie in SEQ ID NR: 70 wiedergegeben.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten. Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
Was TGase-Polypeptide betrifft, so wird hier in Beispiel 3 in Tabelle B2 die prozentuale Identität zwischen dem wie durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen TGase-Polypeptid und dem in Tabelle A2 aufgeführten TGase-Polypeptide beschrieben, die lediglich 26% Aminosäuresequenzidentität betragen kann.
Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Ist bekannt, wo sich ein Protein befindet, so hilft dies bei der Klärung seiner Funktion. Experimentelle Methoden zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunolokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Solche Methoden sind genau, wenn auch im Vergleich zu computergestützten Verfahren arbeitsintensiv. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den dem Fachmann gut bekannten Algorithmen stehen bei ExPASy Proteomics, gehosted vom Schweizer Institut für Bioinformatik, z. B. die Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM und andere zur Verfügung. Die für die Durchführung der Verfahren der Erfindung nützliche subzelluläre Lokalisierung von Polypeptiden wurde bereits in der Literatur beschrieben (Villalobos et al. (2004) Gene 336: 93–104). Insbesondere wird die SEQ ID NR: 45 der vorliegenden Erfindung dem plastidischen (chloroplastischen) Kompartiment von Pflanzenzellen zugeordnet.
Methoden zum Targeting auf Plastiden sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen den Gebrauch von Transitpeptiden ein. Tabelle 3 unten zeigt Beispiele von Transitpeptiden, mit denen sich beliebige TGase-Polypeptide zu einem Plastid führen lassen, wobei dieses TGase-Polypeptid in seiner natürlichen Form normalerweise nicht auf ein Plastid zielt, oder wobei das TGase-Polypeptid in seiner natürlichen Form aufgrund eines anderen Transitpeptids (zum Beispiel seines natürlichen Transitpeptids) auf ein Plastid zielt. Für das Klonieren einer für ein Transitpeptid codierenden Nukleinsäuresequenz upstream und in-frame einer für ein Polypeptid (zum Beispiel ein TGase-Polypeptid, dem sein eigenes Transitpeptid fehlt) codierenden Nukleinsäuresequenz bedient man sich molekularen Standardtechniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Tabelle 3: Beispiele von für das Targeting von Polypeptiden zu Plastiden geeigneten Transitpeptidsequenzen
Das TGase-Polypeptid zielt auf und wirkt in Chloroplasten, d. h., das TGase-Polypeptid ist dazu fähig, im Allgemeinen in einer Ca-abhängigen Weise die Bildung von Amidbindungen zwischen dem primären Amin eines Amindonorsubstrats und der y-Carbonsäureamidgruppe von peptidgebundenen endo-Glutaminresten in Proteinen oder Polypeptiden, bei denen es sich um Aminakzeptoren handelt, zu katalysieren (Villalobos et al. (2004) Gene 336: 93–104).
Weiterhin verfügen RHL1-Polypeptide typischerweise über eine DNA-bindende Aktivtät. Werkzeuge und Techniken zum Messen der DNA-Bindungsaktivität sind im Stand der Technik gut bekannt. Weitere Einzelheiten finden sich im Beispielteil.
Darüber hinaus liefern RHL1-Polypeptide, wenn sie wie im Beispielteil umrissen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere ausgewählt aus einer Früh-Wuchskraft, einem erhöhtem Gesamtsamengewicht pro Pflanze, einer erhöhten Anzahl an Samen, einer erhöhten Anzahl an gefüllten Samen und einem erhöhten Ernteindex.
Weiterhin verfügen TRY-like-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise über eine DNA-bindende Aktivität. Werkzeuge und Techniken zum Messen der DNA-Bindungsaktivität sind im Stand der Technik gut bekannt.
Darüber hinaus liefern TRY-like-Polypeptide, wenn sie wie im Beispielteil umrissen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einer oder mehreren ausgewählt aus einer erhöhten Auflauf-Wuchskraft, einer erhöhten Füllrate, einem erhöhten Ernteindex, einer erhöhten Gesamtanzahl an Samen, einem erhöhten Tausendkerngewichts, einer erhöhten Anzahl an ersten Rispen, einer erhöhten Anzahl an gefüllten Samen und/oder einem erhöhten Gesamtgewicht an Samen.
Weiterhin verfügen BZR-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise über eine DNA-bindende Aktivtät und gegebenfalls über eine proteinbindende Aktivität. Werkzeuge und Techniken zum Messen der DNA-Bindungsaktivität sind im Stand der Technik gut bekannt. Man kann sich zum Beispiel der EMSA-Technik bedienen, die auf der Beobachtung beruht, dass Protein:DNA-Komplexe bei einer nichtdenaturierenden Polyacrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese langsamer wandern als freie DNA-Moleküle (He et al. Science 307, 134–138 (2005)). Techniken zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen Polypeptiden sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen folgende ein: Yeast two-Hybrid, Immunausfällung oder Affinitätsaufreinigung getaggter Proteine so wie bei der TAP (Tandem Affinity Purification) Rigaut et al. Nat Biotechnol. 1999 Oct; 17(10): 1030–2, wobei diese Aufzählung nicht einschränkend ist.
Vorzugsweise verfügen für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete BZR-Polypeptide über DNA-Bindungsaktivität und binden ein DNA-Fragment mit einer Länge von vorzugsweise und mit zunehmender Präferenz mindestens 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 Nukleotiden, welches ein wie durch SEQ ID NR: 327 wiedergegebenes BRRE-Element (Brassinosteroid Response Element) und/oder ein wie durch SEQ ID NR: 328 wiedergegebenes E-Box-Element umfasst. BRRE-Elemente und E-Box-Elemente sind im Stand der Technik gut bekannt (He et al. 2005; Yin et al 2008). Vorzugsweise umfassen das BRRE-Element und das E-Box-Element eine Sequenz mit mindestens 70%, 80%, 85%, 90%, 95% Sequenzidentität zur Sequenz CGTGC(T/C)G (BRRE-Element: SEQ ID NR: 90) beziehungsweise CANNTC (E-Box: SEQ ID NR: 328). Besonders bevorzugt ist das DNA-Fragment, an das das BZR-Polypeptid bindet, ausgewählt aus den CPD-, DWF4-, UBC- und CNX5-Promotoren, wie von He el al. 2005 beschrieben.
Darüber hinaus liefern BZR-Polypeptide, wenn sie wie im Beispielteil umrissen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit einem erhöhten Samenertrag, insbesondere einer erhöhten Anzahl an gefüllten Samen.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 1 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für RHL1 codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten RHL1-Polypeptid durchführen.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so sind Beispiele von für RHL1-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren hier in Tabelle A1 von Beispiel 1 angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebenen RHL1-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hocheingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hocheingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 44 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, die für die TGase-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 45 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein TGase-Polypeptid codierenden Nukleinsäure durchführen.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so sind Beispiele von für TGase-Polypeptide codierenden Nukleinsäuresequenzen hier in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführt. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen TGase-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 44 oder SEQ ID NR: 45 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Oryza sativa-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 75 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 76 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein TRY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten TRY-like-Polypeptid durchführen.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so sind Beispiele von für TRY-like-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren hier in Tabelle A3 von Beispiel 1 angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 76 wiedergegebenen TRY-like-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 75 oder SEQ ID NR: 76 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 238 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 239 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein BRZ-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten BRZ-Polypeptid durchführen.
Was BRZ-Polypeptide betrifft, so sind Beispiele von für BRZ-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren hier in Tabelle A4 von Beispiel 1 angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 239 wiedergegebenen BRZ-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 238 oder SEQ ID NR: 239 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
Hoch eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour-joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so codieren die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten BZR-Polynukleotide vorzugsweise für ein Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz eines der Polypeptide von Tabelle A4.
Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuresequenzen, welche für Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Außerdem sind Nukleinsäuresequenzen in den Verfahren der Erfindung nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind. Weitere für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeignete Varianten sind Varianten, bei denen der Codon-Einsatz optimiert ist oder bei denen miRNA-Targetstellen entfernt sind.
Ferner zählen zu den bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die für RHL1-Polypeptide oder TGase-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide oder BZR-Polypeptide codieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuresequenzen, die für RHL1-Polypeptide oder TGase-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide oder BZR-Polypeptide codieren, hybridisieren, Spleiß-Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für RHL1-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide oder BZR-Polypeptide codieren, allelische Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für RHL1-Polypeptide oder TGase-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide oder BZR-Polypeptide codieren, sowie Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für RHL1-Polypeptide oder TGase-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide oder BZR-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleiß-Variante, allelische Variante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
Nukleinsäuren, die für RHL1-Polypeptide oder TGase-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide oder BZR-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängenukieinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit voller Länge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einem Abschnitt von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes RHL1-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 3 abgebildeten verwendet wird, lieber Kluster mit einem der aus einer dikotyledonen Pflanze stammenden RHL1-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, bilden, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
Was TGase-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes TGase-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mit zunehmender Präferenz mindestens 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt einer für eine Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen TGase-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A angeführten Polypeptidsequenzen codierenden Nukleinsäuresequenz. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 44.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes TRY-like-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
Ganz besonders bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 75. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment eines Polypeptids, das eine Myb-like-DNA-Bindungsdomäne (PFam-Domäne PF00249.17, SMART-Domäne SM00717, ProfileScan-Domäne PS50090, Panther PTHR10641:SF26) umfasst.
Was BZR-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes BZR-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 700, 800, 900 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 238. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die eine Proteindomäne mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer wie in SEQ ID NR: 326 wiedergegebenen bHLH-like-Domäne umfasst.
Eine andere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäurevariante ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codiert, oder mit einem wie hier definierten Abschnitt in der Lage ist.
Was RHL1-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 von Beispiel 1 angeführten Nukleinsäuren fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert, oder bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 von Beispiel 1 angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert, fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Nukleinsäuresequenzen fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert, oder bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert, fähige Nukleinsäuresequenz einführt und dort exprimiert.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Samenertrags in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angeführten Nukleinsäuren fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert, oder bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert, fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen für ein wie hier definiertes RHL1-Polypeptid, welches im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, welche für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, in der Lage. Ganz besonders bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, wie sie durch SEQ ID NR: 1 wiedergegeben wird, oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen für ein wie hier definiertes TGase-Polypeptid, welches im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder an ein Komplement davon oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, welche für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, oder ein Komplement davon in der Lage ist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen TGase-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A angeführten Polypeptidsequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie sie durch SEQ ID NR: 44 wiedergegeben wird, oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen für ein wie hier definiertes TRY-like-Polypeptid, welches im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an ein Komplement einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an ein Komplement einer Nukleinsäure, welche für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, in der Lage. Ganz besonders bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie sie durch SEQ ID NR: 75 wiedergegeben wird, oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen für ein wie hier definiertes BZR-Polypeptid, welches im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an ein Komplement einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an ein Komplement einer Nukleinsäure, welche für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, in der Lage. Ganz besonders bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie sie durch SEQ ID NR: 238 wiedergegeben wird, oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie die volle Länge aufweist und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, verwendet wird, lieber Kluster mit einem der aus einer dikotyledonen Pflanze stammenden RHL1-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, bilden als mit irgendeiner anderen Gruppe.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise für ein Polypeptid mit einer Myb-like-DNA-Bindungsdomäne (PFam-Domäne PF00249.17, SMART-Domäne SM00717, ProfileScan-Domäne PS50090, Panther PTHR10641:SF26).
Was BZR-Polypeptide betrifft, so umfasst die hybridisierende Sequenz vorzugsweise eine Proteindomäne oder codiert für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie die volle Länge aufweist, eine Proteindomäne mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer durch SEQ ID NR: 326 wiedergegebenen bHLH-like Domäne aufweist.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Spleiß-Variante, die für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid wie hierin oben definiert codiert, wobei eine Spleiß-Variante wie hier definiert ist.
Was RHL1-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleiß-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleiß-Variante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von samenertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleiß-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleiß-Variante von einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebene Polypeptidsequenz und beliebige der in Tabelle A2 von Beispiel 1 gezeigten Polypeptidsequenzen.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Samenertrags in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleiß-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleiß-Variante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleiß-Varianten um Spleiß-Varianten einer durch SEQ ID NR: 1 wiedergegebenen Nukleinsäure oder eine Spleiß-Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise bildet die von der Spleiß-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, lieber Kluster mit einem der aus einer dikotyledonen Pflanze stammenden RHL1-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleiß-Varianten um Spleiß-Varianten einer durch SEQ ID NR: 44 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, oder eine Spleiß-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 45 codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der Spleiß-Variante um eine Spleiß-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen TGase-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A2 angeführten Polypeptidsequenzen codiert.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleiß-Varianten um Spleiß-Varianten einer durch SEQ ID NR: 75 wiedergegebenen Nukleinsäure oder eine Spleiß-Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 76 codiert. Vorzugsweise umfasst die durch die Spleiß-Variante codierte Aminosäuresequenz eine Myb-like-DNA-Bindungsdomäne (PFam-Domäne PF00249.17, SMART-Domäne SM00717, ProfileScan-Domäne PS50090, Panther PTHR10641:SF26).
Was BZR-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleiß-Varianten um Spleiß-Varianten einer durch SEQ ID NR: 238 wiedergegebenen Nukleinsäure oder eine Spleiß-Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 239 codiert. Vorzugsweise umfasst die durch die Spleiß-Variante codierte Aminosäuresequenz eine Proteindomäne mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer durch SEQ ID NR: 326 wiedergegebenen bHLH-likeDomäne.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein wie oben definiertes RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
Was RHL1-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von samenertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von Samenerträgen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäure, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so weisen die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das RHL1-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und beliebige der in Tabelle A1 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise bildet die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, lieber Kluster mit einem der aus einer dikotyledonen Pflanze stammenden RHL1-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das TGase-Polypeptid von SEQ ID NR: 45 und eine beliebige der in Tabelle A2 von Beispiel 1 dargestellten Polypeptidsequenzen auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist. die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 44 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 45 codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen TGase-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A2 angeführten Polypeptidsequenzen.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so weisen die Polypeptide, die von allelischen Varianten codiert sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das TRY-like-Polypeptid von SEQ ID NR: 76 und eine beliebige der in Tabelle A3 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Allelische Varianten von SEQ ID NR: 76 sind zum Beispiel in Schellmann et al. (2002) beschrieben. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 75 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 76 codiert. Vorzugsweise umfasst die durch die allelische Variante codierte Aminosäuresequenz eine Myb-like-DNA-Bindungsdomäne (PFam-Domäne PF00249.17, SMART-Domäne SM00717, ProfileScan-Domäne PS50090, Panther PTHR10641:SF26).
Was BZR-Polypeptide betrifft, so weisen die Polypeptide, die von allelischen Varianten codiert sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das BZR-Polypeptid von SEQ ID NR: 239 und eine beliebige der in Tabelle A4 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 238 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 239 codiert. Vorzugsweise umfasst die durch die allelische Variante codierte Aminosäuresequenz eine Proteindomäne mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer wie in SEQ ID NR: 326 wiedergegebenen bHLH-like-Domäne.
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, welche für wie oben definierte RHL1-Polypeptide oder TGase-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide oder BZR-Polypeptide codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hier definiert ist.
Was RHL1-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Gen-Shuffling erhalten wird.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der samenertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidquenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Gen-Shuffling erhalten wird.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Samenertrags in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Gen-Shuffling erhalten wird.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so bildet die von der durch Genshuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz vorzugsweise, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, lieber Kluster mit einem der aus einer dikotyledonen Pflanze stammenden RHL1-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so codiert die durch Genshuffling erhaltene Nukleinsäurevariante vorzugsweise für eine Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen TGase-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A2 angeführten Polypeptidsequenzen.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so umfasst die von der durch Genshuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz vorzugsweise eine Myb-like-DNA-Bindungsdomäne (PFam-Domäne PF00249.17, SMART-Domäne SM00717, ProfileScan-Domäne PS50090, Panther PTHR10641:SF26).
Was BZR-Polypeptide betrifft, so umfasst die von der durch Genshuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz vorzugsweise eine Proteindomäne mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer wie in SEQ ID NR: 326 wiedergegebenen bHLH-like-Domäne.
Weiterhin lassen sich Nukleinsäurevarianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten. Zum Erzielen einer ortsgerichteten Mutagenese sind mehrere Verfahren verfügbar, wobei die üblichsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
Für RHL1-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das RHL1-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
Für TGase-Polypeptide codierende Nukleinsäurensequenzen lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das TGase-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Poacea, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Oryza sativa.
Für TRY-like-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das TRY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
Für BZR-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das BZR-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer heterologen Pflanze, mehr bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, noch mehr bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
Vorteilhafterweise stellt die vorliegende Erfindung bislang unbekannte BZR-Nukleinsäure- und -polypeptidsequenzen bereit.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, umfassend:

(i) eine durch eine der SEQ ID NR: 13, 15, 17, 19 wiedergegebene Nukleinsäure;
(ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, die/das komplementär zu einer der SEQ ID NR: 13, 15, 17, 19 ist;
(iii) eine Nukleinsäure, die für ein BZR-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu einer der SEQ ID NR: 14, 16, 18, 20 codiert;
(iv) eine Nukleinsäure, die dazu fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit einer der oben in (i), (ii) oder (iii) aufgeführten Nukleinsäuren zu hybridisieren.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, umfassend:

(i) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu einer der SEQ ID NR: 14, 16, 18, 20;
(ii) Derivate einer der in (i) aufgeführten Aminosäuresequenzen.

Was RHL1-Polypeptide betrifft, so erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einem erhöhtem Ertrag, insbesondere einem erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Früh-Wuchskraft (Auflauf-Wuchskraft) und einem erhöhten Ertrag, insbesondere einem erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Früh-Wuchskraft”, ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so soll ein Verweis auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften hier eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile im Erdboden einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so soll ein Verweis auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften hier eine Erhöhung der Früh-Wuchskraft und/oder eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile im Erdboden einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so soll ein Verweis auf einen erhöhten Samenertrag hier einen oder mehrere der folgenden Samenparameter bedeuten: eine Erhöhung des Samengewichts, der Gesamtanzahl an Samen, der Anzahl an gefüllten Samen, der Samenfüllrate, des Anteils an gefüllten Samen, der Größe der Samen, dem Volumen der geernteten Samen. Dem Fachmann wird bewusst sein, dass die oben erwähnten Samenertragsparameter in verschiedenen Einheiten ausgedrückt werden können, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, pro Rispe und/oder pro Pflanze und/oder pro Ernte. Eine Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen mit einem erhöhten Samenertrag im Vergleich zu dem Samenertrag von Kontrollpflanzen.
Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehrere der Folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der/des Ährenlänge/Durchmessers, Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der Folgenden manifestieren: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist), Erhöhung des Tausendkerngewichts.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Ertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein RHL1-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein BZR-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung einen erhöhten Ertrag und/oder erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaften und/oder einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann sich so verstehen, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Früh-Wuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden. Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven ermittelt werden, wobei es sich bei derartigen Parametern, unter anderem, um T-Mid (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 50% ihrer maximalen Größe zu erreichen) und T-90 (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 90% ihrer maximalen Größe zu erreichen) handeln kann.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid, ein BZR-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Eine Erhöhung der samenertragsbezogenen Eigenschaften tritt ungeachtet dessen, ob sich die Pflanze unter Nichtstressbedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressfaktoren ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden, auf. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressfaktoren bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das von mäßigem Stress induzierte beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressfaktoren sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressfaktoren, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressfaktoren können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen erlauben. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit.
Im Besonderen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen mit milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen Proteinen und Strukturproteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressfaktoren häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden) ergeben typischerweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer beliebigen gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
Es versteht sich, dass der Begriff ”abiotischer Stress”, wie hierin definiert, ein oder mehrere beliebige von Folgenden bedeutet: Wasserstress (wegen Dürre oder überschüssigem Wasser), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (durch heiße, kalte oder Frost-Temperaturen), Stress durch chemische Toxizität und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionischem Stress. Vorzugsweise ist der Wasserstress ein Dürrestress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um einen beliebigen Stress handeln, der unter anderem von einem oder mehreren von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ verursacht wird.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen im Vergleich zu unter vergleichbaren Stressbedingungen kultivierten Kontrollpflanzen erhöhte samenertragsbezogenen Eigenschaften aufweisen. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein TGase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress ausgewählt aus einem oder mehreren der folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, welche von den Pflanzen für das Wachstum und die Entwicklung assimiliert werden müssen. Wegen des starken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine gewaltige Menge an Düngemitteln über Feldern verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird gewöhnlicherweise von drei Hauptnährstoffen limitiert, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff, der, unter diesen dreien, gewöhnlich das geschwindigkeitslimitierende Element beim Pflanzenwachstum ist. Deshalb ist das für Pflanzenwachstum erforderliche hauptsächliche Nährstoff-Element der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, welche in lebenden Zellen angetroffen werden, einschließlich Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Chlorophyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der Pflanzen-Trockensubstanz und ungefähr 16% des gesamten Pflanzenproteins aus. Somit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein hauptsächlicher limitierender Faktor für Nutzpflanzenwachstum und -produktion (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und besitzt außerdem einen sehr großen Einfluss auf die Proteinakkumulation und Aminosäure-Zusammensetzung. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften bei Kultivierung unter stickstofflimitierenden Bedingungen von großem Interesse.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert Pflanzen, die bei Kultivierung unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit, erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise verringerter Stickstoffverfügbarkeit, kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein TGase-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verringerte Nährstoffverfügbarkeit kann aus einem Mangel oder Überschuss an Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der verringerten Nährstoffverfügbarkeit um eine verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein RHL1-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze umfasst.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften bei unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein TGase-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze umfasst.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein TRY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags bei unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein RHL1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst. Ein Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor resultieren.
Was TRY-like-Polypeptide betrifft, so liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein TRY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst. Ein Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor resultieren. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung erhält man die verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Stickstoffmangelbedingungen.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags bei unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst. Ein Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor resultieren.
Was TYR-like-Polypeptide betrifft, so liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Salzstressbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Salzstressbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein TRY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern kann sich unter anderem auch auf eine oder mehrere der folgenden Substanzen beziehen: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Salzstressbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags bei unter Salzstressbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern kann sich unter anderem auch auf eine oder mehrere der folgenden Substanzen beziehen: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen) oder Zellen, die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, das für ein wie oben definiertes RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codiert, welches funktionell mit einem in Pflanzen wirkenden Promotor verbunden ist.
Die Erfindung stellt außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von für RHL1-Polypeptide oder TGase-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide oder BZR-Polypeptide codierenden Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen bereit. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines wie hier definierten Genkonstrukts in den Verfahren der Erfindung vor.
Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:

(a) eine für ein wie oben definiertes RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codierende Nukleinsäure;
(b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben oder Erhöhen der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz wie oben definiert. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei einer der Steuerungssequenzen eines Konstrukts vorzugsweise um einen aus einem Pflanzengenom isolierten samenspezifischen Promotor. Ein Beispiel für einen samenspezifischen Promotor ist ein alpha-Globulin-Promotor, vorzugsweise ein alpha-Globulin-Promotor aus Reis, besonders bevorzugt ein durch SEQ ID NR: 72 wiedergegebenen alpha-Globulin-Promotor. Alternativ dazu handelt es sich bei einer Steuerungssequenz um einen konstitutiven Promotor, zum Beispiel einen GOS2-Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor aus Reis, ganz besonders bevorzugt eine durch SEQ ID NR: 71 wiedergegebene GOS2-Sequenz.
Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der jedwede der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, erfolgreich zu transformieren zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäuresequenz vorteilhaft ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch; vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor außerdem um einen ubiquitären Promotor. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”. Ebenfalls für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist ein wurzelspezifischer Promotor.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so kann zum Erhöhen der Expression der Nukleinsäuresequenz vorteilhaft ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren, vorzugsweise ein aus einem Pflanzengenom isolierter konstitutiver Promotor. Der konstitutive Pflanzenpromotor steuert die Expression auf einem Niveau, das in allen Fällen unter dem liegt, welches man unter der Kontrolle eines viralen 35S-CaMV-Promotors erhält. Ein Beispiel für einen solchen Promotor ist ein durch SEQ ID NR: 71 wiedergegebener GOS2-Promotor. Organ spezifische Promotoren, zum Beispiel für die bevorzugte Expression in Blättern, Stängeln, Knollen, Meristemen, eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Entwicklungsgesteuerte und induzierbare Promotoren eignen sich ebenfalls zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Vorzugsweise sind samenspezifische Promotoren besonders für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
Was TYR-like-Polypeptide betrifft, so kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäure sequenz vorteilhaft ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch; vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor um einen ubiquitären konstitutiven Promotor mittlerer Stärke. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”. Ebenfalls für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist ein wurzelspezifischer Promotor.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäuresequenz vorteilhaft ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch; vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor ebenfalls um einen ubiquitären Promotor mittlerer Stärke. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die durch SEQ ID NR: 1 wiedergegebene, für das RHL1-Polypeptid codierende Nukleinsäure beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das RHL1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors beschränkt.
Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich bevorzugt um einen Promotor mittlerer Stärke wie einen GOS2-Promotor; vorzugsweise handelt es sich bei dem Promotor um einen GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 39 ähnelt; ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 39 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier in Tabelle 2 im Abschnitt ”Definitionen”.
Gemäß einem anderen bevorzugten Merkmal der Erfindung ist die für ein Polypeptid codierende Nukleinsäure funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor verbunden. Bei dem wurzelspezifischen Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen RCc3-Promotor (Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48), besonders bevorzugt stammt der RCc3-Promotor aus Reis, noch mehr bevorzugt wird der RCc3-Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 43 ähnelt; ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 43 wiedergegeben. Beispiele weiterer wurzelspezifischer Promotoren, die sich ebenfalls zur Durchführung der Verfahren der Erfindung einsetzen lassen, sind oben in Tabelle 3 im Abschitt ”Definitions” gezeigt.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebene, für das TGase-Polypeptid codierende Nukleinsäure beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das TGase-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors beschränkt.
Was TYR-like-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die durch SEQ ID NR: 75 wiedergegebene, für das TRY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das TYR-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors beschränkt.
Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke, besonders bevorzugt aus einer Pflanze, wie einen GOS2-Promotor; besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch ein Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 237 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 237 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
Gemäß einem anderen bevorzugten Merkmal der Erfindung ist die für ein TRY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor verbunden. Bei dem wurzelspezifischen Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen RCc3-Promotor (Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48), besonders bevorzugt stammt der RCc3-Promotor aus Reis, noch mehr bevorzugt wird der RCc3-Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz Wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 235 ähnelt; ganz besonders bevorzugt wird der Promotor durch SEQ ID NR: 235 wiedergegeben. Beispiele weiterer wurzelspezifischer Promotoren, die sich ebenfalls zur Durchführung der Verfahren der Erfindung einsetzen lassen, sind oben in Tabelle 2 im Abschitt ”Definitionen” gezeigt.
Was TYR-like-Polypeptide betrifft, so können gegebenenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die im Wesentlichen SEQ ID NR 236 ähnelt oder damit identisch ist und die den RCc3-Promotor und die für das TRY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure enthält, oder eine Expressionskassette, in welcher die für das TRY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure funktionsfähig mit einem Reis-GOS2-Promotor verbunden ist, welcher im Wesentlichen SEQ ID NR: 237 ähnelt.
Was BZR-Polypeptide betriff, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die durch SEQ ID NR: 238 wiedergegebene, für das BZR-Polypeptid codierende Nukleinsäure beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke, besonders bevorzugt aus einer Pflanze, wie einen GOS2-Promotor; besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch ein Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 322 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 322 wiedergegeben. Weitere Beispiele für aus Pflanzen stammende und konstitutive Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”. Ein aus Pflanzen stammender Promotor ist vorzugsweise pflanzlichen Ursprungs. Der aus Pflanzen stammende Promotor lässt sich nach einem der im Stand der Technik gut bekannten Verfahren aus einer Pflanze isolieren oder kann durch andere Methoden wie eine chemische Synthese unter Anwendung eines der im Stand der Technik gut bekannten Verfahren erhalten werden. Der aus Pflanzen stammende Promotor hat vorzugsweise im Wesentlichen das gleiche Expressionsmuster und die gleiche Expressionstärke wie ein Pflanzenpromotor pflanzlichen Ursprungs. Sequenz und Elementstruktur des aus Pflanzen stammenden Promotors sind im Wesentlichen der eines Promotors pflanzlichen Ursprungs ähnlich. Vorzugsweise umfasst der aus Pflanzen stammende Promotor eine Sequenz mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem Promotor pflanzlichen Ursprungs.
Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Zusätzliche Steuerungselemente können Transkriptions- sowie Translationsverstärker einschließen. Dem Fachmann werden für eine Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignete Terminator- und Verstärkersequenzen bekannt sein. Zur Erhöhung der Menge an reifer Nachricht, die sich im Zytosol anreichert, kann man in der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der Codierungssequenz außerdem eine Intronsequenz einfügen, wie im Definitionsabschnitt beschrieben. Bei anderen Kontrollsequenzen (neben Promotor, Verstärker, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) kann es sich um Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente handeln. Solche Sequenzen sollten dem Fachmann bekannt sein oder sollten sich von diesem leicht in Erfahrung bringen lassen.
Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die für einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
Was RHL1-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide betrifft, so stellt die Erfindung auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression einer beliebigen für ein RHL1-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure, wie hierin oben definiert, in einer Pflanze umfasst.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so stellt die Erfindung auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression einer beliebigen für ein TGase-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz, wie hierin oben definiert, in einer Pflanze umfasst.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so stellt die Erfindung auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression einer beliebigen für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure, wie hierin oben definiert, in einer Pflanze umfasst.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so stellt die vorliegende Erfindung genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäure, die für ein RHL1-Polypeptid codiert; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines RHL1-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so stellt die vorliegende Erfindung genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäure, die für ein TGase-Polypeptid codiert; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteil bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines TGase-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Was TYR-like-Polypeptide betrifft, so stellt die vorliegende Erfindung genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhtem Samenertrag, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like Polypeptid codiert; und,
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und entwicklung fördern.

Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines TRY-like-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so stellt die vorliegende Erfindung genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäure, die für ein BZR-Polypeptid codiert; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines BZR-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Die Nukleinsäuresequenz kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlich exprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem dem von Interesse co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepropft wird) sein.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten, welche für ein TGase-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuresequenzen oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei diese erntefähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für ein BZR-Polypeptid kodiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Was RHL1-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide betrifft, so wird, wie oben erwähnt, ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein RHL1-Polypeptid codiert, durchgeführt, indem man eine für ein RHL1-Polypeptid bzw. ein TRY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze einbringt und dort exprimiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so wird, wie oben erwähnt, ein bevorzugtes Verfahren zur Steigerung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid codiert, durchgeführt, indem man eine für ein TGase-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze einbringt und dort exprimiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von samenertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so wird, wie oben erwähnt, ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein BZR-Polypeptid codiert, durchgeführt, indem man eine für ein BZR-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze einbringt und dort exprimiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von Samenertrag, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die für RHL1-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser RHL1-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
Ferner umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die für TGase-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser TGase-Polypeptide bei der Erhöhung beliebiger der zuvor erwähnten samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stress-Wachstumsbedingungen) und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung weiterhin auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die für TRY-like-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser TRY-like-Polypeptide bei der Verstärkung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die für BZR-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser BZR-Polypeptide bei der Erhöhung beliebiger der zuvor erwähnten Samenertragsparameter in Pflanzen.
Was RHL1-Polypeptide betrifft, so können die hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, die für ein RHL1-Polypeptid codieren, oder die RHL1-Polypeptide selbst Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein für ein für RHL1-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuresequenzen/-gene oder die RHL1-Polypeptide selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
Was TGase-Polypeptide betrifft, so können die hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, die für ein TGase-Polypeptid codieren, oder die TGase-Polypeptide selbst Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein für ein für TGase-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Gen-/Nukleinsäuresequenzen oder die TGase-Polypeptide selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
Was TYR-like-Polypeptide betrifft, so können die hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, die für ein TRY-like-Polypeptid codieren, oder die TRY-like-Polypeptide selbst Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein für ein für TRY-like-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuresequenzen/-gene oder die TRY-like-Polypeptide selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
Was BZR-Polypeptide betrifft, so können die hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, die für ein BZR-Polypeptid codieren, oder die BZR-Polypeptide selbst Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein für ein für BZR-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuresequenzen/-gene oder die BZR-Polypeptide selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
Allelische Varianten einer/eines für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure/Gens können ebenfalls Anwendung in markerunterstützten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten mit unabsichtlich verursachtem sogenanntem ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
Nukleinsäuresequenzen, die für RHL1-Polypeptide oder TGase-Polypeptide oder TRY-like-Polypeptide oder BZR-Polypeptide codieren, können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine derartige Verwendung von für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenzen erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenzen können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook. J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenzen sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der für ein RHL1-Polypeptid oder ein TGase-Polypeptid oder ein TRY-like-Polypeptid oder ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Anwendung von pflanzengenabgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41, beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Intercross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die Nukleinsäuresequenz-Sonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al., in: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenzsonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
Eine Vielzahl von auf Nukleinsäuresequenz-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäuresequenz verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressfaktoren, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
Weiterhin führen die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressfaktoren, Toleranz gegen Herbizide, Insektizide, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
Noch weiter führen die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressfaktoren, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
Punkte

1. Ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, codierend für ein Root-Hairless-Polypeptid, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das Root-Hairless-Polypeptid eine oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
wobei es sich bei den Aminosäuren in den Klammern um alternative Aminosäuren in dieser Position handelt und wobei mit zunehmender Präferenz 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Aminosäuren durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise durch eine konservative Aminosäure, ersetzt sind.
3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, für ein beliebiges der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure oder dem Komplement davon in der Lage ist.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Kultivierungsbedingungen mit Stickstoffmangel erhalten werden.
8. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
10. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die bzw. der durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, umfasst.
11. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, wie in den Punkten 1, 2 oder 3 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
12. Konstrukt gemäß Punkt 11, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
13. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 11 oder 12 transformiert ist.
15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (a) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (b) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (c) Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
16. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondererhöhter Biomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
17. Transgene Pflanze gemäß Punkt 10, 14 oder 16 oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist.
18. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
19. Produkte, gewonnen aus einer Pflanze gemäß Punkt 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 18.
20. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Spross- und/oder Biomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
21. Verfahren zur Erhöhung samenertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Transglutaminase-(TGase-)Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst, wobei das TGase-Polypeptid (i) ein plastidisches Transitpeptid; (ii) mit zunehmender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Domäne, welche mindestens eine Coiled Coil, wie sie durch SEQ ID NR: 27 wiedergegeben wird; (iii) und ein Integrated relational Enzyme-Datenbankeintrag EC 2.3.2.13 für Protein-Glutamin-γ-Glutamyltransferase aufweist.
22. Verfahren gemäß Punkt 21, wobei das TGase-Polypeptid (i) ein plastidisches Transitpeptid; (ii) mit zunehmender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem wie in SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen Polypeptid aufweist.
23. Verfahren gemäß Punkt 21 oder 22, wobei das TGase-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem wie in SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen TGase-Polypeptid oder einer der Polypeptidsequenzen, die in der Tabelle A2 hierin angegeben sind, aufweist.
24. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 23, wobei es sich bei dem TGase-Polypeptid um eine Polypeptidsequenz handelt, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen TGase-Baums, wie demjenigen, der in 5 abgebildet ist, verwendet wird, lieber Kluster mit der Klade von TGase-Polypeptiden bildet, die die durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebene Polypeptidsequenz umfassen, als mit einer der anderen Kladen.
25. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 24, wobei es sich bei dem TGase-Polypeptid um ein Polypeptid mit enzymatischer Wirkung handelt, die darin besteht, dass sie die Bildung von Amidbindungen, im Allgemeinen in einer Ca-abhängigen Weise, zwischen dem primären Amin eines Amindonorsubstrats und der y-Carbonsäureamidgruppe von peptidgebundenen endo-Glutaminresten in Proteinen oder Polypeptiden, bei denen es sich um die Aminakzeptoren handelt, katalysiert.
26. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 25, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid codiert, durch eine der in Tabelle A angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID-NRn oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer der in Tabelle A2 angegebenen Nukleinsäuresequenzen-SEQ ID-NRn in der Lage ist, oder ein Komplement repräsentiert wird.
27. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 26, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A2 angegebenen Polypeptidsequenz-SEQ ID-NRn codiert.
28. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 27, wobei die erhöhte Expression durch ein oder mehrere aus: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination, bewirkt wird.
29. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 28, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein TGAse-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
30. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 29, wobei die erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaft eines oder mehrere ist von: erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen oder erhöhtem Ernteindex.
31. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 30, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor verbunden ist.
32. Verfahren gemäß Punkt 31, wobei es sich bei dem samenspezifischen Promotor um einen alpha-Globulin-Promotor, vorzugsweise einen alpha-Globulin-Promotor aus Reis, besonders bevorzugt einen durch SEQ ID NR: 72 wiedergegebenen alpha-Globulin-Promotor handelt.
33. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 32, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid codiert, aus einer Pflanze, bevorzugt aus einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae stammt und die Nukleinsäuresequenz ganz besonders bevorzugt aus Oryza sativa stammt.
34. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 33, wobei die Pflanze bzw. der Teil oder die Zelle davon ein isoliertes Nukleinsäuretransgen umfasst, das für ein TGase-Polypeptid codiert.
35. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 21 bis 27 definiert; (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
36. Konstrukt gemäß Punkt 35, wobei die Steuerungssequenz ein samenspezifischer Promotor ist.
37. Konstrukt gemäß Punkt 36, wobei es sich bei dem samenspezifischen Promotor um einen alpha-Globulin-Promotor, vorzugsweise einen alpha-Globulin-Promotor aus Reis, besonders bevorzugt einen durch SEQ ID NR: 72 wiedergegebenen alpha-Globulin-Promotor handelt.
38. Verwendung eines Konstrukts gemäß einem der Punkte 35 bis 37 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften eine oder mehrere sind von: erhöhtem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen und erhöhtem Ernteindex.
39. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß einem der Punkte 35 bis 37 transformiert ist.
40. Verfahren für die Produktion von transgenen Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 bis 7 definiert, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern
41. Transgene Pflanze mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche aus der erhöhten Expression einer isolierten Nukleinsäuresequenz resultieren, die für ein TGase-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 21 bis 27 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, welche(r) aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
42. Transgene Pflanze gemäß Punkt 34, 39 oder 41, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
43. Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid codiert, von einer Pflanze gemäß Punkt 42, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
44. Produkte, gewonnen aus einer Pflanze gemäß Punkt 42 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 43.
45. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 21 bis 27 definiert, bei der Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften, welche eines oder mehrere von: erhöhtem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen und erhöhtem Ernteindex umfassen.
46. Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like-Polypeptid codiert, wobei das TRY-like-Polypeptid eine Myb-like-DNA-Bindungsdomäne (Panther PTHR10641:SF26; Gene3D G3DSA:1.10.10.60) umfasst.
47. Verfahren gemäß Punkt 46, wobei das TRY-like-Polypeptid ein oder mehrere der Motive 12 bis 15 (SEQ ID NR: 229 bis SEQ ID NR: 232) umfasst.
Verfahren gemäß Punkt 46 oder 47, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
49. Verfahren gemäß einem der Punkte 46 bis 48, wobei die für ein TRY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A3 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
50. Verfahren gemäß einem der Punkte 46 bis 49, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A3 angegebenen Proteine codiert.
51. Verfahren gemäß einem der Punkte 46 bis 50, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhte Auflauf-Wuchskraft und/oder erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
52. Verfahren gemäß einem der Punkte 46 bis 51, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nichtstressbedingungen und/oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
53. Verfahren gemäß einem der Punkte 48 bis 52, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor, vorzugsweise einem RCc3-Promotor, ganz besonders bevorzugt einem RCc3-Promotor aus Reis, verbunden ist, oder wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
54. Verfahren gemäß einem der Punkte 46 bis 53, wobei die für ein TRY-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
55. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 46 bis 48, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein TRY-like-Polypeptid codiert, umfasst.
56. Konstrukt, umfassend: (a) Nukleinsäure, die für ein TRY-like-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
57. Konstrukt gemäß Punkt 56, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein RCc3-Promotor, ganz besonders bevorzugt ein RCc3-Promotor aus Reis, ist, oder wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein RCc3-Promotor, ganz besonders bevorzugt ein RCc3-Promotor aus Reis, ist.
58. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 56 oder 57 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Auflauf-Wuchskraft und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
59. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 56 oder 57 transformiert ist.
60. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Auflauf-Wuchskraft und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
61. Transgene Pflanze mit erhöhter Auflauf-Wuchskraft und/oder erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche auf die modulierte Expression einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like-Polypeptid codiert, wie in Punkt 46 oder 47 definiert, zurückzuführen sind, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
62. Transgene Pflanze gemäß Punkt 55, 59 oder 61, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
63. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 62, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
64. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 62 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 63 abgeleitet sind.
65. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung der Auflauf-Wuchskraft und/oder der Erhöhung der Ausbeute in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
66. Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein BZR, BRASSINAZOLE-RESISTANT-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, und gegebenenfalls eine Auswahl auf Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag umfasst.
67. Verfahren gemäß Punkt 66, wobei das BZR-Polypeptid Folgendes umfasst: (i) eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der zwischen den Aminosäurekoordinaten 10–157 in SEQ ID NR: 239 befindlichen Domäne und/oder (ii) eine Domäne mit, mitzunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer wie durch SEQ ID NR: 326 wiedergegebenen bHLH-like-Domäne und/oder (iii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz einer der Polypeptide von Tabelle A4; und/oder (iv) ein wie durch eine der SEQ ID NR: 323, SEQ ID NR: 324, SEQ ID NR: 325 wiedergegebenes Motiv, wobei 1, 2, 3 oder 4 Reste durch eine beliebige Aminosäure ersetzt sein können.
68. Verfahren gemäß Punkt 66 oder 67, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein BZR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
69. Verfahren gemäß einem der Punkte 66 bis 68, wobei die Nukleinsäure, die für ein BZR-Polypeptid codiert, für ein beliebiges der in Tabelle A4 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
70. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A4 angegebenen Proteine codiert.
71. Verfahren gemäß einem der Punkte 66 bis 70, wobei der erhöhte Samenertrag ausgewählt ist aus dem Gesamtgewicht an Samen, der Anzahl gefüllter Samen und dem Tausendkerngewicht.
72. Verfahren gemäß einem der Punkte 66 bis 71, wobei der erhöhte Samenertrag unter Nichtstressbedingungen erhalten wird.
73. Verfahren gemäß einem der Punkte 68 bis 72, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem aus einer Pflanze abgeleiteten konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am meisten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
74. Verfahren gemäß einem der Punkte 66 bis 73, wobei die Nukleinsäure, die für ein BZR-Polypeptid codiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am meisten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
75. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die bzw. der durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 66 bis 74 erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein BZR-Polypeptid codiert, umfasst.
76. isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein beliebiges der folgenden Merkmale: (i) eine durch eine von SEQ ID NR: 250, 252, 254, 256 wiedergegebene Nukleinsäure; (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, die/das komplementär zu einem von SEQ ID NR: 250, 252, 254, 256 ist; (iii) eine für ein BZR-Polypeptid codierende Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu einer von SEQ ID NR: 252, 254, 256, 258; (iv) eine Nukleinsäure, die dazu fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit einer der oben in (i), (ii) oder (iii) angeführten Nukleinsäuren zu hybridisieren.
77. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (i) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu einer von SEQ ID NR: 252, 254, 256, 258; und/oder (ii) Derivate einer der in (i) angeführten Aminosäuresequenzen.
78. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, codierend für ein BZR-Polypeptid, wie in einem der Punkte 66, 67 oder 77 definiert, oder eine Nukleinsäure gemäß Punkt 76; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz
79. Konstrukt gemäß Punkt 78, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
80. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 13 oder 14 in einem Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
81. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 78 oder 79 transformiert ist.
82. Verfahren für die Produktion von transgenen Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer für ein wie unter Punkt 66, 67 oder 77 definiertes BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einer Nukleinsäure gemäß Punkt 11 in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) Auswahl auf Pflanzen mit Samenertrag.
83. Transgene Pflanze mit erhöhtem Samenertrag als Resultat der modulierten Expression einer für ein wie unter Punkt 66, 67 oder 77 definiertes BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder aus dieser transgenen Pflanze gewonnene transgene Pflanzenzelle.
84. Transgene Pflanze gemäß Punkt 75, 81 oder 83 oder daraus gewonnene transgene Pflanzenzelle, wobei es sich bei der Pflanze um eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer handelt.
85. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 84, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
86. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 85 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 85 abgeleitet sind.
87. Verwendung einer für ein BZR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure zum Erhöhen des Samenertrags im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
1 die Sequenz von SEQ ID NR: 2 mit konservierten putativen Signalen für die nukleäre Lokalisierung zeigt.
2 multiple Alignments des RHL1-Polypeptids zeigt.
3 phylogenetische Bäume des RHL1-Polypeptids zeigt.
4 den binären Vektor für eine erhöhte Expression einer für RHL1 codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa zeigt.
5 einen phylogenetischen Baum von TGase-Polypeptiden aus verschiedenen Ursprungsorganismen nach Villalobos et al. (2004; Gene 336: 93–104) zeigt. TGasen, die sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung eignen (im Wesentlichen aus Pflanzen), sind mit einer Klammer gezeigt, die Klade ist mit einem Kreis geteilt, der Pfeil zeigt auf das durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebene TGase-Polypeptid aus Oryza sativa.
6 die graphische Ausgabe des COILS-Algorithmus, der mindestens eine Coiled-Coil-Domäne im durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen Polypeptid vorhersagt, zeigt. Die X-Achse repräsentiert die Aminosäurerest-Koordinaten, die Y-Achse die Wahrscheinlichkeit (im Bereich von 0 bis 1), dass eine Coiled-Coil-Domäne vorhanden ist, und die drei Linien die drei untersuchten Fenster (14, 21, 28).
7 ein AlignX (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation)-Mehrfach-Sequenzalignment der TGase-Polypeptide von Tabelle A2. Das N-terminale plastidische Transitpeptid ist vom restlichen Polypeptid (reifes Polypeptid) durch einen senkrechten Strich getrennt. Die putative calciumbindende Region ist eingerahmt und unter der Konsensussequenz mit Kreuzen markiert. Die Domäne, für die mit dem Coils-Algorithmus wenigstens eine Coiled Coil vorhergesagt wurde (und die durch SEQ ID NR: 70 wiedergegebenen wird), ist unter der Konsensussequenz mit Kreuzen markiert.
8 den binären Vektor für erhöhte Expression einer für ein TGase-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle eines in Pflanzen wirkenden Promotors in Oryza sativa-Pflanzen zeigt.
9 die Sequenz von SEQ ID NR: 76 mit konservierten Motiven oder Domänen zeigt: die Myb-like-DNA-Bindungsdomäne, identifiziert mit HMMPfam (PF00249.17), ist fett gezeigt, die durch Motiv 12 abgedeckte Sequenz ist unterstrichen.
10 ein multiples Alignment von verschiedenen TRY-like-Polypeptidsequenzen zeigt. Ein Punkt kennzeichnet konservierte Reste, ein Doppelpunkt kennzeichnet hochkonservierte Reste und ein Sternchen steht für perfekt konservierte Reste. Den höchsten Grad an Sequenzkonservierung findet man in der Region der DNA-Bindungsdomäne.
11 den binären Vektor für erhöhte Expression einer für TRY-like codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-RCc3-Promotors (pRCc3) in Oryza sativa zeigt.
12 ein multiples Alignment von BZR-Polypeptiden zeigt.
13 den binären Vektor für erhöhte Expression einer für BZR codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa zeigt.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche alleinig der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
Beispiel 1: Identifizieren von Sequenzen, die mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
1.1. Root Hairless 1 (RHL1)
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das durch die in der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.

In Tabelle A1 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A1: Beispiele für RHL1-Nukleinsäuren und -Polypeptide:

Name	Ursprungsorganismus	Nukleinsäure-SEQ ID NR:	Protein-SEQ ID NR:
A. thaliana_AT1G48380.1 (Arath_RHL1)	Arabidopsis thaliana	1	2
p. trichocarpa_scaff_44.278	Populus trichocarpa	3	4
p. trichocarpa_scaff_184.3	Populus trichocarpa	5	6
p. trichocarpa_scaff_IV.277	Populus trichocarpa	7	8
O. sativa_Os07g07580 (Orysa_RHL1)	Oryza sativa	9	10
O. sativa_Os06g51380	Oryza sativa	11	12
Z. mays_TA180670	Zea mays	13	14
A. formosa_TA10038	Aquilegia formosa	15	16
M. domestica TA43921	Malus domestica	17	18
P. patens_74926	Physcomitrella patens	19	20
P. patens_173149	Physcomitrella patens	21	22
S. tuberosum TA36268	Solanum tuberosum	23	24
V. shuttleworthii TA2694	Vitis shuttleworthii	25	26
V. vinifera GSVIVT00027050001	Vitis vinifera	27	28

In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen wie The Institute for Genomic Research (TIGR) provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren.
1.2. Transglutaminasen (TGasen)
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das durch die in der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.

In Tabelle A2 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A2: Beispiele für TGase-Polypeptidsequenzen und codierende Nukleinsäuresequenzen:

Name	Ursprungsorganismus	Öffentl. Datenbanks-Zugangsnummer	Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR:	Polypeptidsequenz SEQ ID. NR:
Orysa_TGase	Oryza sativa	-	44	45
Arath_TGase	Arabidopsis thaliana	NM_105387	46	47
Horvu_TGase	Hordeum vulgare	AK251411	48	49
Lyces_TGase	Lycopersicon esculentum	BT012898	50	51
Orysa_TGase II	Oryza sativa	NM_001052696	52	53
Picsi_TGAse	Picea sitchensis	EF087701	54	55
Poptr_TGase	Populus tremuloides	TA16744_3694	56	57
Sacof_TGase	Saccharum officinarum	CA246119 CA254082 CA265940	58	59
Sorbi_TGase	Sorghum bicolor	CL187991 ER757182.1 CW291038	60	61
Zeama_TGase II	Zea mays	DT641696.1, DV540831.1	62	63
Zeama_TGase III	Zea mays	-	64	65
Zeama_tgz15	Zea mays	AJ421525	66	67
Zeama_tgz21	Zea mays	AJ488103	68	69

In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”.
1.3. Tryptichon (TRY-like)
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das durch die in der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.

In Tabelle A3 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A3: Beispiele für TRY-like-Polypeptide:

Name	Nukleinsäure-SEQ ID NR:	Polypeptid-SEQ ID NR:
At5g53200	75	76
A. capillaris_DV853805	77	78
A. capillaris_DV859458	79	80
A. hypogaea_CD038483	81	82
A. sativa_CN818591	83	84
A. thaliana_At1g01380_CPC-like_ETC1	85	86
A. thaliana_At1g09710_CPC-like_NA	87	88
A. thaliana_At1g18960_CPC-like_NA	89	90
A. thaliana_At1g58220_CPC-like_NA	91	92
A. thaliana_At1g71030_CPC-like_ATMYBL2	93	94
A. thaliana_At2g30420_CPC-like_NA	95	96
A. thaliana_At2g46410_CPC-like_CPC	97	98
A. thaliana_At4g01060_CPC-like_ETC3	99	100
B. gymnorrhiza_TA2541_39984	101	102
B. napus_CD843377	103	104
B. napus_EE451172	105	106
B. napus_EV055366	107	108
B. napus_TC92601	109	110
B. napus_TC95812	111	112
C. canephora_DV693718	113	114
C. longa_DY390653	115	116
C. tetragonoloba_EG990179	117	118
E. esula_DV121180	119	120
G. hirsutum_DW508052	121	122
G. hirsutum_TC102183	123	124
G. hirsutum_TC116960	125	126
G. hirsutum_TC121748	127	128
G. max_Glyma11g02060.1	129	130
G. max_8223	131	132
G. max_29139	133	134
G. soja_TA4526_3848	135	136
H. vulgare_TC189825	137	138
I. nil_TC6509	139	140
J. hindsii_x_regia_EL893054	141	142
J. hindsii_x_regia_TA1295_432290	143	144
L. japonicus_CB827663	145	146
L. multiflorum_AU249134	147	148
L. saligna_DW052030	149	150
L. serriola_DW108811	151	152
L. tulipifera_CV004984	153	154
M. domestica_TC17597	155	156
M. esculenta_DV443286	157	158
M. esculenta_TA9427_3983	159	160
M. truncatula_CT033771_17.4	161	162
O. minuta_CB884361	163	164
O. sativa_LOC_Os01g43230.2	165	166
P. equestris_CB034844	167	168
P. glauca_DR564374	169	170
P. hybrida_EB175070	171	172
P. menziesii_TA3655_3357	173	174
P. persica_BU039343	175	176
P. pinaster_CT579117	177	178
P. pinaster_TA6535_71647	179	180
P. sitchensis_TA16538_3332	181	182
P. sitchensis_TA17447_3332	183	184
P. taeda_DR096185	185	186
P. tremula_BU888423	187	188
P. tremula_DN497189	189	190
P. tremula_TA11725_113636	191	192
P. tremula_TA7610_113636	193	194
P. trichocarpa_562293	195	196
P. trichocarpa_568212	197	198
P. trichocarpa_594467	199	200
P. trichocarpa_674550	201	202
P. trichocarpa_807368	203	204
P. vulgaris_CV538421	205	206
S. bicolor_Sb03g028170.1	207	208
S. miltiorrhiza_CV166339	209	210
S. miltiorrhiza_TA1626_226208	211	212
S. tuberosum_CV505951	213	214
T. aestivum_BE412359	215	216
T. androssowii_TA2313_189785	217	218
Triphysaria_sp_TC9313	219	220
V. vinifera_GSVIVT00006915001	221	222
V. vinifera_GSVIVT00010755001	223	224
V. vinifera_GSVIVT00026045001	225	226
Z. mays_TC409725	227	228

In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neue Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
1.4. BRASSINAZOLE RESISTANT 1 (BZR1)
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der BZR-Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. SEQ ID NR: 2 wurde für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg.

In Tabelle A4 findet sich eine Liste der BZR-Nukleinsäuresequenzen und der dadurch codierten Proteine. Tabelle A4: Beispiele für BZR-Polypeptide:

Name	Ursprungspflanze	Nukleinsäure-SEQ ID NR:	Polypeptid-SEQ ID NR:
AT3G50750.1	Arabidopsis thaliana	238	239
AT1G19350.1	Arabidopsis thaliana	240	241
AT1G75080.1	Arabidopsis thaliana	242	243
AT1G78700.1	Arabidopsis thaliana	244	245
AT4G18890.1	Arabidopsis thaliana	246	247
AT4G36780.1	Arabidopsis thaliana	248	249
Gm\1762729	Glycine max	250	251
Gm\1765606	Glycine max	252	253
Gm\1768381	Glycine max	254	255
Gm\1768507	Glycine max	256	257
Hv_TA37786_4513	Hordeum vulgare	258	259
Le\LAT61	Lycopersicum esculentum	260	261
Le_DB718708	Lycopersicum esculentum	262	263
Le_TA37112_4081	Lycopersicum esculentum	264	265
Le_TA51962_4081	Lycopersicum esculentum	266	267
Mt_BF635822	Medicago truncatula	268	269
Mt_TA21345_3880	Medicago truncatula	270	271
Mt_TA28179_3880	Medicago truncatula	272	273
Os01g0203000	Oryza sativa	274	275
Os02g0129600	Oryza sativa	276	277
Os06g0552300	Oryza sativa	278	279
Os07g0580500	Oryza sativa	280	281
Pp\17189	Physcomitrella patens	282	283
Pp\172161	Physcomitrella apatens	284	285
Pp\82495	Physcomitrella patens	286	287
Ps\WS0287_023	Picea sitchensis	288	289
Pt\WS01123_K11	Populus trichocarpa	290	291
Pt_scaff_178.36	Populus trichocarpa	292	293
Pt_scaff_40.175	Populus trichocarpa	294	295
Pt_scaff_57.215	Populus trichocarpa	296	297
Pt_scaff_II.1237	Populus trichocarpa	298	299
Pt_scaff_IV.340	Populus trichocarpa	300	301
Pt_scaff_VII.1038	Populus trichocarpa	302	303
Pt_scaff_XI.678	Populus trichocarpa	304	305
Pt_scaff_XI.792	Populus trichocarpa	306	307
SI\FC26BA11	Solanum lycopersicum	308	309
Vv_TA44770_29760	Vitis vinifera	310	311
Zm_AY107201	Zea mays	312	313
Zm_EE158804	Zea mays	314	315
Zm_TA175044_4577	Zea mays	316	317
Zm_TA178991_4577	Zea mays	318	319

Beispiel 2: Alignment der mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Sequenzen
2.1: Root Hairless 1 (RHL1)
Das Alignment der RHL1-Polypeptidsequenzen aus Tabelle A wurde unter Verwendung des Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment (Larking et al. Bioinformatics. 2007 Nov 1;23 (21): 2947–8. Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500) durchgeführt. Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert (gap open penalty) ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert (gap extension penalty) ein Wert von 0,1, und die gewählte Gewichtungsmatrix ist Blosum 62. Ein Alignment von Proteinen ist in der 2a angegeben.
Ein phylogenetischer Baum der RHL1-Polypeptidsequenzen aus Tabelle A (2b) wurde mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm Clustal W zur Verfügung gestellt wird.
2.2. Transglutaminasen (TGasen)
Ein Mehrfach-Sequenzalignment von allen der TGase-Polypeptidsequenzen in Tabelle A wurde mit Hilfe des Algorithmus AlignX (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt. Ergebnisse der Alignments sind in 7 der vorliegenden Anmeldung gezeigt. Das N-terminale plastidische Transitpeptid ist vom restlichen Polypeptid durch einen senkrechten Strich getrennt. Die putative calciumbindende Region ist eingerahmt und unter der Konsensussequenz mit Kreuzen markiert. Die Domäne, für die mit dem Coils-Algorithmus wenigstens eine Coiled Coil vorhergesagt wurde (und die durch SEQ ID NR: 70 wiedergegeben wird), ist unter der Konsensussequenz mit Kreuzen markiert.
2.3. Tryptichon (TRY-like)
Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des ClustalW 2.0-Algorithmus für progressives Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet, Lückenöffnungsstrafwert 10, Lückenerweiterungsstrafwert: 0,2) durchgeführt. Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die Sequenzkonservierung zwischen TRY-like-Polypeptiden liegt im Wesentlichen in der DNA-Bindungsdomäne der Polypeptide, wobei Sequenzlänge und -zusammensetzung von C-Terminus und N-Terminus gewöhnlich variabler sind. Die TRY-like-Polypeptide sind in der 10 aligniert.
Mit diesem Alignment lassen sich konservierte Signatursequenzen mit einer Länge von etwa 5 bis 10 Aminosäuren bestimmen. Vorzugsweise sind die konservierten Regionen der verwendeten Proteine durch die Sternchen (identische Reste), Doppelpunkte (hochkonservierte Substitutionen) und Punkte (konservierte Substitutionen) kenntlich gemacht.
2.4. BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1)
Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Die Vorgabewerte waren wie folgt: der Lückenöffnungsstrafwert beträgt 10, der Lückenerweiterungsstrafwert beträgt 0,1, und die gewählte Gewichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Das Alignment von BZR-Polypeptiden ist in 12 gezeigt. Die Sequenz Pp172161 im Alignment ist am N- und C-Terminus gekappt. In der Konsensussequenz sind die hochkonservierten Aminosäurereste gekennzeichnet.
Die Sequenzkonservierung zwischen BZR-Polypeptiden findet sich im Wesentlichen im N-terminalen Teil entlang der BZR1-Transkriptionsrepressordomäne. Die hochkonservierte bHLH-like-DNA-Bindungsdomäne, die für BZR-Polypeptide charakteristisch ist, ist in 12 unterlegt. Konservierte Aminosäuremotive wie SAPVTPPLSSP (SEQ ID NR: 323: befindet sich in den Positionen 405–415 in der Konsensussequenz) und VKPWEGERIHE (SEQ ID NR: 324: befindet sich in den Positionen 634–644 in der Konsensussequenz) und DLELTLG (SEQ ID NR: 325: befindet sich in den Positionen 656–662 in der Konsensussequenz) wurden identifiziert.
Beispiel 3: Berechnung von globaler prozentualer Identität zwischen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Polypeptidsequenzen
3.1. Root Hairless 1 (RHL1)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahrens bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
Der Prozentsatz der Identität zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten RHL1-Polypeptidsequenzen kann, verglichen mit der SEQ ID NR: 2, lediglich 31% Aminosäureidentität betragen.
3.2. Transglutaminasen (TGasen)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahrens bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka. L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B2 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt (mit Ausnahme der Polypeptid-Teilsequenzen).

Der Prozentsatz der Identität zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten Volllängenpolypeptidsequenzen kann, verglichen mit der SEQ ID NR: 44, lediglich 26% Aminosäureidentität betragen. Tabelle B: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen von Tabelle A.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
1. Arath_TGase		36	41	26	31	33	30	24	24	21	23	18	16
2. Horvu_TGase	49		40	29	61	30	26	28	27	26	27	22	21
3. Lyces_TGase	58	51		29	36	30	26	28	28	27	28	21	21
4. Orysa_TGase	42	46	45		28	26	29	67	62	57	62	40	36
5. Orysa_TGase/II	43	69	47	42		25	23	27	27	26	25	20	20
6. Picsi_TGAse	49	41	42	43	34		32	24	22	20	21	17	16
7. Poptr_TGase	50	40	39	45	35	51		31	29	26	28	23	22
8. Sacof_TGase	40	45	45	75	42	41	44		88	75	81	48	44
9. Sorbi_TGase	40	46	46	70	41	38	41	91		81	87	49	45
10. Zeama_TGase\II	34	43	42	64	42	34	37	77	82		93	49	47
11. Zeama_TGase\III	38	46	44	70	41	37	39	83	88	93		50	46
12. Zeama_tgz15	32	37	38	49	37	29	34	56	56	58	57		91
13. Zeama_tgz21	29	34	35	45	34	27	32	52	51	55	53	91

Die prozentuale Aminosäureidentität lässt sich signifikant erhöhen, wenn man die am meisten konservierte Region der Polypeptide vergleicht. Vergleicht man zum Beispiel die Aminosäuresequenz der Coiled-Coil-Domäne von SEQ ID NR: 2 (wiedergegeben durch SEQ ID NR: 27) mit der Coiled-Coil-Domäne der Polypeptide von Tabelle A, so erhöht sich die prozentuale Aminosäureidentität um bis zu 50%.
3.3. Tryptichon (TRY-like)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B3 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität zwischen At5g53200 und anderen TRY-like-Polypeptiden ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, sowohl für die Sequenz voller Länge als auch für die DNA-Bindungsdomäne.
Der Prozentsatz der Identität zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten TRY-like-Polypeptidsequenzen kann, verglichen mit SEQ ID NR: 76, lediglich 12% Sequenzidentität betragen. Die Sequenzkonservierung ist jedoch viel höher, wenn man die DNA-Bindung vergleicht. Tabelle B2 zeigt Ähnlichkeit und Identität zwischen den Sequenzen, die die DNA Bindungsdomäne wiedergeben (Sequenzen, die ein Alignment mit der DNA-Bindungsdomäne wie in 9 gezeigt (Reste 30 bis 75 in SEQ ID NR: 76) geben). Die Sequenzidentität liegt im Allgemeinen über 50%.
3.4. BRASSINAZOLE RESISTANT 1 (BZR1)
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-BZR-Polypeptidsequenzen wurden unter Anwendung der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

Wertungsmatrix: Blosum62

Erstlücke: 12

Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
Der Prozentsatz der Identität zwischen den BZR-Polypeptidsequenzen der Tabelle B4 verglichen mit SEQ ID NR: 239 liegt im Bereich von 22,5% bis 88,2%.
Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, die in Polypeptidsequenzen enthalten sind, die sich für die Durchführung der Verfahren der Erfindung eignen
4.1. Root Hairless 1 (RHL1)
Die Identifikation von hochkonservierten Sequenzmotiven in den RHL1-Polypeptiden von Tabelle A erfolgte nach dem MEME-System (Timothy et al; 1998. Journal of Computational Biology, Band 5, S. 211–221, 1998); Timothy et al. 1998. Bioinformatics, Band 14, S. 48–54). Tabelle C1: Ergebnisse des MEME-Scans (Hauptzugangsnummern) der durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebenen Polypeptidsequenz.
*Bei den in Klammern angegebenen Aminosäuren sind alle in dieser Position möglichen Aminosäuren aufgelistet.
** E-Wert: Erwartungswert. Die Anzahl verschiedener Alignments mit Ergebniswerten gleich oder höher einem vorgegebenen Wert, die in einer Datenbank zufallsgemäß auftreten sollten. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Ergebniswert.
4.2. Tryptichon (TRY-like)
Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modelle, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten bzw. gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 76 repräsentiert, sind in der Tabelle C2 dargestellt. Tabelle C2: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der durch SEQ ID NR: 76 wiedergegebenen Polypeptidsequenz.

Methode	Zugang	Domäne	Start	Stopp	E-Wert
HMMPanther	PTHR10641:SF26	TRIPTYCHON UND CPC	32	106	1,20E–60
HMMPanther	PTHR10641	MYB-RELATED	32	106	1,20E–60
Gene3D	G3DSA:1.10.10.60	nicht beschrieben	31	79	3,60E–08
HMMPfam	PF00249	Myb_DNA-bindend	30	75	5,00E–07
Superfamilie	SSF46689	Homeodomain-like	26	79	6,90E–07
HMMSmart	SM00717	SALAT	29	77	3,10E–06
ProfileScan	PS50090	MYB_LIKE	34	71	6,307

4.3. BRASSINAZOLE RESISTANT 1 (BZR1)
Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modelle, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten bzw. gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.
Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 239 repräsentiert, sind in der Tabelle C3 dargestellt. Bei der dem BZR-Polypeptid entsprechenden Interpro-Familie handelt es sich um IPR008540. Tabelle C3: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 239 repräsentiert wird.

Databank Zugangsnummer Zugangsname E-Wert Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR: 239

Pfam PF05687 DUF822 7,199xE–89 10–157
Beispiel 5: Vorhersage der Sekundärstrukturmerkmale von TGase
Coiled Coils enthalten üblicherweise ein wiederkehrendes Sieben-Aminosäurerest-Muster, das als Heptad-Repeat bezeichnet wird. Coiled Coils sind zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Oligomerisierung, entweder von identischen Proteinen, Proteinen der gleichen Familie oder von nicht miteinander verwandten Proteinen wichtig. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage von Coiled Coils aus Sequenzdaten gemacht. Viele dem Fachmann allgemein bekannte Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen verfügbar. Einer von ihnen, COILS, ist ein Programm, das eine Sequenz mit einer Datenbank von bekannten parallelzweisträngigen Coiled-Coils vergleicht und eine Ähnlichkeitswertung ableitet. Durch Vergleich dieser Bewertung mit der Verteilung von Bewertungen in globulären und Coiled-Coil-Proteinen berechnet das Programm dann die Wahrscheinlichkeit, dass die Sequenz eine Coiled-Coil-Konformation annehmen wird.

Das durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebene TGase-Polypeptid besitzt mindestens eine vorhergesagte Coiled-Coil-Domäne, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit, in allen drei untersuchten Fenstern (14, 21 und 28). In der Tabelle D1 sind die Rest-Koordinaten, Reste, die drei Fenster und die entsprechenden Wahrscheinlichkeitswerte gezeigt. In der 6 findet sich die graphische Ausgabe des COILS-Algorithmus für das durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebene Polypeptid, wobei die mindestens eine vorhergesagte Coiled Coil in allen drei Fenstern deutlich sichtbar ist (wie durch die drei Linien wiedergegeben). Tabelle D1: Numerische Ausgabe des COILS-Algorithmus hinsichtlich des durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen Polypeptids. Gezeigt sind die Restkoordinaten (#), Reste, die drei Fenster und die entsprechenden Wahrscheinlichkeitswerte. Wahrscheinlichkeiten über 0,9 sind in fett gedruckt.

#	Rest	Fenster 14	Wahrsch.	Fenster 21	Wahrsch.	Fenster 28	Wahrsch.
29	R	e	0,001	e	0,082	e	0,946
30	Q	f	0,003	f	0,082	f	0,946
31	P	g	0,003	g	0,082	g	0,946
32	L	a	0,708	a	0,991	a	1,000
33	D	b	0,708	b	0,991	b	1,000
34	R	c	0,708	c	0,991	c	1,000
35	A	d	0,737	d	0,991	d	1,000
36	A	e	0,737	e	0,993	e	1,000
37	T	f	0,737	f	0,993	f	1,000
38	A	g	0,813	g	0,999	g	1,000
39	L	a	0,980	a	1,000	a	1,000
40	E	b	0,980	b	1,000	b	1,000
41	I	c	0,980	c	1,000	c	1,000
42	L	d	0,996	d	1,000	d	1,000
43	E	e	0,996	e	1,000	e	1,000
44	K	f	0,996	f	1,000	f	1,000
45	K	g	0,996	g	1,000	g	1,000
46	L	a	0,996	a	1,000	a	1,000
47	A	b	0,996	b	1,000	b	1,000
48	E	c	0,996	c	1,000	c	1,000
49	Q	d	0,996	d	1,000	d	1,000
50	T	e	0,996	e	1,000	e	1,000
51	A	f	0,996	f	1,000	f	1,000
52	E	g	0,996	g	1,000	g	1,000
53	A	a	0,996	a	1,000	a	1,000
54	E	b	0,996	b	1,000	b	1,000
55	K	c	0,996	c	1,000	c	1,000
56	L	d	0,996	d	1,000	d	1,000
57	I	e	0,971	e	1,000	e	1,000
58	R	f	0,971	f	1,000	f	1,000
59	E	g	0,971	g	1,000	g	1,000
60	N	a	0,971	a	1,000	a	1,000
61	Q	b	0,971	b	1,000	b	1,000
62	R	c	0,971	c	1,000	c	1,000
63	L	d	0,971	d	1,000	d	1,000
64	A	e	0,921	e	0,997	e	1,000
65	S	f	0,848	f	0,989	f	1,000
66	S	g	0,231	g	0,917	g	1,000
67	H	a	0,099	a	0,537	a	0,999
68	V	b	0,179	b	0,379	b	0,979
69	V	c	0,662	c	0,379	c	0,979
70	L	d	0,736	d	0,379	d	0,979
71	R	e	0,736	e	0,379	e	0,939
72	Q	f	0,736	f	0,379	f	0,939
73	D	g	0,736	g	0,297	g	0,939
74	I	a	0,736	a	0,297	a	0,939
75	V	b	0,736	b	0,297	b	0,939
76	D	c	0,736	c	0,297	c	0,939
77	T	d	0,736	d	0,297	d	0,939
78	E	e	0,736	e	0,297	e	0,939
79	K	f	0,736	f	0,297	f	0,939
80	E	g	0,736	g	0,297	g	0,939
81	M	a	0,736	a	0,297	a	0,939
82	Q	b	0,736	b	0,297	b	0,900
83	M	c	0,736	c	0,297	c	0,560
84	I	d	0,265	d	0,297	d	0,560
85	R	e	0,265	e	0,297	e	0,560
86	A	f	0,151	f	0,297	f	0,407
87	H	g	0,047	g	0,297	g	0,123
88	L	a	0,047	a	0,297	a	0,123
89	G	b	0,026	b	0,297	b	0,123
90	D	c	0,026	c	0,297	c	0,123
91	V	d	0,026	d	0,108	d	0,123
92	Q	e	0,013	e	0,108	e	0,123
93	T	b	0,009	b	0,086	b	0,123
94	E	c	0,025	c	0,259	c	0,123
95	T	d	0,025	d	0,259	d	0,123
96	D	e	0,025	e	0,259	e	0,123
97	M	f	0,051	f	0,259	f	0,123
98	H	g	0,159	g	0,259	g	0,124
99	M	a	0,517	a	0,259	a	0,124
100	R	b	0,556	b	0,259	b	0,124
101	D	c	0,707	c	0,259	c	0,124
102	L	d	0,707	d	0,259	d	0,124
103	M	e	0,707	e	0,259	e	0,124
104	E	f	0,707	f	0,259	f	0,124
105	R	g	0,707	g	0,259	g	0,124
106	M	a	0,707	a	0,259	a	0,124
107	R	b	0,707	b	0,259	b	0,124
108	L	c	0707	c	0,259	c	0,124
109	M	d	0,707	d	0,259	d	0,124
110	E	e	0,707	e	0,259	e	0,124
111	A	f	0,707	f	0,259	f	0,124
112	D	g	0,707	g	0,259	g	0,124
113	I	a	0,707	a	0,259	a	0,124
114	Q	b	0,707	b	0,259	b	0,124
115	A	c	0,561	c	0,092	c	0,124
116	G	d	0,028	d	0,057	d	0,124
117	D	b	0,040	b	0,424	b	0,842
118	A	c	0,042	c	0,452	c	0,842
119	V	d	0,074	d	0,452	d	0,918
120	K	e	0,349	e	0,639	e	0,918
121	K	f	0,349	f	0,639	f	0,918
122	E	g	0,349	g	0,639	g	0,918
123	L	a	0,349	a	0,639	a	0,918
124	H	b	0,349	b	0,639	b	0,918
125	Q	c	0,349	c	0,639	c	0,918
126	V	d	0,349	d	0,639	d	0,918
127	H	e	0,349	e	0,639	e	0,918
128	M	f	0,349	f	0,639	f	0,918
129	E	g	0,349	g	0,797	g	0,918
130	A	a	0,349	a	0,797	a	0,918
131	K	b	0,349	b	0,930	b	0,918
132	R	c	0,349	c	0,930	c	0,918
133	L	d	0,349	d	0,930	d	0,918
134	I	e	0,190	e	0,930	e	0,918
135	A	f	0,190	f	0,930	f	0,918
136	E	g	0,190	g	0,930	g	0,918
137	R	a	0,190	a	0,930	a	0,918
138	Q	b	0,376	b	0,930	b	0,918
139	M	c	0,376	c	0,930	c	0,918
140	L	d	0,426	d	0,930	d	0,918
141	T	e	0,426	e	0,930	e	0,918
142	V	f	0,426	f	0,930	f	0,918
143	E	g	0,426	g	0,930	g	0,918
144	M	a	0,426	a	0,930	a	0,918
145	D	b	0,426	b	0,930	b	0,918
146	K	c	0,426	c	0,930	c	0,918
147	V	d	0,426	d	0,930	d	0,918
148	T	e	0,426	e	0,930	e	0,838
149	K	f	0,426	f	0,930	f	0,838
150	E	g	0,426	g	0,930	g	0,838
151	L	a	0,426	a	0,930	a	0,838
152	H	b	0,426	b	0,708	b	0,838
153	K	c	0,426	c	0,708	c	0,838
154	F	d	0,066	d	0,334	d	0,838
155	S	e	0,055	e	0,334	e	0,838
156	G	f	0,055	f	0,099	f	0,792
157	D	g	0,018	g	0,062	g	0,492
158	S	e	0,071	e	0,755	e	0,146
159	K	f	0,176	f	0,908	f	0,201
160	K	g	0,176	g	0,908	g	0,288
161	L	a	0,333	a	0,908	a	0,288
162	P	b	0,333	b	0,908	b	0,288
163	E	c	0,804	c	0,916	c	0,288
164	L	d	0,804	d	0,916	d	0,288
165	L	e	0,804	e	0,916	e	0,288
166	T	f	0,807	f	0,916	f	0,288
167	E	g	0,856	g	0,916	g	0,288
168	L	a	0,856	a	0,916	a	0,288
169	D	b	0,856	b	0,916	b	0,288
170	G	c	0,856	c	0,916	c	0,288
171	L	d	0,856	d	0,916	d	0,288
172	R	e	0,856	e	0,916	e	0,288
173	K	f	0,856	f	0,916	f	0,288
174	E	g	0,856	g	0,916	g	0,288
175	H	a	0,856	a	0,916	a	0,288
176	Q	b	0,856	b	0,916	b	0,288
177	S	c	0,856	c	0,916	c	0,288
178	L	d	0,856	d	0,916	d	0,288
179	R	e	0,856	e	0,946	e	0,288
180	S	f	0,856	f	0,916	f	0,288
181	A	g	0,405	g	0,916	g	0,288
182	F	a	0,102	a	0,916	a	0,288
183	E	b	0,102	b	0,916	b	0,288
184	Y	c	0,016	c	0,283	c	0,288
185	E	c	0,085	c	0,283	c	0,288
186	K	d	0,085	d	0,283	d	0,638
187	N	e	0,085	e	0,283	e	0,638
188	T	f	0,085	f	0,058	f	0,638
189	N	g	0,085	g	0,025	g	0,638
190	I	a	0,085	a	0,026	a	0,638
191	K	b	0,085	b	0,232	b	0,938
192	Q	c	0,085	c	0,232	c	0,951
193	V	d	0,085	d	0,696	d	0,988
194	E	f	0,087	f	0,967	f	1,000
195	Q	g	0,087	g	0,967	g	1,000
196	M	a	0,087	a	0,967	a	1,000
197	R	b	0,087	b	0,967	b	1,000
198	T	c	0,087	c	0,967	c	1,000
199	M	d	0,203	d	0,967	d	1,000
200	E	e	0,497	e	0,967	e	1,000
201	M	f	0,497	f	0,967	f	1,000
202	N	g	0,497	g	0,994	g	1,000
203	L	a	0,497	a	0,994	a	1,000
204	M	b	0,497	b	0,994	b	1,000
205	T	c	0,497	c	0,997	c	1,000
206	M	d	0,792	d	0,997	d	1,000
207	T	e	0,884	e	0,997	e	1,000
208	K	f	0,993	f	0,997	f	1,000
209	E	g	0,993	g	0,997	g	1,000
210	A	a	0,993	a	0,997	a	1,000
211	D	b	0,993	b	0,997	b	1,000
212	K	c	0,993	c	0,997	c	1,000
213	L	d	0,993	d	0,997	d	1,000
214	R	e	0,993	e	0,997	e	1,000
215	A	f	0,993	f	0,997	f	1,000
216	D	g	0,993	g	0,997	g	1,000
217	V	a	0,993	a	0,997	a	1,000
218	A	b	0,993	b	0,997	b	1,000
219	N	c	0,993	c	0,997	c	1,000
220	A	d	0,993	d	0,997	d	1,000
221	E	e	0,993	e	0,997	e	1,000
222	K	f	0,993	f	0,997	f	1,000
223	R	g	0,978	g	0,997	g	0,999
224	A	a	0,978	a	0,997	a	0,999
225	Q	b	0,978	b	0,997	b	0,999
226	V	c	0,745	c	0,996	c	0,999
227	A	d	0,560	d	0,996	d	0,999
228	A	e	0,348	e	0,989	e	0,999
229	A	f	0,348	f	0,982	f	0,999
230	Q	g	0,348	g	0,968	g	0,999
231	A	a	0,296	a	0,968	a	0,999
232	V	g	0,184	g	0,778	g	0,999
233	A	a	0,184	a	0,632	a	0,999
234	A	b	0,184	b	0,598	b	0,999
235	Q	c	0,184	c	0,598	c	0,999
236	A	d	0,184	d	0,598	d	0,998
237	G	e	0,013	e	0,069	e	0,840
238	V	f	0,004	f	0,069	f	0,840
239	A	b	0,001	b	0,069	b	0,742
240	H	c	0,001	c	0,017	c	0,383
241	V	d	0,001	d	0,007	d	0,085
242	T	e	0,001	e	0,001	e	0,042
243	A	f	0,001	f	0,001	f	0,042
244	S	g	0,000	g	0,001	g	0,013
245	Q	f	0,000	f	0,001	f	0,002
246	P	b	0,000	b	0,000	b	0,000

Beispiel 6: Topologie-Vorhersage der für die Durchführung der Erfindung geeigneten Polypeptidsequenzen
6.1. Transglutaminasen (TGasen)
Zur Vorhersage der subzellulären Lokalisierung von Polypeptiden lassen sich viele Algorithmen verwenden, einschließlich:

• TargetP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technischen Universität Dänemark;
• ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technischen Universität Dänemark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark

Durch Vergleich der Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 45 mit Orthologen von anderen Pflanzenarten, bei denen eine subzelluläre Lokalisierung gefunden wurde, ist es möglich, die Schlussfolgerung zu ziehen, dass die subzelluläre Lokalisierung der durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen Polypeptidsequenz der Chloroplast ist (Villalobos et al. (2004) Gene 336: 93–104).
6.2. Tryptichon (TRY-like)
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
Eine Anzahl von Parametern wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).

Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NR: 76 wiedergegebenen Polypeptidsequenz sind in der Tabelle E1 aufgeführt. Die Organismengruppe ”Pflanze” würde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der durch SEQ ID NR: 76 wiedergegebenen Polypeptidsequenz kann es sich um das Zytoplasma oder den Zellkern handeln, wobei kein Transitpeptid vorhergesagt wird. Tabelle E1: TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NR: 76 wiedergegebenen Polypeptidsequenz

Länge (AA)	106
chloroplastisches Transitpeptid	0,048
mitochondriales Transitpeptid	0,348
Signalpeptid des sekretorischen Pfades	0,046
andere subzelluläre Ziele	0,822
vorhergesagter Ort	/
Verlässlichkeitsklasse	3
vorhergesagte Länge des Transitpeptids	/

Bei einer Analyse mit PSort betrug die Wahrscheinlichkeit einer nukleären Lokalisierung 0,700; es handelt sich bei dem Protein also wahrscheinlich um ein nukleäres Protein.
Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:

• ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• PSORT (URL: psort. org);
• PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).

Beispiel 7: Assay im Zusammenhang mit den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten Polypeptidsequenzen
7.1. Funktionsassay mit Root Hairless 1 (RHL1)
Die Bindung eines RHL1-Polypeptids wird in einem in-vitro-Assay im Wesentlichen wie von Sugimoto-Shirasu et al. 2005 PNAS Band 102_Nr. 51, 18736–18741 beschrieben untersucht. Kurz gesagt wird rekombinantes RHL1-Protein in einem bakteriellen System hergestellt und unter Anwendung von Standardmethoden aufgereinigt. Aufgereinigtes RHL1-Protein wird mit DNa-Fragmenten inkubiert, und die Bindung des RHL1-Proteins an das DNA-Fragment wird mit Plasmonresonanz (SPR) nachgewiesen.
7.2. Transglutaminasen (TGasen)
Für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeignete Polypeptide katalysieren typischerweise die Bildung von Amidbindung, im Allgemeinen in einer Ca-abhängigen Weise, zwischen dem primären Amin eines Amindonorsubstrats und der y-Carbonsäureamidgruppe der peptidgebundenen endo-Glutaminreste in Proteinen oder Polypeptiden, bei denen es sich um Aminakzeptoren handelt. Genauer gesagt lässt sich die TGase-Aktivität unter Anwendung der Methode mit radioaktiv markiertem Putrescin oder der gamma-Glutamylbiotin-Cadaverin-Methode messen, wie in Villalobos et al. (2004; oben) beschrieben.
Dem Fachmann sind solche experimentellen Vorschriften zur Messung der enzymatischen TGase-Polypeptid-Aktivität einschließlich der durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenen Aktivität eines TGase-Polypeptids gut bekannt.
7.3. Tryptichon-Funktionsassav (TRY-like)
TRY-like-Polypeptide haben typischerweise eine DNA-bindende Aktivität. Ein Verfahren zur Messung und Charakterisierung von Polypeptiden ist in Xue (A CELD-fusion method for rapid determination of the DNA-binding sequence specificity of novel plant DNA-binding Proteins. Plant Journal 41, 638–649, 2005) beschrieben.
Beispiel 8: Klonieren der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz
8.1. Root Hairless 1 (RHL1)
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggtacgagcttcatcgtc-3' (SEQ ID NR: 40; sense) und 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttctggaaaagatttctttaagc-3' (SEQ ID NR: 41; reverse), die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion; durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pArath_RHL1, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der die SEQ ID NO: 1 umfassende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 42) für die wurzelspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::Arath_RHL1l (3) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
8.2. Transglutaminasen (TGasen)
Die für eine durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebene TGase-Polypeptidsequenz codierende Oryza sativa-Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine mit RNA aus Reispflanzen verschiedener Entwicklungsstadien erstellte cDNA-Bank verwendet wurde. Für die PCR-Amplifikation wurden die folgenden Primer, die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen, verwendet: prm02265 (SEQ ID NR: 73, sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggcataccatggacag-3' und prm02266 (SEQ ID NR: 74, reverse, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatttcacctctggcctg-3'.
Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (einschließlich attB-Stellen) wurde amplifiziert und aufgereinigt, ebenfalls nach Standardmethoden. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone” erhält. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der die SEQ ID NR: 44 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-alpha-Globulin-Promotor (SEQ ID NO: 72) für die samenspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGlob::TGase (4) für die samenspezifische Expression nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
8.3. Tryptichon (TRY-like)
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm09014 (SEQ ID NR: 233; sense, Startcodon fett): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggataacactgaccgtcgt-3' und prm09015 (SEQ ID NR: 234; reverse, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttttttcgttggcttaaaaaca-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pTRY-like, erhielt. Das Plasmid pDONR2O1 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der die SEQ ID NR: 75 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 237) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette. Bei einer alternativen Ausführungsform verwendete man einen wurzelspezifischen Promotor (RCc3-Promotor; SEQ ID NR: 235).
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::TRY-like (3) bzw. pRCc3::TRY nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
8.4. BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1)
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um (SEQ ID NR: 320; sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgacggcatcaggagga-3' und (SEQ ID NR: 321; reverse, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaccacgatattaacctagccg-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pBZR, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der die SEQ ID NR: 238 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 322) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::BZR (3) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 9: Pflanzentransformation
Transformation von Reis
Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt, und die Calli wurden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Transformation von Mais
Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wird. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, im Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Weizen
Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexiko) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Sojabohne
Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U.S.-Patent 5 164 310 von Texas A & M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Aussäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jungsämlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Raps/Canola
Kotyledonäre Petiolen bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Aussäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Keimblattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Keimblattstiel-Explantate in bzw. auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Alfalfa
Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (Mckersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (Mckersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Baumwolle
Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß des Verfahrens transformiert, das in US 5 159 135 beschrieben ist. Baumwollsamen werden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung während 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf bzw. in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl₂, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/m1 Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
Beispiel 10: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
10.1 Auswertungsansatz
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nichtstressbedingungen wachsen gelassen wurden, wurden in regelmäßigen Intervallen bewässert, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, so dass die Bedürfnisse der Pflanze zum Abschließen von Wachstum und Entwicklung erfüllt werden.
Vier T1-Ereignisse wurden unter Befolgen desselben Auswertungsvorgehens wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignis in der T2-Generation weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Dürre-Screen
Pflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie wurden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wurde. Zur Überwachung des Bodenwassergehalts (SWC) wurden Feuchtigkeitssonden in zufällig ausgewählte Blumentöpfe gesteckt. Fielt der SWC unter bestimmte Schwellenwerte, so wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wurde. Die Pflanzen wurden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Screen der Stickstoffverwendungseffizienz
Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthielt, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Salzstress-Screen
Pflanzen wurden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wurde während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wurden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Dann wurden samenbezogene Parameter gemessen.
10.2 Statistische Analyse: F-Test
Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
Weil zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
10.3 Gemessene Parameter
Messung von biomassebezogenen Parametern
Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Früh-Wuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
Die Früh-Wuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Messungen von samenbezogenen Parametern
Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller von einer Pflanze abgeernteten gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein%-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
Beispiel 11: Ergebnisse der phanotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
11. 1. Root Hairless 1 (RHL1)
Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen der T2-Generation, die die codierende Region einer Arath_RHL1-Nukleinsäure (SEQ ID NR: 1) unter den Stickstoffmangel-Wachstumsbedingungen von Beispiel 8 exprimieren, sind nachstehend aufgeführt. Eine Steigerung von mindestens 5% wurde bei der Auflauf-Wuchskraft (Früh-Wuchskraft, EmerVigor), dem Gesamtsamenertrag (totalweightseeds), der Anzahl an gefüllten Samen (Nr filled seeds), dem Ernteindex (harvestindex), der Wurzelbiomasse (Rootmax) und der Gesamtanzahl an Samen an einer Pflanze (nrtotalseed) beobachtet (Tabelle F1). Tabelle F1. Bewertung transgener Pflanzendie das Arath_RHL1-Gen unter Stickstoffmangel-Wachstumsbedingungen exprimieren.

Parameter % Erhöhung in transgener im Vergleich zur Kontrollpflanze

EmerVigor 19

RootMax 7,6

totalweightseeds 17

Nr filled seeds 16

harvestindex 12

nrtotalseed 11

Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen der T1-Generation, die die codierende Region einer Orysa_RHL1-Nukleinsäure (SEQ ID NR: 9) unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors GOS2 (SEQ ID NR: 39) unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind nachstehend aufgeführt. (Tabelle F2). Tabelle F2. Bewertung transgener Pflanzen, die eine Onsa_RHL1-Nukleinsäure unter Nichtstressbedingungen exprimieren.

Parameter	% Erhöhung in transgener im Vergleich zur Kontrollpflanze
AreaMax	8,1
TimetoFlower	1,25
RootMax	3,6
totalwgseeds	16,19
nrfilledseed	14,9
fillrate	5,7
harvestindex	10,0
HeightMax	2,6
GNbfFlow	7,4
nrtotalseed	8,6

Die Ergebnisse der Untersuchung von unter den oben im Screen der Stickstoffverwendungseffizienz angeführten Stickstoffmangelbedingungen herangezogenen transgenen Reispflanzen der T1-Generation, die die codierende Region einer Orysa_RHL1-Nukleinsäure (SEQ ID NR: 9) unter der Kontrolle des wurzelspezifischen Promotors Rcc3 (SEQ ID NR: 40) exprimieren, sind in Tabelle F3 gezeigt. EmerVigor (auch als Früh-Wuchskraft bezeichnet) ist eine Ertragseigenschaft, die direkt mit der Wuchskraft der Pflanze insbesondere in einem frühen Keimstadium der Entwicklung korreliert. Tabelle F3. Bewertung transgener Pflanzen, die eine Orysa_RHL1-Nukleinsäure unter Nichtstressbedingungen exprimieren.

Parameter % Erhöhung in transgener im Vergleich zur Kontrollpflanze

EmerVigor 16,6

totalwgseeds 12

nrfilledseed 15
11.2. Transglutaminasen (TGasen)
Die Ergebnisse der Untersuchung von unter normalen Wachstumsbedingungen herangezogenen transgenen Reispflanzen der T1- und der T2-Generation, die die für ein durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenes TGase-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors exprimieren, sind unten gezeigt.

Es gab eine signifikante Zunahme bei der Früh-Wuchskraft, bei der oberirdischen Biomasse, beim Gesamtsamengewicht pro Pflanze, bei der Gesamtanzahl an Samen, bei der Anzahl an gefüllten Samen, bei der Samenfüllrate und beim Ernteindex der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie in Tabelle F4 gezeigt. Tabelle F4: Ergebnisse der Bewertung von transgenen Reispflanzen der T1- und der T2-Generation, die die für ein durch SEQ ID NR: 45 wiedergegebenes TGase-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle eines Promotors für samenspezifische Expression exprimieren.

Merkmal	Durchschn. proz. Gesamtzunahme bei 8 Ereignissen in der T1-Generation	Durchschn. proz. Gesamtzunahme bei 4 Ereignissen in der T2-Generation
Gesamtsamenertrag pro Pflanze	26%	15%
Gesamtanzahl an gefüllten Samen	27%	14%
Ernteindex	26%	14%

11.3. Tryptichon (TRY-like)
Die Untersuchung von eine TRY-like-Nukleinsäure unter der Kontrolle des RCc3-Promotors exprimierenden transgenen Reispflanzen, die unter Bedingungen einer reduzierten Verfügbarkeit von Stickstoff herangezogen wurden, zeigte eine Zunahme von mehr als 5% bei Auflauf-Wuchskraft (Früh-Wuchskraft), Füllrate, Ernteindex und Gesamtsamenertrag. Diese Zunahmen wurden sowohl bei Pflanzen der T1-Generation als auch bei Pflanzen der T2-Generation beobachtet.
Die Ergebnisse der Untersuchung von unter Nichtstressbedingungen herangezogenen transgenen Reispflanzen der T1- und der T2-Generation, die eine für das durch SEQ ID NR: 76 wiedergegebene TRY-Polypeptid codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors exprimieren, sind unten in Tabelle E bzw. F gezeigt. Bei der Kultivierung unter Nichtstressbedingungen wurde bei der T1 eine Zunahme von mindestens 5% beim Samenertrag (Gesamtgewicht der Samen, Anzahl an gefüllten Samen, Gesamtanzahl an Samen) beobachtet. Tabelle F5: Zusammenfassung der Daten von mit dem pGOS2::TRY-Konstrukt transformierten transgenen Reispflanzen; für jeden Parameter ist die prozentuale Gesamtzunahme für die T1-Generation gezeigt, für jeden Parameter liegt der p-Wert bei ≤ 0,05.

Parameter Gesamtzunahme

Nr total seeds. 8,7

totalwgseeds 17,3

nrfilledseed 14,5
Bei der T2-Generation wurde eine starke Zunahme (≤ 5%) bei der oberirdischen Biomasse (AreaMax und firstpan), der Früh-Wuchskraft und dem Samenertrag gefunden; die Details sind in Tabelle F angeführt: Tabelle F6: Zusammenfassung der Daten von mit dem pGOS2::TRY-Konstrukt transformierten transgenen Reispflanzen; für jeden Parameter ist die prozentuale Gesamtzunahme für die T2-Generation gezeigt, für jeden Parameter liegt der p-Wert bei ≤ 0,05.

Parameter Gesamtzunahme

AreaMax 5,0

EmerVigor 20,2

firstpan 8,3

totalwgseeds 8,8

nrfilledseed 7,5
11.4. BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1)
Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen, die die codierende Region der BZR-Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1 unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind unten gezeigt. Eine Steigerung von mindestens 5% wurde beim Gesamtsamenertrag, der Anzahl an gefüllten Samen pro Pflanze, der Samenfüllrate und dem Ernteindex beobachtet, und eine Steigerung von mehr als 2,5% wurde beim Tausendkerngewicht verglichen mit den Kontrollpflanzen (den entsprechenden Nullizygoten) beobachtet (Tabelle F7). Tabelle F7

Parameter Gesamtsamengewicht Anszahl an gefüllten Samen Samenfüllrate Ernteindex TKW

% Zunahme bei der transgenen Pflanze verglichen mit der Kontrollpflanze 17,5 14,4 5,5 11,4 3,0
Zusammenfassung
Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener pflanzenertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein RHL1 (Root Hairless 1) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein RHL1 codiert, wobei die Pflanzen verschiedene gesteigerte pflanzenertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzensamenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Transglutaminase-(TGase-)Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein TGase-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt zusätzlich Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenzen enthalten, bereit.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumscharakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like-(Tryptichon-)Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein TRY-like-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen durch Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein BZR-(BRASSINAZOLE-RESISTANT-)Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein BZR-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte für BZR-codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die diese enthalten, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, codierend für ein Root-Hairless-Polypeptid, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Root-Hairless-Polypeptid ein(e) oder mehrere der Folgenden umfasst: (i) eine Sequenz mit, mit zunehmender Präferenz, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz eines der Polypeptide von Tabelle A (ii) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 1: [IV]R[RK][KG][SG]QRK[NS][RK][FY]LFSFPGLLAP (SEQ ID NR: 29); (iii) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 2: SGG[KR][IV]G[ED]L[KA]DL[GD]TKNP[ILV]LYLDFPQG[RQ]MKL] (SEQ ID NR: 30); (iv) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 3: TP[VS]RQSARTAGKK[FL][KN][FY][AT]ExSS (SEQ ID NR: 31); (v) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 4: GTK[ED]ENPEE[LA][RK]L[DE]FPKE[LF]Q[ENQ][GD] (SEQ ID NR: 32); (vi) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 5: [SN][GN][NL]L[LQV][SR][EDG]xP[AS][KA]PR[SA][APS]LAPSK[TAG]VL[KR][HL][HQ]G[KR]D (SEQ ID NR: 33); (vii) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 6: HA[ED][CY]DFKGGAGAA[CS]D[ES][KA]Q (SEQ ID NR: 34); (viii) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 7: [KSN][KEP]P[GEK][EKT][KTE][YT][VT][EG][EPST][ELQ]SP[KE][IT][ED][SLV][ED][DI][DV][LS]S[ED][DE][SD][NDS][LD]K[DK] (SEQ ID NR: 35); (ix) ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von Motiv 8: KG[PA]AAKKQRASP[EM][EA]K[HQ]P[TA]G[KI]K (SEQ ID NR: 36).
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, für ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure oder dem Komplement davon in der Lage ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog eines der in Tabelle A aufgeführten Proteine codiert.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Kultivierungsbedingungen mit Stickstoffmangel erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die bzw. der durch ein Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, umfasst.
Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, wie in den Ansprüchen 1, 2 oder 3 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
Konstrukt nach Anspruch 11, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt nach Anspruch 11 oder 12 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 10, 14 oder 16 oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
Produkte, gewonnen aus einer Pflanze nach Anspruch 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 18.
Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Spross- und/oder Biomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.