DE112008001044T5 - Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, moduliert wird, wobei das LBD-Polypeptid eine DUF206-Domäne umfasst.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen und/oder Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumseigenschaften durch Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein GRP (Wachstums-Regulations-Protein, Growth Regulating Protein) kodiert, in einer Pflanze. Das GRP ist ausgewählt aus einem die LOB-Domäne (LOB: Lateral Organ Boundaries, Laterale Organgrenzen) umfassenden Protein, hierin abgekürzt als LBD Polypeptid, einem JMJC (JUMONJI-C) Polypeptid, einem CKI (Casein Kinase I) Polypeptid, einem bHLH11-ähnlichem (basic Helix-Loop-Helix 11) Protein, einem Pflanzen-Hömöodomänen-Finger-Homöodomäne-(plant homeodomain fingerhomeodomain (PHDf-HD))-Polypeptid, einem ASR-(Abscisinsäure-, stress- und reifungsinduzierten, (abscisic acid-, stress-, and ripening-induced))-Polypeptid und/oder einem Squamosa-Promotor Bindungsprotein-ähnlichem 11 (SPL11) Transkriptionsfaktorpolypeptid. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die ein GRP kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumseigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch neue GRP-Nukleinsäuren und GRP-Polypeptide, sowie Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Da die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfäche für die Landwirtschaft verfügbar ist, muss die Forschung gezwungenermaßen die Effizienz der Landwirtschaft verbessern. Herkömmliche Maßnahmen zur kulturpflanzen- und gartenbaulichen Verbesserung nutzen Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken gewöhnlich arbeitsintensiv sind und Pflanzen ergeben, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Protoplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (gewöhnlich in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung von diesem genetischen Material in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Kulturpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen produzieren.
  • Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel die Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
  • Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle für Zucker, Öle und vielen Arte von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimlinge). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt; sie erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Pflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist eine wichtige Aufgabe bei modernen Reiszüchtungsprogrammen bei gemäßigten sowie tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind für eine korrekte Verankerung in wassergesetztem Reis wichtig. Wird Reis direkt auf geflutete Felder gesät, und müssen die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen, sind längere Stängel mit Wüchsigkeit gepaart. Bei der Ausführung von Drill- bzw. Reihensaat sind längere Mesokotyle und Koleoptile wichtig für ein gutes Auflaufen des Keimlings. Die Fähigkeit zu gentechnischen Einbringung von Jungpflanzenvitalität in Pflanzen ist in der Landwirtschaft von großer Bedeutung. Eine schlechte Jungpflanzenvitalität war beispielsweise eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea mays L.)-Hybriden auf der Basis von dem im Maisgürtel vorherrschenden Protoplasmas im Europäischen Atlantik.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die verbesserte abiotische Stresstoleranz. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Ernteverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al., Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Versalzung, Temperaturextrems, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Pflanzentoleranz gegenüber abiotischen Stress zu verbessern, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
  • Der Kulturpflanzenertrag kann somit durch Optimierung von einem der vorstehend genannten Faktoren gesteigert werden.
  • Je nach dem Endgebrauch kann die Modifikation bestimmter Ertragsmerkmale gegenüber anderen bevorzugt sein. Für Anwendungen wie Viehfutter- oder Holzproduktion oder für den Rohstoff Biokraftstoff kann eine Steigerung der vegetativen Pflanzenteile gewünscht sein, und für Anwendungen, wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Steigerung der Samenparameter besonders gewünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können je nach der Anwendung einige anderen gegenüber bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Steigerung des Samenertrags beitragen, und zwar in der Form einer erhöhten Samengröße oder einer gesteigerten Samenanzahl.
  • Ein Ansatz zur Steigerung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann über die Modifikation interner Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie Zellzyklus oder verschiedene Signalwege, die an dem Pflanzenwachstum oder Verteidigungsmechanismen beteiligt sind.
  • Es wurde nun überraschend gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein GRP-Polypeptid kodiert, ausgewählt aus einem die LOB-Domäne (LOB: Lateral Organ Boundaries, Laterale Organgrenzen) umfassenden Protein, hierin abgekürzt als LBD-Polypeptid, einem JMJC-(JUMONJI-C)-Polypeptid, einem Casein Kinase 1-Polypeptid, einem Pflanzen-Hömöodomänen-Finger-Homöodomänen-(plant homeodomain fingerhomeodomain (PHDf-HD))-Polypeptid, einem bHLH11-ähnlichem (basic Helix-Loop-Helix 11) Protein, einem ASR-(Abscisinsäure-, stress- und reifungsinduzierten (abscisic acid-, stress-, and ripening-induced))-Polypeptid und/oder einem Squamosa-Promotor Bindungsproteinähnlichem 11 (SPL11)-Transkriptionsfaktorpolypeptid, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und/oder verschiedenen verbesserten Pflanzenwachstumseigenschaften gegenüber Kontrollpflanzen ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung oder Steigerung von Ertragsmerkmalen und/oder zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumseigenschaften einer Pflanze gegenüber Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein GRP-Polypeptid kodiert, ausgewählt aus einem die LOB-Domäne (LOB: Lateral Organ Boundaries, Laterale Organgrenzen) umfassenden Protein, hierin abgekürzt als LBD-Polypeptid, einem JMJC-(JUMONJI-C)Polypeptid, einem Casein Kinase 1-Polypeptid, einem Pflanzen-Hömöodomänen-Finger-Homöodomänen-(plant homeodomain finger-homeodomain (PHDf-HD))-Polypeptid, einem bHLH11-ähnlichem (basic Helix-Loop-Helix 11) Protein, einem ASR- (Abscisinsäure-, stress- und reifungsinduzierten (abscisic acid-, stress-, and ripening-induced))-Polypeptid und/oder einem Squamosa-Promotor Bindungsprotein-ähnlichem 11 (SPL11) Transkriptionsfaktorpolypeptid, in einer Pflanze.
  • Stand der Technik
  • I. LOB-Domäne umfassendes Protein (LOB: Lateral Organ Boundaries, Laterale Organgrenzen)
  • LBD-Proteine (oder LOB-Domänenproteine) weisen eine gemeinsame konservierte Domäne in der N-terminalen Region auf, die als LOB-Domäne bezeichnet wird. LOB-Domänenproteine (Shuai et al., Plant Physiol. 129, 747–761, 2002) werden in verschiedenen Pflanzenarten gefunden und machen eine große Genfamilie aus: Arabidopsis besitzt Berichten zufolge mehr als 40 Gene, die LOB-Domänenproteine kodieren, mindestens 35 Gene werden in Reis gefunden und mindestens 15 in Mais. LBD-Polypeptide können Regulatoren von Transkriptionsfaktoren sein (zu denen die KNOX Transkriptionsfaktoren gehören) und spielen Postulationen zufolge eine Rolle bei der männlichen Blütenstands- und Kolbenverzweigung bei Mais (Bortiri et al., Plant Cell 18, 574–587, 2006), Adventivwurzelbildung (Liu et al., Plant J. 43, 47–56, 2005; Inukai et al., Plant Cell 17, 1387–1396, 2005), bei der Proliferation weiblicher Gametophyten (Evans et al., Plant Cell 19, 46–62, 2007), bei der Proximal-Distal-Mustererzeugung in den Petalen, (Chalfun-Junior et al., Plant Mol. Biol. 57, 559–575, 2005); Blatt-Morphologie und Aderung (Iwakawa et al., Plant Cell Physiol. 43, 467–478, 2002). Yang et al. (Molecular Phylogenetics and Evolution 39, 248–262, 2006) unterschieden drei Klassen von LBD-Proteinen in Reis, und zwar auf der Grundlage der Klassifizierung von Iwakawa et al. (2005) and Shuai et al. (2002). Die Modulation der Klasse I-LOB-Genexpression (Auf- oder Abwärts-Regulation der Expression) führt oft zu pleiotropen Effekten, was eine anomale Pflanzenform und Unfruchtbarkeit mit sich bringt. US20060218674 offenbart beispielsweise ein Verfahren zur Steigerung der Größe des Endosperms in einem Pflanzensamen durch Expression eines Klasse I-LOP-Polypeptids, jedoch sank die Größe des Embryos proportional.
  • Es wurde überraschend gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen ergibt, insbesondere gesteigerter Biomasse und gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze gegenüber Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassten eine gesteigerte Biomasse und einen gesteigerten Samenertrag.
  • II. JMJC(JUMONJI-C)-Polypeptid
  • Das erstmals beschriebene JUMONJI (was auf Japanisch kreuzförmig bedeutet) Gen wurde identifiziert durch Gen-Trapping in Mäusen, wo es bei der Entwicklung multipler Gewebe eine wesentliche Rolle spielt. Bisher machen JUMONJI-Polypeptide eine eigene Klasse von Proteinen aus, die man sowohl in Prokaryoten als auch Eukaryoten findet, einschließlich Bakterien, Pilzen und Pflanzen.
  • Die meisten Mitglieder der JUMONJI Polypeptid-Familie sind durch das Vorhandensein einer JmjC- oder JUMONJI-C-Domäne charakterisiert. Man nimmt an, dass während der Evolution alte Proteine, die nur auf der JmjC-Domäne erworbene zusätzliche Domänen umfassen, das Spektrum der JMJC Polypeptide, die man in der Natur vorfindet, erheblich erweitert. Besonders interessant sind solche JMJC-Polypeptide, die erworbene konservierte Domänen aufweisen, die an der DNA, RNA und Protein-Bindung beteiligt sind, wie Zinkfinger, FY-reiche RING-Finger-Protein, und F-Box-Domänen, die nahelegen, dass Polypeptide der JUMONJI Familie die Transkription, Chromatinfunktion und/oder Proteinumsatz regulieren können. Folglich können JUMONJI-Proteine bei Tieren Berichten zufolge die Entwicklung durch Steuerung der Genexpression und Chromatinaktivität beeinträchtigen. Ein Maus-JUMONJI-Gen reprimiert beispielsweise Cyclin D1 in Embryos, und diese Aktivität ist für die normale Kardiogenese erforderlich (Toyoda et al. 2003 Dev Cell. 5 (1): 85–97.).
  • Hinsichtlich des Verständnisses der Wirkungsweise von Proteinen, die die JmjC-Domäne enthalten, wurden große Fortschritte erzielt. Entscheidend für ihre biologische Funktion können einige der neuer entdeckten Enzymaktivitäten bei JMJC-Polypeptiden sein, beispielsweise JHDM1, ein JMJC Polypeptid menschlichen Ursprungs (Tsukada, Nature. 2006; 439 (7078): 811–6) hat eine Histondimethylase-Aktivität, und Asparaginylhydroxylase-Aktivität wurde bei FIH (HIF-lalpha hemmender Faktor), einem Transkriptionsfaktor, der bei der zellulären Reaktion gegen Hypoxie beteiligt ist, beschrieben (Linke et al. (2004) J. Biol. Chem., Vol. 279, 14391–14397).
  • Die Strukturen der JmjC-Domänen ähneln gewöhnlich denen einiger Metalloenzyme. Neuere Strukturanalysen der im JUMONJI-Protein FIH vorhanden JmjC-Domäne enthüllten die Aminosäurereste, die an der Bindung an die Cofaktoren 2-Oxoglutarat und Eisen Fe(II) beteiligt sind (Dann et al; Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99 (24): 15351–15356). FIH hat das HXD/E-Eisenbindungsmotiv, das für die meisten der 2-Oxoglutaratoxygenasen charakteristisch ist. Zusätzlich zu und in Übereinstimmung mit der Hydrolaseaktivität besteht die FIH-Sekundärstruktur aus einem Betastrang-Jellyroll-Kern, der die Fe(II)-Bindungsstelle umgibt. Diese Eigenschaften sind unter den JmjC-Domäne enthaltenden Proteinen konserviert (Trewick et al. EMBO Rep. 2005 (4): 15–20).
  • Bei Pflanzen sind zwei JMJC-Polypeptide den Berichten zufolge an der Steuerung der Blühdauer beteiligt. Sie wirken beide als Repressoren der Blühwege in Arabidopsis thaliana (Noh et al. Plant Cell. 2004. 16 (10): 2601–13). Die Enzymaktivität für die Pflanzenproteine wurde bisher nicht experimentell bestimmt.
  • Es wurde nun überraschend gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die das JUMONJI-C- oder JMJC-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere einen erhöhten Ertrag gegenüber Kontrollpflanzen ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Verbessern der Ertragsmerkmale einer Pflanze gegenüber Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassen eine oder mehrere von Gesamt-Samengewicht pro Pflanze, Tausendkorn (1000-Samen) Gewicht, Samenfüllrate, Harvest-Index, Jungpflanzenvitalität und Wurzel/Stängel-Index, und zwar und optimalen Wachstumsbedingungen und suboptimalen milden trockenen Bedingungen.
  • III. Casein-Kinase I
  • Proteinkinasen veranschaulichen eine Superfamilie, und die Mitglieder dieser Superfamilie katalysieren die reversible Übertragung einer Phosphatgruppe von ATP auf Serin, Threonin und Tyrosin-Aminosäure-Seitenketten auf Ziel-Polypeptiden. Insbesondere die Caseinkinase 1 (CKI) Familie (EC 2.7.11.1) der Proteinkinasen wirken als Regulatoren der Signaltransduktionswege in den meisten eukaryotischen Organismen. In Hefe ist CKI an der Regulation der DNA-Reparatur und Zellzyklusprogression beteiligt (Hoekstra MF et al., Science 253: Brockman JL et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 89: 9454–9458, 1992; Dhillon N und Hoekstra MF, EMBO J 13: 2777–2788, 1994). Caseinkinase I Proteine sind monomere Proteinkinasen vom Serin/Threonin-Typ, die eine hochkonservierte zentrale Kinasedomäne aufweisen. Mitglieder dieser Familie haben divergente N-terminale and C-terminale Extensionen. Die N-terminale Region ist für die Substraterkennung verantwortlich, und die C-terminale Extension ist für die Wechselwirkung der Kinase mit Substraten wichtig. Die C-terminale Extension ist wahrscheinlich auch wichtig zur Vermittlung der Regulation durch Autophosphorylierung (Gross and Anderson, 1998 Cell Signal 10: 699–711; Craves und Roach, 1995, J Biol Chem 270: 21689–21694).
  • In Pflanzen wurden mehrere Mitglieder der CKI-Proteinfamilie kloniert und biochemisch charakterisiert (Klimczak und Cashmore AR, 1993. Biochem. J. 293: 283–288; Liu et al. 2003, Plant Journal. 36, 189–202; Lee et al. 2005 Plant Cell. 17 (10): 2817–2831). Das Arabidopsis-Genom enthielt Befunden zufolge mindestens 14 Casein Kinase I-artige (CKL) Gene. In den konservierten Kinasedomänen wiesen die Polypeptide 89% Sequenzähnlichkeit auf der Aminosäureebene zueinander auf. Die 14 Arabidopsis CKL Isoformen wurden zudem auf der Basis der subzellulären Lokalisierung in drei Gruppen unterteilt. Die Gruppe 1 befindet sich vorwiegend am Zellrand; die Gruppe 2 im Kern; die Gruppe 3 im Cytoplasma. Ein Nicotiana tabacum CKI wurde in den Plasmodesmen lokalisiert und scheint eine Rolle bei der Kommunikation zwischen den Zellen zu spielen. (Lee et al. 2005). Andere vorgeschlagene Rollen für Pflanzen-CKI ist die Signaltransduktion in Reaktion auf Umweltstimuli, Wurzelentwicklung und Pflanzenhormon-Empfindlichkeit (Liu et al.).
  • Überraschend wurde es jetzt entdeckt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen gegenüber Kontrollpflanzen ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale einer Pflanze gegenüber Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassten einen oder mehrere von gesteigerter Biomasse, gesteigerter Not-Vitaliät und gesteigertem Samenertrag.
  • IV. Pflanzen-Homöodomänen-Finger-Homöodomänen-(Plant homeodomain finger-homeodomain (PHDf-HD))-Polypeptid
  • Transkriptionsfaktoren werden gewöhnlich als Proteine definiert, die eine sequenzspezifische DNA-Bindungsaffinität zeigen, und die die Transkription aktivieren und/oder reprimieren können. Das Arabidopsis thaliana Genom kodiert mindestens 1533 Transkriptionsregulatoren, die ~5,9% der geschätzten Gesamtzahl der Gene ausmachen (Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109). Die Datenbank der Reis-Transkriptionsfaktoren (DRTF) ist eine Sammlung bekannter und vorhergesagter Transkriptionsfaktoren von Oryza sativa L. ssp. indica und Oryza sativa L. ssp. japonica, und enthält derzeit 2025 mutmaßliche Genmodelle für Transkriptionsfakten (TF) in indica and 2,384 in japonica, die in 63 Familien verteilt sind (Gao et al. (2006) Bioinformatics 2006, 22 (10): 1286–7).
  • Eine dieser Familien ist die Superfamilie der Homöodömänen-(HD)-Transkriptionsfaktoren, die bei vielen Aspekten der Entwicklungsprozesse beteiligt sind. HD-Transkriptionsfaktoren sind durch die Anwesenheit einer Homöodomäne (HD) charakterisiert, bei der es sich um eine 60 Aminosäure DNA-bindende Domäne (BD) handelt. Arabidopsis thaliana und Reis enthalten etwa 100 HD-Transkriptionsfaktoren, die auf der Basis der Aminosäuresequenz-Identität in Subfamilien unterteilt werden können (Richardt et al. (2007) Plant Phys 143 (4): 1452–1466). Einige dieser Subfamilien sind durch die Anwesenheit zusätzlicher konservierter Domänen charakterisiert, die die DNA-Bindung und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen erleichtern.
  • Eine dieser Domänen ist der PHD-Finger, der als Pflanzen-Homöodomänen-Finger (plant homeodomain finger (PHDf)) bezeichnet wird, aufgrund seiner Assoziation auf einem gleichen Polypeptid mit einer DNA-bindenden HD, die ursprünglich durch Aminosäuresequenzidentität zwischen einem Mais-Homöobox-Transkriptionsfaktor ZmHOX1a (Bellman & Werr (1992) EMBO J 11: 3367–3374) und seinem Arabidopsis-Verwandten ATHAT3.1 (Schindler et al. (1993) Plant J 4: 137–150) identifiziert wurde. Der PHDf ist ein Cys4-His-Cys3 Zinkinger-artiges Motiv, das mit zwei Zinkionen Chelate bilden kann. PHDFs findet man in nukleären Proteinen und sind wahrscheinlich an der chromatinvermittelten Transkriptionsregulation beteiligt (Halbach et al. (2000) Nucleic Acid Res 28 (18): 3542–3550).
  • Transkriptionsfaktoren, die einen PHDf und eine HD kombinieren, werden daher als PHDf-HDs bezeichnet (Halbach et al. (2000) siehe oben). In Pflanzen, sind diese PHDf-HDs weiter gekennzeichnet durch die Anwesenheit eines Leucin-Zippers (ZIP) stromaufwärts des PHDf. Beide Domänen (ZIP und der PHDf) bilden zusammen eine stark konservierte 180 Aminosäure-Region, die als ZIP/PHDf Domäne bezeichnet wird (Halbach et al. (2000) siehe oben).
  • Transgene Tabakpflanzen, die eines der beiden Mais-PHDf-HD Polypeptide (ZmHOX1a oder ZmHOX1b) stark überexprimieren, und zwar mit einem Blumenkohlmosaikvirus 35S Promotor in Kombination mit einem Omega-Enhancer, zeigten identische morphologische Änderungen: Größenreduktion, Adventivwurzelbildung und homöotische Blütentransformationen (Uberlacker et al. (1996) Plant Cell 8: 349–362). Transgene Reis und Tabakpflanzen, die Oryza sativa HAZ1 PHDF-HD-Polypeptid mit dem Blumenkohl-Mosaikvirus 35S-Promotor stark überexprimieren, zeigten kein anormales Wachstum oder Phänotypänderung im Vergleich mit den Wildtypen (Ito et al. (2004) Gene 331: 9–15).
  • In US-Patent 7 196 245 , wurde ein Arabidopsis thaliana PHDf-HD-Polypeptid (identifiziert als G416) in Arabidopsis transformiert und zeigte ein frühes Blühen in den transgenen Pflanzen im Vergleich mit Kontrollpflanzen ohne Auswirkung auf den Samenertrag.
  • Es wurde überraschend entdeckt, dass die Modulation, vorzugsweise die Steigerung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid ergibt, Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise gesteigerten Samen-Ertragsmerkmalen, im Vergleich mit Kontrollpflanzen ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale, vorzugsweise der Samen-Ertragsmerkmale, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation, vorzugsweise die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die gesteigerten Ertragsmerkmale, vorzugsweise gesteigerten Samen-Ertragsmerkmale, umfassen eine oder mehr von: einer gesteigerten Anzahl von Primärrispen, einem gesteigerten Gesamtsamenertrag pro Pflanze, einer gesteigerten Anzahl gefüllter Samen, einem gesteigerten Tausendkorngewicht (TKG), einem gesteigerten Harvest-Index.
  • V. bHLH11-artiges(basic Helix-Loop-Helix 11)-Protein
  • Transkriptionsfaktoren werden gewöhnlich als Proteine definiert, die eine sequenzspezifische DNA-Bindung zeigen, und die die Transkription aktivieren und/oder reprimieren können. Die Superfamilie der basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren ist eine der größten Familien der Transkriptionsfaktoren, die in Arabidopsis thaliana (Toledo-Ortiz et al., Plant Cell 15, 1749–1770, 2003; Bailey et al., Plant Cell 15, 2497–2501, 2003) und in Reis (Li et al Plant Physiol. 141, 1167–1184, 2006) charakterisiert wurde. Die unterscheidende Eigenschaft der bHLH-Transkriptionsfaktor-Famile ist die Anwesenheit einer zweiteiligen Domäne, die aus etwa 60 Aminosäuren besteht. Diese zweiteilige Domäne umfasst eine DNA-bindende basische Region, die an eine Konsensus-Hexanucleotid-E-box bindet, und zwei a-Helices, die durch eine variable Loop-Region getrennt ist, die sich C-terminal von der basischen Domäne befindet. Die beiden a-Helices fördern die Dimerisierung, was die Bildung von Homo- und Heterodimeren zwischen verschiedenen Familienmitgliedern ermöglicht. Die bHLH-Domäne ist zwar evolutionär konserviert, jedoch gibt es nur eine geringe Sequenzähnlichkeit zwischen den Stämmen außerhalb der Domäne. Li et al. (2006) klassifizieren die bHLH-Transkriptionsfaktoren von Reis und Arabidopsis auf der Basis der Sequenz der bHLH-Domänen in 22 Subfamilien.
  • Über die Funktion der bHLH11-artigen Polypeptide in Pflanzen ist wenig bekannt. Bisher wurde nur ein bHLH11-artiges Polypeptid, OsPTF1 aus Reis, charakterisiert. OsPTF1 ist Berichten zufolge an der Toleanz gegenüber Phosphat-Hungern beteiligt (Vi et al., Plant Physiol. 138, 2087–2096). Reispflanzen, die dieses Gen unter der Kontrolle des 35S-Promotors überexprimieren, zeigten keinerlei verschiedenen Phänotyp im Vergleich mit Kontrollpflanzen, wenn sie unter normalen Bedingungen gewachsen waren, aber unter Phosphatmangelbedingungen hatten die Pflanzen eine verbesserte Phosphataufnahme. Unter Phosphatmange zeigten die transgenen Pflanzen einen Anstieg der Biomasse, Phosphatgehalt, verstärkte Ausläuferbildung und gesteigerten Samenertrag.
  • Es wurde überraschend gefunden, dass die Modulation der Expression I in einer Pflanze von einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-artiges Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere einen gesteigerten Ertrag im Vergleich mit Kontrollpflanzen ergibt. Diese Wirkungen wurden unter Wachstumsbedingungen gezeigt, bei denen Phosphat nicht limitiert war.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze gegenüber Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-artiges Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassten einen gesteigerten Samenertrag.
  • VI. ASR(abscisinsäure-, stress-, und reifungsinduziertes)Protein
  • ASR-(abscisinsäure-, stress-, und reifungsinduzierte)-Polypeptide wurden zuerst in Tomate (Iusem et al 1993 Plant Physiol 102: 1353–1354) als kleine stark geladene hydrophile Proteine identifiziert, die sich auf den Kernen der Zellen befinden und an Chromatin gebunden sind. Die Asr-Genfamilie, die ASR-Polypeptide kodiert, ist in höheren Pflanzen weitverbreitet, und ASR-Homologa wurden aus einer großen Zahl dikotyler und monokotyler Pflanzen kloniert (Carrai et al. 2004 Trends Plant Sci 9: 57–59). Die meisten Asr-Gene werden unter verschiedenen Umweltstressbedingungen während der Fruchtreife und bei der Zellbehandlung mit dem Hormon ABA aufwärts reguliert. ASR-Polypeptide zeigen einen hohen Grad von Sequenzkonservierung (Frankel et al. 2006. Gene Pages 74–83). Alle bekannten Asr-Gene enthalten zwei hochkonservierte Regionen. Die erste Region enthält einen Bereich von His-Resten am N-Terminus, und besitzt eine sequenzspezifische Zn2+-abhängige DNA-Aktivität (Kalifa et al., 2004a Biochem J 381: 373–378). Der zweite Bereich ist ein großer Teil der C-terminalen Sequenz, der oft ein Kernlokalisierungssignal NLS besitzt (Cakir et al., 2003 Plant Cell 15: 2165–2180). Das ASR1-Protein von Tomate ist ein intrinsisch unstrukturiertes Protein, das bei der Bindung von Zinkionen geordnet (gefaltet) wird und Dimere bildet (Goldgur et al. Plant Physiol. 2007 Feb; 143 (2): 617–28).
  • Eine mutmaßliche Rolle der ASR-Polypeptide bei der Regulation der Gentranskription wurde vorgeschlagen. Berichten zufolge ergaben Hefe-Ein-Hybrid-Experimente, dass ein ASR von Wein an den Promotor eines Hexose-Transporter-Gens (VvHT1) bindet. Übereinstimmend wurde eine Rolle für Asr1 bei der Kontrolle der Hexose-Aufnahme bei heterotrophen Organen, wie Kartoffel-Knollen vorgeschlagen (Frankel et al. Plant Mol Biol. 2007 Mar; 63 (5): 719–30). Die zinkabhängige DNA-Bindungsaktivität eines Proteinmitglieds der ASR-Familie wurde beschrieben (Kalifa et al. 2004 Biochem J. 2004 Jul 15; 381 (Pt 2): 373–8). DNA- and Zinkbindende Domänen des ASR1-Proteins wurden kartiert (Rom et al. 2006. Biochimie. 88 (6): 621–8; Goldgur et al. 2007. Plant Physiol. Feb; 143 (2): 617–28).
  • Die Verwendung der ASR-Polypeptide zur Verbesserung agronomischer Merkmale in Pflanzen wurde offenbart als Verfahren zur Steigerung der Toleranz der Pflanze gegen bestimmten abiotischen Stress. Die Überexpression in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) des ASR1 orthologen LLA23 Gens aus der Lilie (Lilium longiflorum) steigert beispielsweise die Pflanzentoleranz gegenüber Trockenheit und Versalzung (Yang et al. 2005. Plant Physiol 139: 836–846). Das US-Patent 7 154 025 offenbart zudem Verfahren zur Steigerung der Resistenz gegenüber Wassermangelstress durch Steigern der Menge der ASR-Proteine in einer Pflanze.
  • Überraschend wurde es gefunden, dass eine Modulation der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen unter Nicht-Stress-Wachstumsbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale unter Nicht-Stress-Wachstumsbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend die Modulation der Expression von einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • VII. Squamosa-Promotorbindungsprotein-artiges 11 (SPL11)
  • Transkriptionsfaktor-Polypeptide werden gewöhnlich als Proteine definiert, die eine sequenzspezifische DNA-Bindungsaffinität zeigen, und die die Transkription aktivieren und/oder reprimieren können. Die Squamosa-Promotorbindungsprotein-artigen (Squamosa Promoter binding Protein-like (SPL)) Transkriptionsfaktor-Polypeptide sind strukturell verschiedene Proteine, die ein hochkonservierte DNA-Bindungsdomäne (DBD) mit etwa 80 Aminosäuren Länge miteinander teilen (Klein et al. (1996) Mol Gen Genet 259: 7–16; Cardon et al. (1999) Gene 237: 91–104). Die Bindungsstelle der SPL Transkriptionsfaktor-DNA Konsensussequenz im Promotor der Zielgene ist 5'-TNCGTACAA-3', wobei N für eine beliebige Base steht. In der SPL-DBD befinden sich 10 konservierte Cystein (Cys) oder Histidin-(His)-Reste (siehe 28), von denen 8 zinkkoordinierende Reste sind, die zwei Zinkionen binden, die zur Bildung einer SPL-spezifischen Zinkfinger-Tertiärstruktur notwendig sind. (Yamasaki et al. (2004) J Mol Biol 337: 49–63). Ein zweites konserviertes Merkmal in der SPL DBD ist ein zweigeteiltes Kernlokalisierungssignal. Außerhalb der DBD wird ein Mikro-RNA(miRNA)-Ziel-Motiv, spezifisch angezielt durch die miR156-Familie der miRNAs in den meisten der Nukleinsäuresequenzen gefunden, die SPL-Transkriptionsfaktor-Polypeptide (entweder in der kodierenden Region oder in der 3'-UTR) im gesamten Pflanzenreich kodieren. (Rhoades et al. (2002) Cell 110: 513–520). miRNAs steuern die SPL-Genexpression posttranskriptionell durch Anzielen SPL-kodierender mRNAs zum Abbau oder durch translationale Repression.
  • Das Arabidopsis-Genom kodiert mindestens 1533 Transkriptionsregulatoren, die ~5,9% der geschätzten Gesamtgenzahl ausmachen (Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109). Die Autoren berichten über 16 SPL Transkriptionsfaktor-Polypeptide in Arabidopsis thaliana, mit einer geringen Sequenzähnlichkeit zwischen ihnen (abgesehen von den vorstehend genannten Merkmalen), wobei die Größe des abgeleiteten SPL-Polypeptids von 131 bis 927 Aminosäuren reicht. Trotzdem wurden Paare der SPL-Transkriptionsfaktor-Polypeptide, die eine höhere Sequenzhomologie teilen, in der SPL-Familie dieser Pflanze entdeckt (Cardon et al. (1999)).
  • Die SPL-Transkriptionsfaktor-Polypeptide (die nur in Pflanzen gefunden werden), die bisher charakterisiert wurden, funktionieren in der Pflanzenentwicklung, insbesondere in der Blütenentwicklung. Transgene Pflanzen, die ein SPL3-Transkriptionsfaktor-Polypeptid überexprimieren, blühen Berichten zufolge früher (Cardon et al. (1997) Plant J 12: 367–377). In der Europäischen Patentanmeldung EP1033405 , sind die Nukleinsäure und die abgeleiteten Polypeptidsequenzen des SPL11 Transkriptionsfaktorpolypeptids offenbart.
  • Es wurde überraschend gefunden, dass die Modulierung der Expression I in eine Pflanze von einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale einer Pflanze im Vergleich mit Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Das gesteigerte Ertragsmerkmal umfasst eine oder mehrere von gesteigerter Auflaufvitalität (verbesserte Jungpflanzenvitalität des Keimlings), Gesamtsamenertrag (Samengewicht), Samenfüllrate (Samenfüllrate), Anzahl der gefüllten Samen, Anzahl der Blüten (Samen) pro Rispe, Harvest-Index und Tausendkorn (1000-Korn)-Gewicht, wobei ein solcher Anstieg unter optimalen und unter suboptimalen Wachstumsbedingungen, vorzugsweise milden Trockenbedingungen, auftreten kann.
  • Gemäß einer Ausführungsform werden neue SPL11-Nukleinsäuren und SPL11-Polypeptide sowie Konstrukte bereitgestellt, die SPL11-kodierende Nukleinsäuren umfassen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Definitionen
  • Polypeptid(e)/Protein(e)
  • Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, welche über Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
  • Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
  • Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination davon, in einer polymeren unverzweigten Form mit einer beliebigen Länge.
  • Kontroilpflanze(n)
  • Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Gewöhnlich gehört die Kontrollpflanze zur selben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze” steht im vorliegenden Zusammenhang nicht nur für ganze Pflanzen, sondern auch Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
  • Homologon/Homologa
  • ”Homologa” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen nichtmodifizierten Protein, sie weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das nichtmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
  • Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
  • Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide gehören die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
  • Eine Substitution bezieht sich auf den Austausch von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch je nach den funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Clustern vorliegen; Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten vor. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionstabellen sind dem Fachmann bestens bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutioren
    Rest konservative Substitutionen Rest konservative Substitutionen
    Ala Ser Leu Ile; Val
    Arg Lys Lys Arg; Gln
    Asn Gln; His Met Leu; Ile
    Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
    Gln Asn Ser Thr; Gly
    Cys Ser Thr Ser; Val
    Glu Asp Trp Tyr
    Gly Pro Tyr Trp; Phe
    His Asn; Gln Val Ile; Leu
    Ile Leu, Val
  • Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Peptidsynthese-Techniken, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind im Stand der Technik bestens bekannt. So kennt der Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA; wozu M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder andere Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese gehören.
  • Derivate
  • ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie das interessierende Protein, Substitutionen von Aminosäuren durch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. ”Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nicht natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, umfassen, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das bzw. der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, damit es leichter nachgewiesen werden kann, und nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins. ”Derivate” umfassen darüber hinaus auch Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Überblick über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
  • Ortholog(a)/Paralog(a)
  • Orthologa und Paraloga umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Stammbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloga sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Urgens entstanden sind, und Orthologa sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind, und die auch von einem gemeinsamen Urgen abstammen.
  • Domäne
  • Der Begriff ”Domäne” steht für einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologa variieren können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologa identifiziert und können als Identifikatoren verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
  • Motiv/Konsensussequenz/Signatur
  • Der Begriff ”Motiv” oder ”Konsensussequenz” oder ”Signatur” steht für eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
  • Hybridisierung
  • Der Begriff ”Hybridisierung” ist wie hier definiert ein Vorgang, bei dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen Basenpaarungen eingehen. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix, wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem anderen Harz immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann außerdem stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einen festen Träger, wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran, immobilisiert ist oder mittels z. B. Photolithographie auf z. B. einen Quarzglasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder ”micorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um ”hairpins” oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
  • Der Begriff ”Stringenz” steht für diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch Bedingungen, wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelztemperatur (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter Tm liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter Tm liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden gewöhnlich zur Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt. Die Sequenzen der Nukleinsäuren können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes voneinander abweichen, und dennoch kodieren die Nukleinsäuren ein im Wesentlichen identisches Polypeptid. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
  • Bei dem Tm-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisiert. Der Tm-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und der Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen hybridisieren zum Beispiel spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei 16°C bis 32°C unter dem Tm-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid ermöglicht eine Hybridisierung bei 30 bis 45°C, obwohl die Hybridisierungsrate gesenkt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für lange Sonden sinkt der Tm-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der Tm-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:
    • 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6 × log10[Na+]a + 0,41 × %[G/Cb] – 500 × [Lc]–1 – 0,61 × % Formamid
    • 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5(log10[Na+]a) + 0,58(%G/Cb) + 11,8(%G/Cb)2 – 820/Lc
    • 3) oligo-DNA- oder oligo-RNAd-Hybride: Für < 20 Nukleotide: Tm = 2 (Ia) Für 20–35 Nukleotide: Tm = 22 + 1,46 (Ia)
      a
      oder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau.
      b
      nur für %GC im Bereich von 30% bis 75% genau.
      b
      L = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren.
      d
      oligo, Oligonukleotid; In, effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).
  • Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit RNase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach senkt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach senkt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung gewöhnlich auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der durch unspezifische Hybridisierung entsteht, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu entscheidenden Faktoren solcher Waschvorgänge gehören die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden gewöhnlich bei oder unter Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie der Hintergrund ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisverfahren wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Dem Fachmann sind die verschiedenen Parameter geläufig, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Übliche hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen zum Beispiel die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–– 1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
  • Zur Bestimmung des Stringenzausmaßes, kann Sambrook et al., (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
  • Spleißvariante
  • Der Begriff ”Spleißvariante”, wie er hier verwendet wird, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in der ausgewählte Introns und/oder Exons ausgeschnitten, ersetzt, versetzt oder zugefügt wurden, oder in der Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten bleibt die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten; dies lässt sich erzielen, indem man funktionelle Segmente des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten findet man in der Natur oder künstlich hergestellt. Verfahren zur Vorhersage und Isolation dieser Spleißvarianten sind im Stand der Technik bestens bekannt (siehe beispielsweise Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
  • Allelvariante
  • Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die sich an der gleichen Chromosomenposition befinden. Allelvarianten umfassen Einzelnukleotid-Polymorphismus (Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)), sowie Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen (Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs)). Die Größe der INDELs ist gewöhnlich kleiner als 100 bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz an Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
  • Genshuffling/gerichtete Evolution
  • Genshuffling oder gerichtete Evolution besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Teilen davon zu erzeugen, die Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al., (2004), Science 304 (5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
  • Regulationselement/Kontrollsequenz/Promotor
  • Die Begriffe ”Regulationselement”, ”Kontrollsequenz” und ”Promotor” werden im vorliegenden Text jeweils austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die diejenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, exprimieren können. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich gewöhnlich auf eine Nukleinsäurekontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die an der Erkennung und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression auf Umweltreize und/oder von außen wirkende Reize hin oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, der in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhaltet. Der Begriff ”Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verbessert.
  • Ein ”pflanzlicher Promotor” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines kodierenden Sequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Ein pflanzlicher Promotor muss daher nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen, zum Beispiel von Viren, die Pflanzenzellen angreifen, abstammen. Der ”pflanzliche Promotor” kann auch von einer Pflanzenzelle abstammen, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere ”pflanzliche” Regulationssignale, wie ”pflanzliche” Terminatoren zu. Die stromaufwärts der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten Nukleotidsequenzen gelegenen Promotor können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne dass die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promotoren, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, gestört wird. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promotoren durch Modifizieren ihrer Sequenz steigern oder sie vollständig durch aktivere Promotoren ersetzen, sogar durch Promotoren von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder einen geeigneten Promotor umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
  • Zur Identifikation funktionell äquivalenter Promotoren kann die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, indem man den Promotor funktionsfähig mit einem Reporter-Gen verknüpft und das Expressionsausmaß und/oder das Muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze untersucht. Geeignete bestens bekannte Reportergene umfassen beispielsweise Betaglucuronidase oder Betagalactosidase. Die Promotor-Aktivität wird untersucht, indem man die Enzymaktivität der Betaglucuronidase oder Betagalactosidase misst. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit der- bzw. demjenigen eines Referenz-Promotors verglichen werden (wie er beispielsweise in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren der mRNA-Spiegel oder durch Vergleich der mRNA-Spiegel der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Housekeeping-Genen, wie 18S rRNA, untersucht werden, wobei Verfahren des Standes der Technik, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse der Autoradiogramme, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR verwendet werden (Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994). Ein ”schwacher Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor, der die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem niedrigen Spiegel steuert. ”Niedrige Spiegel” sind Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis zu etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/500000 Transkripte pro Zelle. Ein ”starker Promotor” steuert die Expression einer kodierenden Sequenz dagegen auf hohem Spiegel, oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle. Ein ”mittelstarker Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor, der die Expression einer kodierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor steuert, insbesondere auf einem Spiegel, der in allen Fällen unter demjenigen Spiegel liegt, der sich unter der Kontrolle eines 35S CaMV-Promotors ergibt.
  • Funktionsfähig verknüpft
  • Der Begriff ”funktionsfähig verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotorsequenz die Transkription des interessierenden Gens einleiten kann.
  • Konstitutiver Promotor
  • Ein ”konstitutiver Promotor” steht für einen Promotor, der während der meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionell aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promotoren finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promotoren
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Actin McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
    HMGP WO 2004/070039
    CAMV 35S Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
    CaMV 19S Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
    GOS2 de Pater et al., Plant J. Nov.; 2 (6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
    Ubiquitin Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
    Reis-Cyclophilin Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25 (5): 837–43, 1994
    Mais-H3-Histon Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
    Luzerne-H3-Histon Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
    Actin 2 An et al., Plant J. 10 (1); 107–121, 1996
    34S FMV Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
    Kleine Rubisco-Untereinheit US 4,962,028
    OCS Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (5): 2553
    SAD1 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
    SAD2 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
    Nos Shaw et al., (1984), Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831–7846
    V-ATPase WO 01/14572
    Superpromotor WO 95/14098
    G-Box-Proteine WO 94/12015
  • Ubiquitärer Promotor
  • Ein Ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
  • Entwicklungsregulierter Promotor
  • Ein entwicklungsregulierter Promotor ist während gewisser Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsrelevante Veränderungen auftreten, aktiv.
  • Induzierbarer Promotor
  • Ein induzierbarer Promotor weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz hin auf, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder ”pathogen induzierbar”, d. h. wird dann aktiviert, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
  • Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
  • Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein Promotor, der die Transkription bevorzugt in bestimmten Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw. initiieren kann. Ein ”wurzelspezifischer Promotor” ist beispielsweise ein Promotor, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promotoren, die die Transkription nur in bestimmten Zellen initiieren können, werden im vorliegenden Text als ”zellspezifisch” bezeichnet.
  • Beispiele für wurzelspezifische Promotoren sind in Tabelle 2b unten angeführt: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promotoren
    Herkunftsgen Literaturangabe
    RCc3 Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27 (2): 237–48
    Arabidopsis-PHT1 Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
    Phosphattransporter aus Medicago Xiao et al., 2006
    Arabidopsis-Pyk10 Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161 (2): 337–346
    in Wurzeln exprimierbare Gene Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987
    auxininduzierbares Gen des Tabaks Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991
    β-Tubulin Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988
    wurzelspezifische Gene aus Tabak Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990
    G1-3b-Gen aus B. napus United States Patent No. 5,401,836
    SbPRP1 Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993
    LRX1 Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128
    BTG-26 aus Brassica napus US 20050044585
    LeAMT1 (Tomate) Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
    Das LeNRT1-1 (Tomate) Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
    Klasse-I-Patatingen (Kartoffel) Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991
    KDC1 (Daucus carota) Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
    TobRB7-Gen W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
    OsRAB5a (Reis) Wang et al., 2002, Plant Sci. 163: 273
    ALF5 (Arabidopsis) Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
    NRT2;1Np (N. plumbaginifolia) Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)
  • Ein samenspezifischer Promotor ist in erster Linie in Samengewebe, jedoch nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (bei ”leaky”-Expression) transkriptionell aktiv. Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann endosperm- und/oder aleuron- und/oder embryospezifisch sein. Beispiele für samenspezifische Promotoren (endosperm-/aleuron-/embryospezifisch) sind in Tabelle 2d, e, f unten angegeben. Weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren sind bei Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, und diese Offenbarung ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen als wäre sie hier vollständig beschrieben. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promotoren
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Samenspezifische Gene Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
    Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
    Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990
    Paranuss-Albumin Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992
    Legumin Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
    Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987
    Zein Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14 (3): 323–32, 1990
    napA Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996
    LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
    Weizen-SPA Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
    α, β, γ-Gliadine aus Weizen EMBO J. 3: 1409–15, 1984
    Itr1-Promotor aus Gerste Diaz et al., (1995), Moll Gen. Genet. 248 (5): 592–8
    B1, C, D, Hordein aus Gerste Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
    Gerste-DOF Mena et al., The Plant Journal, 116 (1): 53–62, 1998
    blz2 EP99106056.7
    synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998
    Reis-Prolamin NRP33 Wu et al., Plant Cell Physiology 39 (8) 885–889, 1998
    a-Globulin Glb-1 aus Reis Wu et al., Plant Cell Physiology 39 (8) 885–889, 1998
    Reis-OSH1 Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    a-Globulin REB/OHP-1 aus Reis Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
    Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase Trans. Res. 6: 157–68, 1997
    Mais-ESR-Genfamilie Plant J. 12: 235–46, 1997
    a-Kafirin aus Sorghumhirse DeRose et al., Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    Reis-Oleosin Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
    Sonnenblumen-Oleosin Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
    PRO0117, mutmaßliches 40S-Ribosomenprotein aus Reis WO 2004/070039
    PRO0136, Reis-Alaninaminotransferase unveröffentlicht
    PRO0147, Trypsinhemmer ITR1 (Gerste) unveröffentlicht
    PRO0151, Reis-WSI18 WO 2004/070039
    PRO0175, Reis-RAB21 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    a-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin β-artiges Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Gerste-Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
    Tabelle 2d: Beispiele für endospermspezifische Promotoren
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al., (1987), FERS Letts. 221: 43–47
    Zein Matzke et al., (1990), Plant Mol. Biol. 14 (3): 323–32
    LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen Colot et al., (1989), Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al., (1989), NAR 17: 461–2
    Weizen-SPA Albani et al., (1997), Plant Cell 9: 171–184
    Weizen-Gliadine Rafalski et al., (1984), EMBO 3: 1409–15
    Itr1-Promotor aus der Gerste Diaz et al., (1995), Mol. Gen. Genet. 248 (5): 592–8
    B1, C, D, Hordein aus der Gerste Cho et al., (1999), Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al., (1993), Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al., (1996), Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
    Gersten-DOF Mena et al., (1998), Plant J. 116 (1): 53–62
    blz2 Onate et al., (1999), J. Biol. Chem. 274 (14): 9175–82
    Synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al., (1998), Plant J. 13: 629–640
    Reis-Prolamin NRP33 Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39 (8) 885–889
    Reis-Globulin Glb-1 Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39 (8) 885–889
    Reis-Globulin REB/OHP-1 Nakase et al., (1997), Plant Molec. Biol. 33: 513–522
    Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase Russell et al., (1997), Trans. Res. 6: 157–68
    Mais-ESR-Genfamilie Opsahl-Ferstad et al., (1997), Plant J. 12: 235–46
    Sorghumhirse-Kafirin DeRose et al., (1996), Plant Mol. Biol. 32: 1029–35
    Tabelle 2e: Beispiele für embryospezifische Promotoren:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Reis-OSH1 Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    PRO0151 WO 2004/070039
    PRO0175 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    Tabelle 2f: Beispiele für aleuronspezifische Promotoren:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    a-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin-β-artiges Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Gersten-Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
  • Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor wie im vorliegenden Text definiert ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.
  • Beispiele für Promotoren, die für das grüne Gewebe spezifisch sind und die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in der Tabelle 2g dargestellt. Tabelle 2g: Beispiele für die Promotoren, die für das grüne Gewebe spezifisch sind
    Gen Expression Literaturangabe
    Orthophosphatdikinase aus Mais Blattspezifisch Fukavama et al., 2001
    Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Mais Blattspezifisch Kausch et al., 2001
    Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Reis Blattspezifisch Liu et al., 2003
    Kleine Rubisco-Untereinheit aus Reis Blattspezifisch Nomura et al., 2000
    Beta-Expansin EXBP9 aus Reis Sprossspezifisch WO 2004/070039
    Kleine Rubisco-Untereinheit aus Straucherbse Blattspezifisch Panguluri et al., 2005
    RBCS3A aus Erbse Blattspezifisch
  • Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promotor ist ein meristemspezifischer Promotor, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Beispiele für Promotoren, die für das grüne Meristem spezifisch sind und die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in Tabelle 2h unten dargestellt. Tabelle 2h: Beispiele für meristemspezfische Promotoren
    Herkunftsgen Expressionsmuster Literaturangabe
    Reis-OSH1 Sprossapikalmeristem, von globulärem Embryostadium bis zum Keimlingsstadium Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
    Reis-Metallothionein Meristemspezifisch BAD87835.1
    WAK1 & WAK2 Spross- und Wurzelapikalmeristeme, sowie in sich ausbreitenden Blättern und Kelchblättern Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13 (2): 303–318
  • Terminator
  • Der Begriff ”Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
  • Modulation
  • Der Begriff ”Modulation” steht in Bezug auf die Expression oder Genexpression für ein Verfahren, bei dem das Expressionsausmaß durch die Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze dahingehend geändert ist, dass das Expressionsausmaß erhöht oder gesenkt ist. Die ursprüngliche unmodulierte Expression kann eine Art Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit nachfolgender Translation sein. Der Begriff ”Modulation der Aktivität” bedeutet eine Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine, die einen erhöhten Ertrag und/oder ein gesteigertes Wachstum der Pflanzen ergibt.
  • Expression
  • Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht für die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht insbesondere für die Transkription eines Gens oder mehrerer Gene oder eines genetischen Konstrukts in strukturelle RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit oder ohne darauffolgende Translation des letzteren in ein Protein. Der Prozess beinhaltet die Transkription der DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
  • Erhöhte Expression/Überexpression
  • Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie es hier verwendet wird steht für eine beliebige Form von Expression, die über den Spiegel des ursprünglichen Wildtyp-Spiegel hinaus geht.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik gut dokumentiert und beinhalten beispielsweise die Überexpression, die durch geeignete Promotoren getrieben wird, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, die als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (gewöhnlich stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, die das interessierende Polypeptid kodiert, aufwärtsreguliert wird. Endogene Promotoren können beispielsweise in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der korrekten Orientierung und im korrekten Abstand von einem erfindungsgemäßen Gen in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
  • Ist eine Polypeptidexpression gewünscht, wird wünschenswerterweise eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer Polynukleotid-kodierenden Region aufgenommen. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von einer Anzahl anderer Pflanzengene oder von T-DNA hergeleitet sein. Die hinzuzufügende 3'-Endsequenz kann beispielsweise hergeleitet sein von Nopalinsynthase- oder Octopinsynthase-Genen oder alternativ von einem anderen Pflanzengen oder weniger bevorzugt von einem anderen eukaryotischen Gen.
  • Eine Intronsequenz kann ebenfalls an der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz der partiellen kodierenden Sequenz zugegeben werden, um die Menge der reifen Botschaft zu steigern, die sich im Cytosol ansammelt. Die Aufnahme eines spleißbaren Introns in die Transkriptionseinheit in Pflanzen- und Tier-Expressionskonstrukten steigert Befunden zufolge die Genexpression auf mRNA- und Protein-Ebenen bis zu 1000fach (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183–1200). Eine solche Intron-Steigerung der Genexpression ist gewöhnlich am größten, wenn es sich nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit befindet. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6, das Bronze-1-Intron, sind im Stand der Technik bekannt. Für eine allgemeine Information siehe: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N. Y. (1994).
  • Endogenes Gen
  • Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ein ”endogenes” Gen betrifft nicht nur das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form gefunden wird (d. h. ohne dass ein menschlicher Eingriff vorliegt), sondern betrifft auch das gleiche Gen, (oder eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäure bzw. Gen) in einer isolierten Form, das anschließend in eine Pflanze (wieder) eingebracht wird (ein Transgen). Eine transgene Pflanze, die ein solches Transgen enthält, kann eine wesentliche Reduktion der Transgenexpression und/oder eine wesentliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder von Menschenhand hergestellt werden, beispielsweise durch chemische Synthese.
  • Verringerte Expression
  • Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” der Expression soll eine Abnahme der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptid-Spiegel und/oder Polypeptid-Aktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung ist in steigender Reihenfolge der Bevorzugung mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder noch mehr im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine hinreichende Länge der im Wesentlichen durchgehenden Nukleotide einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Zur Durchführung von Gensilencing können diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide betragen (u. a. mit der 5'- und/oder 3'-UTR, und zwar entweder teilweise oder ganz). Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann von der Nukleinsäure, die das interessierende Protein (Zielgen) kodiert, oder von einer Nukleinsäure hergeleitet werden, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann. Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Zielgen eingehen (und zwar entweder mit dem Sense- oder Antisense-Strang), stärker bevorzugt hat der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide in steigender Reihenfolge der Bevorzugung 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zu dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäure, die ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, ist keine Anforderung für die verschiedenen hier erörterten Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
  • Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann mit Routine- Werkzeugen und -Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der endogenen Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren eines Genkonstruktes, in das die Nukleinsäure (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen abstammen, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einem der interessierenden Proteine kodieren kann) als inverted Repeat (teilweise oder ganz), getrennt durch einen Spacer (nicht-kodierende DNA) kloniert wird, in einer Pflanze.
  • In einem solchen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing mit einem inverted Repeat einer Nukleinsäure oder einem Teil davon (in diesem Fall einem Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann), der eine Hairpin-Struktur bilden kann. Der inverted repeat wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Kontrollsequenzen umfasst. Eine nichtkodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, beispielsweise ein Fragment der Matrixbindungsregion (matrix attachment region fagment (MAR)), ein Intron, ein Polylinker, etc.) befindet sich zwischen den beiden invertierten Nukleinsäuren, die den inverted Repeat bilden. Nach der Transkription des inverted repeats wird eine chimäre RNA mit einer selbstkomplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als Hairpin-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird durch die Pflanze in siRNAs prozessiert, die in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex eingebracht sind (RISC). Der RISC spaltet zudem die mRNA-Transkripte, wodurch im Wesentlichen die Anzahl der mRNA-Transkripte in Polypeptide translatiert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten können beispielsweise Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ) herangezogen werden.
  • Die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren beruht nicht auf der Einbringung und Expression eines Genkonstrukts, in das die Nukleinsäure als inverted Repeat kloniert wurde, in eine bzw. einer Pflanze, aber eine oder mehrere einiger bekannter ”Gen-Silencing”-Verfahren kann zur Erzielung der gleichen Effekte verwendet werden.
  • Ein solches Verfahren zur Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing der Genexpression (Abwärtsregulation). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze durch eine doppelsträngige RNA-Sequenz (dsRNA) getriggert, die dem endogenen Zielgen im Wesentlichen ähnelt. Diese dsRNA wird weiter durch die Pflanze in etwa 20 bis etwa 26 Nukleotide prozessiert, die als kurze interferierende RNAs (short interfering RNAs (siRNAs)) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht, der das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl der zu einem Polypeptid zu translatierenden mRNA-Transkripte verringert wird. Die doppelsträngige RNA-Sequenz entspricht einem Zielgen.
  • Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Einbringung von Nukleinsäure-Sequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense Orientierung” betrifft eine DNA-Sequenz, die zu einem mRNA-Transkript davon homolog ist. In eine Pflanze wird daher mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz eingebracht. Die zusätzliche Nukleinsäure verringert die Expression des endogenen Gens, was ein Phänomen erzeugt, das als Co-Suppression bezeichnet wird. Die Reduktion der Genexpression wird ausgeprägter, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da es eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und dem Triggern der Co-Suppression gibt.
  • Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotid-Sequenz, die zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem zu silencenden endogenen Gen. Die Komplementarität kann sich in der ”kodierenden Region” und/oder in der ”nichtkodierenden Region” eines Gens befinden. Der Begriff ”kodierende Region” betrifft eine Region der Nukleinsäuresequenz, die Codons umfasst, die zu Aminosäureresten translatiert werden. Der Begriff ”nicht kodierende Region” betrifft 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren, die transkribiert, aber nicht zu Aminosäuren translatiert werden (und die auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet werden).
  • Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß der Basenpaarungsregeln von Watson und Crick entwickelt werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann komplementär zur gesamten Nukleinsäuresequenz sein (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann), kann aber auch ein Oligonukleotid sein, das nur zu einem Teil der Nukleinsäuresequenz Antisense-Orientierung aufweist (wie auch mRNA 5' und 3' UTR). Die Antisense-Oligonukleotidsequenz kann beispielsweise komplementär zu der Region sein, die die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid kodiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotid-Sequenz ist im Stand der Technik bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuresequenz kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mit Verfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (beispielsweise eine Antisense-Oligonukleotid-Sequenz) kann beispielsweise chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukloeotide oder verschiedene modifizierte Nukleotide verwendet werden, die dazu ausgelegt sind, dass die biologische Stabilität der Moleküle oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs erhöht wird, der zwischen den Antisense- und den Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildet wird, beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die sich zur Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwenden lassen, sind im Stand der Technik bestens bekannt. Bekannte Nukleotid-Modifikationen umfassen, Methylierung, Cyclisierung und 'Caps' sowie die Substitution von einer oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, wie Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch produziert werden mit einem Expressionsvektor, in den eine Nukleinsäuresequenz in Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, die aus der eingefügten Nukleinsäure transkribiert wurde, ist zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure in Antisense-Orientierung). Die Produktion der Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch ein stabil integriertes Nukleinsäure-Konstrukt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verknüpftes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
  • Die Nukleinsäuremoleküle, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zum Silencen verwendet werden (unabhängig davon, ob sie in eine Pflanze eingebracht wurden, oder in situ erzeugt wurden), hybridisieren mit oder binden an mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, die ein Polypeptid kodiert, wodurch die Expression des Proteins gehemmt wird, beispielsweise durch Hemmen der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch konventionelle Nukleotid-Komplementarität erfolgen, so dass man einen stabilen Doppelstrang erhält, oder beispielsweise im Falle einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, die an DNA-Doppelstränge bindet, über spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer bestimmten Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Anzielen ausgewählter Zellen modifiziert werden und dann systemisch verabreicht werden. Zur systemischen Verabreichung können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen derart modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, beispielsweise durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, die an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense- Nukleinsäuresequenzen können auch auf Zellen übertragen werden, und zwar mit den hier beschriebenen Vektoren.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelständige Hybride mit komplementärer RNA, in der im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon umfassen (Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215, 327–330).
  • Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression kann auch mit Ribozymen durchgeführt werden. Die Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz spalten können, wie eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen. Somit können Ribozyme (beispielsweise Hammerkopf-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) zur katalytischen Spaltung von mRNA-Transkripten verwendet werden, die in ein Polypeptid translatiert werden, wodurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, erheblich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entwickelt werden (siehe beispielsweise: Cech et al. U.S. Patent No. 4,987,071 ; und Cech et al. U.S. Patent No. 5,116,742 ). Alternativ können mRNA-Transkripte, die einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, zur Auswahl einer katalytischen mRNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen ausgewählt werden (Bartel and Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen zum Gen-Silencing ist im Stand der Technik bekannt (beispielsweise Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
  • Das Gensilencing kann ebenfalls durch Insertionsmutagenese erzielt (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien, wie sie u. a. von Angell and Baulcombe ((1999) Plant J 20 (3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ), oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben wurden.
  • Das Gensilencing kann auch erfolgen, wenn eine Mutation an einem endogenem Gen und/oder eine Mutation an einem isolierten Gen bzw. einer isolierten Nukleinsäure vorliegt, die anschließend in eine Pflanze eingeführt wurde. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Das Polypeptid kann beispielsweise an verschiedene wechselwirkende Proteine binden; eine oder mehrere Mutationen und/oder Verkürzungen können daher ein Polypeptid bereitstellen, das noch an wechselwirkende Proteine binden kann (wie Rezeptorproteine), die aber ihre normale Funktion nicht ausüben können (beispielsweise als signalgebender Ligand).
  • Ein weiterer Ansatz zum Gensilencing ist durch Anzielen von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens komplementär sind (beispielsweise Promotor und/oder Enhancer), so dass dreifach helikale Strukturen erzeugt werden, die die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
  • Andere Verfahren, wie die Verwendung von Antikörpern gegen ein endogenes Polypeptid zur Hemmung seiner Funktion in Pflanzen oder die Interferenz in dem Signalweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, sind dem Fachmann bestens bekannt. Es kann insbesondere angestrebt werden, dass sich von Menschenhand gemachte Moleküle zur Hemmung der biologischen Funktion eines Ziel-Polypeptids oder zum Eingreifen in den Signalweg, an dem das Ziel-Polypeptid beteiligt ist, eignet.
  • Alternativ kann ein Screening-Programm aufgestellt werden, mit dem man in einer Pflanze die natürlichen Genvarianten identifiziert, wobei die Varianten Polypeptide mit reduzierter Aktivität kodieren. Solche natürlichen Varianten können auch beispielsweise zur Durchführung einer homologen Rekombination verwendet werden.
  • Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (mRNAs) können zum Knockout der Genexpression und/oder mRNA-Translation verwendet werden. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs mit gewöhnlich 19 bis 24 Nukleotiden Länge. In erster Linie regulieren sie die Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten Pflanzen-mikroRNAs (miRNAs) haben eine perfekte oder nahezu perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu 5 Mismatches. Sie werden aus längeren nicht-kodierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch doppelstrangspezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Bei der Prozessierung werden sie durch Bindung an ihre Hauptkomponente, ein Argonaut-Protein, in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht. MiRNAs wirken als Spezifitäts-Komponenten von RISC), da sie mit Ziel-Nukleinsäuren, meist mRNAs im Cytoplasma Basenpaare eingehen. Nachfolgende Regulationsereignisse umfassen Ziel-mRNA-Spaltung und die Zerstörung und/oder translationale Hemmung. Die Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich somit oft in verringerten mRNA-Spiegeln der Zielgene wider.
  • Künstliche mikroRNAs (amiRNAs), die gewöhnlich 21 Nukleotide lang sind, können genetisch modifiziert werden, so dass sie die Genexpression einzelner oder multipler interessierender Gene negativ regulieren. Determinanten der Pflanzen-mikroRNA-Zielselektion sind im Stand der Technik bestens bekannt. Empirische Parameter zur Zielerkennung wurden definiert und können zur Unterstützung der Aufmachung spezifischer amiRNAs verwendet werden (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Herkömmliche Werkzeuge zur Aufmachung und Erzeugung von amiRNAs und ihrer Vorstufen sind ebenfalls öffentlich zugänglich (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
  • Für eine optimale Leistung erfordern die Gensilencing-Techniken, die zur Reduktion der Expression in einer Pflanze eines endogenen Gens verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen zur Transformation monokotyler Pflanzen und aus dikotylen Pflanzen zur Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer gegebenen Pflanzenart in die gleiche Pflanzenart eingebracht. Beispielsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Es ist jedoch kein absolutes Erfordernis, dass die einzubringende Nukleinsäuresequenz aus der gleichen Pflanzenart stammt wie die Pflanze, in die sie eingebracht wird. Es reicht, wenn eine wesentliche Homologie zwischen endogenem Zielgen und der einzubringenden Nukleinsäure vorliegt.
  • Vorstehend sind Beispiele für verschiedene Verfahren zur Verringerung oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Der Fachmann kann leicht die vorstehend genannten Verfahren zum Silencing so anpassen, dass die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer vollständigen Pflanze oder in Teilen davon durch die Verwendung beispielsweise eines geeigneten Promotors erzielt wird.
  • Selektionsmarker(gen)/Reportergen
  • ”Selektionsmarker”, ”Selektionsmarkergen” oder ”Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert sind oder transformiert sind, zu erleichtern, einen Phänotyp verleiht. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen gehören zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwertung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose), vermitteln. Die Expression visueller Markergene führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Markern vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
  • Bei stabiler oder transienter Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nimmt bekanntlich nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA auf, und integriert sie wenn gewünscht je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik in ihr Genom. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind) in die Wirtszelle zusammen mit dem interessierenden Gen eingesetzt. Diese Marker können beispielsweise in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nicht funktionell sind, beispielsweise durch Deletion durch herkömmliche Verfahren. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert, oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, oder ansonsten in einem gesonderten Vektor. Zellen, die stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert wurden, können beispielsweise durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, wohingegen andere Zellen sterben).
  • Da die Markergene, insbesondere Gene für die Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich sind oder ungewünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, setzt das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren erfolgreich Techniken ein, die die Entfernung oder Abspaltung dieser Markergene ermöglichen. Ein solches Verfahren wird als Cotransformation bezeichnet. Die Cotransformation setzt 2 Vektoren ein, die simultan zur Transformation eingesetzt werden, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und der zweite das oder die Markergene trägt. Ein großer Anteil der Transformanten erhält, oder umfasst bei Pflanzen (bis zu 40% oder mehr Transformanten) beide Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien, erhalten die Transformanten gewöhnlich nur einen Teil des Vektors, d. h. die Sequenz, die von der T-DNA flankiert wird, die gewöhnlich die Expressions-Kassette veranschaulicht. Die Markergene können anschließend aus der transformierten Pflanze durch Kreuzungen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden die in ein Transposon integrierten Markergene zur Transformation zusammen mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (was als Ac/Ds-Technologie bekannt ist). Die Transformanten können mit einer Quelle für Transposase gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäure-Konstrukt transformiert, das die transiente oder stabile Expression einer Transposase vermittelt. In einigen Fällen (etwa 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat und verloren geht. Bei einer weiteren Anzahl von Fällen, springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen mit Hilfe von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil ist, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieser Art ist als Cre/Iox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Ist der Marker zwischen den IoxP-Sequenzen integriert, wird er entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können stellenspezifisch in das Pflanzengenom integriert werden. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen angewendet werden, wie Hefe, Pilze oder Bakterien.
  • Transgen/transgen/rekombinant
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant” eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels rekombinanter Verfahren entstehen, in denen entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenzen, die Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, oder
    • (b) genetische Kontrollsequenz(en) in funktionsfähiger Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einem Promotor, oder
    • (c) a) und b)
    sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es sich bei der Modifikation zum Beispiel um eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten handeln kann. Unter der natürlichen genetischen Umgebung versteht man den natürlichen genomischen oder chromosomalen Locus in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bank. Bei einer genomischen Bank wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest auf einer Seite und weist eine Sequenzlänge von mindestens 50 Bp, vorzugsweise mindestens 500 Bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 Bp, am stärksten bevorzugt mindestens 5000 Bp, auf. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, das bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch unnatürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren wie zum Beispiel mutagene Behandlung modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5,565,350 oder WO 00/15815 beschrieben.
  • Unter einen transgenen Pflanze versteht man für erfindungsgemäße Zwecke wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen jedoch auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die Nukleinsäuren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, zwar in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz jedoch in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einem unnatürlichen Locus in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen werden im vorliegenden Text erwähnt.
  • Transformation
  • Der Begriff ”Einführung” oder ”Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines Fremdpolynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das entweder durch Organogenese oder Embryogenese zu einer anschließenden klonalen Vermehrung befähigt ist, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden, und daraus kann eine ganze Pflanze regeneriert werden. Das jeweils ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen klonalen Vermehrungssytemen ab, die für die jeweilige zu transformierende Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben gehören zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achelknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf dem Fachmann bekannte Art und Weise regenerieren.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenarten ist eine Technik, die heutzutage relativ routinemäßig erfolgt. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden gehören die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Teilchenkanonenbeschuss, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Verfahren können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglycol-Methode für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al., (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al., (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Partikeln (Klein TM et al., (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in die Pflanze. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien beimpfen. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation des Reises gehören gut bekannte Verfahren für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al., (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al., (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Bei der Transformation von Mais ist das bevorzugte Verfahren entweder wie bei Ishida et al., (Nat. Biotechnol. 14 (6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al. (Plant Physiol. 129 (1): 13–22, 2002) beschrieben, die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Diese Verfahren sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit solch einem Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze angesehen), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in eine Agrobakterienlösung taucht und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel bei Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
  • Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen transformieren, insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben transgene Pflanze. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders wirksames Verfahren ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der ”floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der ”floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet, und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastide bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al., 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wurde. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen steuern die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden, und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie wurde in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225–229).
  • T-DNA-Aktivierungstagging
  • T-DNA-Aktivierungstagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Einführung von T-DNA, die gewöhnlich einen Promotor enthält (es kann auch ein Translations-Enhancer oder ein Intron sein) in der genomischen Region des interessierenden Gens von bis zu 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der kodierenden Region eines Gens in einer Konfiguration, so dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Die Regulation der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor wird gewöhnlich unterbrochen und das Gen gerät unter die Kontrolle des neu eingeführten Promotors. Der Promotor ist gewöhnlich in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom eingeführt, beispielsweise durch Agrobacterium Infektion und führt zu modifizierter Expression der Gene nahe der eingeführten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression der Gene nahe dem eingeführten Promotor.
  • TILLING
  • Der Begriff TILLING ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und steht für eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuren, die Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als diejenige des Gens in seiner natürlichen Form. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING gewöhnlich erfolgen, sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods an Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Herstellung und Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplices zu ermöglichen; (e) DHPLC, wo das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren des mutierten Individuums; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind im Stand der Technik bestens bekannt (McCallum et al., (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5 (2): 145–50) erwähnt.
  • Homologe Rekombination
  • Homologe Rekombination ermöglicht die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäure in ein Genom, an einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standard-Technik, die routinemäßig in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen verwendet wird, wie Hefe und das Moos Physcomitrella. Verfahren zur Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen wurden nicht nur für Pflanzenmodelle beschrieben (Offringa et al. (1990) EMBO J 9 (10): 3077–84) sondern auch für Kulturpflanzen, wie beispielsweise Reis (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20 (10): 1030–4; Iida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15 (2): 132–8), und es gibt Ansätze, die gewöhnlich anwendbar sind, ungeachtet des Zielorganismus (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
  • Ertrag
  • Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das gewöhnlich mit einer bezeichneten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum einher geht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen direkt aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts zum Ertrag bei, oder der tatsächliche Ertrag ist derjenige Ertrag pro m2 für eine Kulturpflanze und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bewirtschafteten m2 dividiert. Der Begriff ”Ertrag” einer Pflanze kann die vegetative Biomasse (Wurzel und/oder Spross-Biomasse), Fortpflanzungsorgane und/oder Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze betreffen.
  • Jungpflanzenvitalität
  • ”Jungpflanzenvitalität” steht für das aktive gesunde gut balancierte Wachstum, insbesondere während früher Stadien des Pflanzenwachstums, und kann sich aus einer gesteigerten Pflanzen-Fitness ergeben, beispielsweise wenn die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. durch Optimierung der Verwendung von Energiequellen und der Verteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit eine Jungpflanzenvitalität zeigen auch ein gesteigertes Überleben des Keimlings und eine bessere Entwicklung der Kulturpflanze, was häufig zu sehr einheitlichen Feldern (wobei die Kulturpflanze einheitlich wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen erreicht im Wesentlichen gleichzeitig verschiedene Entwicklungsstadien) und oft einem besseren und höheren Ertrag führt. Daher kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren bestimmt werden, wie Tausendkorngewicht, Prozent Keimung, Prozent Auflaufen, Wachstum des Keimlings, Höhe des Keimlings, Wurzellänge, Biomasse von Wurzel und Spross und vielen anderen.
  • Erhöhen/Verbessern/Fördern
  • Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert bedeuten.
  • Samenertrag
  • Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder oder pro m2; b) erhöhte Anzahl Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut wie Samen dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird; sowie f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
  • Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Vergrößerung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
  • Greenness Index
  • Der ”Greenness Index”, wie hier verwendet, wird aus digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jeden zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehörigen Pixel wird das Verhältnis des Grünwertes gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell für Farbkodierung) berechnet. Der Greenness Index wird ausgedrückt als Prozent der Pixel, für die das Grün:Rot-Verhältnis eine bestimmte Schwelle überschreitet. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen, und unter den Wachstumsbedingungen einer reduzierten Nährstoffverfügbarkeit wird der Greenness Index der Pflanzen bei der letzten Bildnahme vor dem Blühen gemessen. Unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen, wird der Greenness Index der Pflanzen in der erste Bildnahme nach dem Trockenstress gemessen.
  • Pflanze
  • Der Begriff ”Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, wozu Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe gehören, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst. Der Begriff ”Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst.
  • Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, gehören all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die unter Anderem die folgenden Pflanzen umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (bspw. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (bspw. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (bspw. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (bspw. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (bspw. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (bspw. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (bspw. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (bspw. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (bspw. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (bspw. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • I. Eine LOB-Domäne enthaltendes Protein (LOB: Lateral Organ Boundaries, laterale Organgrenzen)
  • Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression der Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein LBD-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
  • Wird im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein LBD-Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Wird im folgenden Text auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll dies eine Nukleinsäure bedeuten, die ein solches LBD-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäure, die für den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”LBD-Nukleinsäure” oder ”LBD-Gen” bezeichnet.
  • Ein LBD-Polypeptid, wie hier definiert, betrifft jedes Polypeptid, das eine DUF260-Domäne (Pfam-Zugangsnummer PF03195, Interpro-Zugangsnummer IPR004883, siehe 1) umfasst. Vorzugsweise bildet die LBD-Polypeptidsequenz, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten (oder wie von Yang et al., 2006, unter Verwendung des HKY-Verfahrens (Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985) definiert) verwendet wird, eher Cluster mit der Gruppe der Klasse II-LOB-Domäne-Polypeptide, welche die durch SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe.
  • Weiterhin umfasst das LBD-Protein vorzugsweise mindestens eines der folgenden konservierten Motive:
    • Motiv 1: MSCNGCRXLRKGCX (SEQ ID NO: 5); wobei X an Position 8 jede Aminosäure, aber vorzugsweise V oder I sein kann und wobei X an Position 14 jede Aminosäure sein kann, aber vorzugsweise eine Aminosäure aus S, G oder N ist.
    • Motiv 2: QXXATXFXAKFXGR (SEQ ID NO: 6), wobei X an Position 2 jede Aminosäure sein kann, aber vorzugsweise eine Aminosäure aus A, S, oder G ist; wobei X an Position 3 jede Aminosäure, aber vorzugsweise eine Aminosäure aus N, Q oder H sein kann; wobei X an Position 6 jede Aminosäure, aber vorzugsweise eine Aminosäure aus V, L oder I sein kann; wobei X an Position 8 jede Aminosäure, aber vorzugsweise eine Aminosäure aus L, V, A oder I sein kann; und wobei X an Position 12 jede Aminosäure, aber vorzugsweise eine Aminosäure aus Y oder F sein kann.
    • Motiv 3: FXSLLXEAXG (SEQ ID NO: 7); wobei X an Position 2 jede Aminosäure, aber vorzugsweise eine Aminosäure aus R, S, K oder Q sein kann; wobei X an Position 6 jede Aminosäure, aber vorzugsweise eine Aminosäure aus Y, H oder F sein kann; und wobei X an Position 9 jede Aminosäure, aber vorzugsweise C oder A sein kann.
  • Weiterhin bevorzugt umfasst das LBD-Protein mehr als sieben, stärker bevorzugt mindestens neun Cys-Reste und umfasst nicht die DP(V/I)YG-Signatur (SEQ ID NO: 8).
  • Die DUF260-Domäne ist gekennzeichnet durch das Vorliegen eines C-x(2)-C-x(6)-C-x(3)-C-Motivs (SEQ ID NO: 9), wobei X jede Aminosäure sein kann.
  • Der Begriff ”Domäne” und ”Motiv” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der im MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann klar ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen auch spezifische Domänen für die Identifikation von Homologen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder ein konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden.
  • Außerdem können LBD-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) als Transkriptionsfaktoren in der Regel DNA-Bindungsaktivität aufweisen. Werkzeuge und Techniken zum Messen der DNA-Bindungsaktivität sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten zum Beispiel Gelretardationsassays. Experimentelle Ansätze zur Charakterisierung der Aktivität von Transkriptionsfaktoren lassen sich zum Beispiel in Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder in den Bänden 1 und 2 des (jährlich aktualisierten) Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, finden.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, oder des LBD-Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die LBD-Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegeben. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A1 von Beispiel genannten Aminosäuresequenzen sind beispielhafte Sequenzen von Orthologen und Paralogen des LBD-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht mittels Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 aufgelisteten Sequenzen). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Zu solchen Varianten zählen beispielsweise Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivate von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die für LBD-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für LBD-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für LBD-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die für LBD-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für LBD-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier definiert.
  • Vorteilhafterweise stellt die vorliegende Erfindung bisher unbekannte LBD-Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen bereit.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das Folgendes umfasst:
    • (i) eine durch SEQ ID NO: 69 dargestellte Nukleinsäure;
    • (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, die/das zu einer der unter (i) angegebenen SEQ ID NO: komplementär ist;
    • (iii) eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert und, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 70 besitzt;
    • (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an eine der unter (i), (ii) oder (iii) oben angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird deshalb ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das Folgendes umfasst:
    • (i) eine Aminosäuresequenz, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität mit der unter SEQ ID NO: 70 angegebenen Aminosäuresequenz hat;
    • (ii) Derivate von einer der unter (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
  • Nukleinsäuren, die LBD-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle A1 von Beisipiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein LBD-Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten (oder von Yang et al., 2006, unter Verwendung des HKY-Verfahrens (Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985) definierten), verwendet wird, eher mit der Gruppe der Klasse II-LOB-Domäne-Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein LBD-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel genannten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren kann. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten (oder von Yang et al., 2006, unter Verwendung des HKY-Verfahrens (Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985) definierten), verwendet wird, eher mit der Gruppe der Klasse II-LOB-Domäne-Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein LBD-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle A1 von Beispiel angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bei bevorzugten Spleißvarianten handelt es sich um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten (oder von Yang et al., 2006, unter Verwendung des HKY-Verfahrens (Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985) definierten), verwendet wird, eher mit der Gruppe der Klasse II-LOB-Domäne-Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das LBD-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 und irgendeine der in Tabelle A1 von Beispiel 1 dargestellten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten (oder von Yang et al., 2006, unter Verwendung des HKY-Verfahrens (Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985) definierten), verwendet wird, eher mit der Gruppe der Klasse II-LOB-Domane-Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster.
  • ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuren herzustellen, die LBD-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten (oder von Yang et al., 2006, unter Verwendung des HKY-Verfahrens (Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985) definierten), verwendet wird, eher mit der Gruppe der Klasse II-LOB-Domäne-Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die LBD-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile die Sprossbiomasse und Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Sprossbiomasse und Samenausbeute im Vergleich zu der Sprossbiomasse und der Samenausbeute von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. erhöhte Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Sprossbiomasse- und/oder Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht. Eine Erhöhung der Wachstumsrate wurde insbesondere während der frühen Wachstumsstadien der Pflanze beobachtet (Jungpflanzenvitalität).
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder innenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten, verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen erhält, deren Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht ist. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al., (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut. Pflanzen unter optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen herangezogen werden) liefern oft einen Ertrag von, in der Reihenfolge der zunehmenden Präferenz, mindestens 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann bezogen auf die Ernte und/oder die Saison berechnet werden. Der Fachmann ist mit den durchschnittlichen Erträgen einer Kultur vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden, erhöhten Ertrag aufweisen. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, eine erhöhte Jungpflanzenvitalität und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen oder einen Überschuss von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor hervorgerufen werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein LBD-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die LBD-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das Folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, wie oben definiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich transformiert, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter ist für die Verfahren besonders geeignet. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die erfindungsgemäße, ein LBD-Poylpeptid kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 noch auf die Expression einer ein LBD-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, die von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 10 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 10 dargestellt. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier im Abschnitt ”Definitionen.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. ein Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion transgener Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben.
  • Bekanntlich nimmt je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nach der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA auf und integriert sie in ihr Genom, falls gewünscht. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren wird üblicherweise ein Gen, das für einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen) kodiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, zum Beispiel durch Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionell sind. Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die Polypeptide, die bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, kodiert, oder auch auf einem separaten Vektor eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, während die anderen Zellen absterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr gebraucht werden. Techniken zur Entfernung von Markergenen sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Sprossbiomasse und/oder erhöhtem Samenertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein LBD-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäure unter (i) kann es sich um irgendeine der Nukleinsäuren handeln, die ein LBD-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von Genen kodiert werden, die in Pflanzen exprimierbar sind und die mit dem interessierenden Gen cotransferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, gescreent.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des interessierenden Gens, der Kopienzahl und/oder der Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann unter Verwendung klassischer Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (z. B. dass alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das durch eines der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein LBD-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahren, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die LBD-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser LBD-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die LBD-Polypeptid kodieren, oder die LBD-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein LBD-Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die LBD-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend bei den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein LBD-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze.
  • Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuren, die LBD-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die LBD-Polypeptide kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein LBD-Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den LBD kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die restriktionsendonukelasebehandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird ermittelt und dazu verwendet, die Position der Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte zu berechnen (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die bei der Amplifikationsreaktion oder bei Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemisch und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
  • II. JMJC-(JUMONJI-C-)Polypeptid
  • Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man die Expression einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, in eine Pflanze einbringt und in dieser exprimiert.
  • Wird im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein JMJC-Polypeptid, wie hier definiert, verstanden werden. Wird hier im Folgenden auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, bedeutet dies eine Nukleinsäure, die ein solches JMJC-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und die daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede beliebige Nukleinsäure, welche den Typ Protein, der im Folgenden beschrieben wird, kodiert und wird im Folgenden auch als ”JMJC-Nukleinsäure” oder ”JMJC-Gen” bezeichnet.
  • Ein JMJC-Polypeptid, wie hier definiert, betrifft ein Polypeptid, das mindestens eine JmjC-Domäne umfasst.
  • Bei der JmjC-Domäne handelt es sich um eine konservierte Sequenz, die man in Proteinen prokaryotischer und eukaryotischer Organismen findet. JmjC-Domänen sind durchschnittlich 111 Aminosäuren lang. Die Länge einer JmjC-domäne kann gewöhnlich von 25 bis 200 Aminosäuren reichen und längere Versionen können möglich sein. Für JmjC-Domänen wird vorhergesagt, dass es sich um Metalloenzyme handelt, welche die Cupin-Faltung annehmen, und sie sind Kandidaten für Enzyme, welche die Chromatinumgestaltung regulieren (Clissold et al. Trends Biochem Sci. 2001 Jan; 26 (1): 7–9).
  • JMJC-Polypeptide findet man in speziellen Datenbanken, wie Pfam (Finn et al. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247–D251). Pfam listet eine große Sammlung an mehrfachen Sequenz-Alignments und Hidden-Markov-Modellen (HMM) auf, die viele häufige Proteindomänen und -familien abdeckt und über das Sanger Institute in Großbritannien verfügbar ist.
  • Die Erfassungsausschlussgrenze für die JmjC-Domäne im Pfam HMM_fs-Modell beträgt 16,0 und –8,0 im HMM_Is-Modell. In der Pfam-Datenbank gelten als zuverlässige Übereinstimmungen solche mit einem Score oberhalb der Erfassungsausschlussgrenze. Mögliche Übereinstimmungen, die echte JmjC-Domänen umfassen, können jedoch unter den Erfassungsausschluss fallen. Vorzugsweise ist ein JMJC-Polypeptid ein Protein, das in seiner Sequenz eine oder mehrere Domänen aufweist, die den Erfassungsausschluss der Pfam- Proteindomänenfamilie PF02373, jumonji, jmjC, überschreiten.
  • Alternativ kann eine JmjC-Domäne in einem Polypeptid identifiziert werden, indem man einen Sequenzvergleich mit bekannten Polypeptiden, die eine JmjC-domäne umfassen, durchführt und die Ähnlichkeit im Bereich der JmjC-Domäne feststellt. Das Alignment der Sequenzen kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden, wie Blast-Algorithmen, und die Wahrscheinlichkeit, dass ein Alignment mit einer gegebenen Sequenz auftritt, wird als Basis für die Identifikation ähnlicher Polypeptide verwendet. Ein Parameter, der üblicherweise dazu verwendet wird, diese Wahrscheinlichkeit in paarweisen Vergleichen darzustellen, wird als e-Wert bezeichnet. Der e-Wert beschreibt, wie oft das zufallsgemäße Auftreten von einem bestimmten Score erwartet wird. Die e-Wert-Ausschlussgrenze kann bis zu 1,0 betragen. Üblicherweise haben Alignments, bei denen die Wahrscheinlichkeit, dass sie auftreten, hoch ist, einen e-Wert unter 0,1, 0,01, 0,001, 1·e–05, 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100 und 1·e–200. Vorzugsweise umfassen erfindungsgemäße JMJC-Polypeptide eine Sequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz einen e-Wert unter 0,1, 0,01, 0,001, 1·e–05, 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100 und 1·e–200 bei einem Alignment mit einer JmjC-Domäne aufweist, die man in einem bekannten JMJC-Polypeptid findet.
  • Beispiele für JMJC-Polypeptide sind in Tabelle B1 angegeben. Die Aminosäurekoordinaten der JmjC-Domänen in beispielhaften JMJC-Polypeptiden aus Dikotyledonen sind in Tabelle B4 angegeben. Ein Beispiel für eine JmjC-Domäne zeigt SEQ ID NO: 78.
  • Die Sequenzidentität zwischen JmjC-Domänen ist gewöhnlich klein, durchschnittlich 23%, und kann sogar nur 10% betragen. Bevorzugte erfindungsgemäße JMJC-Polypeptide sind solche, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 78 oder mit einer der JmjC-Domänen aufweisen, die in den JMJC-Polypeptiden enthalten sind, die durch SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 110; SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 114; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 132 und SEQ ID NO: 134 dargestellt werden und deren Aminosäurekoordinaten in Tabelle B4 angegeben sind.
  • Zusätzlich zu der JmjC-Domäne können JMJC-Polypeptide gegebenenfalls andere hochkonservierte Sequenzmotive umfassen, wie sie in SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 dargestellt sind, die man in SEQ ID NO: 74 findet. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Polypeptide eine konservierte Sequenz umfassen, die man in Oxygenasen findet und die an der Koordination von Eisenkationen beteiligt ist, hier als HXD(V) oder EXnH dargestellt (SEQ ID NO: 82), wobei ”X” für eine beliebige Aminosäure steht und ”n” für die Anzahl der X-Reste steht, die von 1–5 einschließlich der Grenzen reicht.
  • Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes JMJC-Polypeptid betrifft jedes Polypeptid, das eine JmjC-Domäne umfasst und, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität mit einer oder mehreren der konservierten Sequenzmotive aufweist, die durch SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 und SEQ ID NO: 82 dargestellt werden.
  • Über Befunde für Domänenaustausch (domain swapping) in der JUMONJI-Proteinfamilie wurde berichtet (Balciunas und Ronne. Trends Biochem Sci 2000; 25: 274–276). Folglich enthalten JMJC-Polypeptide zusätzlich zu der JmjC-Domäne üblicherweise eine oder mehrere verschiedene Arten anderer bekannter konservierter Domänen. Relevant für die erfindungsgemäßen Polypeptide sind JMJC-Polypeptide, die zusätzlich zu der JmjC-Domäne andere konservierte Domänen umfassen, die mutmaßlich an DNA-Eindungs- und Transkriptionsaktivitäten beteiligt sind, wie Zinkfingerdomänen, oder an der Proteinwechselwirkung und am Protein-Turnover, wie F-Box und Zinkfinger-RING-Domänen.
  • Daher umfasst das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete JMJC-Polypeptid eine JmjC-Domäne und gegebenenfalls eine oder mehrere der folgenden konservierten Domänen: JmJN (pfam-Zugangsnummer PF02375); C5HC2 Zinkfinger (pfam-Zugangsnummer: PF02928), FY-reiche Domäne, N-terminal (InterPro-Zugangsnummer: IPR003888) und FY-reiche Domäne, C-terminal (InterPro-Zugangsnummer: IPR003889), eine Zinkfinger-FYVE/PHD-Zn-Typ (InterPro-Zugangsnummer: IPR011011), eine Zinkfinger-C2H2-Typ- (pfam-Zugangsnummer: PF00096), ein Zinkfinger–RING-Typ- (zf-C3HC4) (pfam-Zugangsnummer PF00097) und eine F-Box-Domäne (pfam-Zugangsnummer: PF00646).
  • Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße JMJC-Polypeptid eine Sequenz mit, in steigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 60%, 70%, 75%, 60%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% oder mehr Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142 und SEQ ID NO: 148.
  • Vorzugsweise die Polypeptidsequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der JMJC-Polypeptide (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59), welche die in SEQ ID NO: 74 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Der Begriff ”Domäne” und ”Motiv” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motives und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der Übereinstimmungen (”Matches”) maximiert und die Anzahl der Lücken (”Gaps”) minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. Juli 2003, 10; 4:29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann bekannt ist. Weiterhin können für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen anstelle von Volllängensequenzen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder ein konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden.
  • Außerdem können JMJC-Polypeptide gewöhnlich Proteinhydrolaseaktivität, insbesondere Peptid-aspartat-Beta-dioxygenase-(PABD-)Aktivität (EC 1.14.11.16) besitzen. Folgende Reaktion wird katalysiert: Peptid-L-aspartat + 2-Oxoglutarat + O(2) <=> Peptid-3-hydroxy-L-aspartat + Succinat + CO(2). Die Cofaktoren bei der Reaktion sind Eisen und 2-Oxogluatarat. Werkzeuge und Techniken für die Messung der PABD-Aktivität sind im Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Lavaissiere et al. J Clin Invest. 1996; 98 (6): 1313–23; Linke et al. J Biol Chem. 2004; 279 (14): 14391–7; Lee, et al. J. Biol. Chem. 278: 7558–7563; 2003; Lando et al. Genes Dev. 16: 1466–1471; 2002). Eisen (II)/2-Oxoglutarat-(2-OG)-abhängige Oxygenasen katalysieren oxidative Reaktionen bei verschiedenen Stoffwechselreaktionen. Vor kurzem wurde vorgeschlagen, dass JMJC-Polypeptide auch eine Histon-Demethylase-Aktivität besitzen können (Trewick et al. 2005).
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 73, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 74 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder JMJC-kodierenden Nukleinsäure oder jedes JMJC-Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle B1 von Beispiel 12 angegeben. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle B1 von Beispiel 12 angegebenen Aminosäuresequenzen sind beispielhafte Sequenzen von Orthologen und Paralogen des JMJC-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 74, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht identifiziert werden, indem man eine so genannte reziproke Blast-Suche durchführt. Dies beinhaltet üblicherweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 aufgelisteten Sequenzen). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 73 oder SEQ ID NO: 74, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz und vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu führt, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Zu solchen Varianten zählen beispielsweise Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivate von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Aminosäuresequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier definiert.
  • Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt einer beliebigen der in Tabelle B1 von Beisipiel 12 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein JMJC-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle B1 von Beispiel 12 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 100, 200, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 73. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der JMJC-Polypeptide (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59), welche die in SEQ ID NO: 74 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, wie hier definiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein JMJC-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren kann. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 73 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der JMJC-Polypeptide (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59), welche die in SEQ ID NO: 74 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein JMJC-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert. Ein Beispiel für eine gespleißte Variante des Gens, das SEQ ID NO: 74 kodiert, wird durch SEQ ID NO: 73 und SEQ ID NO: 83 (die SEQ ID NO: 84 kodiert) dargestellt.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 73 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 74 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der JMJC-Polypeptide (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59), welche die in SEQ ID NO: 74 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das JMJC-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 74 und jede der in Tabelle B1 von Beispiel 12 dargestellten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante gemäß SEQ ID NO: 73 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 74 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der JMJC-Polypeptide (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59), welche die in SEQ ID NO: 74 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Man kann auch ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution dazu verwenden, Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, die JMJC-Polypeptide, wie vorstehend definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 12 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Vorteilhafterweise stellt die vorliegende Erfindung bisher unbekannte JMJC-Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen bereit.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das Folgendes umfasst:
    • (i) eine durch SEQ ID NO: 169 dargestellte Nukleinsäure;
    • (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, die/das zu der SEQ ID NR: 169 komplementär ist;
    • (ii) eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert und, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 170 angegebenen Aminosäuresequenz besitzt;
    • (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an eine der unter (i), (ii) oder (iii) oben angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird deshalb ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das Folgendes umfasst:
    • (i) eine Aminosäuresequenz, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% oder mehr Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 170 angegebenen Aminosäuresequenz hat;
    • (ii) Derivate von einer der unter (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
  • Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der JMJC-Polypeptide (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59), welche die in SEQ ID NO: 74 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die das JMJC-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verstärkten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” werden hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit höherem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, verglichen mit Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation, vorzugsweise die Erhöhung, der Expression einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine höhere Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige zusätzliche Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau transgener Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation, vorzugsweise die Erhöhung, der Expression einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten, verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen erhält, deren Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht ist. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperatur, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut. Pflanzen unter optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen herangezogen werden) liefern oft einen Ertrag von, in der Reihenfolge der zunehmenden Präferenz, mindestens 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann bezogen auf die Ernte und/oder die Saison berechnet werden. Der Fachmann ist mit den durchschnittlichen Erträgen einer Kultur vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden, erhöhten Ertrag aufweisen. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen oder einen Überschuss von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphate und andere phosphorhaltige Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, hervorgerufen werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein JMJC-Polypeptid kodiert, wie oben definiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation des interessierenden Gens in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, wie oben definiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, welche die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert.
  • Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen erfolgreich transformiert, Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter ist für die Verfahren besonders geeignet. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die durch SEQ ID NO: 73 dargestellte, ein JMJC-Poylpeptid kodierende Nukleinsäure noch auf die Expression einer ein JMJC-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, wenn sie von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 75 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 75 dargestellt. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. als Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion von transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben.
  • Bekanntlich nimmt abhängig von dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nach einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA auf und integriert sie in ihr Genom, falls dies gewünscht ist. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen) kodiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, zum Beispiel durch Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionell sind. Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die Polypeptide, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, kodiert, oder auch auf einen separaten Vektor eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, während die anderen Zellen absterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr gebraucht werden. Techniken zur Entfernung von Markergenen sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem (Samen-)Ertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäure gemäß (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein JMJC-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, die mit dem interessierenden Gen cotransferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, gescreent.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (bei denen z. B. alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren aufweist.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein JMJC-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, besteht ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, darin, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert; die Wirkungen der Durchführung des Verfahren, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser JMJC-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, oder die JMJC-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem ein JMJC-Polpeptid kodierenden Gen genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die JMJC-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend unter den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein JMJC-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht absichtlich hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte beinhalten gegebenenfalls das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die JMJC-Polypeptide kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein JMJC-Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den JMJC-kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease-behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung wiedergeben. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der Nukleinsäure, die das JMJC-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz- Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • III. CKI(Casein-Kinase 1)-Polypeptid
  • Es wurde überraschend entdeckt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem die Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert wird.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation (vorzugsweise Steigerung) der Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, erfolgt durch Einführen und Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze.
  • Jede Bezugnahme auf ein ”Protein, das sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet” soll ein CKI-Polypeptid bedeuten, wie es hier definiert ist. Jede im erfindungsgemäßen Zusammenhang erfolgende Bezugnahme auf eine ”Nukleinsäure, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet” soll eine Nukleinsäure bedeuten, die ein solches CKI-Polypeptid kodieren kann. Die in eine Pflanze einzubringende (und daher bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignete) Nukleinsäure ist eine beliebige Nukleinsäure, die den nachstehend beschriebenen Proteintyp kodiert, der auch als ”CKI-Nukleinsäure” oder ”CKI-Gen” bezeichnet wird.
  • Ein ”CKI-Polypeptid” wie es hier definiert ist, bezeichnet die in der SEQ ID NO: 174 dargestellten Proteine und Homologa (Orthologa und Paraloga) davon. Die Homologa der SEQ ID NO: 174 haben vorzugsweise eine Caseinkinasedomäne.
  • Die Begriffe ”Domäne” und ”Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences Motivs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologa können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie es dem Fachmann ersichtlich wird, kleine manuelle Veränderungen vorgenommen werden. Darüber hinaus können statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologa auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden.
  • Darüber hinaus haben CKI-Polypeptide, und soweit SEQ ID NO: 174 und seine Homologa betroffen sind, die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten CKI-Proteine, gewöhnlich Kinase-Aktivität. Verfahren zum Messen der Kinase-Aktivität sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 173, die die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 174 kodiert, transformiert, dargestellt. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft mit jeder CKI-kodierenden Nukleinsäure oder mit jedem CKI-Polypeptid, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide kodieren, finden sich in den Datenbanken, die im Stand der Technik bekannt sind. Solche Nukleinsäuren sind zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Orthologa und Paraloga, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” die hier definierte Bedeutung haben, können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise einen ersten BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel SEQ ID NO: 174) ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 173 oder SEQ ID NO: 174, erfolgt das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Nicotiana tabacum). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist Stand der Technik. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mit dem Prozentsatz der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den beiden verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologa und Paraloga zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können sich auch Nukleinsäurevarianten eignen, die Homologa und Derivate von SEQ ID NO: 174 kodieren, wobei die Begriffe ”Homologon” und ”Derivat” die hier definierte Bedeutung haben. Für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich auch Nukleinsäuren, die Homologa und Derivate von Orthologa oder Paraloga von SEQ ID NO: 174 kodieren. Homologa und Derivate, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, gehören Abschnitte von Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide kodieren und Varianten von Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide kodieren, die durch ”Gen-Shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”Gen-Shuffling” sind wie im vorliegenden Text definiert.
  • Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide kodieren, müssen nicht unbedingt Volllängennukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von SEQ ID NO: 173 oder einen Abschnitt von einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 174 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können mit anderen kodierenden Sequenzen (oder nichtkodierenden Sequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion mit anderen kodierenden Sequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kodieren ein CKI-Polypeptid wie hier definiert und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 174 angegebene Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in SEQ ID NO: 173 angegebenen Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in SEQ ID NO: 173 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1300, 1400 aufeinanderfolgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um SEQ ID NO: 173 handelt oder um eine Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon von SEQ ID NO: 174 kodiert, handelt. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 173.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignet, ist eine Nukleinsäure, die unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid wie hier definiert kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text hybridisieren kann.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit SEQ ID NO: 173 hybridisieren kann, einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 173 kodiert, hybridisieren kann, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kodieren ein CKI-Polypeptid wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 174 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Die hybridisierende Sequenz kann vorzugsweise mit SEQ ID NO: 173 oder einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon von SEQ ID NO: 174 kodiert, hybridisieren.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet, ist eine Spleißvariante, die ein CKI-Polypeptid wie vorstehend definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante die hier definierte Bedeutung hat.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von SEQ ID NO: 173 einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 174 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignet ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid wie vorstehend definiert kodiert, wobei eine allelische Variante die hier definierte Bedeutung hat.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von SEQ ID NO: 173 einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 174 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten allelischen Varianten haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität, wie das CKI-Polypeptid von SEQ ID NO: 174. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und in den erfindungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung dieser natürlichen Allele mit einbezogen. Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Erzeugung von Varianten von Nukleinsäuren verwendet werden, die CKI-Polypeptide wie vorstehend definiert kodieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” die hier definierte Bedeutung hat.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von SEQ ID NO: 173 einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 174 kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Gen-Shuffling erhalten wird.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch überlegtes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die das CKI-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze. Bei SEQ ID NO: 173, ist die CKI-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie der Solanaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Nicotiana tabacum.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen mit verstärkten Ertragsmerkmalen. Insbesondere ergibt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Biomasse- und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind im vorliegenden Text im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, soll dies eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntefähige) Teile und/oder unterirdische (erntefähige) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntefähige Teile Biomasse und/oder Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität, gesteigertem Biomasse- und/oder Samenertrag in Bezug auf die Jungpflanzenvitalität, Biomasse und/oder Samenausbeute von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung unter Anderem als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Erhöhung der Anzahl Pflanzen, die sich pro Hektar oder Acre entwickeln, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, Ährenlänge/durchmessers, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragssteigerung unter Anderem als Erhöhung von einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausdrücken: Anzahl Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten (Blütchen) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere Biomasse- und/oder Samenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid wie hier definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen zeigen diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) wahrscheinlich eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem reifen trockenen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze reife trockene Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wacnstumsperiode). Entsprechend kann dies bei ausreichender Steigerung der Wachstumsrate ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend z. B. Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann man auch zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kulturpflanze häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parametern von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter unter Anderem folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid wie hier definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht. In einer bestimmten Ausführungsform ergibt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet unabhängig davon statt, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress durch langsameres Wachstum. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichter Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotischer Stress wird gewöhnlich durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten verursacht.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress stehen bekanntlich miteinander in Verbindung und können über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Trockenheit und/oder Versalzung äußern sich beispielsweise in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig Hoch- oder Niedertemperatur-, Salinitäts- oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteinen führen. Demzufolge aktivieren diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Aufwärtsregulation von Antioxidantien, die Anreicherung kompatibler gelöster Stoffe und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen ermöglichen. Der Fachmann ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nicht-Stress-Bedingungen gezüchtet wurden) ergeben gewöhnlich in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze bei einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Basis der Ernte und/oder der Jahreszeit berechnet werden. Dem Fachmann sind Produktionen einer Kulturpflanze mit durchschnittlichem Ertrag geläufig.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, einen erhöhten Ertrag und/oder eine erhöhte Jungpflanzenvitalität aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags und/oder der Jungpflanzenvitalität von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen gezüchtet wurden, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, mit besserem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen gezüchteten Kontrollpflanzen. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Steigerung des Ertrags bei Pflanzen bereitgestellt, die unter Nährstoffmangelbedingungen gezüchtet wurden, bei dem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze steigert. Nährstoffmangel kann sich unter Anderem aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, ergeben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein CKI-Polypeptid wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in handelsübliche Vektoren eingeführt werden, die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, umfassend
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) steuern kann bzw. können; sowie gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die eine CKI-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Die Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren, bestens vertraut. Die interessierende Sequenz ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promotor) verbunden.
  • Jede Art von Promotor, sowohl natürlich als auch synthetisch, kann vorteilhaft für das Steuern der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein samenspezifischer Promotor ist besonders bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet, der Promotor ist vorzugsweise ein embryospezifischer Promotor. Für die Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe Abschnitt ”Definitionen” im vorliegenden Text. Bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignet sich auch ein konstitutiver Promotor.
  • Man muss sich darüber im Klaren sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die CKI-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 173 veranschaulicht wird, noch auf die Expression einer CKI-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure, die von einem samenspezifischen Promotor gesteuert wird, beschränkt ist.
  • Der samenspezifische Promotor ist vorzugsweise ein WSI18-Promotor, vorzugsweise ein WSI18-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt ist der samenspezifische Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz veranschaulicht, die SEQ ID NO: 175 ähnelt, am stärksten bevorzugt ist der samenspezifische Promotor durch SEQ ID NO: 175 veranschaulicht. Im Abschnitt ”Defintionen” sind weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren beschrieben.
  • Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem in eine Pflanze eingebrachten Konstrukt verwendet werden. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- und Translations-Enhancer umfassen. Der Fachmann kennt Terminator- und Enhancer-Sequenzen, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen. Eine Intronsequenz kann ebenfalls zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, damit die Menge der reifen Botschaft gesteigert wird, die sich im Cytosol anreichert, wie es im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Andere Kontrollsequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können leicht von ihm erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die zur Aufrechterhaltung und/oder Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Bei einem Beispiel muss ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Bevorzugte Replikationsursprünge umfassen f1-ori und colE1, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, werden vorteilhafterweise Markergene (oder Reportergene) verwendet. Das Genkonstrukt kann daher gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier eingehender im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder gespalten werden, sobald sie nicht mehr vonnöten sind. Techniken zur Markerentfernung sind Stand der Technik, geeignete Techniken sind oben im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen gegenüber Kontrollpflanzen bereit, wobei eine beliebige Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid wie oben definiert, in eine(r) Pflanze eingeführt und exprimiert wird.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Ertrag bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer CKI Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle; und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige Nukleinsäure sein, die ein CKI-Polypeptid wie hier definiert kodieren kann.
  • Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern selektiert, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden; wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit einer Reihe von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. Sie können beispielsweise Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen sein; klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf eine jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der hier beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf sämtliche Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure, die ein wie oben definiertes CKI-Polypeptid kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zu der Superfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturpflanzen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen gehören zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen gehört zum Beispiel Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden gehören zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung betrifft auch erntefähige Teile einer Pflanze wie zum Beispiel, jedoch nicht ausschließlich, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntefähigen Teil einer solchen Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut beschrieben; und Beispiele sind im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahren, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die CKI-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser CKI-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die das CKI-Polypeptid kodieren, oder die CKI-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem für ein CKI-Polpeptid kodierenden Gen genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die CKI-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier unter den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein CKI-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die ohne Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • CKI-Polypeptide kodierende Nukleinsäuren können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung der CKI-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuren benötigt nur eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die CKI-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuren können als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktions-gespaltener genomischer Pflanzen-DNA kann mit den CKI-kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Computerprogrammen unterworfen werden, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), so dass man eine genetische Karte erhält. Die Nukleinsäuren können zudem zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die die Eltern und die Nachfahren einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der CKI-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte verwendet, die mit dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methoden sind dem Fachmann bestens bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Literaturstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung durch direkte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf der Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann mit Hilfe der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und zu erzeugen, die bei der Amplifikationsreaktion oder Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemisch und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • IV. Pflanzen-Homöodomänen-Finger-Homöodomänen-(Plant homeodomain finger-homeodomain (PHDf-HD))-Polypeptid
  • Es wurde überraschend entdeckt, dass die Modulation, vorzugsweise Steigerung, der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise Verbesserung der Samenertragsmerkmale, bei Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem die Expression einer Nukleinsäure, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert, vorzugsweise erhöht wird.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation, vorzugsweise Steigerung, der Expression einer Nukleinsäure, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, erfolgt durch Einführen und Expression einer Nukleinsäure, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze.
  • Jede Bezugnahme auf ein ”Protein, das sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet” soll ein PHDf-HD-Polypeptid bedeuten, wie es hier definiert ist. Jede im erfindungsgemäßen Zusammenhang erfolgende Bezugnahme auf eine ”Nukleinsäuresequenz, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet” soll eine Nukleinsäuresequenz bedeuten, die ein solches PHDf-HD-Polypeptid kodieren kann. Die in eine Pflanze einzubringende (und daher bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignete) Nukleinsäuresequenz ist eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die den nachstehend beschriebenen Proteintyp kodiert, der auch als ”PHDf-HD-Nukleinsäuresequenz” oder ”PHDf-HD-Gen” bezeichnet wird.
  • Ein PHDf-HD-Polypeptid, wie es hier definiert ist betrifft ein Polypeptid, umfassend (i) eine Domäne mit mindestens 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu einer Leucin-Zipper/Pflanzenhomöodomänenfinger-(ZIP/PHDf)-Domäne wie sie durch SEQ ID NO: 233 veranschaulicht ist; und (ii) eine Domäne mit mindestens 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu einer Homöodomäne (HD) wie sie durch SEQ ID NO: 234 veranschaulicht wird.
  • Alternativ oder zusätzlich betrifft ein ”PHDf-HD-Polypeptid” wie es hier definiert ist, ein Polypeptid, umfassend: (i) eine PHD-Domäne, wie sie durch PFAM00628 versanschaulicht wird; und (ii) eine HD wie sie durch PFAM00046 veranschaulicht wird.
  • Alternativ oder zusätzlich betrifft ein ”PHDf-HD-Polypeptid” wie es hier definiert ist eine Polypeptid-Sequenz, die bei der Verwendung bei der Konstruktion eines HD-Stammbaums wie in 13 gezeigt, eher mit der PHDf-HD Gruppe von Polypeptiden, die die in SEQ ID NO: 180 gezeigte Polypeptid-Sequenz umfassen, statt mit einer anderen HD Gruppe, Cluster bildet.
  • Alternativ oder zusätzlich betrifft ein ”PHDf-HD-Polypeptid” wie es hier definiert ist ein Polypeptid, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu dem PHDf-HD-Polypeptid wie es in SEQ ID NO: 180 gezeigt ist, oder zu einer der in Tabelle D1 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen aufweist.
  • Die Begriffe ”Domäne” und ”Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al. (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden. Die Analyse der Polypeptid-Sequenz von SEQ ID NO: 180 ist nachstehend in den Beispielen 30 und 32 hier angegeben. Ein PHDf-HD-Polypeptid, wie es beispielsweise durch SEQ ID NO: 180 angegeben ist, umfasst einen PHD-Finger mit einem Pfam-Eintrag PF00628, und eine HD mit Pfam-Eintrag PF00046.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologa können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden ((Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie es dem Fachmann ersichtlich wird, kleine manuelle Veränderungen vorgenommen werden. Darüber hinaus können statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologa auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden. Das hierin aufgeführte Beispiel 31 beschreibt in der Tabelle D2 die Prozent Identität zwischen ZIP/PHDf wie es durch SEQ ID NO: 233 veranschaulicht wird and ZIP/PHDf der in Tabelle D1 aufgeführten PHDf-HD-Polypeptide, und in Tabelle D3 die Prozent Identität zwischen der HD wie sie durch SEQ ID NO: 234 veranschaulicht wird, und der HD der in Tabelle D1 von Beispiel 29 gezeigten PHDf-HD-Polypeptide.
  • Darüber hinaus können die Aminosäuresequenzen, die an basischen (Lys und Arg) oder sauren (Glu und Asp) Aminosäuren, angereichert sind, und die als basische bzw saure Abschnitte bezeichnet werden, leicht durch visuelle Untersuchung identifiziert werden (17). Alternativ kann die primäre Aminosäure-Zusammensetzung (in %) berechnet werden, um zu bestimmen, ob eine Polypeptid-Domäne reich am spezifischen Aminosäuren ist, wobei Software-Programme vom ExPASy-Server verwendet werden, insbesondere dem ProtParam Werkzeug (Gasteiger E et al. (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31: 3784–3788). Die Zusammensetzung des interessierenden Proteins kann dann mit der durchschnittlichen Aminosäure-Zusammensetzung (in %) in der Swiss-Prot Protein Sequenz-Datenbank verglichen werden.
  • Coiled Coils sind zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Oligomerisierung, entweder von identischen Proteinen, Proteinen der gleichen Familie oder von unverwandten Proteinen wichtig. Ein PHDf-HD-Polypeptid zeigt mindestens eine vorhergesagte Coiled-Coil-Region. Neuerdings wurde ein großer Fortschritt hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage von Coiled Coils aus Sequenzdaten gemacht. An der ExPASy sind dem Fachmann bestens bekannte Algorithmen zugänglich, wie die Proteomics-Werkzeuge COILS, PAIRCOIL, PAIRCOIL2, MULTICOIL, oder MARCOIL, die vom Schweizer Institut für Bioinformatik gehosted werden. Im Beispiel 33 und in der 16 sind jeweils die numerischen und graphischen Ergebnis von SEQ ID NO: 180 gezeigt, wie sie bei der Analyse mit dem COILS-Algorithmus erhalten werden. Zwei vorhergesagte N-terminale Coiled Coil-Domänen werden in einer PHDf-HD Polypeptid-Sequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 180 veranschaulicht ist, mit einer hohen Wahrscheinlicheit identifiziert. Ein C-terminaler Coiled Coil wird ebenfalls mit niedriger Wahrscheinlichkeit vorhergesagt.
  • Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Proteinlokalisation ist wichtig und gut untersucht. Das Wissen über die Lokalisierung eines Proteins unterstützt die Aufklärung seiner Funktion. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP). Solche Verfahren sind zwar präzise aber verglichen mit Computer-Verfahren arbeitsintensiv. Neuerdings wurde ein großer Fortschritt hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisation aus Sequenzdaten gemacht. An der ExPASy sind dem Fachmann bestens bekannte Algorithmen zugänglich, wie u. a beispielsweise die Proteomics-Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, die vom Schweizer Institut für Bioinformatik gehosted werden. Die Identifikation der subzellulären Lokalisierung des erfindungsgemäßen Polypeptids ist in Beispiel 34 gezeigt. Insbesondere SEQ ID NO: 180 der vorliegenden Erfindung wird dem Kern-Kompartiment eukaryotischer Zellen zugeordnet.
  • PHDf-HD-Polypeptide, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen (zumindest in ihrer nativen Form), haben gewöhnlich, aber nicht unbedingt transkriptionsregulatorische Aktivität und die Fähigkeit, mit anderen Proteinen Wechselwirkungen einzugehen. Daher können PHDf-HD-Polypeptide mit reduzierter transkriptionsregulatorischer Aktivität, ohne transkriptionsregulatorische Aktivität, mit reduzierter Protein-Protein-Wechselwirkungs-Kapazität oder ohne Protein-Protein-Wechselwirkungs-Kapazität gleichermaßen für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sein. Die DNA-Bindungs-Aktivität und die Protein-Protein-Wechselwirkungen können leicht in vitro oder in vivo mittels Techniken des Standes der Technik bestimmt werden (beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Zur Bestimmung der DNA-Bindungs-Aktivität von PHDf-HD-Polypeptiden stehen mehrere Tests zur Verfügung, wie die DNA-Bindungs-Gelshift-Tests (oder Gelretardations-Tests; Korfhage et al. (1994) Plant C 6: 695–708), in vitro DNA Bindungstests (Schindler et al. (1993) Plant J 4 (1): 137–150), oder Transkriptionsaktivierung von PHDf-HD-Polypeptiden in Hefe-, Tier- und Pflanzenzellen (Halbach et al. (2000) Nucleic Acid Res 28 (18): 3542–3550). Spezifische DNA-Bindungssequenzen können mit der statistischen Oligonukleotid-Selektionstechnik bestimmt werden (Viola & Gonzalez (May 26, 2007) Biochemistry).
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der Transformation von Pflanzen mit der in SEQ ID NO: 179 gezeigten Nukleinsäuresequenz gezeigt, die die Polypeptid-Sequenz von SEQ ID NO: 180 kodiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft mit einer jeden Nukleinsäuresequenz durchgeführt werden, die ein PHDf-HD oder PHDf-HD-Polypeptid wie hier definiert kodiert.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die PHDf-HD-Polypeptide kodieren, sind in der Tabelle D1 des Beispiels 29 hierin beschrieben. Solche Nukleinsäuresequenzen sind zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Die in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Polypeptid-Sequenzen sind Beispiel-Sequenzen für Orthologa und Paraloga des durch SEQ ID NO: 180 veranschaulichten PHDf-HD-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” die hier definierte Bedeutung haben. Weitere Orthologa und Paraloga können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise einen ersten BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel eine der in Tabelle D1 von Beispiel 29 aufgeführten Sequenzen) ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 179 oder SEQ ID NO: 180, dann erfolgt das zweite BLASTing daher gegen Reis-Sequenzen). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von der gleichen Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist Stand der Technik. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mit dem Prozentsatz der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den beiden verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologa und Paraloga zu identifizieren. Ein jeder Sequenz-Cluster innerhalb der Gruppe, die SEQ ID NO: 180 umfasst (in 29 eingekreist) liegt in der vorstehend genannten Definition eines PHDf-HD-Polypeptids, und wird zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren als geeignet angesehen.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können sich auch Nukleinsäurevarianten eignen. Beispiele für solche Varianten umfassen die Nukleinsäuresequenzen, die Homologa und Derivate von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homologon” und ”Derivat” die hier definierte Bedeutung haben. Für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich auch Nukleinsäuresequenzen, die Homologa und Derivate von Orthologa oder Paraloga von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen kodieren. Homologa und Derivate, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, gehören Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide kodieren, die durch ”Gen-Shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”Gen-Shuffling” sind wie hier Text beschrieben.
  • Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide kodieren, müssen nicht unbedingt Volllängennukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale, vorzugsweise Verbesserung der Samenertragsmerkmale, bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäuresequenz durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können mit anderen kodierenden (oder nichtkodierenden) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion mit anderen kodierenden Sequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kodieren ein PHDf-HD-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800 aufeinanderfolgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, handelt. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 179. Der Abschnitt kodiert vorzugsweise eine Polypeptidsequenz, die bei der Verwendung bei der Konstruktion eines HD-Stammbaums, wie er in der 13 gezeigt ist, eher mit der Gruppe der PHDf-HD-Polypeptide, umfassend die durch SEQ ID NO: 180 veranschaulichte Polypeptidsequenz, Cluster bildet, als mit einer anderen HD-Gruppe.
  • Eine weitere Nukleinsäuresequenzvariante, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet, ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, wie hier definiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise Verbesserung von Samenertragsmerkmalen, bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die an eine der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann, einführt oder exprimiert, oder bei der man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert, hybridisieren kann, einführt oder exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kodieren ein PHDf-HD-Polypeptid wie hier definiert und haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in der Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Polypeptidsequenzen. Die hybridisierende Sequenz kann vorzugsweise an eine der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder an einen Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt die vorstehend definierte Bedeutung hat, oder wobei die hybridisierende Sequenz an eine Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann, die ein Orthologon, oder Paralogon von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 aufgeführten Polypeptidsequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz an eine Nukleinsäuresequenz hybridisieren, wie sie durch SEQ ID NO: 179 veranschaulicht wird, oder an einen Abschnitt davon.
  • Die hybridisierende Sequenz kodiert vorzugsweise eine Polypeptidsequenz, die bei der Verwendung bei der Konstruktion eines HD-Stammbaums, wie er in der 13 gezeigt ist, eher mit der Gruppe der PHDf-HD-Polypeptide, umfassend die durch SEQ ID NO: 180 veranschaulichte Polypeptidsequenz, Cluster bildet, als mit einer anderen HD-Gruppe.
  • Eine weitere Nukleinsäuresequenzvariante, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignet ist eine Spleißvariante, die ein PHDf-HD-Polypeptid wie hier definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante die vorstehend definierte Bedeutung hat.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise Verbesserung von Samenertragsmerkmalen, bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt oder exprimiert.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 179 veranschaulicht ist, oder ist eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von SEQ ID NO: 180 kodiert. Das von der Spleißvariante kodierte Polypeptid bildet bei der Verwendung bei der Konstruktion eines HD-Stammbaums, wie er in der 13 gezeigt ist, eher mit der Gruppe der PHDf-HD-Polypeptide, umfassend die durch SEQ ID NO: 180 veranschaulichte Polypeptidsequenz, Cluster als mit einer anderen HD-Gruppe.
  • Eine weitere Nukleinsäuresequenzvariante, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignet ist eine allelische Variante, die ein PHDf-HD-Polypeptid wie hier definiert kodiert, wobei eine allelische Variante die vorstehend definierte Bedeutung hat.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, vorzugsweise zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen, bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt oder exprimiert oder bei der man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt oder exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das Polypeptid von SEQ ID NO: 180 und eine der Polypeptidsequenzen in Tabelle D1 von Beispiel 29 auf. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung dieser natürlichen Allele ist von den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante von SEQ ID NO: 179 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von SEQ ID NO: 180 kodiert. Vorzugsweise bildet die von der allelischen Variante kodierte Polypeptidsequenz bei Verwendung bei der Konstruktion eines HD-Stammbaums wie er in 13 gezeigt ist eher mit den PHDf-HD-Polypeptiden, umfassend die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 180, Cluster, als mit einer anderen HD-Gruppe.
  • ”Gen-Shuffling” oder gerichtete Evolution können ebenfalls eingesetzt werden, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide wie oben definiert kodieren, zu erzeugen, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” die vorstehend definierte Bedeutung hat.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle D1 von Beispiel 29 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, wobei diese Nukleinsäuresequenzvariante durch ”Gen-Shuffling” erhalten wurde, einführt und exprimiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt vorteilhafterweise bisher unbekannte PHDf-HD- und Polypeptid-Sequenzen bereit.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, umfassend:
    • (i) eine durch SEQ ID NO: 242 dargestellte Nukleinsäure;
    • (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, die/das zu SEQ ID NO: 242 komplementär ist;
    • (iii) eine Nukleinsäure, die ein JMJC Polypeptid kodiert, mit in steigender Reihenfolge der Präferenz 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 243 angegebenen Aminosäuresequenz;
    • (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an eine der in (i), (ii) oder (iii) oben angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, umfassend:
    • (i) eine durch SEQ ID NO: 242 dargestellte Nukleinsäure;
    • (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, die/das zu SEQ ID NO: 242 komplementär ist;
    • (iii) eine Nukleinsäure, die ein JMJC Polypeptid kodiert, mit in steigender Reihenfolge der Präferenz 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 243 angegebenen Aminosäuresequenz;
    • (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an eine der in (i), (ii) oder (iii) oben angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
  • Vorzugsweise bildet die von der durch Gen-Shuffling erhaltene Nukleinsäurevariante kodierte Polypeptidsequenz bei Verwendung bei der Konstruktion eines HD-Stammbaums wie er in 13 gezeigt ist eher mit den PHDf-HD-Polypeptiden, umfassend die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 180, Cluster, als mit einer anderen HD-Gruppe.
  • Darüber hinaus können Nukleinsäurevarianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Es gibt verschiedene Verfahren zur Erzielung von ortsgerichteter Mutagenes, wobei die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).
  • Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäuresequenz kann aus ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielten menschlichen Eingriff modifiziert werden. Die das PHDf-HD-Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz stammt vorzugsweise aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie der Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Oryza sativa.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt insbesondere Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind eingehender im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, soll dies eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntefähige) Teile und/oder unterirdische (erntefähige) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntefähigen Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung unter Anderem als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Erhöhte Anzahl Pflanzen, die sich pro Hektar oder Acre entwickeln, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, Ährenlänge/durchmessers, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung unter Anderem als Erhöhung von einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausdrücken: Anzahl Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten (Blütchen) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere Samenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale, aufweisen, zeigen diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) wahrscheinlich eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem reifen trockenen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze reife trockene Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte (Jungpflanzen)-Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Entsprechend kann dies bei ausreichender Steigerung der Wachstumsrate ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann man auch zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kulturpflanze häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parametern von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter unter Anderem folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen). Die hier definierten Wachstumsraten sollen kein früheres Blühen bedeuten.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein PHDf-HD-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Verbesserte Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale, treten auf unabhängig davon, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gewachsen waren, verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress durch langsameres Wachstum. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichter Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotischer Stress wird gewöhnlich durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze, Nematoden und Insekten verursacht. Der Begriff der ”Nichtstress”-Bedingungen wie hier verwendet, beinhaltet solche Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen ermöglichen. Der Fachmann ist mit den normalen Bodenund Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen wachsen, verbesserte Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid wie oben definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen, die unter Nicht-Stressbedingungen herangezogen wurden, ergeben in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer bestimmten Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann für einen bestimmten Standort auf Ernte und/oder Jahreszeit-Basis berechnet werden. Der Fachmann ist mit der durchschnittlichen Ertragsproduktionen einer Kulturpflanze vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt unter abiotischen Stressbedingungen gewachsene Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen waren. Wie von Wang et al., (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress stehen bekanntlich miteinander in Verbindung und können über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Trockenheit und/oder Versalzung äußern sich beispielsweise in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig Hoch- oder Niedertemperatur-, Salinitäts- oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Demzufolge aktivieren diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Aufwärtsregulation von Antioxidantien, die Anreicherung kompatibler gelöster Stoffe und ein Einstellen des Wachstums. Da verschiedene Umweltstressfaktoren ähnliche Stoffwechselwege aktivieren, sollte die beispielhafte Erklärung von Trockenheitsstress in der vorliegenden Erfindung nicht als Einschränkung auf Trockenheitsstress angesehen werden, sondern soll lediglich die Beteiligung der PHDf-HD-Polypeptide wie vorstehend definiert bei der Verbesserung der Ertragsmerkmale, vorzugsweise bei der Verbesserung der Samenertragsmerkmale, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die bei vergleichbaren Stressbedingungen, insbesondere bei abiotischem Stress, gewachsen waren, anzeigen.
  • Der Begriff „abiotischer Stress” wie im vorliegenden Text definiert soll einen oder mehrere der folgenden Stressfaktoren bedeuten: Wasserstress (aufgrund von Trockenheit oder Wasserüberschuss), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (aufgrund von Hitze, Kälte oder Gefriertemperaturen), chemischer Toxizitätsstress und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wasserstress um Trockenheitsstress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Natriumchlorid (NaCl) beschränkt, sondern es kann sich dabei unter Anderem um eines der folgenden Salze handeln: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren unter abiotischen Stressbedingungen ergibt Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen waren. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale, vorzugsweise Samenertragsmerkmale in Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen waren, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus einem oder mehreren der Folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress.
  • Ein weiteres Beispiel für einen abiotischen Umweltstress ist die reduzierte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, die von der Pflanze für ihr Wachstum und ihre Entwicklung assimiliert werden müssen. Aufgrund des starken Einflusses, den die Nährstoffverwertungseffizienz einer Pflanze auf den Ertrag und die Produktqualität ausübt, wird eine enorm hohe Menge Dünger auf die Felder gestreut, um das Pflanzenwachstum und die Pflanzenqualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird üblicherweise von den drei Hauptnährstoffen Phosphor, Kalium und Stickstoff begrenzt, wobei von diesen drei Nährstoffen üblicherweise der letztgenannte das limitierende Element der Pflanzenwachstumsrate ist. Das wichtigste Nährstoffelement, das für das Pflanzenwachstum erforderlich ist, ist daher der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, die man in lebenden Zellen findet, wie u. a. von Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Chlorophyll. 1,5% bis 2% der pflanzlichen Trockenmasse ist Stickstoff und ungefähr 16% des gesamten pflanzlichen Proteins. Die Verfügbarkeit von Stickstoff ist daher ein wesentlicher limitierender Faktor für das Kulturpflanzenwachstum und die Kulturpflanzenproduktion (Frink et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (4): 1175–1180) und hat auch eine wichtige Auswirkung auf die Proteinakkumulation und auf die Aminosäurezusammensetzung. Kulturpflanzen, die bei Wachstum unter Stickstoffmangelbedingungen verbesserte Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale, aufweisen, sind daher von großem Interesse.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die bei Wachstum unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, verbesserte Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserte Samenertragsmerkmale, im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen gezüchteten Kontrollpflanzen aufweisen. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale, vorzugsweise Verbesserung der Samenertragsmerkmale, bei Pflanzen bereitgestellt, die unter Nährstoffmangelbedingungen gezüchtet wurden, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, moduliert, vorzugsweise steigert. Nährstoffmangel kann sich unter Anderem aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, ergeben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein PHDf-HD-Polypeptid wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder modulierte, vorzugsweise erhöhte Expression von Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in handelsübliche Vektoren eingeführt werden, die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, umfassend
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein PHDf-HD-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) modulieren, vorzugsweise steigern kann bzw. können; sowie gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Eine der Kontrollsequenzen eines Konstrukts ist vorzugsweise ein konstitutiver Promotor, der aus einem Pflanzengenom isoliert wurde. Ein Beispiel für einen pflanzlichen konstitutiven Promotor ist ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis, stärker bevorzugt ein GOS2-Promotor, der durch die SEQ ID NO: 235 veranschaulicht ist.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Dem Fachmann sind die genetischen Elemente, die auf einem Vektor zur erfolgreichen Transformation, Selektion und Vermehrung der Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, vorhanden sein müssen, geläufig. Die interessierende Sequenz ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promotor) verknüpft.
  • Jede Art von Promotor kann unabhängig davon, ob er natürlich oder synthetisch ist, vorteilhafterweise zur Modulation, vorzugsweise Steigerung, der Expression der Nukleinsäuresequenz, verwendet werden. Ein konstitutiver Promotor ist bei den Verfahren besonders geeignet, vorzugsweise ein aus einem Pflanzengenom isolierter konstitutiver Promotor. Der konstitutive Pflanzenpromotor steuert die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem Niveau, das in allen Fällen unter demjenigen ist, das unter der Kontrolle eines 35S CaMV-Promotors erhalten wird.
  • Andere organspezifische Promotoren, beispielsweise zur bevorzugten Expression in Blättern, Stängeln, Knollen, Meristemen, Samen (Embryo und/oder Endosperm), eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Für die Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe Abschnitt ”Definitionen” im vorliegenden Text.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die PHDf-HD-Polypeptide-kodierende Nukleinsäuresequenz eingeschränkt ist, die durch SEQ ID NO: 179 veranschaulicht ist, entsprechend ist die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die Expression einer PHDf-HD-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz eingeschränkt, wenn sie durch einen konstitutiven Promotor gesteuert wird.
  • Bei dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, kann/können gegebenenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen verwendet werden. Zusätzliche Regulationselemente können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer umfassen. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, die zur Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Zur Steigerung der Menge der reifen Botschaft, die sich im Cytosol anreichert, kann auch eine Introsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, wie es im Abschnitt Definitionen beschrieben wurde. Andere Kontrollsequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder leicht zugänglich.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die zur Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen gehören der f1-ori und colE1, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt ”Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben.
  • Es ist bekannt, dass je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik bei der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und falls gewünscht in ihr Genom integriert. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen Selektionsmarker) kodiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten, in denen diese Gene nicht funktionell sind, verwendet werden, und zwar zum Beispiel durch Deletion nach herkömmlichen Verfahren. Weiterhin können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf demselben Vektor eingeführt werden, der die Sequenz, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die Polypeptide, die bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, umfasst, oder auch auf einen separaten Vektor. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, während die anderen Zellen absterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder gespalten werden, sobald sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Entfernung des Markergens sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind oben im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen gegenüber Kontrollpflanzen bereit, wobei eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid wie oben definiert, in eine(r) Pflanze eingeführt und exprimiert wird.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer PHDf-HD-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle unter der Kontrolle eines konstitutiven Pflanzenpromotors; und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige Nukleinsäure sein, die ein PHDf-HD-Polypeptid wie hier definiert kodieren kann.
  • Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern selektiert, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden; wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. Sie können beispielsweise Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen sein; klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf eine jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der hier beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf sämtliche Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein wie oben definiertes PHDf-HD-Polypeptid kodiert, enthalten, die funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verknüpft ist. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zu der Superfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturpflanzen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen gehören zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen gehört zum Beispiel Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden gehören zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung betrifft auch erntefähige Teile einer Pflanze, die eine funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verknüpfte isolierte Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine PHDf-HD (wie vorstehend definiert) kodiert, wie zum Beispiel, jedoch nicht ausschließlich, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntefähigen Teil einer solchen Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut beschrieben; und Beispiele sind im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren, vorzugsweise Erhöhen, der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale können auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die PHDf-HD-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser PHDf-HD-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale, vorzugsweise Samenertragsmerkmale, in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die das PHDf-HD-Polypeptid kodieren, oder die PHDf-HD-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem für ein PHDf-HD-Polpeptid kodierenden Gen genetisch verknüpft sein kann. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen oder die PHDf-HD-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise erhöhten Samenertragsmerkmalen, verwendet werden, wie hier unter den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten eines Gens/einer Nukleinsäure, das/die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die ohne Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Ertragsmerkmale liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • PHDf-HD-Polypeptide kodierende Nukleinsäuresequenzen können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung der PHDf-HD-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen benötigt nur eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die PHDf-HD-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen können als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktions-gespaltener genomischer Pflanzen-DNA kann mit den PHDf-HD-kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Computerprogrammen unterworfen werden, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), so dass man eine genetische Karte erhält. Die Nukleinsäuren können zudem zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die die Eltern und die Nachfahren einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der PHDf-HD-Polypeptidkodierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte verwendet, die mit dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann sehr geläufig.
  • Die Nukleinsäuresequenzsonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Literaturstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung durch direkte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäuresequenzamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und zu erzeugen, die bei der Amplifikationsreaktion oder Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemisch und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • V. bHLH11-ähnlich (basic Helix-Loop-Helix 11)
  • Es wurde überraschend entdeckt, dass die Modulation der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, Pflanzen ergibt, die verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereit, bei dem die Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert wird.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation (vorzugsweise Steigerung) der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, erfolgt durch Einführen und Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze.
  • Jede Bezugnahme auf ein ”Protein, das sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet”, soll ein bHLH11-ähnliches Polypeptid bedeuten, wie es hier definiert ist. Jede im erfindungsgemäßen Zusammenhang erfolgende Bezugnahme auf eine ”Nukleinsäure, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet” soll eine Nukleinsäure bedeuten, die ein solches bHLH11-ähnliches Polypeptid kodieren kann. Die in eine Pflanze einzubringende (und daher bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignete) Nukleinsäure ist eine beliebige Nukleinsäure, die den nachstehend beschriebenen Proteintyp kodiert, der auch als ”bHLH11-ähnliche Nukleinsäure” oder” bHLH11-ähnliches Gen” bezeichnet wird.
  • Ein ”bHLH11-ähnliches Polypeptid” wie es hier definiert ist, betrifft ein Polypeptid, das eine basische Domäne und danach eine HLH-Domäne umfasst (HMMPFam PF00010, ProfileScan PS50888, SMART SM00353) wodurch eine basische Helix-Loop-Helix-Domäne (bHLH) (Interpro IPR001092) gebildet wird. Das bHLH11-ähnliche Polypeptid umfasst vorzugsweise mindestens eine, vorzugsweise zwei, stärker bevorzugt drei, am stärksten bevorzugt vier oder mehr der folgenden Motive:
    • Motiv 1 (SEQ ID NO: 246): (E/D)(D/S/E)(F/M)(L/F)(D/E/Q/L)(Q/H/E)
    • Motiv 2 (SEQ ID NO: 247): RA(R/I/Q)RG(Q/H)ATDPHSIAER
    • Motiv 3 (SEQ ID NO: 248): (M/I/V/L)(K/R)(A/S/Q/D/N)LQ(E/D/V)LVP
    • Motiv 4 (SEQ ID NO: 249): (M/I)(L/I)DEI(I/V/L)(D/E/G)Y(V/L/I)(K/R)FL(Q/R)LQ(V/I)K
    • Motiv 5 (SEQ ID NO: 250): (V/I)LSMSR(L/V)G
    • Motiv 6 (SEQ ID NO: 251): V(A/V/L/I)(K/R)(L/M)(M/L)(E/D)(E/D/S/K/T)(D/N/S)(M/V/I)(G/T/I)XAMQ(Y/L/F)L
    wobei X eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugsweise eine von S, T, A, M, K, N Motiv 7 (SEQ ID NO: 252): (M/V)(P/S)(I/V)(S/T/A)LA
  • Alternativ hat das Homologon eines bHLH11-ähnlichen Proteins in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Gesamt-Sequenzidentität, wie sie durch SEQ ID NO: 245 veranschaulicht sind, vorausgesetzt das homologe Proteine umfasst die konservierten Motive wie oben erwähnt. Die Gesamtsequenzidentität wird bestimmt mit einem allgemeinen Alignment-Algorithmus, wie dem Algorithmus von Needleman Wunsch in dem Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Default-Parametern. Verglichen mit der Gesamt-Sequenzidentität ist die Sequenzidentität im Allgemeinen höher, wenn nur konservierte Domänen oder Motive berücksichtigt werden. Die Sequenzkonservierung ist viel höher in dem Bereich der bHLH Domäne (siehe Tabelle E3 in Beispiel 45 und 21). Daher ist die bHLH-Domäne ein gutes Kriterium zur Definition der Gruppe der bHLH11-ähnlichen Proteine. Das bHLH11-ähnliche Polypeptid umfasst die Sequenz von Motiv 8 (SEQ ID NO: 253): SIAERLRRERIAERMRALQELVPNTNKTDRAVMLDEILDYVKFLRLQVKVL, oder eine Sequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 253 aufweist. Die HLH-Domäne wie durch SMART bestimmt, überspannt den Rest 132 bis 181 in SEQ ID NO: 245 und ist in Motiv 8 enthalten.
  • Die Polypeptid-Sequenz, die bei der Verwendung in der Konstruktion eines Stammbaums verwendet wird, wie er in der 22 veranschaulicht ist, bildet eher in der Gruppe der bHLH11-ähnlichen Proteine Cluster als mit anderen bHLH-Proteinen. Entsprechend bildet das bHLH11-ähnliche Protein der Wahl eher Cluster in der Subgruppe C, wenn ein Stammbaum gemäß 6 in Li et al. (2006), konstruiert wird als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al. (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologa können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden ((Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10;4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie es dem Fachmann ersichtlich wird, kleine manuelle Veränderungen vorgenommen werden. Darüber hinaus können statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologa auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders geeignet (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147 (1); 195–7).
  • Die bHLH11-ähnlichen Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) haben gewöhnlich DNA Bindungsaktivität. Werkzeuge und Techniken zum Messen der DNA-Bindungsaktivität sind im Stand der Technik bestens bekannt. Zudem ergibt wie erfindungsgemäß gezeigt ein bHLH11-ähnliches Protein, wie SEQ ID NO: 245, bei Überexpression in Reis, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Füllrate. Weitere Einzelheiten sind im Abschnitt Beispiele gezeigt.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der Transformation von Pflanzen mit der in SEQ ID NO: 244 gezeigten Nukleinsäuresequenz, die die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 245 kodiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhafterweise durch Verwendung einer beliebigen bHLH11-ähnlichen kodierenden Nukleinsäure oder bHLH11-ähnlichen Polypeptid, wie hier definiert durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, sind in der Tabelle E1 von Beispiel 43 hierin beschrieben. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle E1 von Beispiel 43 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispiel-Sequenzen für Orthologa und Paraloga des durch SEQ ID NO: 245 veranschaulichten bHLH11-ähnlichen Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” die hier definierte Bedeutung haben. Weitere Orthologa und Paraloga können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise einen ersten BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel eine der in Tabelle E1 von Beispiel 43 aufgeführten Sequenzen) ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 244 oder SEQ ID NO: 245, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Triticum aestivum-Sequenzen). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von der gleichen Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von der gleichen Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist Stand der Technik. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mit dem Prozentsatz der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den beiden verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologa und Paraloga zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können sich auch Nukleinsäurevarianten eignen. Beispiele für solche Varianten umfassen die Nukleinsäuresequenzen, die Homologa und Derivate von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homologon” und ”Derivat” die hier definierte Bedeutung haben. Für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich auch Nukleinsäuren, die Homologa und Derivate von Orthologa oder Paraloga von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 hier angegebenen Aminosäuresequenzen kodieren. Homologa und Derivate, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, gehören Abschnitte von Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, die durch ”Gen-Shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”Gene-Shuffling” sind wie im vorliegenden Text definiert.
  • Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, müssen nicht unbedingt Volllängennukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt von einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 angegebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können mit anderen kodierenden (oder nichtkodierenden) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion mit anderen kodierenden Sequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren für ein bHLH11-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle E1 von Beispiel 43 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 244. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt ein Fragment von einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 22 dargestellten, verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe der bHLH11-ähnlichen Polypeptide als mit anderen bHLH-Proteinen Cluster bildet. Ebenso bildet das gewählte bHLH11-ähnliche Protein eher innerhalb der Subgruppe C als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster, wenn ein Baum gemäß 6 in Li et al. (2006) konstruiert wird.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, wie hier definiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein bHLH11-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren kann. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 244 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die in voller Länge, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 22 dargestellten, verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe der bHLH11-ähnlichen Polypeptide als mit anderen bHLH-Proteinen Cluster bildet. Ebenso bildet das gewählte bHLH11-ähnliche Protein eher innerhalb der Subgruppe C als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster, wenn ein Baum gemäß 6 in Li et al. (2006) konstruiert wird.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 244 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 245 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 22 dargestellten, verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe der bHLH11-ähnlichen Polypeptide als mit anderen bHLH-Proteinen Cluster. Ebenso bildet das gewählte bHLH11-ähnliche Protein eher innerhalb der Subgruppe C als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster, wenn ein Baum gemäß 6 in Li et al. (2006) konstruiert wird.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die von allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodierten Polypeptide haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das bHLH11-ähnliche Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 244 und eine der in Tabelle E1 von Beispiel 43 dargestellten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante gemäß SEQ ID NO: 244 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 245 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 22 dargestellten, verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe der bHLH11-ähnlichen Polypeptide als mit anderen bHLH-Proteinen Cluster. Ebenso bildet das gewählte bHLH11-ähnliche Protein eher innerhalb der Subgruppe C als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster, wenn ein Baum gemäß 6 in Li et al. (2006) konstruiert wird.
  • Man kann auch ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution dazu verwenden, Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, die bHLH11-ähnliche Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle E1 von Beispiel 43 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 22 dargestellten, verwendet wird, eher innerhalb der Gruppe der bHLH11-ähnlichen Polypeptide als mit anderen bHLH-Proteinen Cluster. Ebenso bildet das gewählte bHLH11-ähnliche Protein eher innerhalb der Subgruppe C als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster, wenn ein Baum gemäß 6 in Li et al. (2006) konstruiert wird.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die das bHLH11-ähnliche Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer einkeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Triticum aestivum.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verstärkten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” werden hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit höherem Samenertrag im Vergleich zu dem Samenertrag von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Quadratmeter wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, verglichen mit Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine höhere Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige zusätzliche Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau transgener Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze, Nematoden und Insekten, verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperatur, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut. Pflanzen unter optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen herangezogen werden) liefern oft einen Ertrag von, in der Reihenfolge der zunehmenden Präferenz, mindestens 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann bezogen auf die Ernte und/oder die Saison berechnet werden. Der Fachmann ist mit den durchschnittlichen Erträgen einer Kultur vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen wachsen, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert, vorausgesetzt, dass es sich bei dem Nährstoffmangel nicht um einen Phosphatmangel handelt. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphate und andere phosphorhaltige Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, hervorgerufen werden. Der Begriff ”Nährstoffmandel”, wie er im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst jedoch keinen Phosphatmangel.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, wie oben definiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die für bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation des interessierenden Gens in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, wie oben definiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen erfolgreich transformiert, Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden, aber vorzugsweise stammt der Promotor aus einer Pflanze. Ein konstitutiver Promoter ist für die Verfahren besonders geeignet. Vorzugsweise ist der konstitutive Promoter außerdem ein ubiquitärer Promotor mittlerer Stärke. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die durch SEQ ID NO: 1 dargestellte, ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodierende Nukleinsäure noch auf die Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, wenn sie von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, wie der GOS2-Promotor, vorzugsweise handelt es sich bei dem Promotor um einen GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 256 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 256 dargestellt. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die den GOS2-Promotor, der im Wesentlichen gleich der SEQ ID NO: 256 ist, und die Nukleinsäure, die das bHLH11-ähnliche Polypeptid kodiert, umfasst.
  • Zu weiteren Regulationselementen können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer gehören. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. als Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion von transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr gebraucht werden. Techniken zur Entfernung von Markern sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid, wie oben definiert, kodiert, in eine(r) Pflanze umfasst.
  • Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem (Samen-)Ertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäure gemäß (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, die mit dem interessierenden Gen cotransferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, gescreent.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (bei denen z. B. alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren aufweist.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen beinhalten Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei die erntbaren Teile eine rekombinante Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, umfassen. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, besteht ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser bHLH11-ähnlichen Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodieren, oder die bHLH11-ähnlichen Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein bHLH11-ähnliches Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die bHLH11-ähnlichen Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend in den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte beinhalten gegebenenfalls das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliche Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den Nukleinsäuren, die bHLH11-ähnliches Polypeptid kodieren, sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease-behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung wiedergeben. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der Nukleinsäure, die das bHLH11-ähnliche Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • III. ASR-(Abszisinsäure-, Stress- und Reifungs-induziertes)Polypeptid
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, in eine Pflanze einbringt und in dieser exprimiert.
  • Wird im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein ASR-Polypeptid, wie hier definiert, verstanden werden. Wird hier im Folgenden auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, bedeutet dies eine Nukleinsäure, die ein solches ASR-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und die daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede beliebige Nukleinsäure, welche den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”ASR-Nukleinsäure” oder ”ASR-Gen” bezeichnet.
  • Ein ”ASR-Polypeptid”, wie hier definiert, betrifft die durch SEQ ID NO: 397 dargestellten Proteine und Homologe (Orthologe und Paraloge) davon. Vorzugsweise haben die Homologe der SEQ ID NO: 397 eine ABA-WDS-Domäne (Pfam-Eintrag PF02496).
  • Weiterhin bevorzugt sind erfindungsgemäße ASR-Polypeptide diejenigen, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 83%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit einem oder mehreren der in Tabelle F1 angegebenen Polypeptide aufweisen.
  • Der Begriff ”Domäne” und ”Motiv” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motives and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002)). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie durch Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der Übereinstimmungen (”Matches”) maximiert und die Anzahl der Lücken (”Gaps”) minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mob. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. Juli 2003, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann bekannt ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder ein konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden.
  • Weiterhin haben ASR-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form), soweit es SEQ ID NO: 397 und ihre Homologe betrifft, üblicherweise die Fähigkeit, die Salzstressresistenz von Pflanzen zu erhöhen. Werkzeuge und Techniken für die Expression der ASR in Pflanzen und das Testen auf eine erhöhte Salzstressresistenz sind in der Fachwelt bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 396, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 397 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder ASR-kodierenden Nukleinsäure oder jedes ASR-Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, lassen sich in Datenbanken finden, die in der Fachwelt bekannt sind. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Orthologe und Paraloge, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind, können leicht identifiziert werden, indem man eine so genannte reziproke Blast-Suche durchführt. Dies beinhaltet üblicherweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel unter Verwendung der SEQ ID NO: 397) ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 396 oder SEQ ID NO: 397, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Oryza sativa). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz und vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu führt, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein, die Homologe und Derivate der SEQ ID NO: 397 kodiere, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen der SEQ ID NO: 397 kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen, auf.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind hier definiert.
  • Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt der SEQ ID NO: 396 oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog der SEQ ID NO: 397 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure vornimmt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein ASR- Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 397 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in SEQ ID NO: 396 angegebenen Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in der SEQ ID NO: 396 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei die aufeinander folgenden Nukleotide von der SEQ ID NO: 396 oder von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 397 kodiert, stammen. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 396.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, wie hier definiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit der SEQ ID NO: 396 hybridisieren kann, einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog der SEQ ID NO: 396 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein ASR-Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 397 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit der SEQ ID NO: 396 oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 397 kodiert, hybridisieren kann.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein ASR-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante der SEQ ID NO: 396 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog der SEQ ID NO: 397 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante der SEQ ID NO: 396 einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog der durch SEQ ID NO: 397 dargestellten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das ASR-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 397. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Man kann auch ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution dazu verwenden, Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, die ASR-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante der SEQ ID NO: 396 einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog der SEQ ID NO: 397 kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze. Im Fall der SEQ ID NO: 396 stammt die Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, vorzugsweise aus einer einkeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
  • Die Erfindung stellt auch bisher unbekannte ASR-kodierende Nukleinsäuren und ASR-Polypeptide bereit.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das ausgewählt ist aus:
    • (i) einer Nukleinsäure, die durch eine der SEQ ID NO: 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415 und 417 dargestellt wird;
    • (ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, die durch eine der SEQ ID NO: 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415 und 417 dargestellt wird;
    • (iii) einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert und, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine der SEQ ID NO: 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 und 418 dargestellt wird.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das ausgewählt ist aus:
    • (i) einer Aminosäuresequenz, die durch eine der SEQ ID NO: 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 und 418 dargestellt wird;
    • (ii) einer Aminosäuresequenz, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz hat, die durch eine der SEQ ID NO: 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 und 418 dargestellt wird;
    • (iii) Derivaten von einer der vorstehend unter (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verstärkten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” werden hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile Biomasse und/oder Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit höherer Jungpflanzenvitalität, höherer Biomasse und/oder höherem Samenertrag im Vergleich zu der Jungpflanzenvitalität, der Biomasse oder dem Samenertrag von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Biomasse- und/oder des Samenertrags von Pflanzen, verglichen mit Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression, vorzugsweise die Erhöhung der Expression, einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine höhere Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige zusätzliche Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau transgener Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression, vorzugsweise die Erhöhung der Expression, einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst. In einer bestimmten Ausführungsform ergibt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten, verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperatur, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut. Pflanzen unter optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen herangezogen werden) liefern üblicherweise einen Ertrag von, in der Reihenfolge der zunehmenden Präferenz, mindestens 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann bezogen auf die Ernte und/oder die Saison berechnet werden. Der Fachmann ist mit den durchschnittlichen Erträgen einer Kultur vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden, erhöhten Ertrag und/oder erhöhte Jungpflanzenvitalität. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags und/oder der Jungpflanzenvitalität von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphate und andere phosphorhaltige Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, hervorgerufen werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein ASR-Polypeptid kodiert, wie oben definiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation des interessierenden Gens in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, wie oben definiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen erfolgreich transformiert, Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter ist für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die durch SEQ ID NO: 396 dargestellte Nukleinsäure, die ein ASR-Poylpeptid kodiert, noch auf die Expression einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, wenn sie von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 398 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 398 dargestellt. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Zu weiteren Regulationselementen können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer gehören. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. als Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion von transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr gebraucht werden. Techniken zur Entfernung von Markern sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ASR-Polypeptid, wie hier oben definiert, kodiert, in eine(r) Pflanze umfasst.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten verbesserten Ertragsmerkmalden, insbesondere erhöhter Jungpflanzenvitalität und/oder erhöhtem Ertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäure gemäß (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein ASR-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, die mit dem interessierenden Gen cotransferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, gescreent.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und urtransformierten Zellen, klonale Transformanten (bei denen z. B. alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das durch eines der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren aufweist.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein ASR-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen beinhalten u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, besteht ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, in eine Pflanze einführt und darin exprimiert; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschntt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser ASR-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, oder die ASR-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen genetisch verknüpft sein kann, das ein ASR-Polpeptid kodiert. Die Nukleinsäuren/Gene oder die ASR-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend unter den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein ASR-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte beinhalten gegebenenfalls das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die ASR-Polypeptide kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die ein ASR-Polypeptid kodierenden Nukleinsäuren können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den ASR-kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease-behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung wiedergeben. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der Nukleinsäure, die das ASR-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung durch direkte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und zu erzeugen, die in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren im Allgemeinen nicht erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • VII. Squamosa-Promotor-Bindungsprotein-ähnlich-11-(SPL11-)Transkriptionsfaktor-Polypeptid
  • Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch bisher unbekannte SPL11-kodierende Nukleinsäuren und SPL11-Polypeptide bereit. Diese Sequenzen sind ebenfalls zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet.
  • Daher wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das Folgendes umfasst:
    • (i) eine durch SEQ ID NO: 448 dargestellte Nukleinsäure;
    • (ii) ein Komplement einer durch SEQ ID NO: 448 dargestellten Nukleinsäure;
    • (iii) eine Nukleinsäure, die für ein SPL11-Polypeptid kodiert und, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 449 angegebenen Aminosäuresequenz besitzt und, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 465: SYCQVEGCRTDLSSAKDYHRKHRVCEPHSKAPKVVVAGLERRFC QQCSRFHGLAEFDQKKKSCRRRLNDHNARRRKPQPEAL (die die SBP-Domäne in der SEQ ID NO: 449 darstellt) besitzt;
    • (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO: 448 hybridisiert.
  • Weiterhin wird auch ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das Folgendes umfasst:
    • (i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 449;
    • (ii) eine Aminosäuresequenz, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 449 angegebenen Aminosäuresequenz besitzt und, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der SEQ ID NO: 465: SYCQVEGCRTDLSSAKDYHRKHRVCEPHSKAPKVVVAGLERRFC QQCSRFHGLAEFDQKKKSCRRRLNDHNARRRKPQPEAL (die die SBP-Domäne in der SEQ ID NO: 449 darstellt) besitzt;
    • (iii) Derivate von einer der vorstehend unter (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, in eine Pflanze einbringt und in dieser exprimiert.
  • Wird im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, versteht man darunter ein SPL11-Polypeptid, wie hier definiert. Wird hier im Folgenden auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, bedeutet dies eine Nukleinsäure, die ein solches SPL11-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und die daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede beliebige Nukleinsäure, die den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”SPL11-Nukleinsäure” oder ”SPL11-Gen” bezeichnet.
  • Ein SPL11-Polypeptid, wie hier definiert, betrifft ein Polypeptid, das eine Squamosa-Bindungsprotein-(SBP-)Domäne umfasst, wobei eine solche Domäne, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität mit einer der durch SEQ ID NO: 456 bis SEQ ID NO: 468 oder SEQ ID NO: 478 dargestellten SBP-Domänen aufweist.
  • Ein ”SPL11-Polypeptid”, wie hier definiert, umfasst das Protein gemäß SEQ ID NO: 448, die identisch mit der SEQ ID NO: 172 ist, und Homologe (Orthologe und Paraloge) davon.
  • Vorzugsweise haben die Homologe der SEQ ID NO: 172 eine DNA-Bindungsdomäne.
  • SPL11-Polypeptide lassen sich in speziellen Datenbanken finden, wie Pfam (Finn et al. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247–D251). Pfam listet eine große Sammlung an mehrfachen Sequenz-Alignments und Hidden-Markov-Modellen (HMM) auf, die viele häufige Proteindomänen und -familien abdeckt, und ist über das Sanger Institute in Großbritannien verfügbar.
  • Die Erfassungsausschlussgrenze für die SBP-Domäne im Pfam HMM_fs-Modell und im Pfam HMM_Is-Modell beträgt 25,0. In der Pfam-Datenbank gelten als zuverlässige Übereinstimmungen solche mit einem Score oberhalb der Erfassungsausschlussgrenze. Mögliche Übereinstimmungen, die echte SBP-Domänen umfassen, können jedoch unter den Erfassungsausschluss fallen. Vorzugsweise ist ein SPL11-Polypeptid ein Protein mit einer oder mehreren Domänen in seiner Sequenz, welche den Erfassungsausschluss der Pfam-Proteindomänenfamilie PF03110, die als SBP-Domäne bekannt ist, überschreiten.
  • Alternativ kann eine SBP-Domäne in einem Polypeptid identifiziert werden, indem man einen Sequenzvergleich mit bekannten Polypeptiden, die eine SBP-Domäne umfassen, durchführt und die Ähnlichkeit im Bereich der SBP-Domäne feststellt. Das Alignment der Sequenzen kann unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannten Verfahrens durchgeführt werden, wie Blast-Algorithmen. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Alignment mit einer gegebenen Sequenz auftritt, wird als Basis für die Identifikation ähnlicher Polypeptide verwendet. Ein Parameter, der üblicherweise dazu verwendet wird, diese Wahrscheinlichkeit darzustellen, wird als e-Wert bezeichnet. Der E-Wert ist ein Maß für die Zuverlässigkeit des S-Score. Der S-Score ist ein Maß für die Ähnlichkeit der Abfragesequenz mit der gezeigten Sequenz. Der e-Wert beschreibt, wie oft das zufallsgemäße Auftreten eines bestimmten S-Score erwartet wird. Die e-Wert-Ausschlussgrenze kann bis zu 1,0 betragen. Die übliche Grenze für einen guten e-Wert bei der Ausgabe einer BLAST-Suche, bei der ein SPL11-Polypeptid als Abfragesequenz verwendet wird, kann kleiner als e5 (= 10–5), 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75 1·e–100 1·e–200 1·e–300, 1·e–400 1·e–500, 1·e–600 1·e–700 und 1·e–800 sein. Erfindungsgemäße SPL11-Polypeptide umfassen vorzugsweise eine Sequenz mit einem e-Wert von, in steigender Reihenfolge der Präferenz, unter e–5 (= 10–5), 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75 1·e–100 1·e–200 1·e–300, 1·e–400 1·e–500, 1·e–600 1·e–700 und 1·e–800 bei einem Alignment mit einer SBP-Domäne, die man in einem bekannten SPL11-Polypeptid findet.
  • Beispiele für SPL11-Polypeptide, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, sind in Tabelle G1 angegeben. Die Aminosäurekoordinaten der SBP-Domäne in dem beispielhaften SPL11-Protein von Tabelle G1 sind in Tabelle G4 angegeben und die Domänensequenz wird durch SEQ ID NO: 456 bis SEQ ID NO: 468 dargestellt. Eine Konsensussequenz der SBP-Domänen, die in SPL11-Polypeptiden vorliegen, zeigt SEQ ID NO: 478.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße SPL11-Polypeptide sind solche, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität mit einem der in Tabelle G2 angegebenen Polypeptiden aufweisen.
  • SPL11-Polypeptide können gewöhnlich zusätzlich zu der SBP-Domäne eines oder mehrere der folgenden konservierten Motive an konservierten Positionen in der Sequenz relativ zu der SBP-Domäne umfassen: (i) Motif 1, das durch SEQ ID NO: 469 dargestellt wird, (ii) Motif 2 ist eine Serin-reiche Region, die man üblicherweise am N-Terminus der SBP-Domäne findet und kann durch SEQ ID NO: 470 dargestellt werden; (iii) Motif 3 gemäß SEQ ID: 471, das in der Regel von Nukleotiden kodiert wird, die in der SPL11-Polynukleotidregion enthalten sind, die von Mitgliedern der miR156-MicroRNA-Familie angesteuert wird; (iv) Motif 4 gemäß SEQ ID NO: 472. 27 zeigt die konservierten Motive und ihre relative Position in der SPL11-Polypeptidsequenz, die durch SEQ ID NO: 428 dargestellt wird.
  • Daher umfassen bevorzugte SPL11-Polypeptide, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, zusätzlich zu der SBP-Domäne ein oder mehrere der folgenden konservierten Motive:
    • (i) Motiv 1 gemäß SEQ ID NO: 469, wobei eine beliebige konservative Aminosäuresubstitution und/oder 1 oder 2 nicht-konservative Substitutionen erlaubt sind,
    • (ii) Motiv 2 gemäß SEQ ID NO: 470, wobei eine beliebige Aminosäuresubstitution erlaubt ist unter der Voraussetzung, dass mindestens 4 Aminosäuren eine polare Seitenkette haben, vorzugsweise Serin oder Threonin, und unter der Voraussetzung, dass sich das Motiv am N-Terminus der SBP-Domäne befindet;
    • (iii) Motiv 3 gemäß SEQ ID: 471, wobei 1 oder 2 Unterschiede erlaubt sind;
    • (iv) Motiv 4 gemäß SEQ ID: 472, wobei 1, 2 oder 3 Unterschiede erlaubt sind.
  • Beispiele für konservative Aminosäuresubstitutionen werden im Abschnitt Hintergrund genannt. Üblicherweise sind die in Polypeptiden enthaltenen Aminosäuren alpha-Aminosäuren mit einer Amino- und einer Carboxylgruppe, die an das gleiche Kohlenstoffatom gebunden sind, wobei die Aminosäuremoleküle oft eine Seitenkette umfassen, die an das alpha-Kohlenstoffatom gebunden ist. Tabelle 3 zeigt die Einteilung von Aminosäuren auf der Basis der physikalischen und biochemischen Eigenschaften der Seitenkette. Tabelle 3. Einteilung von Aminosäuren anhand der Seitenketteneigenschaften.
    Aminosäure 3-Buchstaben 1-Buchstaben Seitenkettenpolarität Seitenkettenazidität oder basizität Hydropathie-Index
    Arginin Arg R polar basisch –4,5
    Asparagin Asn N polar neutral –3,5
    Asparaginsäure Asp D polar sauer –3,5
    Cystein Cys C polar neutral 2,5
    Glutaminsäure Glu E polar sauer –3,5
    Glutamin Gin Q polar neutral –3,5
    Histidin His H polar basisch –3,2
    Lysin Lys K polar basisch –3,9
    Serin Ser S polar neutral –0,8
    Threonin Thr T polar neutral –0,7
    Tyrosin Tyr Y polar neutral –1,3
    Alanin Ala A unpolar neutral 1,8
    Glycin Gly G unpolar neutral –0,4
    Isoleucin Ile I unpolar neutral 4,5
    Leucin Leu L unpolar neutral 3,8
    Methionin Met M unpolar neutral 1,9
    Phenylalanin Phe F unpolar neutral 2,8
    Prolin Pro P unpolar neutral –1,6
    Tryptophan Trp W unpolar neutral –0,9
    Valin Val V unpolar neutral 4,2
  • Beispiele für SPL11-Polypeptide, die ein oder mehrere der konservierten Motive Motiv 1 bis Motiv 4 umfassen, werden in Beispiel 62 genannt. 28 zeigt die Position der konservierten Motive in diesen SPL11-Polypeptiden.
  • Wenn es zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 29 dargestellten, verwendet wird, bildet das erfindungsgemäße SPL11-Polypeptid vorzugsweise eher mit der S3-Gruppe, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 428 umfasst, (in 29 als AtSPL11 bezeichnet) als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Der Begriff ”Domäne” und ”Motiv” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-si/ico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der Übereinstimmungen (”Matches”) maximiert und die Anzahl der Lücken (”Gaps”) minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mob. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. Juli 2003, 10;4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann bekannt ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder ein konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden.
  • Weiterhin können SPL11-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) gewöhnlich DNA-Bindungsaktivität besitzen, insbesondere können sie DNA-Fragmente binden, welche die SBP-Domänen-DNA-Bindungsbox umfassen, wie in SEQ ID NO: 49 dargestellt. In der Regel findet man die SBP-Domänen-DNA-Bindungsbox in Genpromotoren pflanzlichen Ursprungs, wie im SQAMOSA-Gen. Fragmente, welche die SBP-Domänen-DNA-Bindungsbox umfassen, sind vorzugsweise mehr als 10, 15, 20, 25, 100, 200, 500, 1000, 2000 Basenpaare lang. Verfahren zur Ermittlung der DNA-Bindung von Proteinen, die eine SBP-Domäne enthalten, lassen sich auf SPL11-Polypeptide anwenden und sind im Stand der Technik bekannt (Klein at al. Mol Gen Genet. 1996, 15; 250 (1): 7–16; Yamasaki et al. 2004 J Mol Biol. 2004, 12; 337 (1): 49–63).
  • Bevorzugte erfindungsgemäße SPL11-Polypeptide sind solche mit DNA-Bindungsaktivität, stärker bevorzugt solche, die ein DNA-Fragment binden, das die SEQ ID NO: 475 umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 427, die die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 428 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder SPL11-kodierenden Nukleinsäure oder mit SPL11-Polypeptid, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle G1 von Beispiel 62 angegeben. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle G1 von Beispiel 62 angegebenen Aminosäuresequenzen sind beispielhafte Sequenzen von Orthologen und Paralogen des SPL11-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 428, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht identifiziert werden, indem man eine so genannte reziproke Blast-Suche durchführt. Dies beinhaltet üblicherweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 aufgelisteten Sequenzen). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 427 oder SEQ ID NO: 428, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz und vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu führt, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Zu solchen Varianten zählen beispielsweise Nukleinsäuren, die Homologe und Derivate von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Aminosäuresequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen, auf.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden.
  • Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier beschrieben.
  • Eine bevorzugte Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, das mikroRNA-unempfindlich ist, weiterhin bevorzugt ist die Nukleinsäure unempfindlich gegenüber mikroRNAs, die zur miR156-Familie gehören. MikroRNAs steuern Nukleinsäuren (insbesondere RNA) an, um sie zu zerstören, wodurch es in der Regel zu einer Verringerung oder Hemmung der Akkumulation der angesteuerten RNA kommt. Für die Ansteuerung ist eine Hybridisierung zwischen der mikroRNA und der angesteuerten Nukleinsäure (RNA) in einer ganz spezifischen Region erforderlich, die man als miR-(mikroRNA-)Zielstelle bezeichnet und die eine Sequenz umfasst, die zu einem Abschnitt des reifen mikroRNA-Gens komplementär ist. Üblicherweise umfassen die mikroRNA-unempfindlichen Nukleinsäuren eine Sequenz, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Fehlpaarungen bei einem Alignment mit dem entsprechenden mikroRNA-Molekül in der miR-Zielstelle aufweist. MikroRNA-unempfindliche Nukleinsäuren können in einer Zelle bis auf akkumulieren Niveaus, die, in steigender Reihenfolge der Präferenz, das 5-, 10-, 20-, 30-, 40-, 50-Fache oder mehr der Nukleinsäure sind, die von der entsprechenden mikroRNA angesteuert wird, die im Allgemeinen 100% Sequenzkomplementarität in der miR-Zielstelle aufweist.
  • Die miR156-Familie wurde bereits beschrieben und eine Auflistung der mikroRNAs einschließlich der Mitglieder der miR156-Familie ist unter miRBase-Datenbank (Griffiths-Jones et al. 2006 Nucleic Acids Research, 2006, Bd. 34, Database issue D140–D144) zu finden. Die miRBase-Datenbank wird am The Wellcome Trust Sanger Institute in Cambridge, GB, gepflegt. Die miR156-Zielstelle in einer SPL11-Nukleinsäure ist komplementär zu der reifen Sequenz von miR156-mikroRNAs. Ein Beispiel für reife Sequenzen der Mitglieder der miR156-Familie aus Reis und ihre entsprechenden Zielstellen auf Reis-SPL-Nukleinsäuren sind in 30A angegeben. 31B zeigt ein Alignment beispielhafter SPL11-Nukleinsäuren (in der DNA-Form), in dem die Zielstelle für miR156 in den entsprechenden Ribonukleinsäuren angegeben ist. Ein Beispiel für eine miR156-unempfindliche SPL11-Nukleinsäure, welche die SEQ ID NO: 428 kodiert, wird durch SEQ ID NO: 431 wiedergegeben. Weitere Beispiele für miR156-unempfindliche SPL11-Nukleinsäuren werden durch SEQ ID NO: 440 und SEQ ID NO: 454 wiedergegeben, wobei in der Letzteren die miR156-Zielstelle fehlt.
  • Eine SPL11-Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, hat vorzugsweise 1, 2, 3, 4 oder mehr Fehlpaarungen in der miR156-Zielstelle oder ihr fehlt die Zielstelle des miR156-Gens. Beispiele für solche SPL11-Nukleinsäuren sind in 31B angegeben. Weiterhin bevorzugt ist eine Nukleinsäure, wie sie durch SEQ ID NO: 431, SEQ ID 440 und SEQ ID NO: 454 dargestellt wird.
  • Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze einen Abschnitt einer beliebigen der in Tabelle G1 von Beispiel 62 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und darin exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein SPL11-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle G1 von Beispiel 62 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 70, 100, 200, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt mindestens eine SBP-Domäne. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 427. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 29 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der SPL11-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 428 dargestellte Aminosäuresequenz (AtSPL 11) umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, wie hier definiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und darin exprimiert, oder bei dem man in eine Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und darin exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein SPL11-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren kann. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 427 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 29 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der SPL11-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 428 dargestellte Aminosäuresequenz (AtSPL 11) umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein SPL11-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert. Beispiele für gespleißte Varianten des Gens, das SEQ ID NO: 428 kodiert, werden durch SEQ ID NO: 427; SEQ ID NO: 429 and SEQ ID NO: 430 dargestellt.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 427 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 428 kodiert. Vorzugsweise bildet die von der Spleißvariante kodierte Aminosäuresequenz, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 29 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der SPL11-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 428 dargestellte Aminosäuresequenz (AtSPL 11) umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das SPL11-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 428 und eine der in Tabelle G1 von Beispiel 62 dargestellten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante gemäß SEQ ID NO: 427 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 428 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 29 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der SPL11-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 428 dargestellte Aminosäuresequenz (AtSPL 11) umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Man kann auch ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution dazu verwenden, Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, die SPL11-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle G1 von Beispiel 62 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 29 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der SPL11-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 428 dargestellte Aminosäuresequenz (AtSPL 11) umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die das SPL11-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verstärkten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” werden hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit höherem Ertrag im Vergleich zu kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung unter Anderem als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Erhöhung der Anzahl Pflanzen, die sich pro Hektar oder Acre entwickeln, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, Ährenlänge/durchmessers, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragssteigerung unter Anderem als Erhöhung von einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausdrücken: Anzahl Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten (Blütchen) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Steigerung des Ertrags, insbesondere Samenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid wie hier definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen zeigen diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) wahrscheinlich eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem reifen trockenen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze reife trockene Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies ein weiteres Aussäen von Samen der gleichen Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Entsprechend kann dies bei ausreichender Steigerung der Wachstumsrate ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend z. B. Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann man auch zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kulturpflanze häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parametern von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter unter Anderem folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid wie hier definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet unabhängig davon statt, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress durch langsameres Wachstum. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichter Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotischer Stress wird gewöhnlich durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten verursacht.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress stehen bekanntlich miteinander in Verbindung und können über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Trockenheit und/oder Versalzung äußern sich beispielsweise in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig Hoch- oder Niedertemperatur-, Salinitäts- oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteinen führen. Demzufolge aktivieren diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Aufwärtsregulation von Antioxidantien, die Anreicherung kompatibler gelöster Stoffe und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen ermöglichen. Der Fachmann ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nicht-Stress-Bedingungen gezüchtet wurden) ergeben gewöhnlich in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze bei einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Basis der Ernte und/oder der Jahreszeit berechnet werden. Dem Fachmann sind Produktionen einer Kulturpflanze mit durchschnittlichem Ertrag geläufig.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhten Ertrag aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen gezüchtet wurden, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, mit besserem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen gezüchteten Kontrollpflanzen. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Steigerung des Ertrags bei Pflanzen bereitgestellt, die unter Nährstoffmangelbedingungen gezüchtet wurden, bei dem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze steigert. Nährstoffmangel kann sich unter Anderem aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, ergeben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein SPL11-Polypeptid wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in handelsübliche Vektoren eingeführt werden, die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, umfassend:
    • (d) eine Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
    • (e) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) steuern kann bzw. können; sowie gegebenenfalls
    • (f) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die eine SPL11-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Die Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren, bestens vertraut. Die interessierende Sequenz ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promotor) verbunden.
  • Jede Art von Promotor, sowohl natürlich als auch synthetisch, kann vorteilhaft für das Steuern der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promotor ist besonders bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Für die Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe Abschnitt ”Definitionen” im vorliegenden Text.
  • Man muss sich darüber im Klaren sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die SPL11-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 427 veranschaulicht wird, noch auf die Expression einer SPL11-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure, die von einem konstitutiven Promotor gesteuert wird, beschränkt ist.
  • Der samenspezifische Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt ist der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz veranschaulicht, die im wesentlichen SEQ ID NO: 476 ähnelt, am stärksten bevorzugt ist der samenspezifische Promotor durch SEQ ID NO: 476 veranschaulicht. Im Abschnitt ”Defintionen” sind weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren beschrieben.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird ein samenspezifischer Promotor verwendet. Der samenspezifische Promotor ist vorzugsweise durch ABA (Abszisinsäure) induzierbar, er ist vorzugsweise der WSI18-Promotor, vorzugsweise WSI18 aus Reis. Weiter bevorzugt ist der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz dargestellt, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 477 ähnelt. Siehe im Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren.
  • Es sollte eindeutig sein, dass die Promotoren, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, nicht auf diejenigen eingeschränkt sind, die in den vorstehenden Ausführungsformen angegeben sind.
  • Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem in eine Pflanze eingebrachten Konstrukt verwendet werden. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- und Translations-Enhancer umfassen. Der Fachmann kennt Terminator- und Enhancer-Sequenzen, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen. Eine Intronsequenz kann ebenfalls zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, damit die Menge der reifen Botschaft gesteigert wird, die sich im Cytosol anreichert, wie es im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Andere Kontrollsequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können leicht von ihm erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die zur Aufrechterhaltung und/oder Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Bei einem Beispiel muss ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Bevorzugte Replikationsursprünge umfassen f1-ori und colE1, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, werden vorteilhafterweise Markergene (oder Reportergene) verwendet. Das Genkonstrukt kann daher gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier eingehender im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Es ist bekannt, dass je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik bei der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und falls gewünscht in ihr Genom integriert. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen Selektionsmarker) kodiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten, in denen diese Gene nicht funktionell sind, verwendet werden, und zwar zum Beispiel durch Deletion nach herkömmlichen Verfahren. Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf demselben Vektor eingeführt werden, der die Sequenz, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die Polypeptide, die bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, umfasst, oder auch auf einen separaten Vektor. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, während die anderen Zellen absterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder gespalten werden, sobald sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Entfernung des Markengens sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind oben im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen gegenüber Kontrollpflanzen bereit, wobei eine beliebige Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid wie oben definiert, in eine(r) Pflanze eingeführt und exprimiert wird.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise gesteigertem (Samen)ertrag bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (iii) Einführen und Exprimieren einer SPL11-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle unter der Kontrolle eines konstitutiven Pflanzenpromotors; und
    • (iv) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige Nukleinsäure sein, die ein SPL11-Polypeptid wie hier definiert kodieren kann.
  • Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern selektiert, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. Sie können beispielsweise Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen sein; klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf eine jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der hier beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf sämtliche Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure, die ein wie oben definiertes SPL11-Polypeptid kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zu der Superfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturpflanzen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen gehören zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen gehört zum Beispiel Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden gehören zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung betrifft auch erntefähige Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, jedoch nicht ausschließlich, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntefähigen Teil einer solchen Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut beschrieben; und Beispiele sind im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die SPL11-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser SPL11-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die die SPL11-Polypeptide kodieren, oder die SPL11-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem für ein SPL11-Polpeptid kodierenden Gen genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die SPL11-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier unter den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein SPL11-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die ohne Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • SPL11-Polypeptide kodierende Nukleinsäuren können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung der SPL11-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuren benötigt nur eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die SPL11-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuren können als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktions-gespaltener genomischer Pflanzen-DNA kann mit den SPL11-kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Computerprogrammen unterworfen werden, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), so dass man eine genetische Karte erhält. Die Nukleinsäuren können zudem zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die die Eltern und die Nachfahren einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der SPL11-Polypeptidkodierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte verwendet, die mit dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methoden sind dem Fachmann bestens bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Literaturstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung durch direkte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf der Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann mit Hilfe der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und zu erzeugen, die bei der Amplifikationsreaktion oder Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Punkte beschrieben:
    • 1. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, moduliert wird, wobei das LBD-Polypeptid eine DUF206-Domäne umfasst.
    • 2. Verfahren nach Punkt 1, wobei das LBD-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 1: MSCNGCRXLRKGCX (SEQ ID NO: 5), (ii) Motiv 2: QXXATXFXAKFXGR (SEQ ID NO: 6), (iii) Motiv 3: FXSLLXEAXG (SEQ ID NO: 7)
    • 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
    • 4. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
    • 5. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle A1 angegebenen Proteine kodiert.
    • 6. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerte Biomasse und/oder gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfasst.
    • 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
    • 9. Verfahren nach einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis, verknüpft ist.
    • 10. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, stammt.
    • 11. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eines der folgenden Merkmale: (i) eine Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 69; (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, das zu einer der in (i) angegebenen SEQ ID NOs komplementär ist; (iii) eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 70 aufweist; (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer der in (i), (ii) oder (iii) oben abgegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
    • 12. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (i) eine Aminosäuresequenz, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 70 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist. (ii) Derivate von einer der in (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
    • 13. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein LBD-Polypeptid kodiert.
    • 14. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid nach den Punkten 1, 2 oder 12 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • 15. Konstrukt nach Punkt 14, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • 16. Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 14 oder 15 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 17. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Punkt 14 oder 15 transformiert ist.
    • 18. Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid nach Punkt 1, 2 oder 12 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • 19. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer gesteigerten Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid nach Punkt 1, 2 oder 12 kodiert, ergibt, oder eine Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • 20. Transgene Pflanze nach Punkt 13, 17 oder 19, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
    • 21. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Punkt 19, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • 22. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 19 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 20 stammen.
    • 23. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags, vorzugsweise Steigerung des Samenertrags und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 24. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, moduliert wird, wobei das JMJC-Polypeptid eine JmjC-Domäne umfasst.
    • 25. Verfahren nach Punkt 24, wobei die JmjC-Domäne durch eine Sequenz veranschaulicht wird, die in steigender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, oder mehr Sequenzidentität aufweist zu: (i) SEQ ID NO: 78; und/oder (ii) einer der JmjC-Domänen, die sich in den JMJC-Polypeptiden befinden, die durch SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 110; SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 114; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 132; und SEQ ID NO: 134 veranschaulicht werden, deren Aminosäurekoordinaten in der Tabelle B4 angegeben sind.
    • 26. Verfahren nach Punkt 24 und Punkt 25, wobei das JMJC-Polypeptid ein Motiv umfasst, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität aufweist zu einer Sequenz von: (i) SEQ ID NO: 79, (ii) SEQ ID NO: 80, (iii) SEQ ID NO: 81, (iv) SEQ ID NO: 82;
    • 27. Verfahren nach Punkt 24 oder 26, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
    • 28. Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 27, wobei es sich bei der modulierten Expression um eine erhöhte Expression handelt.
    • 29. Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 28, wobei die Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle B1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
    • 30. Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 29, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle B1 angegebenen Proteine kodiert.
    • 31. Verfahren nach Punkt 30, wobei die Nukleinsäure SEQ ID NO: 74 kodiert.
    • 32. Verfahren nach einem der Punkte 24 to 31, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerten Harvest-Index und/oder Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 33. Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 32, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale Jungpflanzenvitalität im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 34. Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 33, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • 35. Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 33, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Wachstumsbedingungen eines leichten Trockenheitsstress erhalten werden.
    • 36. Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 33, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangel-Wachstumsbedingungen erhalten werden.
    • 37. Verfahren nach einem der Punkte 27 bis 36, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis verknüpft ist.
    • 38. Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 37, wobei die Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
    • 39. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 38 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die JMJC-Polypeptid kodiert.
    • 40. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid nach den Punkten 24 bis 26 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäure von (i) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • 41. Konstrukt nach Punkt 40, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • 42. Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 40 oder 41 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 43. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Punkt 40 oder 41 transformiert ist.
    • 44. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid nach Punkt 24 bis 26 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • 45. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität beim Keimling und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus der gesteigerten Expression einer Nukleinsäure ergibt, die ein JMJC-Polypeptid nach Punkt 24 bis 26 kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • 46. Transgene Pflanze nach Punkt 39, 43 oder 45, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
    • 47. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Punkt 46, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • 48. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 46 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 47 stammen.
    • 49. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags, insbesondere bei der Steigerung des Samenertrags und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 50. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eines der folgenden Merkmale: (i) eine Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 169; (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fagment davon, das zu SEQ ID NO: 169 komplementär ist; (iii) eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 170 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an eine der in (i), (ii) oder (iii) oben angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
    • 51. Isoliertes Polypeptidmolekül, umfassend: (i) eine Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 170 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; (ii) Derivate von einer der in (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
    • 52. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei der man die Expression einer Nukleinsäure, die eine Caseinkinase I (CKI) kodiert, in einer Pflanze moduliert, wobei die CKI aus SEQ ID NO: 174 oder einem Orthologon oder Paralogon davon ausgewählt ist.
    • 53. Verfahren nach Punkt 52, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die das CKI-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
    • 54. Verfahren nach Punkt 52 oder 53, wobei die Nukleinsäure, die das CKI-Polypeptid kodiert, ein Abschnitt von SEQ ID NO: 173, oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
    • 55. Verfahren nach einem der Punkte 52 bis 54, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 174 kodiert.
    • 56. Verfahren nach einem der Punkte 52 bis 55, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale eine gesteigerte Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerte Biomasse und/oder gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 57. Verfahren nach einem der Punkte 52 bis 56, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • 58. Verfahren nach einem der Punkte 52 to 56, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter abiotischen Stressbedingungen erhalten werden.
    • 59. Verfahren nach Punkt 58, wobei die abiotischen Stressbedingungen ausgewählt sind aus einer oder mehreren Bedingungen von Trockenheitsstress, Salzstressbedingungen, und Stickstoffmangelbedingungen.
    • 60. Verfahren nach einem der Punkte 53 bis 59, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor verknüpft ist.
    • 61. Verfahren nach einem der Punkte 53 bis 60, wobei der samenspezifische Promotor ein WSI18-Promotor, vorzugsweise ein WSI18-Promotor aus Reis, ist.
    • 62. Verfahren nach einem der Punkte 52 bis 61, wobei die Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze stammt.
    • 63. Verfahren nach einem der Punkte 52 bis 62, wobei die Ursprungspflanze vorzugsweise eine dikotyle Pflanze ist, weiter bevorzugt aus der Familie der Solanaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Nicotiana tabacum.
    • 64. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der Punkte 52 bis 63 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein CKI-Polypeptid kodiert.
    • 65. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid nach Punkt 52 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • 66. Konstrukt nach Punkt 65, wobei eine der Kontrollsequenzen ein samenspezifischer Promotor, vorzugsweise ein WSI18-Promotor, ist.
    • 67. Konstrukt nach Punkt 65, wobei einer der samenspezifischen Promotoren ein WSI18-Promotor, am stärksten bevorzugt ein WSI18-Promotor aus Reis, ist.
    • 68. Verwendung eines Konstrukts nach einem der Punkte 65 bis 67 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität, gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 69. Pflanze, Pflanzenteil, oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach einem der Punkte 65 bis 67 transformiert sind.
    • 70. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem gesteigerten Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid nach Punkt 52 kodiert, in eine(r) Pflanze; and (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • 71. Transgene Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer gesteigerten Expression einer Nukleinsäure ergibt, die ein CKI-Polypeptid nach Punkt 52 kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • 72. Transgene Pflanze nach Punkt 64, 69 oder 71, oder eine davon stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
    • 73. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Punkt 72, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • 74. Produkte, die von einer Pflanze nach Punkt 72, und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 73 stammen.
    • 75. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, insbesondere zur Steigerung von einem oder mehreren Merkmalen von Jungpflanzenvitalität, Samenertrag und Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 76. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Pflanzen-Homöodomänen-Finger-Homöodomänen-(plant homeodomain fnger-homeodomain (PHDf-HD))-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert, vorzugsweise gesteigert wird, wobei das PHDf-HD-Polypeptid umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Leucin-Zipper/Pflanzen-Homöodomänen-Finger(ZIP/PHDf)-Domäne, wie sie durch SEQ ID NO: 233 veranschaulicht wird; und (ii) eine Domäne mit mindestens 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Homöodomäne (HD) wie sie durch SEQ ID NO: 234 veranschaulicht wird, und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen.
    • 77. Verfahren nach Punkt 76, wobei das PHDf-HD-Polypeptid umfasst: (i) eine PHD-Polypeptid-Domäne wie sie durch PFAM00628 veranschaulicht ist; und (ii) eine HD wie sie durch PFAM00046 veranschaulicht wird.
    • 78. Verfahren nach Punkt 76 oder 77, wobei das PHDf-HD-Polypeptid bei der Verwendung zur Konstruktion eines HD-Stammbaums, wie in 13 gezeigt, eher mit der PHDf-HD Gruppe von Polypeptiden, umfassend die Polypeptidsequenz wie sie in SEQ ID NO: 180 veranschaulicht ist, Cluster bildet, als mit einer anderen HD-Gruppe.
    • 79. Verfahren nach einem der Punkte 76 bis 78, wobei das PHDf-HD-Polypeptid in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu dem PHDf-HD-Polypeptid wie es durch SEQ ID NO: 180 veranschaulicht ist oder zu einer der in Tabelle D1 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen aufweist.
    • 80. Verfahren nach einem der Punkte 76 bis 79, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, durch eine der in Tabelle D1 angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NOs oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die mit eine der in Tabelle D1 angegebenen Nukleinsäuresequenz SEQ ID NOs hybridisieren kann veranschaulicht ist.
    • 81. Verfahren nach einem der Punkte 76 bis 80, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle D1 angegebenen SEQ ID NOs kodiert.
    • 82. Verfahren nach einem der Punkte 76 bis 81, wobei die modulierte, vorzugsweise gesteigerte, Expression durch eine oder mehrere von T-DNA activation tagging, TILLING, oder homologer Rekombination herbeigeführt wird.
    • 83. Verfahren nach einem der Punkte 76 bis 82, wobei die gesteigerte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
    • 84. Verfahren nach einem der Punkte 76 bis 83, wobei die Ertragsmerkmale Samenertragsmerkmale sind, umfassend eines oder mehrere der folgenden Merkmale: (i) erhöhte Anzahl Primärrispen; (ii) gesteigertes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) gesteigerte Anzahl (gefüllter) Samen; (iv) gesteigertes TKG; oder (v) gesteigerter Harvest-Index.
    • 85. Verfahren nach einem der Punkte 76 bis 84, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem konstitutiven Pflanzenpromotor, stärker bevorzugt einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis verknüpft ist.
    • 86. Verfahren nach einem der Punkte 76 bis 85, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poacae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, stammt.
    • 87. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, die durch ein Verfahren nach einem der Punkte 76 bis 86 erhältlich sind, wobei die Pflanze, ein Teil oder eine Zelle davon ein isoliertes Nukleinsäure-Transgen umfasst, das ein PHDf-HD Polypeptid kodiert, und das funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verknüpft ist.
    • 88. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD Polypeptid nach einem der Punkte 76 bis 81 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz. wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Pflanzenpromotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, ist.
    • 89. Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 87 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmale ein oder mehrere der folgenden Merkmale sind: (i) erhöhte Anzahl Primärrispen; (ii) gesteigertes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) gesteigerte Anzahl (gefüllter) Samen; (iv) gesteigertes TKG; oder (v) gesteigerter Harvest-Index.
    • 90. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Punkt 87 oder 88 transformiert ist.
    • 91. Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD Polypeptid nach einem der Punkte 76 bis 81 kodiert, in eine(r) Pflanze, eine(m) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzezelle unter der Kontrolle eines konstitutiven Pflanzenpromotors; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • 92. Transgene Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer modulierten, vorzugsweise gesteigerten Expression einer Nukleinsäuresequenz ergibt, die ein PHDf-HD Polypeptid nach einem der Punkte 76 bis 81 kodiert, die funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verknüpft ist, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • 93. Transgene Pflanze nach Punkt 87, 90 oder 92, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • 94. Erntefähige Teile, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, einer Pflanze nach Punkt 93, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
    • 95. Produkte, die von einer Pflanze nach Punkt 93 und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 94 stammen.
    • 96. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid nach einem der Punkte 76 bis 81 kodieren, bei der Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, vorzugsweise Samenertragsmerkmalen, umfassend eines oder mehrere der folgenden Merkmale: (i) gesteigerte Anzahl Primärrispen; (ii) gesteigertes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) gesteigerte Anzahl (gefüllter) Samen; (iv) gesteigertes TKG; oder (v) gesteigerter Harvest-Index.
    • 97. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eines der folgenden Merkmale: (i) eine Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 242; (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, das zu SEQ ID NO: 242 komplementär ist; (iii) eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindesten 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 243 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer der in (i), (ii) oder (iii) oben angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
    • 98. Isoliertes Polypeptid-Molekül, umfassend: (i) eine Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 243 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; (ii) Derivate von einer der in (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
    • 99. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei das bHLH-11-ähnliche Polypeptid eine Helix-Loop-Helix Domäne umfasst.
    • 100. Verfahren nach Punkt 99, wobei das bHLH11-ähnliche Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 1 (SEQ ID NO: 246); (ii) Motiv 2 (SEQ ID NO: 247); (iii) Motiv 3 (SEQ ID NO: 248); (iv) Motiv 4 (SEQ ID NO: 249); (v) Motiv 5 (SEQ ID NO: 250); (vi) Motiv 6 (SEQ ID NO: 251); (vii) Motiv 7 (SEQ ID NO: 252).
    • 101. Verfahren nach Punkt 99 oder 100, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
    • 102. Verfahren nach einem der Punkte 99 bis 101, wobei die Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle E1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure, oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
    • 103. Verfahren nach einem der Punkte 99 bis 102, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle E1 angegebenen Proteine kodiert.
    • 104. Verfahren nach einem der Punkte 99 bis 103, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 105. Verfahren nach einem der Punkte 99 bis 104, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • 106. Verfahren nach einem der Punkte 101 bis 105, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
    • 107. Verfahren nach einem der Punkte 99 bis 106, wobei die Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise eine monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Triticum, am stärksten bevorzugt aus Triticum aestivum stammt.
    • 108. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Punkte 99 bis 107, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert.
    • 109. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid nach den Punkten 99 oder 100 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • 110. Konstrukt nach Punkt 109, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • 111. Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 109 oder 110 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 112. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Punkt 109 oder 110 transformiert sind.
    • 113. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid nach Punkt 99 oder 100 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • 114. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid nach Punkt 99 oder 100 kodiert, ergibt, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • 115. Transgene Pflanze nach Punkt 108, 112 oder 114, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse and Hafer ist.
    • 116. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Punkt 115, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
    • 117. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 115 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 116 stammen.
    • 118. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags, insbesondere bei der Steigerung des Samenertrags in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 119. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein ASR kodiert, wobei das ASR durch SEQ ID NO: 397 oder einem Orthologon oder Paralogon veranschaulicht wird, in einer Pflanze.
    • 120. Verfahren nach Punkt 119, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die das ASR-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
    • 121. Verfahren nach Punkt 119 oder 120, wobei die Nukleinsäure, die das ASR-Polypeptid kodiert, ein Abschnitt von SEQ ID NO: 396 ist, oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
    • 122. Verfahren nach einem der Punkte 119 bis 121, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 397 oder ein Orthologon oder Paralogon davon kodiert.
    • 123. Verfahren nach einem der Punkte 119 bis 122, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 124. Verfahren nach einem der Punkte 119 bis 123, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • 125. Verfahren nach einem der Punkte 120 bis 124, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
    • 126. Verfahren nach einem der Punkte 119 bis 125, wobei die Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa stammt.
    • 127. Pflanzen oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Punkte 119 bis 126, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein ASR-Polypeptid kodiert.
    • 128. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid nach Punkt 119 kodiert, oder eine von SEQ ID NO: 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415 und 417; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) ein Transkriptionsterminationssequenz.
    • 129. Konstrukt nach Punkt 128, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • 130. Verwendung eines Konstrukts nach einem der Punkte 128 oder 129 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 131. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach einem der Punkte 128 oder 129 transformiert sind.
    • 132. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid nach Punkt 119 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • 133. Transgene Pflanze mit verbesserten Samenertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer gesteigerten Expression einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid nach Punkt 119 kodiert, ergibt, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • 134. Transgene Pflanze nach Punkt 127, 131 oder 133, oder eine davon abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
    • 135. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Punkt 134, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
    • 136. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 134 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 135 stammen.
    • 137. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, bei der Verbesserung der Ertragsmerkmale, insbesondere bei der Steigerung des Samenertrags bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 138. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eines der folgenden Merkmale: (i) eine Nukleinsäure nach einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415 und 417; (ii) das Komplement einer Nukleinsäure, dargestellt durch eine der Sequenzen von SEQ ID NO: 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415 und 417; (iii) eine Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine der Sequenzen von SEQ ID NO: 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 und 418 veranschaulicht wird.
    • 139. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (i) eine Aminosäuresequenz, nach einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 und 418; (ii) eine Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine der Sequenzen von SEQ ID NO: 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 und 418 veranschaulicht wird. (iii) Derivate von einer der in (i) oder (ii) oben angegebenen Aminosäuresequenzen.
    • 140. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das SPL11-Polypeptid eine SBP-Domäne umfasst, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 456 to SEQ ID NO: 468 und SEQ ID NO: 478 aufweist.
    • 141. Verfahren nach Punkt 140, wobei das SPL11-Polypeptid neben der SBP-Domäne eine oder mehrere der folgenden konservierten Motive umfasst: (i) Motiv 1 nach SEQ ID NO: 469, wobei jede konservative Aminosäuresubstitution und/oder 1 oder 2 nichtkonservative Substitutionen erlaubt sind; (ii) Motiv 2 nach SEQ ID NO: 470, wobei jede Änderung erlaubt ist, vorausgesetzt dass mindestens 4 Aminosäuren eine polare Seitenkette, vorzugsweise Serin oder Threonin, aufweisen, und vorausgesetzt dass sich die Domäne am N-terminalen Ende der SBP-Domäne befindet; (iii) Motiv 3 nach SEQ ID: 471 wobei 1 oder 2 Mismatches erlaubt sind; (iv) Motiv 4 nach SEQ ID: 472 wobei 1, 2 oder 3 Mismatches erlaubt sind.
    • 142. Verfahren nach Punkt 140 oder 141, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid nach Punkt 140 oder 141 kodiert, in einer Pflanze herbeigeführt wird.
    • 143. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 142, wobei die modulierte Expression eine gesteigerte Expression ist.
    • 144. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 143, wobei die Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle G1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure, oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
    • 145. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 144, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle G1 angegebenen Proteine kodiert.
    • 146. Verfahren nach Punkt 145, wobei die Nukleinsäure SEQ ID NO: 428 kodiert.
    • 147. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 146, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigertes Gesamtsamengewicht, Anzahl der gefüllten Samen, Anzahl der Samen oder Blütchen pro Rispe, Tausendkorngewicht, Samenfüllungsrate und/oder Harvest-Index im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 148. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 147, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale die Jungpflanzenvitalität der Pflanze (des Keimlings) im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 149. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 147, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • 150. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 147, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Wachstumsbedingungen eines leichten Trockenheits-Stresses erhalten werden.
    • 151. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 147, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
    • 152. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 151, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
    • 153. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 151, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor, vorzugsweise einem WSI18-Promotor, am stärksten bevorzugt einem WSI18-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
    • 154. Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 153, wobei die Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
    • 155. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Punkte 140 bis 154, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein SPL11-Polypeptid kodiert.
    • 156. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend: (i) eine Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 448; (ii) das Komplement einer Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 448; (iii) eine Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 449 aufweist, und die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 465: SYCQVEGCRTDLSSAKDYHRKHRVCEPHSKAPKVWAGLERRFCQQCSRFHG LAEFDQKKKSCRRRLNDHNARRRKPQPEAL aufweist; (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit SEQ ID NO: 448 hybridisiert.
    • 157. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (i) eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 449; (ii) eine Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 449 aufweist, und die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 465: SYCQVEGCRTDLSSAKDYHRKHRVCEPHSKAPKVVVAGLERRFCQQCSRFHG LAEFDQKKKSCRRRLNDHNARRRKPQPEAL aufweist. (iii) Derivate von einer der in (i) oder (ii) oben angegebenen Aminosäuresequenzen.
    • 158. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz
    • 159. Konstrukt nach Punkt 158, wobei die Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, eine Nukleinsäure nach Punkt 156 ist.
    • 160. Konstrukt nach Punkt 158 oder 159, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • 161. Konstrukt nach Punkt 158 oder 159, wobei eine der Kontrollsequenzen ein samenspezifischer Promotor, vorzugsweise ein WSI18-Promotor, am stärksten bevorzugt ein WSI18-Promotor aus Reis, ist.
    • 162. Verwendung eines Konstrukts nach den Punkten 158 bis 161 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und/oder einer Pflanze mit Jungpflanzenvitalität beim Keimling.
    • 163. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach den Punkten 158 bis 161 transformiert sind.
    • 164. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Samenertrag und/oder Jungpflanzenvitalität bei der Pflanze oder dem Keimling im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • 165. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität beim Keimling und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer gesteigerten Expression einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, ergibt, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • 166. Transgene Pflanze nach Punkt 155, 163 oder 165, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine dikotyle Kulturpflanze, wie Sojabohne, Baumwolle oder Canola-Raps, oder eine monokotyle Kulturpflanze oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist.
    • 167. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Punkt 166, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse, Blüten und/oder Samen sind.
    • 168. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 166 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 167 stammen.
    • 169. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags, insbesondere Samenertrags, und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Beschreibung der Figuren
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren veranschaulicht. Es zeigt:
  • I. LOB-Domäne umfassendes Protein (LOB: Lateral Organ Boundaries, Laterale Organgrenzen)
  • 1 die Sequenz von SEQ ID NO: 2, wobei die DUF260 Domäne fett gezeigt ist, die konservierten Motive 1, 2 and 3 unterstrichen sind und die konservierten Cys-Reste (Motiv von SEQ ID NO: 9) kursiv gezeigt ist.
  • 2 ein multiples Alignment von Sequenzen verschiedener LBD-Proteine, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 3 einen Stammbaum der LBD-Proteine der Klasse II und Klasse I. Die Sequenz von SEQ ID NO: 2 ist durch AtLBD37 veranschaulicht.
  • 4 den binären Vektor für die gesteigerte Expression in Oryza sativa einer LBD-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines GOS2-Promotors (pGOS2) aus Reis.
  • 5 genaue Beispiele für LBD-Sequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • II. JMJC(JUMONJI-C)-Polypeptid
  • 6 die Aminosäuresequenz und die Domänenstruktur von SEQ ID NO: 74. Es sind konservierte Motive und Domänen gezeigt. Die JmjC-Domäne ist fett gezeigt. Die konservierten Motive SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 und SEQ ID NO: 81 sind durch einfach, doppelt bzw. dreifach gestrichelte Rechtecke gezeigt. Unterstrichen sind die Aminosäurereste T (Theonin) und K (Lysin), die gewöhnlich an der 2-Oxogutarat-Koordinierung beteiligt sind. Ein groß geschriebenes H zeigt den Aminosäurerest Histidin an, der das Eisenion koordiniert.
  • 7 ein multiples Alignment von JMJC-Proteinen. Der Ursprung des Proteins ist durch die beiden ersten alphanumerischen Zeichen im Namen angegeben, At: Arabidopsis thaliana, Pp: Populus trichocarpa, Os: Oryza sativa, Ot: streococcus tauri, Ce: Caenorhabditis elegans, Hs: Homo sapiens. Die Position der konservierten Aminosäurereste und der Domänen, die denen der 6 entsprechen, ist angegeben. Es ist eine Konsensussequenz angegeben.
  • Hochkonservierte Aminosäuren in den Konsensussequenzen sind angegeben; Leerstellen stehen für eine beliebige Aminosäure.
  • 8 einen Stammbaum der JMJC-Polypeptide. Der Pfeil zeigt SEQ ID NO: 74. Andere JMJC-Polypeptide sind nach der Genbank-Zugangsnummer bezeichnet. Gruppe I (G I) umfasst Proteine pflanzlichen Ursprungs; Gruppe II (GII) umfasst Proteine nicht-pflanzlichen Ursprungs.
  • 9 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa von SEQ ID NO: 73 unter der Kontrolle eines GOS2-Promotors (pGOS2) aus Reis.
  • 10 genaue Beispiele für JMJC-Sequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • III. Casein Kinase I
  • 11 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer GRP-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines WSI18-Promotors (pWSI18::GRP) aus Reis.
  • 12 genaue Beispiele für GRP-Sequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • IV. Pflanzen-Homöodomänen-Finger-Homöodomänen(Plant homeodomain finger-homeodomain (PHDf-HD))-Polypeptid
  • 13 ein Dendrogramm, konstruiert nach einem Alignment sämtlicher Transkriptionsfaktoren, die zu der HD-Familie gehören (heruntergeladen von der riceTFDB Datenbank, die auf dem Server der Universität Potsdam gehostet wird) und sämtlicher Polypeptid-Sequenzen von Tabelle D1 (wenn es sich um Volllänge handelt), durchgeführt mit dem Clustal-Algorithmus (1.83) des progressiven Alignments, unter Verwendung von Default Werten. Die interessierende Gruppe, die zwei Reis-Paraloga umfasst (SEQ ID NO: 180 oder Os02g05450.1, und SEQ ID NO: 202 oder Os06g12400.1) wurde eingekreist. Jedes Polypeptid, das in dieser HD-Gruppe liegt (nach einem neuen multiplen Alignment-Schritt wie vorstehend beschrieben) wird zur Durchführung der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren als geeignet angesehen.
  • 14 einen Cartoon eines PHDf-HD Polypeptids nach SEQ ID NO: 180, das eines oder mehrere der folgenden Merkmale umfasst: ein vorhergesagtes Kernlokalisierungssignal (NLS), einen Leucin-Zipper (ZIP), einen PHD-Finger (PHDf, Pfam00628), einen sauren Abschnitt, zwei basische Abschnitte, eine Homöodomäne (HD, Pfam00046).
  • 15 das Sequenzlogo für die Homöodomäne (HD) der PHDf-HD-Polypeptide von Tabelle D1, wobei die Gesamthöhe des Stapels die Sequenzkonservierung an dieser Position angibt, wohingegen die Höhe der Symbole innerhalb des Stapels die relative Häufigkeit jeder Aminosäure oder Nukleinsäure an dieser Position angibt. Die HD nach SEQ ID NO: 234, die sich auch in SEQ ID NO: 180 befindet, entspricht dem in dieser Figur gezeigten Sequenzlogo.
  • 16 die graphische Ausgabe des COILS-Algorithmus, der zwei Coiled Coil-Domänen in der N-terminalen Hälfte des Polypeptids nach SEQ ID NO: 180 vorhersagt. Die X-Achse veranschaulicht die Aminosäurereste-Koordinaten, die Y-Achse die Wahrscheinlichkeit (die von 0 bis 1 reicht), dass eine Coiled Coil-Domäne zugegen ist, und die drei Linien, die drei untersuchten Fenster (14, 21, 28).
  • 17 ein CLUSTAL W (1; 83) multiples Sequenzalignment von PHDf-HD-Polypeptiden aus Tabelle D1 (wenn es sich um Volllänge handelt), wobei eine Anzahl von Merkmalen identifiziert werden. Vom N-Terminus zum C-Terminus der Polypeptide sind: (i) ein vorhergesagtes Kernlokalisierungssignal (NLS); (ii) ein Leucin-Zipper (ZIP), mit vier Heptaden (im Kasten, wobei gewöhnlich ein Leucin (mitunter ein Isoleucin, ein Valin, oder ein Methionin) an jeder siebten Aminosäure erscheint; (iii) ein PHD-Finger (PHDf), mit dem üblichen C4HC3 (4 Cysteine, 1 Histidin, 3 Cysteine) und einem charakteristischen Cystein-Spacing; (iv) ein saurer Abschnitt (reich an sauren Aminosäuren D und E); (v) saure Abschnitte (reich an basischen Aminosäuren K und R); (vi) eine Homöodomäne (HD).
  • 18 den binären Vektor für modulierte, vorzugsweise gesteigerte Expression in Oryza sativa einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle des GOS2-Promotors (pGOS2) aus Reis.
  • 19 genaue Beispiele für PHDf-HD Sequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • V. bHLH11-ähnliches(basisches Helix-Loop-Helix 11)-Protein
  • 20 die Domänenstruktur von SEQ ID NO: 245 wobei die konservierten Motive durch Unterstreichen und ihre Zahl angegeben ist. Die HLH-Domäne (Motiv 8) wie durch SMART bestimmt ist fett unterstrichen gezeigt.
  • 21 ein multiples Alignment verschiedener bHLH11-ähnlicher Proteine. Ein Punkt zeigt konservierte Reste, ein Komma hochkonservierte Reste, und ein Sternchen steht für perfekt konservierte Reste. Der höchste Grad an Sequenzkonservierung findet sich in der Region der bHLH Domäne. Der C-terminale Teil von AT2G24260, der über die anderen Proteine hinausgeht, ist weggelassen.
  • 22 Kreis-Kladogramm ausgewählter bHLH-Proteine. bHLH11-ähnliche Proteine und ein Arabidopsis-Protein, die jeweils eine der anderen Klassen repräsentieren, die von Heim 2003 definiert wurden, wurden verwendet. Das Alignment erfolgte mit ”CLUSTALX”, und es wurde ein Dendrogramm berechnet. Das Kreis-Kladogramm wurde mit einem Dendroskop gezeichnet (Huson et al. BMC Bioinformatics 2007). Bootstrap-Ergebnisse für 100 Replikate sind für einige Hauptknoten angegeben, wobei der Bootstrap-Wert im Kasten zeigt, dass die Gruppe der bHLH11-ähnlichen Proteine klar von den anderen bHLH Proteinen abgegrenzt ist.
  • 23 den binären Vektor zur gesteigerten Expression in Oryza sativa einer bHLH11-ähnlich-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines GOS2-Promotors (pGOS2) aus Reis.
  • 24 genaue Beispiele für bHLH11-ähnliche Sequenzen, die sich zur Durchführung in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • VI. ASR (abszisinsäure-, stress-, und reifeinduziertes) Protein
  • 25 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer GRP-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines GOS2-Promotors (pGOS2::GRP) aus Reis.
  • 26 genaue Beispiele für GRP-Sequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • VII. Squamosa-Promotor-Bindungsprotein-ähnlich 11 (SPL11)
  • 27 die Aminosäuresequenz und die Domänenstruktur von SEQ ID NO: 428. Konservierte Motive und Domänen sind gezeigt. Die SBP-Domäne ist durch eine unterbrochene Linie gezeigt; Motiv 1 ist fett gezeigt; Motiv 2 ist fett und unterstrichen gezeigt; Motiv 3 ist in fetten Großbuchstaben und unterstrichen und Motiv 4 ist fett und doppelt unterstrichen.
  • 28 ein multiples Sequenzalignment von SPL11-Polypeptiden. Die Position der konservierten Aminosäurereste und Domänen, die denjenigen der 27 entsprechen, ist angegeben. Eine Konsensussequenz, die SPL11 Polypeptide veranschaulicht, ist angegeben. In der Konsensussequenz sind die hochkonservierten Aminosäuren angegeben und Leerstellen dazwischen stehen für eine beliebige Aminosäure.
  • 29 einen Stammbaum der SPL11-Polypeptide. Der Stammbaum entspricht demjenigen in Xie et al. Plant Physiology, 2006, Vol. 142, pp. 280–293, die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen ist. SPL11-Polypeptide bilden in der gleichen Gruppe Cluster wie AtSPL11 (identisch zu SEQ ID NO: 2) in der als Klass S3 bezeichneten Klasse.
  • 30 eine Sequenzanalyse von miR156 Genen aus (OsmiR156) Reis und ihren angezielten Sequenzen in SPL-Polypeptiden (30A) aus Reis, sowie ein multiples Alignment von SPL11-Nukleinsäuren (30B). Die 30A zeigt ein Sequenz-Alignment von reifen OsmiR156-Sequenzen mit komplementären Sequenzen von OsSPL-Genen. Die konservierte Aminosäuresequenz, die durch die Zielsequenzen kodiert wird, ist unten gezeigt. Die Punkte zwischen miR156 und den angezielten OsSPL-Sequenzen zeigen Mismatches. Die 4B zeigt ein multiples Alignment von SPL11-Nukleinsäuren, wobei die hochkonservierten Nukleinsäurereste in der Konsensussequenz angezeigt sind. Die Position der hochkonservierten miR156-Zielstelle ist fett gegenüber der Konsensussequenz angegeben. SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 440 und SEQ ID NO: 454 veranschaulichen SPL11-Nukleinsäuren, die miR156-unempfindlich sind, die nicht die konservierte miR156 Zielstelle haben oder eine große Divergenz in ihrer Position an dieser Stelle haben.
  • 31 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa von SEQ ID NO: 427 unter der Kontrolle eines GOS2-Promotors (pGOS2) aus Reis (31A) oder unter einem WSI 18-Promotor aus Reis (31B).
  • 32 genaue Beispiele für SPL11-Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die lediglich beispielhaft sind. Die folgenden Beispiele sollen den Schutzbereich der Erfindung keinesfalls vollständig definieren oder ansonsten einschränken.
  • Die DNA-Manipulation: wenn nicht anders angegeben werden DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standard-Protokollen durchgeführt, beschrieben in Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder in Bd. 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standard-Materialien und Verfahren zur molekularen Arbeit an der Pflanze sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) beschrieben.
  • I. LOB-Domäne umfassendes Protein (LOB: Laterale Organ Grenzen)
  • Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren verwandt sind
  • Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren verwandt sind, identifiziert. Das Programm wurde zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Matches. Das durch die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure kodierte Polypeptid wurde beispielsweise für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment statistisch vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure (oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge.
  • Die Tabelle A1 stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten LBD Nukleinsäuresequenz verwandt sind Tabelle A1: Beispiele für LBD-Polypeptide: zugefügt DNA Sequenzen von Reis, Mais, Weizen, Canola-Raps, Kartoffel, Soja, Arabidopsis
    Ursprungspflanze* Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Arabidopsis thaliana LBD-Protein 1 2
    Os01g03890, Oryza sativa 59 11
    Os01g32770, Oryza sativa 60 12
    Os03g33090, Oryza sativa 61 13
    Os03g41330, Oryza sativa 62 14
    Os07g40000, Oryza sativa 63 15
    TC9404, Nicotiana benthamiana 16
    TC227562, Glycine max 17
    TC216138, Glycine max 18
    TC147776, Hordeum vulgare 19
    TC104758, Sorghum bicolor 20
    TC18561, Aquilegia sp. 21
    TC60668, Vitis vinifera 22
    TC15459, Lotus japonicus 23
    TC30552, Gossypium hirsutum 24
    TC235711, Triticum aestivum 71 25
    TC133081, Solanum tuberosum 26
    TC107091, Medicago truncatula 27
    TC147808, Hordeum vulgare 28
    TC55931, Vitis vinifera 29
    TC162239, Solanum tuberosum 30
    TC69225, Pinus taeda 31
    TC67269, Pinus taeda 32
    TC220806, Glycine max 33
    TC270332, Triticum aestivum 34
    TC18329, Aquilegia sp. 35
    TC137193, Solanum tuberosum 36
    TC133385, Solarium tuberosum 37
    TC140088, Solanum tuberosum 38
    TC14656, Picea alba 39
    TC59178, Pinus taeda 40
    TC67974, Pinus taeda 41
    TC178827, Lycopersicon esculentum 42
    Pt-III.589, Populus tremuloides 43
    Pt-V.543, Populus tremuloides 44
    Pt-XIV.94, Populus tremuloides 45
    Pt-II105, Populus tremuloides 46
    Pt-123.86, Populus tremuloides 47
    Pt-X180, Populus tremuloides 48
    Pt-XII.481, Populus tremuloides 49
    DQ787782, Caragana korshinskii 50
    AAP37970, Brassica napus 51
    ABE82505, Medicago truncatula 72 52
    ABE78739, Medicago truncatula 53
    Q9SN23, Arabidopsis thaliana 64 54
    Q9SZE8, Arabidopsis thaliana 65 55
    Q9ZW96, Arabidopsis thaliana 66 56
    Q9M886, Arabidopsis thaliana 67 57
    Q9CA30, Arabidopsis thaliana 68 58
    Ls_LBD, Linum usitatissimum 69 70
    • *: GenBank oder SwissProt Datenbank Zugangsnummern sind angegeben, wenn vorhanden, TC-Codes stammen von TIGR.
  • Beispiel 2: Alignment von LBD-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment von Polypeptid-Sequenzen erfolgte mit dem AlignX Programm von Vector NTI (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus des progressiven Alignments beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62. Um das Alignment weiter zu optimieren, wurden kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt. Die Sequenzkonservierung unter LBD-Polypeptiden befand sich im Wesentlichen in der N-terminalen DUF260-Domäne der Polypeptide, wobei die C-terminale Region gewöhnlich hinsichtlich Sequenzlänge und Zusammensetzung variabler ist. Das Alignment der LBD-Polypeptide ist in 2 gezeigt.
  • Mit einem ”Neighbour joining”-Clustering-Algorithmus, wie er von dem AlignX-Programm von Vektor NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird, wurde ein Stammbaum der LBD-Polypeptide (3) konstruiert. Die Sequenzen der LBD-Proteine der Klasse I, die bei der Konstruktion des Stammbaums verwendet wurden, sind öffentlich zugänglich und sind mit ihren GenBank oder SwissProt-Zugangsnummern gekennzeichnet.
  • Beispiel 3: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete software) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum 62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt. Der Identitätsprozentsatz ist fett über der Diagonale und der Ähnlichkeitsprozentsatz unter der Diagonale (normale Schrift) angegeben.
  • Der Identitätsprozentsatz zwischen den LBD-Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann nur 30,2% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 (veranschaulicht durch At-LBD37, Reihe 44) betragen. Der Identitätsprozentsatz ist wahrscheinlich höher, wenn nur die Sequenzen der DUF206-Domäne verglichen werden. Zur Identifikation der DUF260-Domäne (wie in 1 beschrieben) in anderen LBD Proteinen, kann das multiple Alignment von 2 verwendet werden. Tabelle A2: MatGAT-Ergebnis für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der LBD-Polypeptidsequenzen.
    Figure 02200001
    Figure 02210001
    Figure 02210002
    Figure 02220001
    Figure 02230001
    Figure 02230002
    Figure 02240001
    Figure 02240002
    Figure 02250001
    Figure 02260001
    47 48 49
    1. Os-Os01g03890 41,5 41,3 38,2
    2. Os-Os01g32770 41,5 44,8 39,0
    3. Os-Os03g33090 40,4 35,0 40,8
    4. Os-Os03g41330 38,2 33,7 36,0
    5. Os-Os07g40000 40,2 33,8 36,3
    6. Nb-TC9404 39,4 34,6 40,7
    7. Gm-TC227562 40,8 35,7 39,8
    8. Gm-TC216138 36,5 34,0 35,5
    9. Hv-TC147776 38,2 34,6 37,7
    10. Sb-TC104758 36,2 34,5 38,6
    11. Aq-TC18561 42,1 37,2 36,6
    12. Vv-TC60668 40,2 36,1 38,2
    13. Lj-TC15459 38,1 35,1 36,4
    14. Gh-TC30552 39,8 34,6 36,6
    15. Ta-TC235711 44,3 44,3 41,0
    16. St-TC133081 50,7 55,9 45,7
    17. Mt-TC107091 52,6 56,1 40,2
    18. Hv-TC147808 42,1 46,5 39,7
    19. Vv-TC55931 49,2 49,3 47,3
    20. St-TC162239 46,5 44,5 47,5
    21. Pta-TC69225 36,4 36,2 34,1
    22. Pta-TC67269 36,0 36,3 33,3
    23. Gm-TC220806 52,8 50,8 49,8
    24. Ta-TC270332 39,2 30,4 36,3
    25. Aq-TC18329 49,8 53,2 43,7
    26. St-TC137193 39,2 34,2 38,6
    27. St-TC133385 40,1 34,1 38,4
    28. St-TC140088 37,8 35,7 36,6
    29. Pa-TC14656 33,8 30,4 31,3
    30. Pta-TC59178 30,2 32,5 27,2
    31. Pta-TC67974 34,8 31,8 33,0
    32. Le-TC178827 39,0 34,6 38,5
    33. Pt-III.589 36,6 35,0 35,3
    34. Pt-V.543 38,2 35,4 39,2
    35. Pt-XIV.94 37,8 33,8 38,3
    36. Pt-II105 40,2 35,7 37,4
    37. Pt-123.86 53,8 59,1 43,6
    38. Pt-X180 46,8 41,5 49,6
    39. Pt-XII.481 38,5 37,6 36,4
    40. Ck-LOB-DQ787782 40,2 31,6 38,2
    41. Bn-AAP37970 55,5 83,5 42,1
    42. Mt-ABE82505 40,3 33,8 36,8
    43. Mt-ABE78739 53,3 51,6 43,8
    44. At-LBD37-Q9FN11 37,5 34,5 34,9
    45. At-LBD38-Q9SN23 40,5 33,5 34,8
    46. At-LBD39-Q9SZE8 38,3 35,0 37,1
    47. At-LBD40-Q9ZW96 56,7 46,5
    48. At-LBD41-Q9M886 68,4 42,6
    49. At-LBD42-Q9CA30 61,8 56,3
  • Beispiel 4: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites-(InterPro-)Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele häufige Proteindomänen und Familien abdeckt. Pfam wird auf dem Server des Sanger Institut im Vereinigten Königreich gehostet. InterPro wird vom European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
  • Die Ergebnisse des Interpro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sind in Tabelle A3 angegeben. Tabelle A3: InterPro-Scan-Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsname Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NO: 2
    PFAM PF03195 DUF260 2–107
    PROFILE PS50891 LOB 1–107
  • Beispiel 5: Topologie-Vorhersage für Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine voraus. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) für den sekretorischen Weg. Die Bewertungen (Scores), auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten, und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Score ist jedoch gemäß TargetP am wahrscheinlichsten und das Verhältnis zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (Reliability Class, RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Für die Sequenzen, die den Vorhersagen zufolge eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurde eine Anzahl Parameter ausgewählt, wie Organismusgruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Sätze von Ausschlussgrenzen (keine, vordefinierte Sätze von Ausschlussgrenzen oder nutzerspezifische Sätze von Ausschlussgrenzen) und die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 2 veranschaulicht wird, sind in Tabelle A4 dargestellt. Es wurde die Organismusgruppe ”Pflanze” gewählt, keine Ausschlussgrenzen definiert und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt. Tabelle A4: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2
    Länge (AA) 250
    Chloroplasten-Transitpeptid 0,026
    Mitochondriales Transitpeptid 0,401
    Signalpeptid des sekretorischen Wegs 0,019
    Anderes subzelluläres Ziel 0,573
    Vorhergesagte Lokalisierung /
    Verlässlichkeitsklasse 5
    Vorhergesagte Länge des Transitpeptids /
  • Die subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kann das Cytoplasma oder der Kern sein, es wird kein Transitpeptid vorhergesagt. SubLoc (Hua & Sun, Bioinformatics 17, 721–728, 2001) sagt eine Kernlokalisierung voraus (Verlässlichkeitsindex: 2, Genauigkeit: 74%); diese Voraussage stimmt mit den Daten von Liu et al (2005) überein.
  • Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:
    • • ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Univerität Dänemark gehostet wird;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada, gehostet wird;
    • • TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird
  • Beispiel 6: Klonierung der LBD-Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
  • Die Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm009067 (SEQ ID NO: 3; sense, Startcodon fettgedruckt):
    5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgagctgcaatggttgc-3' und prm009068 (SEQ ID NO: 4; revers, komplementär):
    5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtactaactctgagaaaaccgcc-3',
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, pLBD, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 1 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 10) für die spezifische Expression in Wurzeln befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::LBD (4) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 7: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Transformation von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und mittels Subkultur auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli mittels Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Stückchen der embryogenen Kalli wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium–Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und für 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft, auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und für 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden für die Ernte von T1-Samen nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen zurückbehalten, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel zeigten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach der Transplantation geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days after pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A&M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojanbohnen-Sorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojabohnensamen wird für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps-/Canolatransformation
  • Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die in-vitro-Aussaat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakterienlösung getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Alfalfatransformation
  • Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums herangezogen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Baumwolltransformation
  • Die Transformation von Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) erfolgt unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens an Hypokotylenexplantaten. Die handelsüblichen Sorten, wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sind für die Transformation verwendete Standardsorten, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln gekeimt. Hypokotylenexplantate von den gekeimten Keimlingen werden auf eine Länge von etwa 1–1,5 Zentimeter geschnitten. Das Hypokotylenexplantat wird in dem Agrobacterium tumefaciens-Impfgut, das den Expressionsvektor enthält, für 5 Minuten eingetaucht und dann für etwa 48 Stunden auf MS + 1,8 mg/l KNO3 + 2% Glucose bei 24°C im Dunkeln cokultiviert. Die Explantate werden in das gleiche Medium, das geeignete bakterielle und pflanzliche Selektionsmarker enthält (und mehrmals erneuert wird) umgesetzt, bis embryogene Kalli beobachtet werden. Die Kalli werden dann getrennt und subkultiviert, bis somatische Embryonen auftreten. Pflänzchen, die von den somatischen Embryonen stammen, lässt man auf Wurzelmedium reifen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Blumenerde im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Beispiel 8: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 8.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Die unter Nichtstressbedingungen gezogenen Pflanzen werden in regelmäßigen Abständen mit Wasser versorgt, so dass gewährleistet ist, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, damit die Bedürfnisse der Pflanze hinsichtlich der Vollendung von Wachstum und Entwicklung erfüllt werden.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe wurden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufwies. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entsprach ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • 8.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • 38.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten. Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag pro Pflanze und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 9: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen, die die SEQ ID NO: 1 umfassen
  • Die Untersuchung transgener Reispflanzen, die eine LBD-Nukleinsäuresequenz exprimierten, unter Nicht-Stress-Bedingungen zeigte, dass es zu einem Anstieg von mehr als 5% bei der oberirdischen Biomasse (AreaMax), dem Gesamtsamenertrag, der Anzahl gefüllter Samen, der Füllungsrate, beim Harvest Index und von mehr als 3% beim Tausendkorngewicht kam.
  • Die Untersuchung transgener Reispflanzen, die eine LBD-Nukleinsäuresequenz exprimierten, im Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung ergab einen Anstieg von mehr als 5% für die Vitalität beim Aufgehen (Jungpflanzenvitalität).
  • Beispiel 10: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen, die die SEQ ID NO: 71 umfassen
  • Die in der SEQ ID NO: 71 enthaltene kodierende Region wurde unter der Kontrolle des GOS2-Promotors aus Reis in einen Reis-Transformationsvektor kloniert, wie in Beispiel 6 beschrieben. Transgene Reispflanzen, die die kodierende Region der SEQ ID NO: 71 enthielten, wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 7 hergestellt. Die Pflanzen wurden nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren untersucht. SEQ ID NO: 71 kodiert das durch SEQ ID NO: 25 dargestellte LBD-Protein.
  • Die Untersuchung transgener Reispflanzen, die die SEQ ID NO: 71 exprimierten, unter Nicht-Stress-Bedingungen zeigte, dass es zu einem Anstieg von mehr als 5% bei der oberirdischen Biomasse (AreaMax), der Anzahl an Blüten pro Rispe, der Gesamtanzahl an Samen pro Pflanze und von mehr als 3% beim Tausendkorngewicht kam.
  • Beispiel 11: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen, die die SEQ ID NO: 72 umfassen
  • Die in der SEQ ID NO: 72 enthaltene kodierende Region wurde unter der Kontrolle des GOS2-Promotors aus Reis in einen Reis-Transformationsvektor kloniert, wie in Beispiel 6 beschrieben. Transgene Reispflanzen, die die kodierende Region der SEQ ID NO: 72 enthielten, wurden gemäß den Verfahren von Beispiel 7 hergestellt. Die Pflanzen wurden nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren untersucht. SEQ ID NO: 72 kodiert das durch SEQ ID NO: 52 dargestellte LBD-Protein.
  • Die Untersuchung transgener Reispflanzen, die die SEQ ID NO: 72 exprimierten, unter Nicht-Stress-Bedingungen zeigte, dass es zu einem Anstieg von mehr als 5% bei der oberirdischen Biomasse (AreaMax), dem Samengewicht pro Pflanze, der Anzahl gefüllter Samen, der Anzahl an Blüten pro Rispe, der Gesamtanzahl an Samen pro Pflanze, beim Harvest Index und von mehr als 3% beim Tausendkorngewicht kam.
  • Die Untersuchung transgener Reispflanzen, die die SEQ ID NO: 72 exprimierten, im Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung ergab einen Anstieg von mehr als 5% für die oberirdische Biomasse (AreaMax).
  • II. JMJC-(JUMONJI-C-)Polypeptid
  • Beispiel 12: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten JMJC-Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische), die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), identifiziert. Das Programm wird zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Übereinstimmungen. Das Polypeptid, das durch die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure kodiert wird, wurde zum Beispiel für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und anhand der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) in eine Reihenfolge gebracht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein bestimmtes Alignment zufällig vorkommt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch anhand der Prozent Identität gewertet. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure-(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge.
  • Die Tabelle B1 stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der JMJC-Nukleinsäuresequenz, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, verwandt sind. Polypeptide, an deren Zugang ein Punkt und eine Stelle angehängt ist, stellen Spleißvarianten dar. Tabelle B1: Beispiele für JMJC-Polypeptide:
    Ursprungspflanze Genbank-Zugangs(oder Locus-)nummer Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Arabidopsis thaliana AT3G20810 73 74
    Arabidopsis thaliana AT3G20810 83 84
    Arabidopsis thaliana AT5G19840 85 86
    Arabidopsis thaliana AT3G45880 87 88
    Medicago truncatula ABE92082 89 90
    Brachypodium sylvaticum CAJ26373 91 92
    Oryza sativa Os09g0483600 93 94
    Arabidopsis thaliana AT1G08620 95 96
    Arabidopsis thaliana AT1G09060 97 98
    Arabidopsis thaliana AT1G09060 99 100
    Arabidopsis thaliana AT1G09060 101 102
    Arabidopsis thaliana AT1G11950 103 104
    Arabidopsis thaliana AT1G30810 105 106
    Arabidopsis thaliana AT1G62310 107 108
    Arabidopsis thaliana AT1G63490 109 110
    Arabidopsis thaliana AT1G78280 111 112
    Arabidopsis thaliana AT2G34880 113 114
    Arabidopsis thaliana AT2G38950 115 116
    Arabidopsis thaliana AT3G07610 117 118
    Arabidopsis thaliana AT3G48430 119 120
    Arabidopsis thaliana AT4G00990 121 122
    Arabidopsis thaliana AT4G20400 123 124
    Arabidopsis thaliana AT4G20400 125 126
    Arabidopsis thaliana AT5G04240 127 128
    Arabidopsis thaliana AT5G06550 129 130
    Arabidopsis thaliana AT5G46910 131 132
    Arabidopsis thaliana AT5G63080 133 134
    Oryz asativa Os01g36630 135 136
    Oryz asativa Os01g67970 137 138
    Oryza sativa Os02g01940 139 140
    Oryza sativa Os02g58210 141 142
    Oryza sativa Os02g58210 143 144
    Oryza sativa Os03g05680 145 146
    Oryza sativa Os03g22540 147 148
    Oryza sativa Os03g27250 149 150
    Oryza sativa Os03g31594 151 152
    Oryza sativa Os03g31594 153 154
    Oryza sativa Os05g10770 155 156
    Oryza sativa Os05g23670 157 158
    Oryza sativa Os09g22540 159 160
    Oryza sativa Os10g42690 161 162
    Oryza sativa Os11g36450 163 164
    Oryza sativa Os12g18149 165 166
    Oryza sativa Os12g18150 167 168
    Glycine max Gm_JMJ_1 169 170
  • In einigen Fällen sind verwandte Sequenzen vorläufig zusammengebaut und durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), öffentlich offenbart worden. Die Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank kann zur Identifikation solcher verwandten Sequenzen verwendet werden, und zwar entweder über die Schlüsselwort-Suche oder unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz.
  • Beispiel 13: Alignment von JMJC-Polypeptisequenzen
  • Das Alignment von Polypeptidsequenzen erfolgte mit dem AlignX-Programm von dem Vector NTI (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1 und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (wenn Polypeptide einem Alignment unterworfen werden). Um das Alignment weiter zu optimieren, können kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt wurden. Die Sequenzkonservierung unter JMJC-Polypeptiden findet sich größtenteils in der JmjC-Domäne der Polypeptide. Die Region, die den durch SEQ ID NO: 79 und SEQ ID NO: 81 dargestellten Motiven entspricht, ist stärker konserviert als diejenige von Motiv B. Eine Konsensussequenz ist angegeben. Die Aminosäurereste in der Konsensussequenz sind hochkonserviert. Das Alignment der JMJC-Polypeptide ist in 7 gezeigt.
  • Beispiel 14: Berechnung der Gesamtprozent an Identität zwischen JMJC-Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einem der im Stand der Technik verfügbaren Verfahren, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software), bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und die Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum 62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B2 für die Gesamt-Ähnlichkeit und -Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt. Die Prozent Identität sind fettgedruckt über der Diagonalen und die Prozent Ähnlichkeit sind (in normaler Schrift) unter der Diagonalen angegeben.
  • Die Prozent Identität zwischen den JMJC-Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann nur 15% Aminosäure-Identität im Vergleich zu SEQ ID NO: 74 betragen. Tabelle B2: MatGAT-Ergebnisse für Gesamt-Ähnlichkeit und -Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.
    SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 136
    AT3G20810.1 SEQ ID NO: 74 97,4 16,1 15,5 16,9 17,3 15,5
    AT3G20810.2 SEQ ID NO: 84 97,4 15,5 14,5 17,5 17,1 14,9
    AT5G19840 SEQ ID NO: 86 30,3 30,7 16,9 17 16,9 16,9
    ABE92082 SEQ ID NO: 90 28,2 27,7 28,5 51,8 51,7 17,3
    CAJ26373 SEQ ID NO: 92 30,1 29,6 27,7 67,6 82,5 12,4
    Os09g0483600 SEQ ID NO: 94 30,1 30,1 27,5 67,3 89,6 16,1
    Os01g36630 SEQ ID NO: 136 33,7 31,2 32,9 34,2 29,1 29,6
  • Beispiel 15: Identifikation von Domänen in JMJC-Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites-(InterPro-)Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele häufige Proteindomänen und Familien abdeckt. Pfam wird auf dem Server des Sanger Institut im Vereinigten Königreich gehostet. InterPro wird am European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet. Tabelle B3 zeigt die Einstellungen (Gathering cut off, trusted cut off und noise cut off), wie in der Pfam-Datenbank beschrieben, die zur Erstellung der HMMs_fs für die verschiedenen Domänen verwendet wurden. Tabelle B3: HMMs_fs-Einstellungen.
    Domäne Gathering cutoff Trusted cutoff Noise cutoff
    PF02373 16 16,1 15,9
    PF02375 15 16,8 13,8
    PF02928 25 44,4 21,1
    PF00646 17,7 17,7 17,6
    PF00096 22,5 22,5 22,4
    PF04967 15,4 15,4 3
  • Die Ergebnisse des Pfam-Scans für beispielhafte JMJC-Polypeptide pflanzlichen Ursprungs sind in Tabelle B4 dargestellt. Die Aminosäurekoordinaten für jede Domäne in der Referenz-Sequenz sind in den Spalten Start und Ende angegeben. Der E-Wert für das Alignment ist ebenfalls angegeben. Die InterPro ID-Zugangsnummer jeder identifizierten Domäne ist ebenfalls genannt. Tabelle B4: Pfam-Scan-Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) beispielhafter JMJC-Polypeptide pflanzlichen Ursprungs.
    Figure 02430001
    Figure 02440001
    Figure 02450001
    Figure 02460001
    Figure 02470001
  • Beispiel 16: Klonierung der JMJC-Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
  • Die Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Es wurden ein stromaufwärts- bzw. ein stromabwärts-Primer, die in SEQ ID NO: 75 und SEQ ID NO: 76 dargestellt sind, für die Amplifikation der kodierenden Region von JMJC gemäß SEQ ID NO: 73 mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) verwendet. Die Primer enthalten die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination, wodurch die Klonierung des amplifizierten PCR-DNA-Fragments in einen Gateway-Klonierungsvektor erleichtert wird.
  • Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, pJMJC, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NO: 73 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet.
  • Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 77) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::JMJC (9) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 17: Pflanzentransformation
  • Die Transformation von Pflanzen wurde gemäß dem in Beispiel 7 dargestellten Verfahren durchgeführt.
  • Beispiel 18: Verfahren bei der phänotypischen Untersuchung
  • 18.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden acht Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Die unter Nichtstressbedingungen gezogenen Pflanzen werden in regelmäßigen Abständen mit Wasser versorgt, so dass gewährleistet ist, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, damit die Bedürfnisse der Pflanze hinsichtlich der Vollendung von Wachstum und Entwicklung erfüllt werden.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation nach dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter untersucht. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufwies. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • 18.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Aussagen von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass man den Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglich.
  • 18.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanze ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatte. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung. Eine Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Anstieg der Gesamtwurzelbiomasse (die als maximale Biomasse der Wurzeln, die während der Lebenszeit einer Pflanze beobachtet werden, gemessen wird) oder als ein Anstieg des Wurzel/Spross-Index (der als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im aktiven Wachstumszeitraum von Wurzel und Spross gemessen wird) ausgedrückt.
  • Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die verbleibende Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 19: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die JMJC-Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 73 exprimierten, unter Nicht-Stress-Bedingungen sind nachstehend dargestellt. Es wurde ein Anstieg von mindestens 5% bei der Vitalität beim Aufgehen (Jungpflanzenvitalität), beim Wurzel/Spross-Index, Gesamtsamenertrag, Harvest Index und von mindestens 3% beim Tausendkorngewicht bei den transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Nullizygoten-Kontrollpflanzen beobachtet.
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die SEQ ID NO: 73 exprimierten, unter Trockenheitsstressbedingungen sind im Folgenden dargestellt. Es wurde ein Anstieg von mindestens 5% beim Wurzel/Spross-Index, Gesamtsamengewicht, der Anzahl an gefüllten Samen, der Füllungsrate, beim Harvest Index und von mindestens 3% beim Tausendkorngewicht bei den transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Nullizygoten-Kontrollpflanzen beobachtet.
  • III. Casein Kinase 1
  • Beispiel 20: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten CKI-Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische), die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, werden unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), identifiziert. Das Programm wird zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Übereinstimmungen. Das Polypeptid, das durch die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuren kodiert wird, wird zum Beispiel für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wird mittels paarweisem Vergleich betrachtet und anhand der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) in eine Reihenfolge gebracht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein bestimmtes Alignment zufällig vorkommt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch anhand der Prozent Identität gewertet. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze fast genaue Übereinstimmungen identifizieren.
  • In einigen Fällen können verwandte Sequenzen vorläufig zusammengebaut und öffentlich durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), offenbart werden. Die Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank kann zur Identifikation solcher verwandten Sequenzen verwendet werden, und zwar entweder über die Schlüsselwort-Suche oder unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz.
  • Beispiel 21: Alignment von GRP-Polypeptisequenzen
  • Das Alignment von Polypeptidsequenzen erfolgt mit dem AlignX-Programm aus dem Vector NTI-Paket (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1 und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (wenn Polypeptide einem Alignment unterworfen werden). Um das Alignment weiter zu optimieren, können kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt werden.
  • Ein Stammbaum von GRP-Polypeptiden wird unter Verwendung eines Neighbour-Joining-Cluster-Algorithmus konstruiert, der in dem AlignX Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird.
  • Beispiel 22: Berechnung der Gesamtprozent an Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, werden unter Verwendung von einem der im Stand der Technik verfügbaren Verfahren, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software), bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und die Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum 62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Eine MATGAT-Tabelle für das lokale Alignment einer spezifischen Domäne oder Daten zu % Identität/Ähnlichkeit zwischen spezifischen Domänen können ebenfalls erzeugt werden.
  • Beispiel 23: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites-(InterPro-)Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele häufige Proteindomänen und Familien abdeckt. Pfam wird auf dem Server des Sanger Institut im Vereinigten Königreich gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
  • Die Proteinsequenzen, welche die GRP wiedergeben, werden als Abfrage bei einer Suche in der InterPro-Datenbank verwendet.
  • Beispiel 24: Topologie-Vorhersage für Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine voraus. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) für den sekretorischen Weg. Die Scores, auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten, und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Score ist jedoch gemäß TargetP am wahrscheinlichsten und das Verhältnis zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Für die Sequenzen, die den Vorhersagen zufolge eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurde eine Anzahl an Parametern ausgewählt, wie Organismusgruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Sätze von Ausschlussgrenzen (keine, vordefinierte Sätze von Ausschlussgrenzen oder nutzerspezifische Sätze von Ausschlussgrenzen) und die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).
  • Die Proteinsequenzen, welche die GRP darstellen, werden für die Abfrage von TargetP 1.1 verwendet. Es wurde die Organismusgruppe ”Pflanze” gewählt, keine Ausschlussgrenzen definiert und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt.
  • Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:
    • • ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Univerität Dänemark gehostet wird;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada, gehostet wird;
    • • TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird
  • Beispiel 25: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
  • Klonierung von SEQ ID NO: 171:
  • Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 171, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm8667 (SEQ ID NO: 177; sense, Startcodon fettgedruckt):
    5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggactgcaacatggtatct-3' und prm8668 (SEQ ID NO: 178; revers, komplementär):
    5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcacattacttactcatctattttgg-3',
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone” rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Klonierung von SEQ ID NO: 173:
  • Ein cDNA-AFLP-Experiment wurde an einer synchronisierten Tabak-BY2-Zellkultur (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2) durchgeführt und in BY2 exprimierte Sequenz-Tags, die mit dem Verlauf des Zellzyklus moduliert wurden, wurden für die weitere Klonierung ausgewählt. Die exprimierten Sequenz-Tags wurden für das Screening einer Tabak-cDNA-Bank und zur Isolation einer interessierenden Volllängen-cDNA, nämlich einer DNA, die SEQ ID NO: 173 kodierte, verwendet.
  • Eine Suspension von kultivierten Tabak-BY2-Zellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2) wurde synchronisiert, indem die Zellen mit Aphidicolin wie folgt in der frühen S-Phase blockiert wurden. Die Zellsuspension von Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2 wurde gehalten, wie beschrieben (Nagata et al. Int. Rev. Cytol. 132, 1–30, 1992). Für die Synchronisation wurde eine 7 Tage alte stationäre Kultur 10-fach in frischem Medium verdünnt, das mit Aphidicolin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 5 mg/l) angereichert war. Nach 24 Std. wurde die Blockierung der Zellen durch mehrmaliges Waschen mit frischem Medium aufgehoben, wonach sie das Durchlaufen des Zellzyklus wieder aufnahmen.
  • Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von LiCI-Fällung extrahiert und die poly(A+)-RNA wurde aus 500 μg Gesamt-RNA unter Verwendung von Oligotex-Säulen (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß der Anleitung des Herstellers isoliert. Ausgehend von 1 μg poly(A+)-RNA wurde der erste Strang der cDNA mittels reverser Transkription mit einem biotinylierten oligo-dT25-Primer (Genset, Paris, Frankreich) und Superscript II (Life Technologies, Gaithersburg, MD) synthetisiert. Die Zweistrangsynthese erfolgte durch Strangverdrängung mit Escherichia coli-Ligase (Life Technologies), DNA-Polymerase I (USB, Cleveland, OH) und RNAse H (USB).
  • Es wurden 500 ng doppelsträngige cDNA für die AFLP-Analyse, wie beschrieben (Vos et al., Nucleic Acids Res. 23 (21) 4407–4414, 1995; Bachem et al., Plant J. 9 (5) 745–53, 1996) mit Modifikationen, verwendet. Die verwendeten Restriktionsenzyme waren BstYI und MseI (Biolabs) und die Spaltung erfolgte in zwei getrennten Schritten. Nach der ersten Restriktionsspaltung mit einem der Enzyme wurden die 3'-Ende-Fragmente mithilfe ihres biotinylierten Schwanzes an Dyna-Kugeln (Dynal, Oslo, Norwegen) eingefangen, wohingegen die übrigen Fragmente abgewaschen wurden. Nach der Spaltung mit dem zweiten Enzym wurden die freigesetzten Restriktionsfragmente gesammelt und als Matrizen bei den anschließenden AFLP-Schritten eingesetzt. Für Voramplifikationen wurden ein MseI-Primer ohne selektive Nukleotide mit einem BstYI-Primer kombiniert, der entweder ein T oder ein C als häufigstes 3'-Nukleotid enthielt. Die PCR-Bedingungen waren wie beschrieben (Vos et al., 1995). Die erhaltenen Amplifikationsgemische wurden 600-fach verdünnt und 5 μl wurden für selektive Amplifikationen unter Verwendung eines P33-markierten BstYI-Primers und der Amplitaq-Gold-Polymerase (Roche Diagnostics, Brüssel, Belgien) eingesetzt. Die Amplifikationsprodukte wurden auf 5%igen Polyacrylamidgelen unter Verwendung des Sequigel-Systems (Biorad) aufgetrennt. Die getrockneten Gele wurden mit Kodak Biomax-Filmen exponiert und in einem PhosphorImager (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) gescannt.
  • Banden, die differentiell exprimierten Transkripten entsprachen, darunter das (partielle) Transkript, das der SEQ ID NO: 173 entspricht, wurden aus dem Gel isoliert und die eluierte DNA wurde unter den gleichen Bedingungen wie bei der selektiven Amplifikation reamplifiziert. Sequenzinformation wurde entweder durch direkte Sequenzierung des reamplifizierten Produkts der Polymerasekettenreaktion mit dem selektiven BstYI-Primer oder nach Klonierung der Fragmente in pGEM-T easy (Promega, Madison, WI) und Sequenzierung von Einzelklonen erhalten. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Nukleotid- und Proteinsequenzen in den öffentlich zugänglichen Datenbanken mittels BLAST-Sequenz-Alignments (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17) 3389–3402 1997) verglichen. Wenn verfügbar, wurden die Tag-Sequenzen gegen längere EST- oder isolierte cDNA-Sequenzen ausgetauscht, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass eine signifikante Homologie gefunden wurde. Der physikalische cDNA-Klon, der der SEQ ID NO 173 entspricht, wurde anschließend aus einer im Handel erhältlichen Tabak-cDNA-Bank wie folgt isoliert:
    Eine cDNA-Bank mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 1400 bp wurde aus poly(A+)-RNA hergestellt, die aus sich aktiv teilenden, nicht-synchronisierten BY2-Tabakzellen isoliert worden war. Die Inserts dieser Bank waren in dem Vektor pCMVSPORT6.0 kloniert, der eine attB-Gateway-Kassette (Life Technologies) umfasst. Aus dieser Bank wurden 46 000 Klone ausgewählt, in Arrays auf Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen angeordnet und anschließend in Doppelproben auf Nylonfilter getupft. Die Klon-Arrays wurden unter Verwendung von Pools von mehreren Hundert radioaktiv markierten Tags (einschließlich des BY2-Tags, das der SEQ ID NO: 173 entspricht) als Sonden gescreent. Positive Klone wurden isoliert (darunter der Klon, der der SEQ ID NO: 173 entspricht), sequenziert und einem Alignment mit der Tag-Sequenz unterzogen. Wenn die Hybridisierung mit dem Tag nicht gelang, wurde die Volllängen-cDNA, die dem Tag entsprach, mittels PCR-Amplifikation selektiert: Tag-spezifische Primer wurden unter Verwendung von öffentlich zugänglicher Software gestaltet und in Kombination mit einem üblichen Vektor-Primer für die Amplifikation partieller cDNA-Inserts verwendet. Pools der DNA von 50 000, 100 000, 150 000 und 300 000 cDNA-Klonen wurden bei den PCR-Amplifikationen als Matrizen eingesetzt. Die Amplifikationsprodukte wurden dann aus Agarosegelen isoliert, kloniert sequenziert und ihre Sequenz wurde einem Alignment mit der Tag-Sequenz unterzogen. Danach wurde die Volllängen-cDNA, die der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO 173 entsprach, aus dem pCMVsport6.0-Bankvektor über eine LR-Reaktion in pDONR201, einen Gateway®-Donorvektor (Invitrogen, Paisley, UK), kloniert, wodurch ein ”entry clone” erhalten wurde.
  • Der die SEQ ID NO: 171 oder SEQ ID NO: 173 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein WSI18-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 175) für die spezifische Expression in Samen befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pWSI18::GRP (11) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • In einem alternativen Konstrukt wurde der GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 176) verwendet, so dass der Expressionsvektor pGOS2::GRP erhalten wurde.
  • Beispiel 26: Pflanzentransformation
  • Die Transformation von Pflanzen wurde gemäß dem in Beispiel 7 ausgeführten Verfahren durchgeführt.
  • Beispiel 27: Verfahren bei der phänotypischen Auswertung
  • 27.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte, (Nullizygoten) durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Die unter Nichtstressbedingungen gezogenen Pflanzen werden in regelmäßigen Abständen mit Wasser versorgt, so dass gewährleistet ist, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, damit die Bedürfnisse der Pflanze hinsichtlich der Vollendung von Wachstum und Entwicklung erfüllt werden.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation nach dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter untersucht. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • 27.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Befunde von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass der Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglichen wurde.
  • 27.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten.
  • Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung. Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 28: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
  • Die transgenen Reispflanzen, welche die durch SEQ ID NO: 171 dargestellte GRP-Nukleinsäure unter der Kontrolle des WSI18-Promotors exprimierten, zeigten einen Anstieg von mehr als 5% bei der Biomasse, dem Gesamtgewicht der Samen, der Anzahl gefüllter Samen, der Füllungsrate und beim Harvest Index, wenn sie unter Trockenheitsstressbedingungen herangezogen wurden. Bei Anzucht unter Nichtstressbedingungen wurde ein Anstieg von mehr als 5% bei der Biomasse, der Anzahl gefüllter Samen, dem Gesamtgewicht der Samen und der Anzahl an ersten Rispen beobachtet.
  • Bei dem Konstrukt mit SEQ ID NO: 171 unter der Kontrolle des GOS2-Promotors wurde bei den transgenen Pflanzen ein Anstieg bezüglich der Jungpflanzenvitalität und der Blüten pro Rispe beobachtet, wobei der Anstieg bei jedem dieser Parameter mehr als 5% betrug.
  • Transgene Pflanzen, die die SEQ ID NO: 173 unter der Kontrolle des WSI18-Promotors exprimierten und unter Trockenheitsstressbedingungen herangezogen wurden, zeigten eine Zunahme beim Gesamtgewicht der Samen, der Anzahl an gefüllten Samen, der Anzahl an Blüten pro Rispe, beim Harvest Index und beim Tausendkorngewicht. Beim Tausendkorngewicht betrug die beobachtetet Zunahme mindestens 3,5% und bei den anderen Parametern mehr als 5%.
  • IV. Pflanzen-Homöodomäne-Finger-Homöodomäne-(PHDf-HD-)Polypeptid
  • Beispiel 29: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische), die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), identifiziert. Das Programm wird zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Übereinstimmungen. Das Polypeptid, das durch die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kodiert wird, wurde zum Beispiel für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und anhand der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) in eine Reihenfolge gebracht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein bestimmtes Alignment zufällig vorkommt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch anhand der Prozent Identität gewertet. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast genaue Übereinstimmungen identifizieren.
  • Tabelle D1 zeigt eine Auflistung von Nukleinsäuresequenzen, die mit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten PHDf-HD-Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Tabelle D1: Beispiele für PHDf-HD-Polypeptide:
    Figure 02620001
    Figure 02630001
  • Beispiel 30: Alignment von PHDf-HD-Polypeptidsequenzen
  • Die Universität Potsdam, Deutschland, hat eine Datenbank von Pflanzen-Transkriptionsfaktoren, einschließlich derjenigen von Oryza sativa mit der Bezeichnung riceTFDB, erstellt. Sämtliche Polypeptidsequenzen, die den zur HD-Familie gehörenden Transkriptionsfaktoren entsprechen (bisher 120 identifizierte Genmodelle (91 Loci)) wurden einschließlich der beiden bisher identifizierten PHDf-HD-Polypeptide (Os02g05450.1 und Os06g12400.1) heruntergeladen. Die Polypeptidsequenzen in Tabelle D1 der vorliegenden Anmeldung (bei Volllänge, d. h. 21 Polypeptidsequenzen) wurden zu dem Satz der HD-Familie hinzugefügt.
  • Das Alignment aller Polypeptidsequenzen erfolgte mit dem Clustal Algorithmus (1.83) für progressives Alignment unter Verwendung der Default-Werte (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Anschließend wurde ein Neighbour-Joining-Tree konstruiert, der in 13 der vorliegenden Anmeldung dargestellt ist. Die interessierende Gruppe, welche die beiden Paraloge aus Reis (Os02g05450.1 und Os06g12400.1) umfasst, ist eingekreist. Jedes Polypeptid, das (nach einem Mehrfach-Alignment-Schritt, wie hier vorstehend beschrieben) in diese HD-Gruppe fällt, wird als geeignet für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, wie hier beschrieben, erachtet.
  • In einem mehrfachen Sequenz-Alignment der Volllangen-PHDf-HD-Polypeptide in Tabelle D1 kann eine Reihe von Merkmalen identifiziert werden, die in 17 markiert sind. Vom N-Terminus zum C-Terminus der Polypeptide findet man: (i) ein vorhergesagtes Kern-Lokalisierungssignal (NLS); (ii) einen Leucin-Zipper (ZIP) mit vier Heptaden (im Kasten, worin in der Regel ein Leucin (gelegentlich ein Isoleucin, ein Valin oder ein Methionin) als jede siebte Aminosäure auftritt); (iii) einen PHD-Finger (PHDf) mit dem typischen C4HC3 (vier Cysteine, ein Histidin, drei Cysteine) mit charakteristischem Cystein-Abstand; (iv) eine saure Abfolge (die reich an den sauren Aminosäuren D und E ist); (v) basische Abfolgen (die reich an den basischen Aminosäuren K und R sind); (vi) eine Homöodomäne (HD).
  • Beispiel 31: Berechnung der Gesamtprozent an Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einem der im Stand der Technik verfügbaren Verfahren, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software), bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und die Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum 62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle D2 für die Gesamt-Ähnlichkeit und -Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt (wobei die partiellen Polypeptidsequenzen ausgeschlossen wurden). Die Prozent Identität sind oberhalb der Diagonalen und die Prozent Ähnlichkeit sind unterhalb der Diagonalen angegeben.
  • Die Prozent Identität zwischen den PHDf-HD-Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann nur 15% Aminosäure-Identität im Vergleich zu SEQ ID NO: 180 betragen. Tabelle D2: MatGAT-Ergebnisse für Gesamt-Ähnlichkeit und -Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.
    Figure 02650001
    Figure 02660001
  • Die Prozent Identität können erheblich erhöht werden, wenn man die Identitätsberechnung zwischen der konservierten ZIP/PHDf-Domäne (konservierte Leucin-Zipper/Pflanzen-Homöodomäne-Finger-Domäne, die die Zip- und die PHDf-Domäne enthält) der SEQ ID NO: 180 (wie durch SEQ ID NO: 233 dargestellt) und der konservierten ZIP/PHDf-Domäne der Polypeptide, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sind, durchführt. Die konservierte ZIP/PHDf der SEQ ID NO: 233 ist insgesamt 180 aufeinander folgende Aminosäuren lang. Die Prozent Identität über die konservierte ZIP/PHDf-Domäne zwischen den Polypeptidsequenzen, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, reicht von 30% bis 75% Aminosäure-Identität, wie aus Tabelle D3 zu entnehmen ist. Tabelle D3: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamt-Ähnlichkeit und -Identität zwischen den Polypeptidsequenzen über die konservierte ZIP/PHDf-Domäne.
    Figure 02660002
    Figure 02670001
  • Die Prozent Identität können auch zwischen der konservierten HD der SEQ ID NO: 180 (wie in SEQ ID NO: 234 dargestellt) und der konservierten HD der Polypeptide, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sind, berechnet werden. Die Prozent Identität über die konservierte HD zwischen den Polypeptidsequenzen, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, reicht von 25% bis 70% Aminosäure-Identität, wie aus Tabelle D4 zu entnehmen ist. Tabelle D4: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamt-Ähnlichkeit und -Identität zwischen den Polypeptidsequenzen über die konservierte HD.
    Figure 02670002
    Figure 02680001
  • Beispiel 32: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites-(InterPro-)Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Interpro wird am European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
  • Die Ergebnisse aus dem InterPro-Scan der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 180 sind in Tabelle D5 dargestellt. Tabelle D5: InterPro-Scan-Ergebnisse für die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 180
    InterPro-Zugangsnummer Name in der integrierten Datenbank Zugangsnummer in der integrierten Datenbank Zugangsname in der integrierten Datenbank Aminosäure-koordinaten auf SEQ ID NO: 180
    IPR0013556 Homeobox ProDom PD000010 PRH_ARATH_P48785 439–497
    IPR0013556 Homeobox PFAM PF00046 Homeobox 439–495
    IPR0013556 Homeobox SMART SM00389 HOX 438–500
    IPR0013556 Homeobox Profile PS50071 Homeobox_2 436–496
    IPR00195 Zinc-finger, PHDtype PFAM PF00628 PHD 197–251
    IPR00195 Zinc-finger, PHD-type SMART SM00249 PHD 197–249
    IPR00195 Zinc-finger, PHD-type Profile PS50016 ZF_PHD_2 195–251
    IPR012287 Homeodomainrelated Gene3D G3DSA:1.10.10.60 keine Beschreibung 436–501
    IPR013256 Chromatin SPT2 SMART SM00784 keine Beschreibung 78–154
    Untegrated IPR PANTHER PTHR19418 Homeobox protein 397–414 431–590
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans identifizieren deutlich die wesentlichen Merkmale eines PHDf-HD-Polypeptids, d. h. einen PHDf-Zinkfinger und eine Homöobox, wie zum Beispiel an den Pfam-Einträgen PF00628 beziehungsweise PF00046 zu erkennen ist.
  • Bekanntlich enthalten HDs kanonische Reste. Die HD von PHDf-HD-Polypeptiden zeigt sogar an den Positionen, die unter den Homöodomänen nahezu unveränderlich sind, große Sequenzunterschiede. Das Sequenz-Logo der HD der PHDf-HD-Polypeptide in Tabelle D1 ist in 15 dargestellt. Sequenz-Logos sind eine graphische Darstellung eines Alignments mehrerer Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen. Jedes Logo besteht aus Stapeln von Symbolen mit jeweils einem Stapel für jede Position in der Sequenz. Die Gesamthöhe des Stapels zeigt die Sequenzkonservierung an dieser Position an, wohingegen die Höhe der Symbole in dem Stapel die relative Häufigkeit jeder Amino- oder Nukleinsäure an dieser Position anzeigt. Im Allgemeinen liefert ein Logo eine reichhaltigere und genauere Beschreibung zum Beispiel einer Bindungsstelle als eine Konsensussequenz. Der Algorithmus (WebLogo), der zum Erzeugen solcher Logos verwendet wird” ist auf dem Server der Universität of California, Berkeley, verfügbar. Die HD gemäß SEQ ID NO: 234, die in SEQ ID NO: 180 enthalten ist, stimmt mit dem in 15 dargestellten Sequenz-Logo überein. Polypeptide, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, umfassen eine HD, die das in 15 dargestellte Sequenz-Logo umfasst.
  • Beispiel 33: Vorhersage von Sekundärstrukturmerkmalen der Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Coiled Coils enthalten gewöhnlich ein Muster aus sieben wiederholten Aminosäuren, das man als Heptad-Wiederholung bezeichnet. Coiled Coils sind wichtig für die Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Oligomerisierung, entweder von identischen Proteinen, Proteinen aus derselben Familie oder von nicht miteinander verwandten Proteinen. Vor kurzem wurden große Fortschritte bei der Computer-Vorhersage von Coiled Coils aus Sequenzdaten gemacht. Unter den ExPASy Proteomics-Werkzeugen sind viele Algorithmen verfügbar, die dem Fachmann bekannt sind. Eines unter ihnen, COILS, ist ein Programm, das eine Sequenz mit einer Datenbank bekannter paralleler zweisträngiger Coiled Coils vergleicht und einen Ähnlichkeitswert ableitet. Durch Vergleichen dieses Werts mit der Verteilung der Bewertungen in globulären und Coiled Coil-Proteinen berechnet das Programm die Wahrscheinlichkeit, dass die Sequenz eine Coiled Coil-Konformation annimmt.
  • Für das PHDf-HD-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 180 werden zwei N-terminale Coiled Coil-Domänen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit in allen drei untersuchten Fenstern (14, 21 and 28) vorhergesagt. In Tabelle D6 sind die Koordinaten der Reste, die Reste, die drei Fenster und die entsprechenden Wahrscheinlichkeitswerte dargestellt. 16 zeigt die graphische Ausgabe des COILS-Algorithmus an dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 180, wobei die beiden vorhergesagten Coiled Coils in der N-terminalen Hälfte des Polypeptids in allen drei Fenstern (durch die drei Linien dargestellt) deutlich sichtbar sind. Tabelle D6: Numerische Ausgabe des COILS-Algorithmus an dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 180. Die Koordinaten der Reste (#), die Reste, die drei Fenster und die entsprechenden Wahrscheinlichkeitswerte sind dargestellt. Wahrscheinlichkeiten über 0,09 sind grau dargestellt.
    # Rest Fenster = 14 Wahr Fenster = 21 Wahr Fenster = 28 Wahr
    87 P d 0,001 e 0,001 E 0,001
    88 T e 0,063 f 0,274 F 0,099
    89 R f 0,063 g 0,567 G 0,099
    90 R g 0,063 a 0,567 A 0,099
    91 K b 0,066 b 0,642 B 0,188
    92 H c 0,066 c 0,642 C 0,188
    93 K d 0,069 d 0,642 D 0,591
    94 Q e 0,178 e 0,642 E 0,672
    95 K f 0,335 f 0,642 F 0,672
    96 R g 0,335 g 0,642 G 0,772
    97 K a 0,335 a 0,642 A 0,772
    98 N b 0,347 b 0,642 B 0,772
    99 D c 0,347 c 0,642 C 0,772
    100 E d 0,347 d 0,642 D 0,772
    101 S e 0,347 e 0,642 E 0,808
    102 D f 0,347 f 0,642 F 0,808
    103 E g 0,347 g 0,642 g 0,808
    104 V a 0,347 a 0,642 a 0,808
    105 S b 0,347 b 0,642 b 0,808
    106 R c 0,347 c 0,642 c 0,808
    107 M d 0,347 d 0,642 d 0,808
    108 E e 0,347 e 0,642 e 0,808
    109 K f 0,347 f 0,642 F 0,808
    110 R g 0,347 g 0,642 g 0,808
    111 A a 0,347 a 0,642 a 0,808
    112 R b 0,307 b 0,514 b 0,808
    113 Y c 0,066 c 0,503 c 0,808
    114 L d 0,262 d 0,503 d 0,808
    115 L e 0,262 e 0,503 e 0,808
    116 I f 0,262 f 0,503 F 0,808
    117 K g 0,262 g 0,503 g 0,808
    118 I a 0,262 a 0,503 a 0,808
    119 K b 0,262 b 0,503 b 0,808
    120 Q c 0,262 c 0,503 c 0,808
    121 E d 0,262 d 0,503 d 0,808
    122 Q e 0,262 e 0,503 e 0,808
    123 N f 0,262 f 0,503 F 0,808
    124 L g 0,262 g 0,434 g 0,808
    125 L a 0,262 a 0,434 a 0,808
    126 D b 0,262 b 0,434 b 0,808
    127 A c 0,262 c 0,304 c 0,808
    128 Y d 0,145 d 0,304 d 0,808
    129 S e 0,145 e 0,044 e 0,808
    130 G f 0,119 f 0,009 F 0,367
    131 D g 0,078 g 0,007 g 0,136
    132 G a 0,002 a 0,001 a 0,005
    133 W b 0 a 0,001 a 0,001
    134 N b 0,001 b 0,045 b 0,057
    135 G c 0,001 c 0,045 c 0,057
    136 H d 0,003 d 0,07 d 0,219
    137 S e 0,008 e 0,132 e 0,231
    138 R f 0,025 f 0,357 F 0,231
    139 E g 0,025 g 0,357 g 0,231
    140 K a 0,025 a 0,357 a 0,231
    141 I b 0,028 b 0,357 b 0,231
    142 K c 0,07 c 0,357 c 0,462
    143 P d 0,07 d 0,357 d 0,462
    144 E e 0,998 e 0,997 e 0,974
    145 K f 0,998 f 0,997 f 0,974
    146 E g 0,998 g 0,997 g 0,974
    147 L a 0,998 a 0,997 a 0,974
    148 Q b 0,998 b 0,997 b 0,974
    149 R c 0,998 c 0,997 c 0,974
    150 A d 0,998 d 0,997 d 0,974
    151 K e 0,998 e 0,997 e 0,974
    152 K f 0,998 f 0,997 f 0,974
    153 Q g 0,998 g 0,997 g 0,974
    154 I a 0,998 a 0,997 a 0,974
    155 M b 0,998 b 0,997 b 0,974
    156 K c 0,998 c 0,997 c 0,974
    157 Y d 0,998 d 0,997 d 0,974
    158 K e 0,989 e 0,997 e 0,974
    159 I f 0,896 f 0,997 f 0,974
    160 A g 0,486 g 0,997 g 0,974
    161 I a 0,409 a 0,997 a 0,974
    162 R b 0,274 b 0,997 b 0,974
    163 D c 0,255 c 0,997 c 0,974
    164 V d 0,095 d 0,997 d 0,974
    165 I e 0,025 e 0,871 e 0,974
    166 H f 0,025 f 0,622 f 0,974
    167 Q g 0,025 g 0,496 g 0,974
    168 L a 0,025 a 0,496 a 0,974
    169 D b 0,025 b 0,468 b 0,974
    170 L c 0,005 c 0,111 c 0,974
    171 C d 0,002 d 0,02 d 0,974
    172 S e 0,001 e 0,007 e 0,719
    173 S f 0,001 f 0,003 f 0,482
    174 S g 0,001 g 0,001 g 0,066
    175 G a 0 a a 0,001
  • Ein weiteres Coiled Coil wird in der C-terminalen Hälfte des PHDf-HD-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 180 mit einer kleineren Wahrscheinlichkeit als für die zwei Coiled Coil-Domänen in der N-terminalen Hälfte des Polypeptids vorhergesagt.
  • Beispiel 34: Subzelluläre Lokalisierungsvorhersage der Polypeptid-Sequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.
  • LOCtree ist ein Algorithmus, mit dem man die subzelluläre Lokalisierung und die DNA-Bindungsneigung von Nichtmembranproteinen in nichtpflanzlichen und pflanzlichen Eukaryoten sowie Prokaryoten vorhersagen kann. LOCtree klassifiziert eukaryotische Tierproteine in eine von 5 Subzellklassen, wohingegen pflanzliche Proteine in eine von 6 Klassen und prokaryotische Proteine in eine von 3 Klassen unterteilt werden.
  • LOCtree beschreibt sofern vorhanden auch Vorhersagen, die sich auf folgendes gründen: 1) Kernlokalisierungssignale, die mit dem PredictNLS-Algorithmus ermittelt werden, 2) eine Lokalisierung, die über die in dem Protein befindlichen Prosite-Motiven und Pfam-Domänen hergeleitet wird, und 3) die mit einem Protein einhergehenden SWISS-PROT- Schlüsselwörter. Die Lokalisierung wird in den letzten beiden Fällen mit dem LOCkey-Algorthmus auf Entropie-Basis hergeleitet. Die Software wird an der Universität von Columbia, USA, gehostet. Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines PHDf-HD-Polypeptids nach SEQ ID NO: 180 auf Motiv- und Schlüsselwort-Basis mittels LOCkey:
    Vorhergesagte Lokalisierung Vertrauen Alternative Vorhersage SWISS-PROT Schlüsselwörter die für die Bestimmung der Lokalisierung
    Kern 100 - verwendet wurden Homöobox, DNA-Bindung, Transkriptionsregulation, Kern-Protein, Transkription, Zinkfinger
  • Die Vorhersage eines Kernlokalisierungssignals (NLS) erfolgt beispielsweise mit dem PredictNLS-Algorithmus. Der Algorithmus wird ebenfalls auf dem Server an der Universität von Columbia, USA, gehostet. In der nachstehenden Tabelle ist die Vorhersage des NLS auf dem Polypeptid von SEQ ID NO: 180 mit dem PredictNLS-Algorithmus, gezeigt.
    Generalisiertes Motiv ([KR]{3,5} zwischen 3- und 5-fach K oder R) Hit auf das Polypeptid von SEQ ID NO: 180 Koordinaten auf dem Polypeptid von SEQ ID NO: 180
    K[RK]{3,5}×{11,18}[RK]K×{2,3}K KRRRGSDAATGKSATGPTRRKHKQK 71–95
    [KR]{4}×{20,24}K{1,4}×K KRRRGSDAATGKSATGPTRRKHKQKRK 71–97
  • In der nachstehend gezeigten Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 180), ist die Position des vorhergesagten NLS fett und doppelt unterstrichen gezeigt:
    Figure 02750001
  • Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:
    • • ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Canada gehostet wird;
    • • TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird.
  • Beispiel 35: Klonierung der Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 179
  • Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach den Standardprotokollen durchgeführt, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: (Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterialien und -verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK).
  • Das PHDf-HD-Gen aus Oryza sativa wurde mittels PCR unter Verwendung einer Reis-cDNA-Bank als Matrize, die aus mRNA, extrahiert aus gemischten Pflanzengeweben, synthetisiert wurde. Für die PCR-Amplifikation wurden die Primer prm09687 (SEQ ID NO: 236; Sense: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaataccccagaaaagaaaa-3') und Primer prm09688 SEQ ID NO: 237; revers, komplementär: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgcaaggttaagatgcttt-3'), die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination beinhalten, verwendet. Die PCR erfolgte mittels Hifi-Taq-DNA-Polymerase unter Standard-Bedingungen. Ein PCR-Fragment mit der erwarteten Größe (einschließlich AttB-Spaltstellen) wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden amplifiziert und aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß Gateway-Teminologie – ”entry clone” rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben.
  • Beispiel 36: Expressionsvektorkonstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 179
  • Der die SEQ ID NO: 179 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthält als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 235) aus Reis zur konstitutiven Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::PHDf-HD (18) nach Verfahren des Standes der Technik in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 37: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde unabhängig zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D (Kallusinduktionsmedium) enthielt zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli durch Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man unabhängig den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der jeden einzelnen Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt, und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Beispiel 38: Verfahren bei der phänotypischen Untersuchung
  • 38.1 Aufbau der Untersuchung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Ereignisse, von denen sich die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln, und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Die unter Nichtstressbedingungen gezogenen Pflanzen werden in regelmäßigen Abständen mit Wasser versorgt, so dass gewährleistet war, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend waren, damit die Bedürfnisse der Pflanze, zu wachsen und sich zu entwickeln, erfüllt werden.
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • 38.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtuntersuchung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Ereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, der auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • 38.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Dieser Wert wurde über die am selben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanze ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatte, bestimmt wurde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (Keimpflanze) 3 Wochen nach der Keimung. Die Steigerung der Wurzelbiomasse wird als Steigerung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als maximale Wurzelbiomasse, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wurde) oder als Steigerung des Wurzel/Spross-Index (gemessen als Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im Zeitraum des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Das Gesamtsamengewicht wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamengewicht pro Pflanze und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtzahl Blüten pro Rispe wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtsamenzahl und der Anzahl der reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (als Prozent ausgedrückt) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Screening auf reduzierte Nährstoff-(Stickstoff-)Verfügbarkeit
  • Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe wurden von der Umsetzung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff (N)-Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8mal niedriger, aufwies. Die Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entsprach ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • Beispiel 39: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung transgener Reispflanzen
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD Polypeptid nach SEQ ID NO: 180 kodiert, unter der Kontrolle des GOS2-Promotors für eine konstitutive Expression exprimieren, sind nachstehend aufgeführt.
  • Es kam zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl Rispen, des Gesamtsamenertrags pro Pflanze, der Gesamtanzahl gefüllter Samen, der Gesamtanzahl Samen, des Tausendkorngewichts (TKG) und des Harvest Index der transgenen Pflanzen im Vergleich zu den entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie in Tabelle D7 gezeigt. Tabelle D7: Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD Polypeptid nach SEQ ID NO: 180 kodiert, unter der Kontrolle des GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren.
    Durchschn. % Anstieg in 3 Ereignissen in der T1 Generation
    Anzahl der ersten Rispen 22%
    Gesamtsamenertrag pro Pflanze 30%
    Gesamtanzahl gefüllter Samen 24%
    Gesamtsamenanzahl 24%
    TKG 4%
    Harvest Index 17%
  • Beispiel 40: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung transgener Reispflanzen, die unter reduzierter Nährstoffverfügbarkeit gewachsen waren.
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD Polypeptid nach SEQ ID NO: 180 kodiert, unter der Kontrolle des GOS2-Promotors für eine konstitutive Expression exprimieren, und die unter reduzierter Nährstoffverfügbarkeit gewachsen waren, sind nachstehend aufgeführt.
  • Es kam zu einem signifikanten Anstieg der Biomasse, beim Auftreten von Jungpflanzenvitalität, des Gesamtsamenertrags pro Pflanze, der Gesamtanzahl gefüllter Samen, der Gesamtanzahl Samen, des Tausendkorngewichts (TKG) und des Harvest Index der transgenen Pflanzen im Vergleich zu den entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie in Tabelle D8 gezeigt. Tabelle D8: Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD Polypeptid nach SEQ ID NO: 180 kodiert, unter der Kontrolle des GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren, und die unter reduzierter Nährstoffverfügbarkeit gewachsen waren.
    durchschn. Gesamt % Anstieg (6 Ereignisse in der T2-Generation)
    Biomasse 8%
    Auftreten von Vitalität 20%
    Gesamtsamenertrag pro Pflanze 17%
    Gesamtanzahl gefüllter Samen 12%
    Samenfüllungsrate 3%
    Gesamtanzahl Samen 9%
    TKG 5%
    Harvest Index 9%
  • Beispiel 41: Beispiele für die Transformation anderer Kulturpflanzen
  • Die Transformation von Mais, Weizen, Sojabohne, Raps/Canola-Raps, Luzerne, und Baumwolle erfolgte wie in Beispiel 7 beschrieben
  • Beispiel 42: Beispiele für Screenings bei abiotischem Stress
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen von einer ausgewählten Anzahl Ereignisse wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch erneut gegossen, bis wiederum ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • Salzstress-Screening
  • Die Pflanzen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend wurden die Wachstums- und Ertragsparameter bestimmt, wie für Wachstum unter normalen Bedingungen eingehend beschrieben.
  • VIII. bHLH11-ähnliches (basisches Helix-Loop-Helix 11) Protein
  • Beispiel 43: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten bHLH11-ähnlichen Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, identifiziert. Das Programm wurde zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Matches. Das durch die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure kodierte Polypeptid wurde beispielsweise für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment statistisch vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch die Prozent der Identität gewertet. Die Prozent der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter so eingestellt werden, dass die Stringenz der Suche angepasst wird. Der E-Wert kann beispielsweise erhöht werden, dass weniger stringente Matches gezeigt werden. Auf diese Weise können nahezu exakte Matches identifiziert werden. Die Tabelle E1 stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Tabelle E1: Beispiele für bHLH11-ähnliche Polypeptide:
    Ursprungspflanze Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Triticum aestivum 244 245
    Allium cepa 258 327
    Arabidopsis thaliana 259 328
    Arabidopsis thaliana 260 329
    Arabidopsis thaliana 261 330
    Arabidopsis thaliana 262 331
    Arabidopsis thaliana 263 332
    Aquilegia vulgaris 264 333
    Aquilegia vulgaris 265 334
    Brassica napus 266 335
    Citrus clementina 267 336
    Curcuma longa 268 337
    Citrus paridisi hybrid 269 338
    Citrus sinensis 270 339
    Eucalyptus grandis 271 340
    Eucalyptus grandis 272 341
    Gossypium hirsutum 273 342
    Gossypium hirsutum 274 343
    Gossypium hirsutum 275 344
    Gossypium hirsutum 276 345
    Gossypium hirsutum 277 346
    Gossypium hirsutum 278 347
    Glycine max 279 348
    Glycine max 280 349
    Glycine max 281 350
    Glycine max 282 351
    Gossypium raimondii 283 352
    Helianthus petiolaris 284 353
    Hordeum vulgare 285 354
    Lactuca perennis 286 355
    Nicotiana benthamiana 287 356
    Nicotiana benthamiana 288 357
    Nicotiana benthamiana 289 358
    Nicotiana benthamiana 290 359
    Nicotiana tabacum 291 360
    Oryza sativa 292 361
    Oryza sativa 293 362
    Oryza sativa 294 363
    Oryza sativa 295 364
    Oryza sativa 296 365
    Oryza sativa 297 366
    Oryza sativa 298 367
    Picea abies 299 368
    Populus deltoides 300 369
    Pinus radiata 301 370
    Picea sitchensis 302 371
    Pinus taeda 303 372
    Populus trichocarpa 304 373
    Populus trichocarpa 305 374
    Populus trichocarpa 306 375
    Populus trichocarpa 307 376
    Populus trichocarpa 308 377
    Poncirus trifoliata 309 378
    Ricinus communis 310 379
    Ricinus communis 311 380
    Sorghum bicolor 312 381
    Solanum lycopersicum 313 382
    Solanum lycopersicum 314 383
    Solanum lycopersicum 315 384
    Solanum tuberosum 316 385
    Solanum tuberosum 317 386
    Solanum tuberosum 318 387
    Solanum tuberosum 319 388
    Triticum aestivum 320 389
    Vitis vinifera 321 390
    Vitis vinifera 322 391
    Vitis vinifera 323 392
    Vitis vinifera 324 393
    Zea mays 325 394
    Zea mays 326 395
  • In einigen Fällen wurden verwandte Sequenzen vorläufig zusammengebaut und öffentlich durch Forschungsinstitutionen offenbart, wie The Institute for Genomic Research (TIGR). Die Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank kann zur Identifikation solcher verwandten Sequenzen verwendet werden, und zwar entweder über die Schlüsselwort-Suche oder durch den BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenz.
  • Beispiel 44: Alignment von bHLH11-ähnlichen Polypeptisequenzen
  • Das Alignment von Polypeptid-Sequenzen erfolgte mit dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus des progressiven Alignments beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (wenn Polypeptide einem Alignment unterworfen werden). Um das Alignment weiter zu optimieren, wurden kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt. Die Sequenzkonservierung unter bHLH11-ähnlichen Polypeptiden befand sich im Wesentlichen in der C-terminalen bHLH-Domäne der Polypeptide, wobei die N-terminale Region gewöhnlich hinsichtlich Sequenzlänge und Zusammensetzung variabler ist. Das Alignment der bHLH11-ähnlichen Polypeptide ist in 21 gezeigt.
  • Mit ”CLUSTALX” wurde ein Stammbaum der bHLH11-ähnlichen Polypeptide (22) konstruiert und es wurde ein Dendrogramm berechnet. Das Kreis-Kladogramm wurde mit einem Dendroskop gezeichnet (Huson et al., 2007).
  • Beispiel 45: Berechnung der Gesamtidentitätsprozent zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozent für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Ledion Bitincka gehostete software) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum 62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle E2 für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt. Die Identitätsprozent sind über der Diagonale und die Ähnlichkeitsprozent unter der Diagonale angegeben. SEQ ID NO: 245 ist als TabHLH11 dargestellt.
  • Die Identitätsprozent zwischen den bHLH11-ähnlichen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann nur 20% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 245 betragen. Die Identitätsprozent sind jedoch viel höher, wenn die HLH-Domänen verglichen werden. (Tabelle E3).
  • Figure 02870001
  • Figure 02880001
  • Figure 02890001
  • Figure 02900001
  • Figure 02910001
  • Figure 02920001
  • Figure 02930001
  • Figure 02940001
  • Figure 02950001
  • Figure 02960001
  • Figure 02970001
  • Figure 02980001
  • Figure 02990001
  • Figure 03000001
  • Figure 03010001
  • Figure 03020001
  • Figure 03030001
  • Beispiel 46: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele gemeinsame Proteindomänen und Familien abdecken. Pfam wird am Sanger Institute Server im Vereinigten Königreich gehostet. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
  • Die Ergebnisse des Interpro-Scans der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 245 sind in Tabelle E4 angegeben. Tabelle E4: InterPro-Scan Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 245.
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsname Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NO 245; e-Wert
    InterPro IPR001092 Basischer Helix-Loop-Helix Dimerisierungsregion bHLH
    HMMPfam PF00010.14 Helix-Loop-Helix DNA-Bindungsdomäne T[127–176] 1.6e–06
    HMMSmart SM00353 keine Beschreibung T[132–181] 1.5e–09
    Profil-Scan PS50888 HLH T[120–176] 12.451
    InterPro IPR011598 Helix-Loop-Helix DNA-Bindung
    Superfamilie SSF47459 Helix-Loop-Helix DNA-Bindungsdomäne T[122–195] 1.8e–14
  • Beispiel 47: Topologie-Vorhersage der Polypeptidsequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
  • TargetP 1.1 bestimmt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der N- terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) des sekretorischen Wegs. Die Werte, auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten, und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Wert ist gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und das Verhältnis zwischen den Werten (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Für die Sequenzen, die den Vorhersagen entsprechend eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurde eine Anzahl Parameter ausgewählt, wie Organismus-Gruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussgrenz-Sätze für (kein, vordefinierte Ausschlussgrenz-Sätze, oder verwenderspezifische Ausschlussgrenz-Sätze), und die Berechnung der Vorhersage der Spaltstellen (Ja oder Nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 245 veranschaulicht ist, sind in der Tabelle E5 veranschaulicht. Es wurde die Organismus-Gruppe ”Pflanze” gewählt, es wurden keine Ausschlussgrenzen definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt. Die subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 245 kann das Cytoplasma oder der Kern sein, es wurde kein Transitpeptid vorhergesagt. Tabelle E5: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 245
    Länge (AA) 281
    Chloroplasten-Transitpeptid 0,094
    Mitochondriales Transitpeptid 0,166
    Signalpeptid des sekretorischen Wegs 0,034
    Anderes subzelluläres Ziel 0,855
    Vorhergesagte Lokalisierung /
    Verlässlichkeitsklasse 2
    Vorhergesagte Länge des Transitpeptids /
  • Gemäß der Analysen mit PLOC (Park und Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003) oder mit PSORT (URL: psort.org), hat das Protein den Vorhersagen zufolge eine Kernlokalisierung.
  • Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:
    • • ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Canada gehostet wird;
    • • TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird
  • Beispiel 48: Funktioneller Test für das bHLH11-ähnliche Polypeptid
  • Ein DNA-Bindungstest für AtbHLH6 ist in Dombrecht et al. (2007) angegeben, dieser Ansatz kann für ein beliebiges bHLH11-ähnliches Protein verwendet werden. Kurz gesagt wurde ein 1000-bp Fragment der AtbHLH6 kodierenden Sequenz, die die Codons 285 bis 623 umfasst, aus der genomischen DNA amplifiziert und in den Nhel-BamHI-gespaltenen pTacLCELD6·His Vektor kloniert (Xue, Plant J. 41, 638–649, 2005). Das resultierende Konstrukt kodierte die letzten 338 Aminosäuren von AtbHLH6 (einschließlich der bHLH-Region) im Leseraster mit dem Reporterprotein CelD und einem 6xHis-Tag. Die korrekte Amplifikation und Klonierung wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • Die Bestimmung der Konsensussequenz des MYC2-DNA-Bindungsmotivs und die relative Bindungsaffinität dieser Stellen erfolgte gemäß Xue (2005), wobei eine Fusion eines DNA-Bindungsproteins (DBP) an 6·His-tagged Cellulase D (CELD) sowohl als Mittel für eine Affinitätsreinigung des DBP-DNA Komplexes bei der Auswahl der Bindungsstellen aus einem Pool biotinylierter Oligonukleotide mit statistischer Sequenz als auch als Reporter zur Messung der DNA-Bindungsaktivität dienen kann.
  • Zur Auswahl der Bindungsstellen mittels Cellulosepapier als Affinitätsmatrix wurde DBD-CELD bei Raumtemperatur für 1 Std. mit 20 ng eines Biotin-markierten Bio-RS-Oligo in 40 μl Bindungs-/Waschpuffer (oben beschrieben) mit 1 mM EDTA, 0,25 μg μl–1 poly d(AC-TG), 1 mg ml–1 BSA und 10% Glycerin inkubiert. Bei einer geeigneten Menge rohes DBP-CELD, das zur Selektion der Bindungsstelle verwendet wurde, wurden 20 bis 30% relative Cellulose-Bindungseffizienz (Prozent Cellulose-Aktivität, die nach dem Waschen an Cellullose band) erzielt. DBP-CELD/Bio-RS-Oligo Gemische wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen überführt, welche Whatman 1 Filterpapier (4 mm2) enthielten, das mit 10 μl Blockierungslösung [Bindungs-/Waschpuffer mit 0,5 μg μl–1 poly d(AC-TG) und 10% Glycerin] vorgetränkt wurde. Nach der Inkubation bei 0°C für 1 Std. unter leichtem Schütteln, wurde das Cellulosepapier sechsmal mit Bindungs-/Waschpuffer mit 1 mM EDTA und 0,1 mg ml–1 BSA gemischt. Die Verwendung von ausgiebigem Waschen bei der Auswahl der Zielstelle beruhte auf Beobachtungen der relativ hohen Stabilität des auf der festen Matrix immobilisierten DBP-Oligonukleotid-Komplexes. DBP-CELD tragende Ziel-Bindungsstellen wurden bei 40°C für 15 min mit 40 μl Cellulase-Elutionspuffer [10 mM HEPES, pH-Wert 7, 50 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 4 mM Cellobiose, 0,05 mg ml–1 BSA und 10 μg ml–1 eines sense-sequenzspezifischen Primer SP-S] eluiert. Das Eluat wurde zur PCR-Amplifikation ausgewählter Oligonukleotide verwendet. Das PCR-Produkt (0,1 μl) ohne Reinigung wurde in der nächsten Runde der Stellenselektion verwendet.
  • Alternativ wurde 6·His tagged DBP-CELD (10–25 μg rohes Protein) in 60 μl PNT-Puffer (50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 8,0, 300 mM NaCl und 0,05% Tween 20) mit 10 mM Imidazol und 350 μg Ni-NTA Magnetagaroseperlen (Qiagen) bei Raumtemperatur für 45–60 min unter leichtem Schütteln in einem Micro-Röhrchen-Mischer (Tomy Seiko Co., Tokyo, Japan) inkubiert. Die Ni-NTA Magnetperlen wurden auf der Seite der Röhrchen gesammelt, indem die Röhrchen in einem Magnet für 12 Röhrchen (Qiagen) untergebracht wurden. Ungebundene Proteine wurden durch zweimaliges Waschen mit 150–200 μl PNT mit 20 mM Imidazol und einmal mit 60 μl Bindungs-/Waschpuffer mit 2 mM MgCl2, 1 mg ml–1 BSA und 10% Glycerin entfernt. Die gewaschenen Perlen wurde- in 40 μl of Bindungs-/Waschpuffer mit 2 mM MgCl2, 0,25 μg μl–1 poly d(AC-TG), 1 mg ml–1 BSA, 0,0025% Nonidet P-40, 10% Glycerin und biotin-markierten Oligonukleotiden (50 ng Bio-RS-Oligo oder 1 μl PCR-Produkt, das aus vorher ausgewählten Oligonukleotiden amplifiziert wurde) resuspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Std. unter leichtem Schütteln in dem Mikro-Röhrchen-Mischer inkubiert. Nach viermaligem Waschen (3–4 min bei jedem Waschvorgang) mit 150–200 μl Bindungs-/Waschpuffer mit 2 mM MgCl2, 0,1 mg ml–1 BSA und 0,0025% Nonidet P-40, wurden die Perlen, die das an der Zielstelle gebundene BDP-CELD tragen, in 8 μl 5 mM Tris-Cl (pH-Wert 8,0)/0,5 mM EDTA mit 5 μg ml–1 eines sense-sequenzspezifischen Primers (SP-S) resuspendiert, und die Suspension wurde in ein sauberes Röhrchen überführt und für die PCR-Amplifikation ausgewählter Oligonukleotide verwendet. Das PCR-Produkt (1 μl) wurde ohne Reinigung in der nächsten Runde der Stellenselektion verwendet.
  • Für EMSA Tests wurden 6·His-tagged DBP-CELD Proteine mit Ni-NTA Magnetagaroseperlen mit einem hochstringenten Bindungspuffer (50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 8,0, 1 M NaCl, 10% Glycerin, 1% Tween 20 und 10 mM Imidazol) gereinigt, und der Rest des Verfahrens folgte den Herstellangaben. Doppelsträngige synthetische Oligonukleotide (30–45 fmol), markiert mit Digoxigenin am 3'-Ende, wurde mit einem gereinigten DBP (30–75 ng) in 15 μl Bindungspuffer [25 mM HEPES/KOH, pH-Wert 7,0, 50 mM KCl, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 0,2 μg μl–1 poly d(AC-TG), 0,3 mg ml–1 BSA und 10% Glycerin] inkubiert. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min, wurden die DBP/DNA-Komplexe von freien Sonden auf einem 6% Polyacrylamidgel in einem 40-mM Tris-Acetat-Puffer (pH-Wert 7,5) mit 5 mM Na-Acetat, 0,5 mM EDTA und 5% Glycerin getrennt. Die DBP/DNA-Komplexe und die freien Sonden in den Gelen nach der Elektrophorese wurden auf eine Hybond Nþ-Membran überführt. Alkalische Phosphatase-konjugierter Anti-Digoxigenin-Antikörper und ein chemilumineszierendes Substrat, CDP-Star (Roche Diagnostics) wurde zum Nachweisen von Digoxigenin gemäß den Herstellerangaben verwendet. Weitere Einzelheiten sind in Xue (2005) angegeben.
  • Beispiel 49: Klonierung der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz
  • Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 244 wurde durch PCR mit einer speziell angefertigten cDNA-Bank von Triticum aestivum Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) als Matrize amplifiziert. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase in Standardbedingungen, mit 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm009718 (SEQ ID NO: 254; Sense, Start-Codon in fett):
    5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcggggcanccg-3' und prm009719 (SEQ ID NO: 255; revers, komplementär):
    5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatgggtgttgcagctgctgtt-3',
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls mit Standardverfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines pbHLH11-ähnlichen – gemäß Gateway-Teminologie – ”entry clone” rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben.
  • Der SEQ ID NO: 244 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthält als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 256) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::bHLH11-ähnlich (23) nach fachbekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 50: Pflanzentransformation
  • Die Transformation der Pflanzen erfolgte gemäß dem in Beispiel 7 aufgeführten Verfahren.
  • Beispiel 51: Verfahren bei der phänotypischen Untersuchung
  • 51.1 Aufbau der Untersuchung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Ereignisse, von denen sich die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln, und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Die unter Nichtstressbedingungen gezogenen Pflanzen werden in regelmäßigen Abständen mit Wasser versorgt, so dass gewährleistet war, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend waren, damit die Bedürfnisse der Pflanze, zu wachsen und sich zu entwickeln, erfüllt werden.
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch erneut gegossen, bis wiederum ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • Effizienz-Screening der Stickstoff-Verwerfung
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe werden vom Umsetzen bis zur Reife mit einer spezifischen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wird wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen aufgezeichnet
  • Salzstress-Screening
  • Die Pflanzen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend werden die Wachstums- und Ertragsparameter bestimmt, wie für Wachstum unter normalen Bedingungen eingehend beschrieben.
  • 51.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtuntersuchung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Ereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, der auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • 51.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Dieser Wert wurde über die am selben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanze ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatte, bestimmt wurde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (Keimpflanze) 3 Wochen nach der Keimung. Die Steigerung der Wurzelbiomasse wird als Steigerung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als maximale Wurzelbiomasse, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wurde) oder als Steigerung des Wurzel/Spross-Index (gemessen als Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im Zeitraum des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Für die Bestimmung der Jungpflanzenvitalität wurde die Gesamtzahl der Pixel aus überirdischen Pflanzenteilen vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, die zum gleichen Zeitpunkt aus verschiedenen Winkeln aufgenommen wurden, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in mm2 ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse stammen von Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamengewicht und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtzahl Blüten pro Rispe wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtsamenzahl und der Anzahl der reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (als Prozent ausgedrückt) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 52: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung transgener Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die bHLH11-ähnliche Nukleinsäuresequenz unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind nachstehend aufgeführt. Eine Steigerung von mehr als 5% in mindestens 2 Linien wurde für den Gesamtsamenertrag, die Anzahl gefüllter Samen, Füllungsrate, Harvest-Index, Anzahl der ersten Rispen, und mindestens 3% für das Tausendkorngewicht beobachtet. Die Daten der Gesamtsteigerung (gemessen über alle untersuchten Linien) für jeden Parameter sind in der Tabelle E6 angegeben: Tabelle E6:
    Parameter Gesamtanstieg (%)
    Gesamtgewicht der Samen (Gesamtsamenertrag) 20
    Anzahl gefüllter Samen 20
    Füllungsrate 18
    Harvest Index 21
  • VI. ASR (abszisinsäure-, stress-, und reifungsinduziertes) Protein
  • Beispiel 53: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten ASR Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren verwandt sind, identifiziert. Das Programm wurde zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Matches. Das durch die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure kodierte Polypeptid wurde beispielsweise für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment statistisch vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch die Prozent der Identität gewertet. Die Prozent der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge.
  • Die Tabelle F1 stellt eine Liste von Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen bereit, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Tabelle F1: Beispiele für ASR Nukleinsäuresequenzen und Polypeptide.
    Name Ursprungspflanze Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Orysa_ASR_1 Oryza sativa 396 397
    Zeama_ASR_1 Zea mays 401 402
    Zeama_ASR_2 Zea mays 403 404
    Zeama_ASR_3 Zea mays 405 406
    Zeama_ASR_4 Zea mays 407 408
    Zeama_ASR_5 Zea mays 409 410
    Zeama_ASR_6 Zea mays 411 412
    Zeama_ASR_7 Zea mays 413 414
    Zeama_ASR_8 Zea mays 415 416
    Zeama_ASR_9 Zea mays 417 418
    Lyces_ASR_1 Lycopersicon esculentum 419 420
    Lyces_ASR_2 Lilium longiflorum 421 422
    Sacof_ASR_1 Saccharum officinarum 423 424
    Zeama_ASR_10 Zea mays 425 426
  • Beispiel 54: Alignment von ASR-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment von Polypeptid-Sequenzen erfolgte mit dem AlignX Programm aus dem Vector NTI Package (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus des progressiven Alignments beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (wenn Polypeptide einem Alignment unterworfen werden). Um das Alignment weiter zu optimieren, wurden kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt.
  • Ein Stammbaum der GRP-Polypeptide wird mit einem Neighbour joining clustering Algorithmus wie er in dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird, konstruiert.
  • Beispiel 55: Berechnung der Gesamtidentitätsprozent zwischen ASR-Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozent für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software hosted by Ledion Bitincka) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum 62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Eine MATGAT-Tabelle für lokales Alignment einer spezifischen Domäne oder die Daten bezüglich % Identität/Ähnlichkeit zwischen spezifischen Domänen können ebenfalls erzeugt werden.
  • Beispiel 56: Identifikation von Domänen in ASR-Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele gemeinsame Proteindomänen und Familien abdecken. Pfam wird am Sanger Institute Server im Vereinigten Königreich gehostet. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
  • Die das GRP veranschaulichenden Proteinsequenzen werden als Abfrage zum Durchsuchen der InterPro Datenbank verwendet.
  • Beispiel 57: Topologie-Vorhersage der ASR-Polypeptidsequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
  • TargetP 1.1 bestimmt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) des sekretorischen Wegs. Die Werte, auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten, und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Wert ist am wahrscheinlichsten gemäß TargetP, und das Verhältnis zwischen den Werten (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Für die Sequenzen, die den Vorhersagen entsprechend eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurde eine Anzahl Parameter ausgewählt, wie Organismus-Gruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze) Ausschlussgrenz-Sätze (kein, vordefinierte Ausschlussgrenz-Sätze, oder verwenderspezifische Ausschlussgrenz-Sätze), und die Berechnung der Vorhersage der Spaltstellen (Ja oder Nein).
  • Die das GRP veranschaulichenden Sequenzen werden zur Abfrage von TargetP 1.1 verwendet. Es wurde die Organismus-Gruppe ”Pflanze” gewählt, es wurden keine Ausschlussgrenzen definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt.
  • Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:
    • • ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Canada gehostet wird;
    • • TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird.
  • Beispiel 58: Klonierung einer in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten ASR-Nukleinsäure
  • Klonierung von SEQ ID NO: 396:
  • Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 396, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde durch PCR mit einer speziell angefertigten cDNA-Bank aus Oryza sativa Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) amplifiziert. Die PCR erfolgte mit Hifi Taq DNA-Polymerase in Standard-Bedingungen, mit 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix. Die verwendeten Primer waren prm06442 (SEQ ID NO: 399; Sense, Startcodon in fett):
    5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcggaggagaagca-3' und prm06443 (SEQ ID NO: 400; revers, komplementär):
    5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcggcgacgttgtgatga-3',
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls mit Standardverfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß Gateway-Teminologie – ”entry clone” rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben.
  • Der SEQ ID NO: 396 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthält als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 398) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::GRP (25) in den Agrobacterium Stamm LBA4044 gemäß den Verfahren des Standes der Technik transformiert.
  • Beispiel 59: Pflanzentransformation
  • Die Transformation der Pflanzen erfolgte gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren
  • Beispiel 60: Verfahren bei der phänotypischen Untersuchung
  • 60.1 Aufbau der Untersuchung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Ereignisse, von denen sich die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln, und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Ereignisse wurden weiterhin in der T2-Generation nach dem gleichen Bewertungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis bewertet.
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch erneut gegossen, bis wiederum ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet. Pflanzen, die unter Nicht-Stressbedingungen gewachsen waren, werden in regelmäßigen Abständen mit Wasser versorgt, so dass das Wasser und die Nährstoffe nicht limitierend waren, damit die Bedürfnisse der Pflanzen, das Wachstum und die Entwicklung zu beenden erfüllt wurde.
  • Effizienz-Screening der Stickstoff-Verwertung
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe werden vom Umsetzen bis zur Reife mit einer spezifischen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wird wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen aufgezeichnet.
  • 60.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtuntersuchung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Ereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, der auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist geeignet, um die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Aussagen von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass man den Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen vergleicht.
  • 60.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Dieser Wert wurde über die am selben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten, bestimmt wurde.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamengewicht und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtzahl Blüten pro Rispe wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtsamenzahl und der Anzahl der reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (als Prozent ausgedrückt) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 61: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
  • Die transgenen Reispflanzen, die die GRP-Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 396 unter der Kontrolle des GOS2-Promotors exprimieren, zeigten einen Anstieg von mehr als 5% für das Gesamtgewicht der Samen, Anzahl der gefüllten Samen, und Harvest-Index, wenn sie unter Nichtstress-Bedingungen gewachsen waren.
  • VII. Squamosa-Promotor-Bindungsprotein-ähnlich 11 (SPL11)
  • Beispiel 62: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten SPL11-Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, identifiziert. Die Durchsuchung der Sequenzen erfolgte auch mit anderen öffentlichen und geschützten Datenbanken. Es wurden Datenbanksequenzabfragewerkzeuge verwendet, wie das Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Das Programm wurde zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Matches. Das durch die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure kodierte Polypeptid wurde beispielsweise für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment statistisch vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch die Prozent der Identität gewertet. Die Prozent der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter so eingestellt werden, dass die Stringenz der Suche angepasst wird. Der E-Wert kann beispielsweise erhöht werden, dass weniger stringente Matches gezeigt werden. Auf diese Weise können nahezu exakte Matches identifiziert werden.
  • Die Tabelle G1 stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Die Polypeptide mit einer um einen Punkt und eine Ziffer verlängerten Zugangsnummer veranschaulichen Spleißvarianten. Tabelle G1: Beispiele von SPL11 Nukleinsäuren und Polypeptiden
    Name Alias Ursprungspflanze Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Arath_SPL11a At1g27360 Arabidopsis thaliana 427 428
    Arath_SPL11aa NM_202191 (Spleißvariante) Arabidopsis thaliana 429 428
    Arath_SPL11aaa NM_001084135 Arabidopsis thaliana 430 428
    Arath_SPL11aaaa SEQ ID NO: 1 Variant MiR156 insensitiv Synthetisch 431 428
    Arath_SPL11b At1g27370 Arabidopsis thaliana 432 433
    Arath_SPL11c At5g43270 Arabidopsis thaliana 434 435
    Orysa_SPL11a LOC_Os02g04680 Oryza sativa 436 437
    Orysa_SPL11b LOC_Os06g49010 Oryza sativa 438 439
    Popth_SPL11a Populus SPL11a Populus Art 440 441
    Popth_SPL11b Populus SPL11b Populus Art 442 443
    Popth_SPL11c Populus SPL11c Populus Art 444 445
    Brara_SPL11a Br_AC189413 Brassica rapa 446 447
    Zeama_SPL11a ZM_60752693 Zea mays 448 449
    Zeama_SPL11b ZM_SPL11b Zea mays 450 451
    Triae_SPL11a Ta_SPi11a Triticum aestivum 452 453
    Vitvi_SPL11a Vv_SPL11a Vitis vinifera 454 455
  • Beispiel 63: Alignment von SPL11-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment von Polypeptid-Sequenzen erfolgte mit dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus des progressiven Alignments beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (wenn Polypeptide einem Alignment unterworfen werden). Um das Alignment weiter zu optimieren, wurden kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt. Eine Konsensussequenz, die die hochkonservierten Aminosäuren an jeder Position umfasst, ist angegeben; Leerstellen zwischen bestimmten Aminosäuren in der Konsensussequenz veranschaulichen eine beliebige Aminosäure. Eine hohe Sequenzkonservierung unter SPL11-Polypeptiden wird hauptsächlich entlang der SBP-Domäne der Polypeptide beobachtet. Die Position der anderen konservierten Sequenzmotive außerhalb der SBP-Domäne, die hier durch Motiv 1 bis Motiv 4 (SEQ ID NO: 466 to SEQ ID NO: 472) dargestellt ist, ist über die Konsensussequenz angegeben.
  • Die 28 stellt ein Alignment repräsentativer SPL11 Polypeptide bereit.
  • Beispiel 64: Berechnung der Gesamtidentitätsprozent zwischen SPL11 Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozent für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka 1, Smalley J; software hosted by Ledion Bitincka) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist.
  • Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum 62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Softwareanalyse sind in der Tabelle G2 für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen und in der Tabelle G3 für die SBP-Domäne dargestellt. Die Identitätsprozent sind über der Diagonale und die Ähnlichkeitsprozent unter der Diagonale (normale Schriftsatz) angegeben.
  • Die Identitätsprozent zwischen den SP11-Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann nur 20% Aminosäureidentität gegenüber SEQ ID NO: 428 ausmachen. Gewöhnlich haben die SPL11 Polypeptide eine Gesamt (entlang der Sequenz des gesamten Polypeptids) Sequenzidentität im Bereich von 40%.
  • Die Identitätsprozent zwischen den SBP-Domänen in den SPL11-Polypeptidsequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kann nur 30% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 456 (SBP-Domäne in Arath_SPL11a oder SEQ ID NO: 428) betragen. Die SBP-Domänen in den in Table G1 angegebenen SPL11 Polypeptidsequenzen haben eine Sequenzidentität im Bereich von 31 bis 93,6%. Tabelle G2: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die Volllänge der Polypeptidsequenzen.
    Figure 03220001
    Figure 03230001
    Tabelle G3: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die SBP-Domäne der Polypeptidsequenzen.
    Figure 03230002
  • Beispiel 65: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele gemeinsame Proteindomänen und Familien abdecken. Pfam wird am Sanger Institute Server im Vereinigten Königreich gehostet. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
  • Die Tabelle G4 zeigt die Einstellungen (Gathering cut off, trusted cut off, und noise cut off), wie in der Pfam-Datenbank beschrieben, die zum Aufbau der HMMs_fs für verschiedene SBP-Domänen verwendet wurden. Tabelle G4: HMMs Aufbauinformation in der Domänendatenbank Pfam Version 21.0
    HMMER Aufbau information
    Pfam_Is [Download HMM] Pfam fs [Download HMM]
    Gathering cut off 25.0 25.0; 25.0 25.0
    Trusted cut off 41.4 41.4; 26.2 54.1
    Noise cut off 20.8 20.8; 18.0 11.2
    Aufbauverfahren von HMM hmmbuild -F HMM_Is SEED hmmbuild -f -F HMM_fs SEED
    hmmcalibrate --seed 0 HMM_Is hmmcalibrate --seed 0 HMM_fs
  • Die Ergebnisse des Pfam-Scans für die repräsentativen SPL11-Polypeptide pflanzlichen Ursprungs sind in der Tabelle G5 angegeben. Die Aminosäurekoordinaten für die SBP-Domäne in der Referenzsequenz sind in der entsprechenden Spalte angegeben. Der E-Wert des Alignments ist ebenfalls angegeben. Tabelle G5: Pfam-Scan-Ergebnisse für die SBP-Domäne (Pfam Referenz PF03110) der repräsentativen SPL11-Polypeptide, wie sie auf Pfam Version 21.0 erhalten wurden.
    Sequenzname Aminosäurekoordinaten der SBP Domäne e-Wert des Alignments
    Arath_SPL11a 174–252 1.10E–50
    Arath_SPL11b 175–253 1.61E–47
    Arath_SPL11c 168–246 1.90E–52
    Orysa_SPL11a 181–259 5.10E–50
    Orysa_SPL11b 179–257 3.90E–47
    Popth_SPL11a 170–277 170–277
    Popth_SPL11b 180–277 1.50E–41
    Popth_SPL11c 171–249 7.80E–52
    Brara_SPL11a 180–279 5.20E–44
    Zeama_SPL11a 161–239 2.20E–51
    Zeama_SPL11b 159–237 1.10E–48
    Triae_SPL11a 184–262 2.90E–52
    Vitvi_SPL11a 171–249 7.80E–52
  • Beispiel 66: Klonierung der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz
  • Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR mit einer speziell angefertigten cDNA-Bank von Arabidopsis thaliana Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) als Matrize amplifiziert. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase in Standardbedingungen, mit 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Ein stromaufwärts und ein stromabwärts gelegener Primer nach SEQ ID NO: 473 bzw. SEQ ID NO: 474 wurden zur Amplifikation des kodierenden Bereichs der SPL11 Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 427 durch PCR (Polymerasekettenreaktion) verwendet. Die Primer umfassen die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination zur Erleichterung der Klonierung des amplifizierten PCR DNA-Fragments in einen Gateway-Klonierungsvektor.
  • Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls mit Standard-Verfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß Gateway-Teminologie – ”entry clone” pSPL11 rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben.
  • Der SEQ ID NO: 427 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthält als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 476) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette in dem Vektor pGOS2::SPL11. Die SPL11-kodierende Sequenz wurde auch in einen Expressionsvektor kloniert, der einen WSI18-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 477) für eine (ABA induzierbare) Expression (pWSI18::SPL11) enthielt.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die erhaltenen Expressionsvektoren pGOS2::SPL11 und pWSI18::SPL11 (31) in den Agrobacterium Stamm LBA4044 nach fachbekannten Verfahren transformiert.
  • Beispiel 67: Pflanzentransformation
  • Die Transformation der Pflanzen erfolgte gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren.
  • Beispiel 68: Verfahren bei der phänotypischen Untersuchung
  • 60.1 Aufbau der Untersuchung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Ereignisse, von denen sich die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln, und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Die unter Nichtstressbedingungen gezogenen Pflanzen werden in regelmäßigen Abständen mit Wasser versorgt, so dass gewährleistet war, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend waren, damit die Bedürfnisse der Pflanze, zu wachsen und sich zu entwickeln, erfüllt werden.
  • Vier T1-Ereignisse wurden weiterhin in der T2-Generation nach dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis untersucht. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch erneut gegossen, bis wiederum ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • Effizienz-Screening der Stickstoff-Verwertung
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe werden vom Umsetzen bis zur Reife mit einer spezifischen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wird wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen aufgezeichnet.
  • 68.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtuntersuchung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Ereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, der auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Wenn zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist geeignet, um die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Aussagen von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass man den Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen vergleicht.
  • 68.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Dieser Wert wurde über die am selben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanze ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatte, bestimmt wurde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (Keimpflanze) 3 Wochen nach der Keimung. Die Steigerung der Wurzelbiomasse wird als Steigerung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als maximale Wurzelbiomasse, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wurde) oder als Steigerung des Wurzel/Spross-Index (gemessen als Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im Zeitraum des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Für die Bestimmung der Jungpflanzenvitalität wurde die Gesamtzahl der Pixel aus überirdischen Pflanzenteilen vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, die zum gleichen Zeitpunkt aus verschiedenen Winkeln aufgenommen wurden, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in mm2 ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse stammen von Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Samenparameter-Messungen
  • sDie reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamengewicht und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtzahl Blüten pro Rispe wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtsamenzahl und der Anzahl der reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (als Prozent ausgedrückt) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 69: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung transgener Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Untersuchung der transgenen Reispflanzen, die eine SP11-Nukleinsäure exprimieren, die dem Konstrukt pGOS2::SPL11 und pWSI18::SPL11 entsprechen, sind unabhängig davon, ob sie unter Trockenheitsstress oder unter Nichtstressbedingungen erhalten wurde, hier angegeben. Eine Steigerung von mehr als 5% wurde für einen oder mehrere der folgenden Parameter erhalten, das Auftreten von Jungpflanzenvitalität (Jungpflanzenvitalität der Keimpflanze), den Gesamtsamenertrag (Samengewicht), Samenfüllrate (Samenfüllungsrate), die Anzahl gefüllter Samen, die Anzahl Blüten (Samen) pro Rispe, und Harvest-Index, und mindestens 3% für das Tausendkorn (1000-Samen)-Gewicht in den transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontroll-Nullizygoten-Pflanzen in mindestens einer der Wachstumsbedingungen beobachtet.
  • Zusammenfassung
  • Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen und/oder zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumseigenschaften, bei dem man eine Nukleinsäure, die ein GRP (wachstumsregulierendes Protein) kodiert, in einer Pflanze moduliert. Das GRP ist ausgewählt aus einem Protein mit LOB-Domäne (LOB: Lateral Organ Boundaries, Laterale Organgrenzen), hier abgekürzt als LBD-Polypeptid, einem JMJC (JUMONJI-C)-Polypeptid, einem CKI (Casein Kinase I) Polypeptid, einem bHLH11-ähnlichen (basische Helix-Loop-Helix 11) Protein, einem Pflanzen-Homöodomänen-Finger-Homöodomänen(PHDf-HD) Polypeptid, einem ASR (abszisinsäure-, stress-, und reifungsinduzierten) Polypeptid und/oder einem Squamosa-Promotor-Bindungsprotein-ähnlichen 11 (SPL11) Transkriptionsfaktorpolypeptid. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein GRP kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumseigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch neue GRP-Nukleinsäuren und GRP-Polypeptide, sowie Konstrukte bereit, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • - US 20060218674 [0012]
    • - US 7196245 [0031]
    • - US 7154025 [0040]
    • - EP 1033405 [0044]
    • - US 5811238 [0069]
    • - US 6395547 [0069]
    • - WO 2004/070039 [0074, 0080, 0080, 0080, 0080, 0080, 0080, 0080, 0080, 0080, 0082]
    • - WO 2004/065596 [0074]
    • - US 4962028 [0074]
    • - WO 01/14572 [0074]
    • - WO 95/14098 [0074]
    • - WO 94/12015 [0074]
    • - US 5401836 [0079]
    • - US 20050044585 [0079]
    • - EP 99106056 [0080]
    • - US 5565350 [0088, 0117]
    • - WO 9322443 [0088]
    • - WO 98/53083 [0095]
    • - WO 99/53050 [0095]
    • - US 4987071 [0104]
    • - US 5116742 [0104]
    • - WO 94/00012 [0104]
    • - WO 95/03404 [0104]
    • - WO 00/00619 [0104]
    • - WO 97/13865 [0104]
    • - WO 97/38116 [0104]
    • - WO 98/36083 [0105]
    • - WO 99/15682 [0105]
    • - WO 00/15815 [0117]
    • - EP 1198985 A1 [0120]
    • - US 5164310 [0779]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Wang et al., Planta (2003), 218: 1–14 [0006]
    • - Shuai et al., Plant Physiol. 129, 747–761, 2002 [0012]
    • - Bortiri et al., Plant Cell 18, 574–587, 2006 [0012]
    • - Liu et al., Plant J. 43, 47–56, 2005 [0012]
    • - Inukai et al., Plant Cell 17, 1387–1396, 2005 [0012]
    • - Evans et al., Plant Cell 19, 46–62, 2007 [0012]
    • - Chalfun-Junior et al., Plant Mol. Biol. 57, 559–575, 2005 [0012]
    • - Iwakawa et al., Plant Cell Physiol. 43, 467–478, 2002 [0012]
    • - Yang et al. (Molecular Phylogenetics and Evolution 39, 248–262, 2006) [0012]
    • - Iwakawa et al. (2005) [0012]
    • - Shuai et al. (2002) [0012]
    • - Toyoda et al. 2003 Dev Cell. 5 (1): 85–97. [0016]
    • - Tsukada, Nature. 2006; 439 (7078): 811–6 [0017]
    • - Linke et al. (2004) J. Biol. Chem., Vol. 279, 14391–14397 [0017]
    • - Dann et al; Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99 (24): 15351–15356 [0018]
    • - Trewick et al. EMBO Rep. 2005 (4): 15–20 [0018]
    • - Noh et al. Plant Cell. 2004. 16 (10): 2601–13 [0019]
    • - Hoekstra MF et al., Science 253: Brockman JL et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 89: 9454–9458, 1992 [0022]
    • - Dhillon N und Hoekstra MF, EMBO J 13: 2777–2788, 1994 [0022]
    • - Gross and Anderson, 1998 Cell Signal 10: 699–711 [0022]
    • - Craves und Roach, 1995, J Biol Chem 270: 21689–21694 [0022]
    • - Klimczak und Cashmore AR, 1993. Biochem. J. 293: 283–288 [0023]
    • - Liu et al. 2003, Plant Journal. 36, 189–202 [0023]
    • - Lee et al. 2005 Plant Cell. 17 (10): 2817–2831 [0023]
    • - Lee et al. 2005 [0023]
    • - Liu et al. [0023]
    • - Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109 [0026]
    • - Gao et al. (2006) Bioinformatics 2006, 22 (10): 1286–7 [0026]
    • - Richardt et al. (2007) Plant Phys 143 (4): 1452–1466 [0027]
    • - Bellman & Werr (1992) EMBO J 11: 3367–3374 [0028]
    • - Schindler et al. (1993) Plant J 4: 137–150 [0028]
    • - Halbach et al. (2000) Nucleic Acid Res 28 (18): 3542–3550 [0028]
    • - Halbach et al. (2000) [0029]
    • - Halbach et al. (2000) [0029]
    • - Uberlacker et al. (1996) Plant Cell 8: 349–362 [0030]
    • - Ito et al. (2004) Gene 331: 9–15 [0030]
    • - Toledo-Ortiz et al., Plant Cell 15, 1749–1770, 2003 [0034]
    • - Bailey et al., Plant Cell 15, 2497–2501, 2003 [0034]
    • - Li et al Plant Physiol. 141, 1167–1184, 2006 [0034]
    • - Li et al. (2006) [0034]
    • - Vi et al., Plant Physiol. 138, 2087–2096 [0035]
    • - Iusem et al 1993 Plant Physiol 102: 1353–1354 [0038]
    • - Carrai et al. 2004 Trends Plant Sci 9: 57–59 [0038]
    • - Frankel et al. 2006. Gene Pages 74–83 [0038]
    • - Kalifa et al., 2004a Biochem J 381: 373–378 [0038]
    • - Cakir et al., 2003 Plant Cell 15: 2165–2180 [0038]
    • - Goldgur et al. Plant Physiol. 2007 Feb; 143 (2): 617–28 [0038]
    • - Frankel et al. Plant Mol Biol. 2007 Mar; 63 (5): 719–30 [0039]
    • - Kalifa et al. 2004 Biochem J. 2004 Jul 15; 381 (Pt 2): 373–8 [0039]
    • - Rom et al. 2006. Biochimie. 88 (6): 621–8 [0039]
    • - Goldgur et al. 2007. Plant Physiol. Feb; 143 (2): 617–28 [0039]
    • - Yang et al. 2005. Plant Physiol 139: 836–846 [0040]
    • - Klein et al. (1996) Mol Gen Genet 259: 7–16 [0042]
    • - Cardon et al. (1999) Gene 237: 91–104 [0042]
    • - Yamasaki et al. (2004) J Mol Biol 337: 49–63 [0042]
    • - Rhoades et al. (2002) Cell 110: 513–520 [0042]
    • - Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109 [0043]
    • - Cardon et al. (1999) [0043]
    • - Cardon et al. (1997) Plant J 12: 367–377 [0044]
    • - Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) [0054]
    • - Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003 [0056]
    • - Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984 [0062]
    • - Sambrook et al., (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York [0066]
    • - Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen) [0066]
    • - Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25 [0067]
    • - Castle et al., (2004), Science 304 (5674): 1151–4 [0069]
    • - Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994 [0072]
    • - McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990 [0074]
    • - Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985 [0074]
    • - Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997 [0074]
    • - Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992 [0074]
    • - Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25 (5): 837–43, 1994 [0074]
    • - Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992 [0074]
    • - Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988 [0074]
    • - An et al., Plant J. 10 (1); 107–121, 1996 [0074]
    • - Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443 [0074]
    • - Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (5): 2553 [0074]
    • - Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696 [0074]
    • - Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696 [0074]
    • - Shaw et al., (1984), Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831–7846 [0074]
    • - Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108 [0077]
    • - Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27 (2): 237–48 [0079]
    • - Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341) [0079]
    • - Xiao et al., 2006 [0079]
    • - Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161 (2): 337–346 [0079]
    • - Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987 [0079]
    • - Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991 [0079]
    • - Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988 [0079]
    • - Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990 [0079]
    • - Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993 [0079]
    • - Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128 [0079]
    • - Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139) [0079]
    • - Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139) [0079]
    • - Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991 [0079]
    • - Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420) [0079]
    • - W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA [0079]
    • - Wang et al., 2002, Plant Sci. 163: 273 [0079]
    • - Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625) [0079]
    • - Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265) [0079]
    • - Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) [0080]
    • - Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985 [0080]
    • - Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987 [0080]
    • - Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990 [0080]
    • - Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992 [0080]
    • - Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988 [0080]
    • - Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986 [0080]
    • - Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987 [0080]
    • - Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14 (3): 323–32, 1990 [0080]
    • - Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996 [0080]
    • - Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989 [0080]
    • - Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997 [0080]
    • - EMBO J. 3: 1409–15, 1984 [0080]
    • - Diaz et al., (1995), Moll Gen. Genet. 248 (5): 592–8 [0080]
    • - Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999 [0080]
    • - Plant J. 4: 343–55, 1993 [0080]
    • - Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996 [0080]
    • - Mena et al., The Plant Journal, 116 (1): 53–62, 1998 [0080]
    • - Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998 [0080]
    • - Wu et al., Plant Cell Physiology 39 (8) 885–889, 1998 [0080]
    • - Wu et al., Plant Cell Physiology 39 (8) 885–889, 1998 [0080]
    • - Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996 [0080]
    • - Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997 [0080]
    • - Trans. Res. 6: 157–68, 1997 [0080]
    • - Plant J. 12: 235–46, 1997 [0080]
    • - DeRose et al., Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996 [0080]
    • - Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999 [0080]
    • - Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998 [0080]
    • - Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992 [0080]
    • - Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992 [0080]
    • - Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991 [0080]
    • - Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992 [0080]
    • - Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994 [0080]
    • - Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994 [0080]
    • - Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998 [0080]
    • - Takaiwa et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 208: 15–22 [0080]
    • - Takaiwa et al., (1987), FERS Letts. 221: 43–47 [0080]
    • - Matzke et al., (1990), Plant Mol. Biol. 14 (3): 323–32 [0080]
    • - Colot et al., (1989), Mol. Gen. Genet. 216: 81–90 [0080]
    • - Anderson et al., (1989), NAR 17: 461–2 [0080]
    • - Albani et al., (1997), Plant Cell 9: 171–184 [0080]
    • - Rafalski et al., (1984), EMBO 3: 1409–15 [0080]
    • - Diaz et al., (1995), Mol. Gen. Genet. 248 (5): 592–8 [0080]
    • - Cho et al., (1999), Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62 [0080]
    • - Muller et al., (1993), Plant J. 4: 343–55 [0080]
    • - Sorenson et al., (1996), Mol. Gen. Genet. 250: 750–60 [0080]
    • - Mena et al., (1998), Plant J. 116 (1): 53–62 [0080]
    • - Onate et al., (1999), J. Biol. Chem. 274 (14): 9175–82 [0080]
    • - Vicente-Carbajosa et al., (1998), Plant J. 13: 629–640 [0080]
    • - Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39 (8) 885–889 [0080]
    • - Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39 (8) 885–889 [0080]
    • - Nakase et al., (1997), Plant Molec. Biol. 33: 513–522 [0080]
    • - Russell et al., (1997), Trans. Res. 6: 157–68 [0080]
    • - Opsahl-Ferstad et al., (1997), Plant J. 12: 235–46 [0080]
    • - DeRose et al., (1996), Plant Mol. Biol. 32: 1029–35 [0080]
    • - Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996 [0080]
    • - Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999 [0080]
    • - Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992 [0080]
    • - Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991 [0080]
    • - Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992 [0080]
    • - Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994 [0080]
    • - Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994 [0080]
    • - Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998 [0080]
    • - Fukavama et al., 2001 [0082]
    • - Kausch et al., 2001 [0082]
    • - Liu et al., 2003 [0082]
    • - Nomura et al., 2000 [0082]
    • - Panguluri et al., 2005 [0082]
    • - Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122 [0083]
    • - Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13 (2): 303–318 [0083]
    • - Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395–4405 [0090]
    • - Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183–1200 [0090]
    • - The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N. Y. (1994) [0090]
    • - Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641 [0103]
    • - Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148 [0103]
    • - Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215, 327–330 [0103]
    • - Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585–591 [0104]
    • - Bartel and Szostak (1993) Science 261, 1411–1418 [0104]
    • - Angell and Baulcombe ((1999) Plant J 20 (3): 357–62 [0105]
    • - Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992 [0107]
    • - Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992 [0107]
    • - Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005 [0111]
    • - Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006 [0111]
    • - Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267 [0116]
    • - Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566 [0116]
    • - Krens, F. A. et al., (1982), Nature 296, 72–74 [0120]
    • - Negrutiu I et al., (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373 [0120]
    • - Shillito R. D. et al., (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102 [0120]
    • - Crossway A et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185 [0120]
    • - Klein TM et al., (1987), Nature 327: 70 [0120]
    • - Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743 [0120]
    • - Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996 [0120]
    • - Chan et al., (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993 [0120]
    • - Hiei et al., (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994 [0120]
    • - Ishida et al., (Nat. Biotechnol. 14 (6): 745–50, 1996 [0120]
    • - Frame et al. (Plant Physiol. 129 (1): 13–22, 2002 [0120]
    • - B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 [0120]
    • - Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225 [0120]
    • - Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711 [0120]
    • - Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 [0120]
    • - F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 [0120]
    • - Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289 [0121]
    • - Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289 [0121]
    • - Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370 [0121]
    • - Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199 [0121]
    • - Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743 [0121]
    • - Klaus et al., 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] [0121]
    • - Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 [0121]
    • - Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28 [0121]
    • - Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225–229 [0121]
    • - Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353 [0122]
    • - Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82 [0123]
    • - Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172 [0123]
    • - Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods an Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104 [0123]
    • - McCallum et al., (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5 (2): 145–50 [0123]
    • - Offringa et al. (1990) EMBO J 9 (10): 3077–84 [0124]
    • - Terada et al. (2002) Nat Biotech 20 (10): 1030–4 [0124]
    • - Iida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15 (2): 132–8 [0124]
    • - Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007 [0124]
    • - Yang et al., 2006 [0136]
    • - Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985 [0136]
    • - Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864 [0140]
    • - Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244 [0140]
    • - Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318 [0140]
    • - Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; [0140]
    • - Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004) [0140]
    • - Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002) [0140]
    • - Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003) [0140]
    • - Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453 [0141]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10 [0141]
    • - Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. [0141]
    • - Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York [0142]
    • - Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols [0142]
    • - Yang et al., 2006 [0153]
    • - Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985 [0153]
    • - Yang et al., 2006 [0157]
    • - Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985 [0157]
    • - Yang et al., 2006 [0160]
    • - Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985 [0160]
    • - Yang et al., 2006 [0163]
    • - Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985 [0163]
    • - Yang et al., 2006 [0166]
    • - Hasegawa et al., J. Mol. Evol. 22, 160–174, 1985 [0166]
    • - Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg. [0167]
    • - Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14 [0177]
    • - Rabbani et al., (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767 [0177]
    • - S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer [0196]
    • - Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual [0210]
    • - Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181 [0210]
    • - Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 [0210]
    • - Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 [0211]
    • - Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 [0212]
    • - Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154 [0213]
    • - Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20 [0213]
    • - Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96 [0214]
    • - CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332 [0214]
    • - Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080 [0214]
    • - Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671 [0214]
    • - Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28 [0214]
    • - Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807 [0214]
    • - Clissold et al. Trends Biochem Sci. 2001 Jan; 26 (1): 7–9 [0220]
    • - Finn et al. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247–D251 [0221]
    • - Balciunas und Ronne. Trends Biochem Sci 2000; 25: 274–276 [0228]
    • - Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59 [0231]
    • - Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864 [0232]
    • - Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244 [0232]
    • - Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318 [0232]
    • - Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motives und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park [0232]
    • - Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004) [0232]
    • - Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002) [0232]
    • - Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003) [0232]
    • - Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453 [0233]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10 [0233]
    • - Campanella et al., BMC Bioinformatics. Juli 2003, 10; 4:29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. [0233]
    • - Lavaissiere et al. J Clin Invest. 1996; 98 (6): 1313–23 [0234]
    • - Linke et al. J Biol Chem. 2004; 279 (14): 14391–7 [0234]
    • - Lee, et al. J. Biol. Chem. 278: 7558–7563; 2003 [0234]
    • - Lando et al. Genes Dev. 16: 1466–1471; 2002 [0234]
    • - Trewick et al. 2005 [0234]
    • - Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59 [0242]
    • - Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59 [0246]
    • - Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59 [0249]
    • - Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59 [0252]
    • - Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235 (9): 2449–59 [0258]
    • - Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg [0259]
    • - Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14 [0269]
    • - Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767 [0269]
    • - Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual [0302]
    • - Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181 [0302]
    • - Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 [0302]
    • - Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 [0303]
    • - Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 [0304]
    • - Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154 [0305]
    • - Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20 [0305]
    • - Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96 [0306]
    • - CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332 [0306]
    • - Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080 [0306]
    • - Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671 [0306]
    • - Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28 [0306]
    • - Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807 [0306]
    • - Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864 [0312]
    • - Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244 [0312]
    • - Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318 [0312]
    • - Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences Motivs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park [0312]
    • - Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004) [0312]
    • - Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002) [0312]
    • - Gasteiger et al., ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003) [0312]
    • - Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) [0313]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) [0313]
    • - Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. [0313]
    • - Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg. [0332]
    • - Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14 [0342]
    • - Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767 [0342]
    • - Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual [0373]
    • - Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181 [0373]
    • - Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 [0373]
    • - Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 [0374]
    • - Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 [0375]
    • - Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154 [0376]
    • - Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20 [0376]
    • - Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96 [0377]
    • - CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332 [0377]
    • - Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080 [0377]
    • - Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671 [0377]
    • - Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28 [0377]
    • - Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807 [0377]
    • - Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864 [0386]
    • - Letunic et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244 [0386]
    • - Mulder et al. (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318 [0386]
    • - Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61 [0386]
    • - AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004) [0386]
    • - Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002) [0386]
    • - Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003) [0386]
    • - Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453 [0387]
    • - Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10 [0387]
    • - Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. [0387]
    • - Gasteiger E et al. (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31: 3784–3788 [0388]
    • - Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1 und 2, Ausubel et al. (1994) [0391]
    • - Korfhage et al. (1994) Plant C 6: 695–708 [0391]
    • - Schindler et al. (1993) Plant J 4 (1): 137–150 [0391]
    • - Halbach et al. (2000) Nucleic Acid Res 28 (18): 3542–3550 [0391]
    • - Viola & Gonzalez (May 26, 2007) Biochemistry [0391]
    • - Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds. [0416]
    • - Wang et al., (Planta (2003), 218: 1–14 [0427]
    • - Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767 [0427]
    • - Frink et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (4): 1175–1180 [0430]
    • - Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual [0462]
    • - Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181 [0462]
    • - Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 [0462]
    • - Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 [0463]
    • - Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 [0464]
    • - Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154 [0465]
    • - Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20 [0465]
    • - Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96 [0466]
    • - CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332 [0466]
    • - Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080 [0466]
    • - Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671 [0466]
    • - Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28 [0466]
    • - Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807 [0466]
    • - Li et al. (2006) [0473]
    • - Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864 [0474]
    • - Letunic et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244 [0474]
    • - Mulder et al. (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318 [0474]
    • - Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park [0474]
    • - Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004) [0474]
    • - Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002) [0474]
    • - Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003) [0474]
    • - Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453 [0475]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10 [0475]
    • - Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10;4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. [0475]
    • - Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147 (1); 195–7 [0475]
    • - Li et al. (2006) [0484]
    • - Li et al. (2006) [0488]
    • - Li et al. (2006) [0491]
    • - Li et al. (2006) [0494]
    • - Li et al. (2006) [0497]
    • - Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg. [0498]
    • - Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14 [0508]
    • - Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767 [0508]
    • - Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual [0540]
    • - Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181 [0540]
    • - Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 [0540]
    • - Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 [0541]
    • - Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 [0542]
    • - Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154 [0543]
    • - Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20 [0543]
    • - Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96 [0544]
    • - CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332 [0544]
    • - Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080 [0544]
    • - Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671 [0544]
    • - Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28 [0544]
    • - Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807 [0544]
    • - Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864 [0550]
    • - Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244 [0550]
    • - Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318 [0550]
    • - Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motives and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park [0550]
    • - Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004) [0550]
    • - Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002) [0550]
    • - Gasteiger et al., ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003) [0550]
    • - Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453 [0551]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mob. Biol. 215: 403–10 [0551]
    • - Campanella et al., BMC Bioinformatics. Juli 2003, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. [0551]
    • - Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14 [0583]
    • - Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767 [0583]
    • - Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual [0614]
    • - Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181 [0614]
    • - Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 [0614]
    • - Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 [0615]
    • - Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 [0616]
    • - Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154 [0617]
    • - Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20 [0617]
    • - Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96 [0618]
    • - CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332 [0618]
    • - Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080 [0618]
    • - Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671 [0618]
    • - Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28 [0618]
    • - Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807 [0618]
    • - Finn et al. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247–D251 [0629]
    • - Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864 [0639]
    • - Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244 [0639]
    • - Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318 [0639]
    • - Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park [0639]
    • - Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004) [0639]
    • - (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002) [0639]
    • - Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003) [0639]
    • - Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453 [0640]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mob. Biol. 215: 403–10 [0640]
    • - Campanella et al., BMC Bioinformatics. Juli 2003, 10;4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. [0640]
    • - Klein at al. Mol Gen Genet. 1996, 15; 250 (1): 7–16 [0641]
    • - Yamasaki et al. 2004 J Mol Biol. 2004, 12; 337 (1): 49–63 [0641]
    • - Griffiths-Jones et al. 2006 Nucleic Acids Research, 2006, Bd. 34, Database issue D140–D144 [0650]
    • - Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14 [0678]
    • - Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767 [0678]
    • - Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual [0712]
    • - Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181 [0712]
    • - Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 [0712]
    • - Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 [0713]
    • - Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 [0714]
    • - Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154 [0715]
    • - Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20 [0715]
    • - Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96 [0716]
    • - CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332 [0716]
    • - Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080 [0716]
    • - Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671 [0716]
    • - Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28 [0716]
    • - Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807 [0716]
    • - Huson et al. BMC Bioinformatics 2007 [0742]
    • - Xie et al. Plant Physiology, 2006, Vol. 142, pp. 280–293 [0749]
    • - Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York [0754]
    • - in Bd. 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standard-Materialien und Verfahren zur molekularen Arbeit an der Pflanze sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) [0754]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0755]
    • - Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0755]
    • - Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500 [0757]
    • - BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete software [0759]
    • - Hua & Sun, Bioinformatics 17, 721–728, 2001 [0769]
    • - Liu et al (2005) [0769]
    • - Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994 [0776]
    • - Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 [0777]
    • - Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6): 745–50 [0778]
    • - Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188 [0780]
    • - McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847 [0781]
    • - Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) [0781]
    • - Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659 [0781]
    • - McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847 [0781]
    • - Murashige and Skoog, 1962 [0781]
    • - Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0795]
    • - Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0795]
    • - Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882 [0798]
    • - Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500 [0798]
    • - BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software [0799]
    • - Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0823]
    • - Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0823]
    • - Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882 [0825]
    • - Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500 [0825]
    • - BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software [0827]
    • - Nagata et al. Int. Rev. Cytol. 132, 1–30, 1992 [0839]
    • - Vos et al., Nucleic Acids Res. 23 (21) 4407–4414, 1995 [0841]
    • - Bachem et al., Plant J. 9 (5) 745–53, 1996 [0841]
    • - Vos et al., 1995 [0841]
    • - Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17) 3389–3402 1997 [0842]
    • - Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0859]
    • - Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0859]
    • - Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882 [0862]
    • - Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500 [0862]
    • - BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software [0864]
    • - Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York [0882]
    • - Band 1 und 2 von Ausubel et al., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterialien und -verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) [0882]
    • - Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994 [0888]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0903]
    • - Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0903]
    • - Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882 [0905]
    • - Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500 [0905]
    • - Huson et al., 2007 [0906]
    • - BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Ledion Bitincka gehostete software [0907]
    • - Park und Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003 [0917]
    • - psort.org [0917]
    • - Dombrecht et al. (2007) [0919]
    • - Xue, Plant J. 41, 638–649, 2005 [0919]
    • - Xue (2005) [0920]
    • - Xue (2005) [0923]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0939]
    • - Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0939]
    • - Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882 [0941]
    • - Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500 [0941]
    • - BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software hosted by Ledion Bitincka [0943]
    • - Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0967]
    • - Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0967]
    • - Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882 [0969]
    • - Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500 [0969]
    • - (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka 1, Smalley J; software hosted by Ledion Bitincka [0971]

Claims (169)

  1. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, moduliert wird, wobei das LBD-Polypeptid eine DUF206-Domäne umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das LBD-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 1: MSCNGCRXLRKGCX (SEQ ID NO: 5), (ii) Motiv 2: QXXATXFXAKFXGR (SEQ ID NO: 6), (iii) Motiv 3: FXSLLXEAXG (SEQ ID NO: 7)
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
  4. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
  5. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle A1 angegebenen Proteine kodiert.
  6. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerte Biomasse und/oder gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfasst.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis, verknüpft ist.
  10. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, stammt.
  11. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eines der folgenden Merkmale: (v) eine Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 69; (vi) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, das zu einer der in (i) angegebenen SEQ ID NOs komplementär ist; (vii) eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 70 aufweist; (viii) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer der in (i), (ii) oder (iii) oben abgegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
  12. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (iii) eine Aminosäuresequenz, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 70 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist. (iv) Derivate von einer der in (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
  13. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein LBD-Polypeptid kodiert.
  14. Konstrukt, umfassend: (iv) eine Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid nach den Ansprüchen 1, 2 oder 12 kodiert; (v) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (vi) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  15. Konstrukt nach Anspruch 14, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2- Promotor aus Reis, ist.
  16. Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 14 oder 15 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  17. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Anspruch 14 oder 15 transformiert ist.
  18. Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (iii) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 12 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (iv) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  19. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer gesteigerten Expression einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 12 kodiert, ergibt, oder eine Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
  20. Transgene Pflanze nach Anspruch 13, 17 oder 19, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
  21. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 19, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
  22. Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 19 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 20 stammen.
  23. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein LBD-Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags, vorzugsweise Steigerung des Samenertrags und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  24. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, moduliert wird, wobei das JMJC-Polypeptid eine JmjC-Domäne umfasst.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die JmjC-Domäne durch eine Sequenz veranschaulicht wird, die in steigender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, oder mehr Sequenzidentität aufweist zu: (iii) SEQ ID NO: 78; und/oder (iv) einer der JmjC-Domänen, die sich in den JMJC-Polypeptiden befinden, die durch SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 110; SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 114; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 132; und SEQ ID NO: 134 veranschaulicht werden, deren Aminosäurekoordinaten in der Tabelle B4 angegeben sind.
  26. Verfahren nach Anspruch 24 und Anspruch 25, wobei das JMJC-Polypeptid ein Motiv umfasst, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität aufweist zu einer Sequenz von: (v) SEQ ID NO: 79, (vi) SEQ ID NO: 80, (vii) SEQ ID NO: 81, (viii) SEQ ID NO: 82;
  27. Verfahren nach Anspruch 24 oder 26, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei es sich bei der modulierten Expression um eine erhöhte Expression handelt.
  29. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei die Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle B1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle B1 angegebenen Proteine kodiert.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Nukleinsäure SEQ ID NO: 74 kodiert.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 to 31, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerten Harvest-Index und/oder Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 32, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale Jungpflanzenvitalität im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 33, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  35. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 33, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Wachstumsbedingungen eines leichten Trockenheitsstress erhalten werden.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 33, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangel-Wachstumsbedingungen erhalten werden.
  37. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 36, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis verknüpft ist.
  38. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 37, wobei die Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
  39. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 38 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die JMJC-Polypeptid kodiert.
  40. Konstrukt, umfassend: (iv) eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid nach den Ansprüchen 24 bis 26 kodiert; (v) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäure von (i) steuern können; und gegebenenfalls (vi) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  41. Konstrukt nach Anspruch 40, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
  42. Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 40 oder 41 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  43. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Anspruch 40 oder 41 transformiert ist.
  44. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (iii) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid nach Anspruch 24 bis 26 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (iv) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  45. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität beim Keimling und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus der gesteigerten Expression einer Nukleinsäure ergibt, die ein JMJC-Polypeptid nach Anspruch 24 bis 26 kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
  46. Transgene Pflanze nach Anspruch 39, 43 oder 45, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
  47. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 46, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
  48. Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 46 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 47 stammen.
  49. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags, insbesondere bei der Steigerung des Samenertrags und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  50. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eines der folgenden Merkmale: (v) eine Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 169; (vi) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, das zu SEQ ID NO: 169 komplementär ist; (vii) eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 170 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; (viii) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an eine der in (i), (ii) oder (iii) oben angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
  51. Isoliertes Polypeptidmolekül, umfassend: (iii) eine Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 170 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; (iv) Derivate von einer der in (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
  52. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei der man die Expression einer Nukleinsäure, die eine Caseinkinase I (CKI) kodiert, in einer Pflanze moduliert, wobei die CKI aus SEQ ID NO: 174 oder einem Orthologon oder Paralogon davon ausgewählt ist.
  53. Verfahren nach Anspruch 52, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die das CKI-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
  54. Verfahren nach Anspruch 52 oder 53, wobei die Nukleinsäure, die das CKI-Polypeptid kodiert, ein Abschnitt von SEQ ID NO: 173, oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
  55. Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 54, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 174 kodiert.
  56. Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 55, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale eine gesteigerte Jungpflanzenvitalität und/oder gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerte Biomasse und/oder gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  57. Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 56, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  58. Verfahren nach einem der Ansprüche 52 to 56, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter abiotischen Stressbedingungen erhalten werden.
  59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei die abiotischen Stressbedingungen ausgewählt sind aus einer oder mehreren Bedingungen von Trockenheitsstress, Salzstressbedingungen, und Stickstoffmangelbedingungen.
  60. Verfahren nach einem der Ansprüche 53 bis 59, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor verknüpft ist.
  61. Verfahren nach einem der Ansprüche 53 bis 60, wobei der samenspezifische Promotor ein WSI18-Promotor, vorzugsweise ein WSI18-Promotor aus Reis, ist.
  62. Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 61, wobei die Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze stammt.
  63. Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 62, wobei die Ursprungspflanze vorzugsweise eine dikotyle Pflanze ist, weiter bevorzugt aus der Familie der Solanaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Nicotiana tabacum.
  64. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 63 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein CKI-Polypeptid kodiert.
  65. Konstrukt, umfassend: (iv) eine Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid nach Anspruch 52 kodiert; (v) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (vi) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  66. Konstrukt nach Anspruch 65, wobei eine der Kontrollsequenzen ein samenspezifischer Promotor, vorzugsweise ein WSI18-Promotor, ist.
  67. Konstrukt nach Anspruch 65, wobei einer der samenspezifischen Promotoren ein WSI18-Promotor, am stärksten bevorzugt ein WSI18-Promotor aus Reis, ist.
  68. Verwendung eines Konstrukts nach einem der Ansprüche 65 bis 67 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität, gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  69. Pflanze, Pflanzenteil, oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach einem der Ansprüche 65 bis 67 transformiert sind.
  70. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem gesteigerten Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (iii) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid nach Anspruch 52 kodiert, in eine(r) Pflanze; and (iv) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  71. Transgene Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität, gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer gesteigerten Expression einer Nukleinsäure ergibt, die ein CKI-Polypeptid nach Anspruch 52 kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
  72. Transgene Pflanze nach Anspruch 64, 69 oder 71, oder eine davon stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
  73. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 72, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
  74. Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 72, und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 73 stammen.
  75. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein CKI-Polypeptid kodiert, zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, insbesondere zur Steigerung von einem oder mehreren Merkmalen von Jungpflanzenvitalität, Samenertrag und Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  76. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen, vorzugsweise zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Pflanzen-Homöodomänen-Finger-Homöodomänen-(plant homeodomain finger-homeodomain (PHDf-HD))-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert, vorzugsweise gesteigert wird, wobei das PHDf-HD-Polypeptid umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Leucin-Zipper/Pflanzen-Homöodomänen-Finger (ZIP/PHDf)-Domäne, wie sie durch SEQ ID NO: 233 veranschaulicht wird; und (ii) eine Domäne mit mindestens 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Homöodomäne (HD) wie sie durch SEQ ID NO: 234 veranschaulicht wird, und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen.
  77. Verfahren nach Anspruch 76, wobei das PHDf-HD-Polypeptid umfasst: (i) eine PHD-Domäne wie sie durch PFAM00628 veranschaulicht ist; und (ii) eine HD wie sie durch PFAM00046 veranschaulicht wird.
  78. Verfahren nach Anspruch 76 oder 77, wobei das PHDf-HD-Polypeptid bei der Verwendung zur Konstruktion eines HD-Stammbaums, wie in 13 gezeigt, eher mit der PHDf-HD Gruppe von Polypeptiden, umfassend die Polypeptidsequenz wie sie in SEQ ID NO: 180 veranschaulicht ist, Cluster bildet, als mit einer anderen HD-Gruppe.
  79. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 78, wobei das PHDf-HD-Polypeptid in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu dem PHDf-HD-Polypeptid wie es durch SEQ ID NO: 180 veranschaulicht ist oder zu einer der in Tabelle D1 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen aufweist.
  80. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 79, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, durch eine der in Tabelle D1 angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NOs oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die mit eine der in Tabelle D1 angegebenen Nukleinsäuresequenz SEQ ID NOs hybridisieren kann, veranschaulicht ist.
  81. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 80, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle D1 angegebenen SEQ ID NOs kodiert.
  82. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 81, wobei die modulierte, vorzugsweise gesteigerte, Expression durch eine oder mehrere von T-DNA activation tagging, TILLING, oder homologer Rekombination herbeigeführt wird.
  83. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 82, wobei die gesteigerte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
  84. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 83, wobei die Ertragsmerkmale Samenertragsmerkmale sind, umfassend eines oder mehrere der folgenden Merkmale: (i) erhöhte Anzahl Primärrispen; (ii) gesteigertes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) gesteigerte Anzahl (gefüllter) Samen; (iv) gesteigertes TKG; oder (v) gesteigerter Harvest-Index.
  85. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 84, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem konstitutiven Pflanzenpromotor, stärker bevorzugt einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis verknüpft ist.
  86. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 85, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poacae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, stammt.
  87. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 86 erhältlich sind, wobei die Pflanze, ein Teil oder eine Zelle davon, ein isoliertes Nukleinsäure-Transgen umfasst, das ein PHDf-HD Polypeptid kodiert, und das funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verknüpft ist.
  88. Konstrukt, umfassend: (iv) eine Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD Polypeptid nach einem der Ansprüche 76 bis 81 kodiert; (v) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) steuern können; und gegebenenfalls (vi) eine Transkriptionsterminationssequenz. wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Pflanzenpromotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, ist.
  89. Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 87 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmale ein oder mehrere der folgenden Merkmale sind: (i) erhöhte Anzahl Primärrispen; (ii) gesteigertes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) gesteigerte Anzahl (gefüllter) Samen; (iv) gesteigertes TKG; oder (v) gesteigerter Harvest-Index.
  90. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Anspruch 87 oder 88 transformiert ist.
  91. Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (iii) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD Polypeptid nach einem der Ansprüche 76 bis 81 kodiert, in eine(r) Pflanze, eine(m) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzezelle unter der Kontrolle eines konstitutiven Pflanzenpromotors; und (iv) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  92. Transgene Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise verbesserten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer modulierten, vorzugsweise gesteigerten Expression einer Nukleinsäuresequenz ergibt, die ein PHDf-HD Polypeptid nach einem der Ansprüche 76 bis 81 kodiert, die funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verknüpft ist, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
  93. Transgene Pflanze nach Anspruch 87, 90 oder 92, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
  94. Erntefähige Teile, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid kodiert, einer Pflanze nach Anspruch 93, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
  95. Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 93 und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 94 stammen.
  96. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHDf-HD-Polypeptid nach einem der Ansprüche 76 bis 81 kodieren, bei der Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, vorzugsweise Samenertragsmerkmalen, umfassend eines oder mehrere der folgenden Merkmale: (i) gesteigerte Anzahl Primärrispen; (ii) gesteigertes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) gesteigerte Anzahl (gefüllter) Samen; (iv) gesteigertes TKG; oder (v) gesteigerter Harvest-Index.
  97. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eines der folgenden Merkmale: (v) eine Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 242; (vi) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, das zu SEQ ID NO: 242 komplementär ist; (vii) eine Nukleinsäure, die ein JMJC-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindesten 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 243 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; (viii) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer der in (i), (ii) oder (iii) oben angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann.
  98. Isoliertes Polypeptid-Molekül, umfassend: (iii) eine Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% oder mehr Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 243 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; (iv) Derivate von einer der in (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
  99. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei das bHLH-11-ähnliche Polypeptid eine Helix-Loop-Helix Domäne umfasst.
  100. Verfahren nach Anspruch 99, wobei das bHLH11-ähnliche Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (viii) Motiv 1 (SEQ ID NO: 246); (ix) Motiv 2 (SEQ ID NO: 247); (x) Motiv 3 (SEQ ID NO: 248); (xi) Motiv 4 (SEQ ID NO: 249); (xii) Motiv 5 (SEQ ID NO: 250); (xiii) Motiv 6 (SEQ ID NO: 251); (xiv) Motiv 7 (SEQ ID NO: 252).
  101. Verfahren nach Anspruch 99 oder 100, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
  102. Verfahren nach einem der Ansprüche 99 bis 101, wobei die Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle E1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure, oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
  103. Verfahren nach einem der Ansprüche 99 bis 102, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle E1 angegebenen Proteine kodiert.
  104. Verfahren nach einem der Ansprüche 99 bis 103, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  105. Verfahren nach einem der Ansprüche 99 bis 104, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  106. Verfahren nach einem der Ansprüche 101 bis 105, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
  107. Verfahren nach einem der Ansprüche 99 bis 106, wobei die Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise eine monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Triticum, am stärksten bevorzugt aus Triticum aestivum, stammt.
  108. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 99 bis 107, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert.
  109. Konstrukt, umfassend: (iv) eine Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid nach den Ansprüchen 99 oder 100 kodiert; (v) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) steuern können; und gegebenenfalls (vi) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  110. Konstrukt nach Anspruch 109, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
  111. Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 109 oder 110 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  112. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Anspruch 109 oder 110 transformiert sind.
  113. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (iii) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid nach Anspruch 99 oder 100 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (iv) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  114. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid nach Anspruch 99 oder 100 kodiert, ergibt, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
  115. Transgene Pflanze nach Anspruch 108, 112 oder 114, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse and Hafer ist.
  116. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 115, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
  117. Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 115 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 116 stammen.
  118. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein bHLH11-ähnliches Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags, insbesondere bei der Steigerung des Samenertrags in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  119. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein ASR kodiert, wobei das ASR durch SEQ ID NO: 397 oder einem Orthologon oder Paralogon veranschaulicht wird, in einer Pflanze.
  120. Verfahren nach Anspruch 119, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die das ASR-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
  121. Verfahren nach Anspruch 119 oder 120, wobei die Nukleinsäure, die das ASR-Polypeptid kodiert, ein Abschnitt von SEQ ID NO: 396 ist, oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
  122. Verfahren nach einem der Ansprüche 119 bis 121, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 397 oder ein Orthologon oder Paralogon davon kodiert.
  123. Verfahren nach einem der Ansprüche 119 bis 122, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  124. Verfahren nach einem der Ansprüche 119 bis 123, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  125. Verfahren nach einem der Ansprüche 120 bis 124, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
  126. Verfahren nach einem der Ansprüche 119 bis 125, wobei die Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa stammt.
  127. Pflanzen oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 119 bis 126, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein ASR-Polypeptid kodiert.
  128. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid nach Anspruch 119 kodiert, oder eine von SEQ ID NO: 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415 und 417; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) ein Transkriptionsterminationssequenz.
  129. Konstrukt nach Anspruch 128, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
  130. Verwendung eines Konstrukts nach einem der Ansprüche 128 oder 129 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  131. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach einem der Ansprüche 128 oder 129 transformiert sind.
  132. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (iii) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid nach Anspruch 119 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (iv) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  133. Transgene Pflanze mit verbesserten Samenertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer gesteigerten Expression einer Nukleinsäure, die ein ASP-Polypeptid nach Anspruch 119 kodiert, ergibt, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
  134. Transgene Pflanze nach Anspruch 127, 131 oder 133, oder eine davon abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
  135. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 134, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
  136. Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 134 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 135 stammen.
  137. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, bei der Verbesserung der Ertragsmerkmale, insbesondere bei der Steigerung des Samenertrags bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  138. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eines der folgenden Merkmale: (iv) eine Nukleinsäure nach einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415 und 417; (v) das Komplement einer Nukleinsäure, dargestellt durch eine der Sequenzen von SEQ ID NO: 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415 und 417; (vi) eine Nukleinsäure, die ein ASR-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine der Sequenzen von SEQ ID NO: 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 und 418 veranschaulicht wird.
  139. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (iv) eine Aminosäuresequenz, nach einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 und 418; (v) eine Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine der Sequenzen von SEQ ID NO: 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 und 418 veranschaulicht wird. (vi) Derivate von einer der in (i) oder (ii) oben angegebenen Aminosäuresequenzen.
  140. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein SP11-Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das SPL11-Polypeptid eine SBP-Domäne umfasst, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 456 to SEQ ID NO: 468 und SEQ ID NO: 478 aufweist.
  141. Verfahren nach Anspruch 140, wobei das SPL11-Polypeptid neben der SBP-Domäne eine oder mehrere der folgenden konservierten Motive umfasst: (v) Motiv 1 nach SEQ ID NO: 469, wobei jede konservative Aminosäuresubstitution und/oder 1 oder 2 nichtkonservative Substitutionen erlaubt sind; (vi) Motiv 2 nach SEQ ID NO: 470, wobei jede Änderung erlaubt ist, vorausgesetzt dass mindestens 4 Aminosäuren eine polare Seitenkette, vorzugsweise Serin oder Threonin, aufweisen, und vorausgesetzt dass sich die Domäne am N-terminalen Ende der SBP-Domäne befindet; (vii) Motiv 3 nach SEQ ID: 471 wobei 1 oder 2 Mismatches erlaubt sind; (viii) Motiv 4 nach SEQ ID: 472 wobei 1, 2 oder 3 Mismatches erlaubt sind.
  142. Verfahren nach Anspruch 140 oder 141, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid nach Anspruch 140 oder 141 kodiert, in einer Pflanze herbeigeführt wird.
  143. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 142, wobei die modulierte Expression eine gesteigerte Expression ist.
  144. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 143, wobei die Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle G1 aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure, oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
  145. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 144, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle G1 angegebenen Proteine kodiert.
  146. Verfahren nach Anspruch 145, wobei die Nukleinsäure SEQ ID NO: 428 kodiert.
  147. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 146, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigertes Gesamtsamengewicht, Anzahl der gefüllten Samen, Anzahl der Samen oder Blütchen pro Rispe, Tausendkorngewicht, Samenfüllungsrate und/oder Harvest-Index im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  148. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 147, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale die Jungpflanzenvitalität der Pflanze (des Keimlings) im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  149. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 147, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  150. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 147, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Wachstumsbedingungen eines leichten Trockenheits-Stresses erhalten werden.
  151. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 147, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
  152. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 151, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
  153. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 151, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor, vorzugsweise einem WSI18-Promotor, am stärksten bevorzugt einem WSI18-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
  154. Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 153, wobei die Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
  155. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 140 bis 154, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein SPL11-Polypeptid kodiert.
  156. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend: (v) eine Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 448; (vi) das Komplement einer Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 448; (vii) eine Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 449 aufweist, und die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 465: SYCQVEGCRTDLSSAKDYHRKHRVCEPHSKAPKVVVAGLERRFCQQCSRFHG LAEFDQKKKSCRRRLNDHNARRRKPQPEAL aufweist; (viii) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit SEQ ID NO: 448 hybridisiert.
  157. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (iv) eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 449; (v) eine Aminosäuresequenz, die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 449 aufweist, und die in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 465: SYCQVEGCRTDLSSAKDYHRKHRVCEPHSKAPKVVVAGLERRFCQQCSRFHG LAEFDQKKKSCRRRLNDHNARRRKPQPEAL aufweist. (vi) Derivate von einer der in (i) oder (ii) oben angegebenen Aminosäuresequenzen.
  158. Konstrukt, umfassend: (iv) eine Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert; (v) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) steuern können; und gegebenenfalls (vi) eine Transkriptionsterminationssequenz
  159. Konstrukt nach Anspruch 158, wobei die Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, eine Nukleinsäure nach Anspruch 156 ist.
  160. Konstrukt nach Anspruch 158 oder 159, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
  161. Konstrukt nach Anspruch 158 oder 159, wobei eine der Kontrollsequenzen ein samenspezifischer Promotor, vorzugsweise ein WSI18-Promotor, am stärksten bevorzugt ein WSI18-Promotor aus Reis, ist.
  162. Verwendung eines Konstrukts nach den Ansprüchen 158 bis 161 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und/oder einer Pflanze mit Jungpflanzenvitalität beim Keimling.
  163. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach den Ansprüchen 158 bis 161 transformiert sind.
  164. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Samenertrag und/oder Jungpflanzenvitalität bei der Pflanze oder dem Keimling im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (iii) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein SP11-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; und (iv) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  165. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Jungpflanzenvitalität beim Keimling und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer gesteigerten Expression einer Nukleinsäure, die ein SP11-Polypeptid kodiert, ergibt, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
  166. Transgene Pflanze nach Anspruch 155, 163 oder 165, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine dikotyle Kulturpflanze, wie Sojabohne, Baumwolle oder Canola-Raps, oder eine monokotyle Kulturpflanze oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist.
  167. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 166, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse, Blüten und/oder Samen sind.
  168. Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 166 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 167 stammen.
  169. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein SPL11-Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags, insbesondere Samenertrags, und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101969759A (zh) * 2007-12-20 2011-02-09 巴斯夫植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法
US8658591B2 (en) 2008-07-11 2014-02-25 Robert Day Multi-LEU peptides and analogues thereof as selective PACE4 inhibitors and effective antiproliferative agents
ES2560806T3 (es) * 2009-06-30 2016-02-22 Performance Plants, Inc. Expresión de reguladores de la transcripción que proporcionan tolerancia al calor
CN104651323A (zh) * 2009-11-13 2015-05-27 巴斯夫植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法
RS55986B1 (sr) 2010-01-22 2017-09-29 Bayer Ip Gmbh Akaricidne i/ili insekticidne kombinacije aktivnih supstanci
EA201290933A1 (ru) * 2010-03-18 2013-05-30 Басф Плант Сайенс Компани Гмбх Растения с улучшенными характеристиками урожайности и способ их получения
WO2011163029A2 (en) * 2010-06-21 2011-12-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Alkenyl substituted cycloaliphatic compounds as chemical inducers of proximity
CA2833876A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Down-regulation of a homeodomain-leucine zipper i-class homeobox gene for improved plant performance
US9265252B2 (en) 2011-08-10 2016-02-23 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
CN102925466A (zh) * 2011-08-12 2013-02-13 华中农业大学 一种棉花酪蛋白激酶基因及其应用
EP2780458A4 (de) * 2011-11-14 2015-11-18 Basf Plant Science Co Gmbh Pflanzen mit verbesserten ertragseigenschaften und verfahren zu ihrer herstellung
CN103102402A (zh) * 2011-11-14 2013-05-15 中国科学院遗传与发育生物学研究所 大豆转录活性蛋白GmPHD5及其编码基因与应用
WO2013076672A1 (en) * 2011-11-25 2013-05-30 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having enhanced yield-related traits and method for making the same
US10634668B2 (en) 2012-09-13 2020-04-28 Takara Bio Usa, Inc. Modifiable chemical inducers of proximity and methods of using the same
CN103232533A (zh) * 2012-11-13 2013-08-07 华中科技大学 一种小麦抗旱基因TaASR1及其应用
CN103215280B (zh) * 2013-05-08 2014-08-20 山东省农业科学院高新技术研究中心 一种花生spl转录因子基因及其编码蛋白与应用
CA2905229C (en) 2013-06-11 2023-10-10 Clontech Laboratories, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
CN104341523B (zh) * 2013-08-02 2017-05-17 中国农业科学院作物科学研究所 水稻转录因子Os03g33090基因CDS序列的应用
CN104371023B (zh) * 2013-08-13 2017-09-05 中国农业科学院作物科学研究所 水稻转录因子Os01g36630基因CDS序列的应用
CN105452274A (zh) * 2013-09-26 2016-03-30 创世纪种业有限公司 一种小盐芥亮氨酸拉链蛋白bZIP-6及其编码基因与应用
CN106062195A (zh) * 2013-11-29 2016-10-26 中国农业大学 玉米基因zmspl1和zmspl2及其用途
US20150322452A1 (en) * 2014-05-12 2015-11-12 Donald Danforth Plant Science Center Compositions and methods for increasing plant growth and yield
CN105087640B (zh) * 2014-05-23 2018-03-30 中国科学院上海生命科学研究院 调节植物种子发育的基因及其应用
GB201501941D0 (en) * 2015-02-05 2015-03-25 British American Tobacco Co Method
WO2016130087A1 (en) * 2015-02-11 2016-08-18 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Controlling timing of plant flowering
CN114032251A (zh) * 2015-08-07 2022-02-11 拜尔作物科学公司 根优先和胁迫诱导型启动子及其用途
CN105524933B (zh) * 2016-01-20 2018-12-07 中国农业科学院生物技术研究所 OsJMJ714影响水稻籽粒大小以及盐胁迫耐性的功能及其应用
CN105734140B (zh) * 2016-03-30 2017-06-30 广东省农业科学院蔬菜研究所 茄子高温胁迫内参基因及其应用
CN106399513B (zh) * 2016-09-28 2019-08-09 中国农业科学院作物科学研究所 小麦基因TaSPL20-7D分子标记及其在鉴定小麦产量相关性状中的应用
CN107058321B (zh) * 2017-04-13 2020-09-01 中国农业科学院作物科学研究所 miR156及其前体在调控小麦分蘖数中的应用
CN109161550B (zh) * 2018-09-26 2020-06-30 华中农业大学 一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法
CN111041034B (zh) * 2018-10-11 2022-09-13 内蒙古农业大学 一种中间锦鸡儿Senescence_reg-1类蛋白编码基因CiDUF584-1及其应用
CN109868278B (zh) * 2019-03-20 2021-02-09 浙江大学 OsSPL3在控制水稻不定根发育中的应用
CA3138204A1 (en) * 2019-05-14 2020-11-19 Yield10 Bioscience, Inc. Modified plants comprising a polynucleotide comprising a non-cognate promoter operably linked to a coding sequence that encodes a transcription factor
CN110183524B (zh) * 2019-06-11 2022-06-14 扬州大学 一个促进大豆主根伸长的基因GmKRP2a、蛋白及其应用
CN112680472B (zh) * 2019-10-17 2023-08-01 华南农业大学 ZmSPL基因在调控玉米冠根或气生根发育中的应用
CN110734481B (zh) * 2019-11-12 2021-02-19 中国农业大学 番茄SlMIP蛋白及其编码基因在调控植物灰霉病抗性中的应用
CN110734916B (zh) * 2019-11-26 2020-11-03 浙江大学 OsbHLH98在调控水稻叶夹角中的应用
CN112940092B (zh) * 2019-12-11 2022-06-28 中国科学院遗传与发育生物学研究所 玉米ZmbHLH124蛋白质及其编码基因在调控植物耐旱性中的应用
CN111072761B (zh) * 2020-01-09 2021-06-01 西南大学 促进枇杷成花转变的EjSPL5基因及其编码蛋白与应用
US20230039763A1 (en) * 2020-01-14 2023-02-09 Centure Application Ltd. System and method for real-time crop management
CN112375777B (zh) * 2020-08-05 2022-05-27 浙江大学 OsbHLH6在提高作物磷吸收能力及作物耐低磷育种中的应用
CN114250230B (zh) * 2020-09-24 2024-02-09 中国科学院遗传与发育生物学研究所 大豆组蛋白去甲基化酶GmJMJ30-2在调控植物耐逆性中的应用
CN112575106A (zh) * 2020-12-17 2021-03-30 东北农业大学 基于转录因子基因ZmNAC89开发的与玉米耐盐碱相关的分子标记及其应用
CN115354042A (zh) * 2021-05-19 2022-11-18 湖南农业大学 一种启动子及其制备方法与应用
US20230116819A1 (en) * 2021-10-07 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
CN114231542B (zh) * 2022-01-21 2023-02-24 沈阳农业大学 一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因及其应用
CN115287290B (zh) * 2022-05-25 2023-11-03 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白在调控水稻种子活力中的应用
CN116286944B (zh) * 2022-12-09 2023-08-29 中国科学院华南植物园 组蛋白去甲基化酶SlJMJ10及其编码基因在调控番茄果实成熟中的应用
CN116536286B (zh) * 2023-05-12 2023-11-10 南京农业大学 水稻OsCTK1蛋白及其编码基因的应用

Citations (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US5164310A (en) 1988-06-01 1992-11-17 The Texas A&M University System Method for transforming plants via the shoot apex
WO1993022443A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Sri International In vivo homologous sequence targeting in eukaryotic cells
WO1994000012A1 (en) 1992-06-29 1994-01-06 Gene Shears Pty. Ltd. Nucleic acids and methods of use thereof for controlling viral pathogens
WO1994012015A1 (en) 1992-11-30 1994-06-09 Chua Nam Hai Expression motifs that confer tissue- and developmental-specific expression in plants
WO1995003404A1 (en) 1993-07-22 1995-02-02 Gene Shears Pty Limited Dna virus ribozymes
US5401836A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Pioneer Hi-Bre International, Inc. Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression
WO1995014098A1 (en) 1993-11-19 1995-05-26 Biotechnology Research And Development Corporation Chimeric regulatory regions and gene cassettes for expression of genes in plants
US5565350A (en) 1993-12-09 1996-10-15 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site directed mutations in eukaryotic cells
WO1997013865A1 (en) 1995-10-06 1997-04-17 Plant Genetic Systems, N.V. Seed shattering
WO1997038116A1 (en) 1996-04-11 1997-10-16 Gene Shears Pty. Limited The use of dna sequences for male sterility in transgenic plants
WO1998036083A1 (en) 1997-02-14 1998-08-20 Plant Bioscience Limited Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US5811238A (en) 1994-02-17 1998-09-22 Affymax Technologies N.V. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO1998053083A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Zeneca Limited Gene silencing
WO1999006056A1 (en) 1997-07-29 1999-02-11 Gho'st Holding B.V. Use of physiologically acceptable vanadium compounds, salts and complexes
WO1999015682A2 (en) 1997-09-22 1999-04-01 Plant Bioscience Limited Gene silencing materials and methods
WO1999053050A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
WO2000000619A2 (en) 1998-06-26 2000-01-06 Iowa State University Research Foundation, Inc. MATERIALS AND METHODS FOR THE ALTERATION OF ENZYME AND ACETYL CoA LEVELS IN PLANTS
WO2000015815A1 (en) 1998-09-14 2000-03-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes from maize and methods of use
EP1033405A2 (de) 1999-02-25 2000-09-06 Ceres Incorporated DNS-fragmente mit bestimmter Sequenz und die dadurch kodierte Polypeptide
WO2001014572A2 (de) 1999-08-26 2001-03-01 Basf Plant Science Gmbh Pflanzliche genexpression unter der kontrolle von konstitutiven pflanzlichen v-atpase promotoren
EP1198985A1 (de) 1999-07-22 2002-04-24 Japan as represented by Dir. Gen. of National Inst. of Agrobiological Resources,Ministry of Agriculture, Forestry and Fisherie Verfahren zur superschnellen transformation von monokotyledonen
US6395547B1 (en) 1994-02-17 2002-05-28 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO2004065596A2 (en) 2003-01-21 2004-08-05 Cropdesign N.V. Use of the regulatory sequence of the rice gos2 gene for the gene expression in dicotyledonous plants or plant cells
WO2004070039A2 (en) 2003-02-04 2004-08-19 Cropdesign N.V. Rice promoters
US20050044585A1 (en) 1996-02-14 2005-02-24 Good Allen G. Plants with enhanced levels of nitrogen utilization proteins in their root epidermis and uses thereof
US20060218674A1 (en) 2005-03-23 2006-09-28 Hajime Sakai Alteration of plant embryo/endosperm size during development
US7154025B2 (en) 2000-04-28 2006-12-26 Biogemma Method for obtaining plants exhibiting enhanced resistance to water stress
US7196245B2 (en) 2002-09-18 2007-03-27 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides that confer increased biomass and tolerance to cold, water deprivation and low nitrogen to plants

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2276612A1 (en) * 1997-01-08 1998-07-16 University Of Florida Polynucleotides encoding choline monooxygenase and plants transformed therewith
US20100293669A2 (en) * 1999-05-06 2010-11-18 Jingdong Liu Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US20110131679A2 (en) * 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
WO2003007699A2 (en) * 2001-06-22 2003-01-30 Syngenta Participations Ag Transcription factors of cereals
CN1342772A (zh) * 2001-10-24 2002-04-03 中国科学院成都生物研究所 一种农杆菌介导的植物转基因技术
US6953880B2 (en) * 2003-02-28 2005-10-11 University Of Arkansas, N.A. Rice cultivar ‘Francis’
WO2004093530A2 (en) * 2003-04-22 2004-11-04 Agrinomics Llc Generation of plants with altered oil content
US20040216190A1 (en) * 2003-04-28 2004-10-28 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
DE602004032374D1 (de) * 2003-06-24 2011-06-01 Agrigenetics Inc Erzeugung von pflanzen mit verbesserter toleranz gegenüber trockenheit
US7071380B1 (en) * 2003-08-29 2006-07-04 Agrigenesis Biosciences Limited Control of floral induction
US20060107345A1 (en) * 2003-09-30 2006-05-18 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US7439416B2 (en) * 2004-01-09 2008-10-21 The Carnegie Institution Of Washington Indeterminate gametophyte 1 (ig1)gene from Zea mays and uses thereof
BRPI0506620A (pt) * 2004-02-02 2007-05-08 Du Pont polinucleotìdeo isolado, subfragmento funcionalmente equivalente do polinucleotìdeo isolado, fragmento de ácido nucléico isolado, construção de dna recombinante, planta, semente, célula vegetal ou tecido vegetal transformado, método de alteração da estrutura de raiz, método de isolamento de fragmentos de ácido nucléico, método de mapeamento de variações genéticas e método de cultivo molecular
US20070270578A1 (en) * 2004-11-25 2007-11-22 Cropdesign N.V. Plants Having Increased Yield and a Method for Making the Same

Patent Citations (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US5164310A (en) 1988-06-01 1992-11-17 The Texas A&M University System Method for transforming plants via the shoot apex
WO1993022443A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Sri International In vivo homologous sequence targeting in eukaryotic cells
WO1994000012A1 (en) 1992-06-29 1994-01-06 Gene Shears Pty. Ltd. Nucleic acids and methods of use thereof for controlling viral pathogens
US5401836A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Pioneer Hi-Bre International, Inc. Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression
WO1994012015A1 (en) 1992-11-30 1994-06-09 Chua Nam Hai Expression motifs that confer tissue- and developmental-specific expression in plants
WO1995003404A1 (en) 1993-07-22 1995-02-02 Gene Shears Pty Limited Dna virus ribozymes
WO1995014098A1 (en) 1993-11-19 1995-05-26 Biotechnology Research And Development Corporation Chimeric regulatory regions and gene cassettes for expression of genes in plants
US5565350A (en) 1993-12-09 1996-10-15 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site directed mutations in eukaryotic cells
US5811238A (en) 1994-02-17 1998-09-22 Affymax Technologies N.V. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6395547B1 (en) 1994-02-17 2002-05-28 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO1997013865A1 (en) 1995-10-06 1997-04-17 Plant Genetic Systems, N.V. Seed shattering
US20050044585A1 (en) 1996-02-14 2005-02-24 Good Allen G. Plants with enhanced levels of nitrogen utilization proteins in their root epidermis and uses thereof
WO1997038116A1 (en) 1996-04-11 1997-10-16 Gene Shears Pty. Limited The use of dna sequences for male sterility in transgenic plants
WO1998036083A1 (en) 1997-02-14 1998-08-20 Plant Bioscience Limited Methods and means for gene silencing in transgenic plants
WO1998053083A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Zeneca Limited Gene silencing
WO1999006056A1 (en) 1997-07-29 1999-02-11 Gho'st Holding B.V. Use of physiologically acceptable vanadium compounds, salts and complexes
WO1999015682A2 (en) 1997-09-22 1999-04-01 Plant Bioscience Limited Gene silencing materials and methods
WO1999053050A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
WO2000000619A2 (en) 1998-06-26 2000-01-06 Iowa State University Research Foundation, Inc. MATERIALS AND METHODS FOR THE ALTERATION OF ENZYME AND ACETYL CoA LEVELS IN PLANTS
WO2000015815A1 (en) 1998-09-14 2000-03-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes from maize and methods of use
EP1033405A2 (de) 1999-02-25 2000-09-06 Ceres Incorporated DNS-fragmente mit bestimmter Sequenz und die dadurch kodierte Polypeptide
EP1198985A1 (de) 1999-07-22 2002-04-24 Japan as represented by Dir. Gen. of National Inst. of Agrobiological Resources,Ministry of Agriculture, Forestry and Fisherie Verfahren zur superschnellen transformation von monokotyledonen
WO2001014572A2 (de) 1999-08-26 2001-03-01 Basf Plant Science Gmbh Pflanzliche genexpression unter der kontrolle von konstitutiven pflanzlichen v-atpase promotoren
US7154025B2 (en) 2000-04-28 2006-12-26 Biogemma Method for obtaining plants exhibiting enhanced resistance to water stress
US7196245B2 (en) 2002-09-18 2007-03-27 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides that confer increased biomass and tolerance to cold, water deprivation and low nitrogen to plants
WO2004065596A2 (en) 2003-01-21 2004-08-05 Cropdesign N.V. Use of the regulatory sequence of the rice gos2 gene for the gene expression in dicotyledonous plants or plant cells
WO2004070039A2 (en) 2003-02-04 2004-08-19 Cropdesign N.V. Rice promoters
US20060218674A1 (en) 2005-03-23 2006-09-28 Hajime Sakai Alteration of plant embryo/endosperm size during development

Non-Patent Citations (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
An et al., Plant J. 10 (1); 107-121, 1996
Bailey et al., Plant Cell 15, 2497-2501, 2003
Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128
Bellman & Werr (1992) EMBO J 11: 3367-3374
Bortiri et al., Plant Cell 18, 574-587, 2006
Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25 (5): 837-43, 1994
Cakir et al., 2003 Plant Cell 15: 2165-2180
Cardon et al. (1997) Plant J 12: 367-377
Cardon et al. (1999) Gene 237: 91-104
Carrai et al. 2004 Trends Plant Sci 9: 57-59
Castle et al., (2004), Science 304 (5674): 1151-4
Chalfun-Junior et al., Plant Mol. Biol. 57, 559-575, 2005
Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992
Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990
Craves und Roach, 1995, J Biol Chem 270: 21689-21694
Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.)
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen)
Dann et al; Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99 (24): 15351-15356
Dhillon N und Hoekstra MF, EMBO J 13: 2777-2788, 1994
Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
Evans et al., Plant Cell 19, 46-62, 2007
Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25
Frankel et al. 2006. Gene Pages 74-83
Frankel et al. Plant Mol Biol. 2007 Mar; 63 (5): 719-30
Gao et al. (2006) Bioinformatics 2006, 22 (10): 1286-7
Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108
Goldgur et al. 2007. Plant Physiol. Feb; 143 (2): 617-28
Goldgur et al. Plant Physiol. 2007 Feb; 143 (2): 617-28
Gross and Anderson, 1998 Cell Signal 10: 699-711
Halbach et al. (2000) Nucleic Acid Res 28 (18): 3542-3550
Hoekstra MF et al., Science 253: Brockman JL et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 89: 9454-9458, 1992
Inukai et al., Plant Cell 17, 1387-1396, 2005
Ito et al. (2004) Gene 331: 9-15
Iusem et al 1993 Plant Physiol 102: 1353-1354
Iwakawa et al., Plant Cell Physiol. 43, 467-478, 2002
Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
Kalifa et al. 2004 Biochem J. 2004 Jul 15; 381 (Pt 2): 373-8
Kalifa et al., 2004a Biochem J 381: 373-378
Klein et al. (1996) Mol Gen Genet 259: 7-16
Klimczak und Cashmore AR, 1993. Biochem. J. 293: 283-288
Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Lee et al. 2005 Plant Cell. 17 (10): 2817-2831
Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (5): 2553
Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992
Li et al Plant Physiol. 141, 1167-1184, 2006
Linke et al. (2004) J. Biol. Chem., Vol. 279, 14391-14397
Liu et al. 2003, Plant Journal. 36, 189-202
Liu et al., Plant J. 43, 47-56, 2005
Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386-395, 1991
McElroy et al., Plant Cell, 2: 163-171, 1990
Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984
Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994
Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456-462, 1997
Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161 (2): 337-346
Noh et al. Plant Cell. 2004. 16 (10): 2601-13
Odell et al., Nature, 313: 810-812, 1985
Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988
Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27 (2): 237-48
Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)
Rhoades et al. (2002) Cell 110: 513-520
Richardt et al. (2007) Plant Phys 143 (4): 1452-1466
Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105-2109
Rom et al. 2006. Biochimie. 88 (6): 621-8
Sambrook et al., (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York
Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443
Schindler et al. (1993) Plant J 4: 137-150
Shaw et al., (1984), Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831-7846
Shuai et al., Plant Physiol. 129, 747-761, 2002
Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109-119, 1993
Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003
Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987
Toledo-Ortiz et al., Plant Cell 15, 1749-1770, 2003
Toyoda et al. 2003 Dev Cell. 5 (1): 85-97.
Trewick et al. EMBO Rep. 2005 (4): 15-20
Tsukada, Nature. 2006; 439 (7078): 811-6
Uberlacker et al. (1996) Plant Cell 8: 349-362
Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991
Vi et al., Plant Physiol. 138, 2087-2096
W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
Wang et al., 2002, Plant Sci. 163: 273
Wang et al., Planta (2003), 218: 1-14
Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641-649, 1988
Xiao et al., 2006
Yamasaki et al. (2004) J Mol Biol 337: 49-63
Yang et al. (Molecular Phylogenetics and Evolution 39, 248-262, 2006)
Yang et al. 2005. Plant Physiol 139: 836-846

Also Published As

Publication number Publication date
US20150259698A1 (en) 2015-09-17
CA2900183A1 (en) 2008-11-13
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US20100132071A1 (en) 2010-05-27
EP2505652A1 (de) 2012-10-03
CA2685223A1 (en) 2008-11-13
BRPI0823525A2 (pt) 2014-06-03
EP2316956A2 (de) 2011-05-04
BRPI0810703A2 (pt) 2012-12-25
MX2009011716A (es) 2009-12-11
EP2228386B1 (de) 2015-03-18
ES2558745T3 (es) 2016-02-08
EP2230310B1 (de) 2013-01-16
CN101802202B (zh) 2014-12-10
WO2008137108A2 (en) 2008-11-13
CN104862333A (zh) 2015-08-26
ES2542311T3 (es) 2015-08-04
EP2230310A1 (de) 2010-09-22
ES2437621T3 (es) 2014-01-13

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