CN110734481B - 番茄SlMIP蛋白及其编码基因在调控植物灰霉病抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及番茄SlMIP蛋白及其编码基因在调控植物灰霉病抗性中的应用。本发明发现番茄SlMIP基因能够负调控植物灰霉病抗性，通过降低SlMIP基因的表达量，能够有效提高植物灰霉病抗性。SlMIP基因的灰霉病抗性调控功能的发现为培育高抗灰霉病的植物新品种提供了宝贵的基因资源和新的方法。本发明利用CRISPR‑Cas9基因组定点编辑系统突变番茄SlMIP基因，创制了抗灰霉病番茄株系，该番茄株系的抗灰霉病能力显著提高，具有重要的应用价值。

Description

番茄SlMIP蛋白及其编码基因在调控植物灰霉病抗性中的 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及番茄SlMIP蛋白及其编码基因在调控植物灰霉病抗性中的应用。

背景技术

在设施栽培蔬菜过程中，保护地内的温暖潮湿的环境容易发生蔬菜病害。随着设施栽培蔬菜面积的不断广大，对蔬菜的抗病性要求越来越高。番茄作为目前设施栽培面积最大的蔬菜品种之一，其病害的预防具有重要意义。番茄灰霉病是非常容易发生的真菌性病害，该病的发生会使得番茄产业受到严重的损失。目前，生产上应对番茄灰霉病的防治需要大量使用化学杀菌剂，给环境和食品安全造成了严重的威胁。

已有研究证明植物中存在多个信号通路与植物抵抗病菌具有密切关系，例如：番茄中过表达茉莉酸信号通路基因SlMYC2能够显著增强番茄对灰霉病的耐受性。目前，番茄中抗病性相关基因资源仍十分有限，发现新的抗病性调控相关基因对于培育番茄抗病品种具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供番茄 SlMIP蛋白及其编码基因在调控番茄灰霉病抗性中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供番茄SlMIP蛋白或其编码基因或番茄 SlMIP蛋白的编码基因的抑制因子在调控植物抗病性中的应用。

优选地，所述抗病性为灰霉病抗性。

第二方面，本发明提供番茄SlMIP蛋白或其编码基因或番茄 SlMIP蛋白的编码基因的抑制因子在植物遗传育种中的应用。

上述植物遗传育种为抗病植物的遗传育种，优选为抗灰霉病植物的遗传育种。

上述应用中，通过降低所述植物中番茄SlMIP蛋白的编码基因的表达量，提高所述植物的灰霉病抗性；或者，通过将番茄SlMIP蛋白的编码基因的失活突变株系与其他株系杂交，培育灰霉病抗性株系。

优选地，所述降低所述番茄SlMIP蛋白的编码基因的表达量为失活SlMIP蛋白的编码基因。

本发明中，所述番茄SlMIP蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为番茄SlMIP蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据番茄SlMIP蛋白的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与番茄SlMIP蛋白具有相同功能的SlMIP蛋白的突变体。

本发明中，所述番茄SlMIP蛋白的编码基因的CDS序列具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸；

(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

上述如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为番茄中SlMIP蛋白的CDS序列。考虑到密码子的简并性，所有编码所述番茄SlMIP蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

本发明中，所述番茄SlMIP蛋白的编码基因的抑制因子包括能够抑制番茄SlMIP蛋白的编码基因表达的gRNA或干扰RNA。

优选地，所述gRNA的靶序列为所述番茄SlMIP蛋白的编码基因的第一个外显子的第59-78位。

更优选地，所述gRNA包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

上述gRNA的靶位点为本发明通过大量筛选获得，利用上述 gRNA能够实现高效的番茄SlMIP的敲除，使得番茄SlMIP失活。

第三方面，本发明提供一种编辑番茄SlMIP基因的gRNA，所述 gRNA的靶序列包含所述番茄SlMIP基因的第一个外显子的第59-78 位。

上述gRNA可与CRISPR-Cas9基因编辑系统配合作用，具有较低的脱靶概率，可实现番茄SlMIP基因的高效敲除。

优选地，所述gRNA包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

第四方面，本发明提供包含所述用于编辑番茄SlMIP基因的 gRNA的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、宿主细胞或工程菌。

所述表达盒可为含有AtU6启动子和所述gRNA的表达盒。

所述载体可为含有AtU6启动子、所述gRNA以及Cas9表达盒的 CRISPR-Cas9基因编辑载体。

所述工程菌可为含有所述CRISPR-Cas9基因编辑载体的大肠杆菌或农杆菌。

第五方面，本发明提供一种调控植物灰霉病抗性的方法，其包括：调控植物中番茄SlMIP基因的表达量；

所述番茄SlMIP基因的编码蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

优选地，上述方法中，通过降低所述植物中番茄SlMIP基因的表达量，提高所述植物的灰霉病抗性；或者，通过将番茄SlMIP基因的失活突变株系与其他株系杂交，培育灰霉病抗性株系。

上述降低所述植物中番茄SlMIP基因的表达量可通过本领域常规技术手段实现。优选地，降低所述植物中番茄SlMIP基因的表达量为利用CRISPR-Cas9系统实现，所述CRISPR-Cas9系统使用的gRNA 的靶序列包含所述番茄SlMIP基因的第一个外显子的第59-78位。

作为本发明的优选实施方式，所述CRISPR-Cas9系统的构建方法如下：将包含AtU6启动子和如SEQ ID NO.3所示的gRNA序列的 AtU6-26-sgRNA-SK质粒克隆到pCAMBIA1300-pYAO:Cas9载体中。

本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物包括但不限于番茄、葡萄、黄瓜、大豆、小麦、水稻、玉米、棉花、花生、拟南芥等。

本发明的有益效果在于：

本发明发现番茄SlMIP基因能够负调控植物灰霉病抗性，通过降低SlMIP基因的表达量，能够有效提高植物灰霉病抗性(降低灰霉病的易感性和发病情况)。SlMIP基因的灰霉病抗性调控功能的发现为培育高抗灰霉病的植物新品种提供了宝贵的基因资源和新的方法：一方面可通过将栽培番茄的SlMIP基因定点突变，获得抗灰霉病能力更强的番茄品系；另一方面，也可利用本发明提供的SlMIP基因失活植株(MIP-KO-3和MIP-KO-5)与其他番茄品种杂交，培育抗病品系，丰富番茄抗病种质资源。SlMIP基因及其抑制因子在番茄抗病性育种中具有重大的应用价值。

本发明利用CRISPR-Cas9基因组定点编辑系统突变番茄SlMIP基因，创制了抗灰霉病番茄株系，该番茄株系的抗灰霉病能力显著提高，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中SlMIP基因的基因结构以及纯合突变体植株的MIP基因靶序列突变情况，其中，KO-3和KO-5代表两个纯合的敲除株系MIP-KO-3和MIP-KO-5，WT为野生型；-表示碱基缺失。

图2为本发明实施例1中PCR筛选含有Cas9基因的转基因植株的电泳检测结果图，其中，第1泳道为转基因植株MIP-KO-3，第2泳道为转基因植株MIP-KO-5，M为DNA Mark，条带大小由上向下依次为 2000bp、1000bp、750bp。

图3为本发明实施例1中PCR扩增转基因植株中SIMIP基因的电泳检测结果图，其中，第1泳道为MIP-KO-3，第2泳道为MIP-KO-5，M 为DNA Mark，条带大小由上向下依次为2000bp、1000bp、750bp。

图4为本发明实施例2中SlMIP基因敲除株系(MIP-KO-3和 MIP-KO-5)和野生型材料(WT)接种灰葡萄孢10天后的病斑照片。

图5为本发明实施例2中SlMIP基因敲除株系(MIP-KO-3和 MIP-KO-5)和野生型材料(WT)接种灰葡萄孢10天后的病斑大小统计图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1基于CRISPR-Cas9系统的番茄SlMIP基因定点突变

(1)背景材料准备

取一定数量的番茄种子Micro Tom(购自南京丰硕园艺有限公司，货号：3556)，将种子用2.5％的次氯酸钠浸泡20-25分钟，后用无菌水洗涤7-8次。每瓶30-40粒种子密度播于MS培养基上。在暗室培养3-4天，后光下培养3-4天，至长出完整子叶。然后于无菌条件下将子叶裁剪5*5mm的叶片方块，置于预培养培养基上，培养基上提前铺好滤纸，子叶背面朝上放置，摆放间隔以5-10mm，进行暗培养。

(2)gRNA靶点的选择

登录https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，查询番茄SlMIP基因的序列 (CDS序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白序列如SEQ ID NO.1所示)。根据SlMIP基因序列可知，其含有两个外显子(见图1)。基于CRISPR-Cas9的sgRNA序列特点，本发明开展了能够高效失活突变SlMIP基因的sgRNA靶点的筛选工作，最终选择的靶点位于SlMIP 基因的第一个外显子正义链上含有NGG序列特征的第59位至第78 位的序列，即5’-GCATTAGGCCTTGTCTTCAA-3′(SEQID NO.3)。该序列是番茄SlMIP基因的一部分，经转录后形成的RNA链可特异结合SlMIP基因并指导CRISPR-Cas9系统对番茄SlMIP基因进行高效的定点突变。

(3)sgRNA片段的克隆和CRISPR-Cas9载体构建

根据选定的sgRNA靶点序列，合成引物MIP-gRNA-S(SEQ ID NO.4)和MIP-gRNA-A(SEQ ID NO.5)，将引物MIP-gRNA-S和 MIP-gRNA-A通过退火方法合成双链DNA gRNA-LOB,并将该双链 DNA电泳后回收。

将AtU6-26-sgRNA-SK质粒经BsaI酶切后与上述回收的DNA gRNA-LOB连接，使双链靶序列连接到质粒AtU6-26-sgRNA-SK载体上。通过T4连接的方法将包含AtU6启动子和sgRNA序列的 AtU6-26-sgRNA-SK的质粒克隆到pCAMBIA1300-pYAO:Cas9载体上，获得重组载体YAO-gRNA-Cas9-MIP。

(4)重组根癌农杆菌的获得

将上述(3)中构建的重组载体YAO-gRNA-Cas9-MIP通过热激方法转化进入农杆菌GV3101菌株中，具体步骤按照上海唯地生物公司农杆菌感受态(货号：AC1001)说明书进行。获得含有重组表达载体YAO-gRNA-Cas9-MIP的重组农杆菌，命名为 GV3101-YAO-gRNA-Cas9-MIP。

(5)农杆菌介导的番茄转化

将重组根癌农杆菌GV3101-YAO-gRNA-Cas9-MIP于28℃振荡扩大培养，至OD₆₀₀为0.6-0.8，侵染番茄品种Micro Tom幼嫩子叶，在含潮霉素抗生素培养基上成功再生及生根的植株为转基因阳性植株 MIP-KO。

(6)转基因番茄鉴定及突变位点检测

提取转基因T0代再生植株叶片总DNA，分别以1300-gRNA检测引物1300-gRNA-S(SEQ ID NO.6)和1300-gRNA-A(SEQ ID NO.7) PCR扩增1300-gRNA部分序列。再以1300-gRNA阳性植株基因组为模板运用引物SlMIP-S(SEQ ID NO.8)和SlMIP-A(SEQ ID NO.9) 扩增SlMIP基因全序列。将PCR产物测序，通过测序序列判断靶位点是否发生突变。

PCR扩增产物的电泳检测结果见图2和图3，将上述SlMIP基因的PCR片段送测序，测序引物为SlMIP-A，测序结果见图1，结果显示，MIP-KO-3和MIP-KO-5两个转基因植株的SlMIP基因均在PAM 位点(TGG序列)附近出现缺失突变，且两条染色体同时发生突变，其中，MIP-KO-3植株两条染色体上的SlMIP基因在第75位发生缺失1个碱基的突变，导致移码突变，翻译提前终止，SlMIP蛋白质功能丧失(缺失后的DNA序列如SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列如 SEQ ID NO.11所示)；MIP-KO-5植株的染色体上的SlMIP基因在第 71到76位发生缺失六个碱基的突变，导致移码突变，翻译提前终止， SlMIP蛋白质功能丧失(缺失后的DNA序列如SEQ ID NO.12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示)。

实施例2转基因株系番茄抗灰霉病能力检测

挑选四周龄、长势一致的野生型番茄株系(WT)以及基因敲除株系MIP-KO-3、MIP-KO-5的幼苗接种浓度为1×10⁶spores/mL的灰葡萄孢孢子(株系为B05.10)悬浮液，具体方法如下：摘取不同株系叶片各4-5片，置于方型培养皿中，在表皮滴5μl孢子悬浮液，十天后统计病斑面积。结果如图4和图5所示，与WT相比，MIP-KO-3 和MIP-KO-5接种灰葡萄孢孢子后的病斑面积显著减小，表明转基因株系MIP-KO-3和MIP-KO-5对灰葡萄孢的抗性显著增加，具有优异的灰霉病抗性。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 番茄SlMIP蛋白及其编码基因在调控植物灰霉病抗性中的应用

<130> KHP191115761.2

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser

1 5 10 15

Glu Ser Cys Ser Ile Arg Pro Cys Leu Gln Trp Ile Lys Thr Pro Asp

20 25 30

Ser Gln Ser Asn Ala Thr Val Phe Leu Ala Lys Phe Tyr Gly Arg Ala

35 40 45

Gly Leu Met Asn Leu Ile Asn Ala Gly Pro Asp His Leu Arg Pro Ala

50 55 60

Ile Phe Arg Ser Leu Leu Tyr Glu Ala Cys Gly Arg Ile Val Asn Pro

65 70 75 80

Ile Tyr Gly Ser Val Gly Leu Leu Trp Ser Gly Asn Trp Gln Leu Cys

85 90 95

Gln Asn Ala Val Glu Ala Val Leu Lys Gly Thr Pro Ile Thr Pro Ile

100 105 110

Ala Ser Glu Ile Ala Val Asn Asn Asn Gly Pro Pro Leu Lys Leu Pro

115 120 125

Tyr Asp Ile Arg His Ile Asn Lys Asp Glu Asn Ser Thr Lys Ser Ser

130 135 140

Glu Leu His Arg Val Arg Thr Arg Cys Arg Phe Lys Arg Ser Gly Ala

145 150 155 160

Asn Thr Lys Ala Lys Asn Ser Asn Pro Val Cys Ser Gly Ser Gly Asp

165 170 175

Glu Leu Ala His Glu Lys Met Asn Gly Ser Thr Ser His Glu Ser Ser

180 185 190

Leu Ser His Gln Ser Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala

195 200 205

Met Asn Val Glu Cys Asp Ser Ser Gly Met Ala Glu Val Glu Asp Ser

210 215 220

Ala Lys Asp Val Glu Leu Glu Leu Thr Leu Gly Phe Ser Ser Leu Gly

225 230 235 240

Thr Val Asp Ser Lys Pro Lys Glu Thr Lys Arg Asn Lys Asp Val Gln

245 250 255

Leu Val Asn Gly Ala Gly Glu Cys Lys Ile Glu Leu Arg Leu His

260 265 270

<210> 2

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcgtatga gttgcaatgg ttgtagagtt cttcgtaaag gttgcagcga aagttgtagc 60

attaggcctt gtcttcaatg gatcaaaacc ccggattctc agtccaacgc cactgttttt 120

ctggcaaagt tttacggccg tgctggtctg atgaatctca ttaacgctgg ccctgatcat 180

cttcgtcctg cgatatttag gtcattgctt tatgaggctt gtggaagaat agtgaacccg 240

atttatggat cggtagggtt gttatggtca gggaattggc agctttgtca aaatgctgtg 300

gaggcggtac tcaaaggaac tccaattact cccatagctt ctgaaattgc tgtaaacaac 360

aacggtcctc ctttgaaatt gccttacgat attaggcata ttaacaaaga tgaaaactct 420

accaagtcca gcgagctgca tcgggtcagg acccgatgtc gattcaagcg ctcaggtgct 480

aacacaaaag caaaaaactc gaatccggta tgttccgggt cgggtgatga attggcccat 540

gagaaaatga acgggtctac gagccatgag tcttcgttga gtcaccagtc tgaagaagaa 600

gctgcggcgg cggcggctgt ggctatgaat gtggaatgcg atagctcggg tatggctgaa 660

gtggaagatt cagctaaaga tgtcgaattg gaactgactt taggtttttc gtctttagga 720

actgttgaca gtaaaccgaa ggaaactaaa cggaataaag atgttcagtt ggtgaacggc 780

gccggcgaat gtaaaataga gcttcgactt cattga 816

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcattaggcc ttgtcttcaa 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attggcatta ggccttgtct tcaa 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacttgaag acaaggccta atgc 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagtcacga cgttgtaaaa c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caatgaattt cccatcgtcg ag 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgcgtatga gttgcaatgg tt 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaatgaagt cgaagctcta tttta 25

<210> 10

<211> 815

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgcgtatga gttgcaatgg ttgtagagtt cttcgtaaag gttgcagcga aagttgtagc 60

attaggcctt gtctcaatgg atcaaaaccc cggattctca gtccaacgcc actgtttttc 120

tggcaaagtt ttacggccgt gctggtctga tgaatctcat taacgctggc cctgatcatc 180

ttcgtcctgc gatatttagg tcattgcttt atgaggcttg tggaagaata gtgaacccga 240

tttatggatc ggtagggttg ttatggtcag ggaattggca gctttgtcaa aatgctgtgg 300

aggcggtact caaaggaact ccaattactc ccatagcttc tgaaattgct gtaaacaaca 360

acggtcctcc tttgaaattg ccttacgata ttaggcatat taacaaagat gaaaactcta 420

ccaagtccag cgagctgcat cgggtcagga cccgatgtcg attcaagcgc tcaggtgcta 480

acacaaaagc aaaaaactcg aatccggtat gttccgggtc gggtgatgaa ttggcccatg 540

agaaaatgaa cgggtctacg agccatgagt cttcgttgag tcaccagtct gaagaagaag 600

ctgcggcggc ggcggctgtg gctatgaatg tggaatgcga tagctcgggt atggctgaag 660

tggaagattc agctaaagat gtcgaattgg aactgacttt aggtttttcg tctttaggaa 720

ctgttgacag taaaccgaag gaaactaaac ggaataaaga tgttcagttg gtgaacggcg 780

ccggcgaatg taaaatagag cttcgacttc attga 815

<210> 11

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Arg Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser

1 5 10 15

Glu Ser Cys Ser Ile Arg Pro Cys Leu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ile

20 25 30

Leu Ser Pro Thr Pro Leu Phe Phe Trp Gln Ser Phe Thr Ala Val Leu

35 40 45

Val

<210> 12

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgcgtatga gttgcaatgg ttgtagagtt cttcgtaaag gttgcagcga aagttgtagc 60

attaggcctt aatggatcaa aaccccggat tctcagtcca acgccactgt ttttctggca 120

aagttttacg gccgtgctgg tctgatgaat ctcattaacg ctggccctga tcatcttcgt 180

cctgcgatat ttaggtcatt gctttatgag gcttgtggaa gaatagtgaa cccgatttat 240

ggatcggtag ggttgttatg gtcagggaat tggcagcttt gtcaaaatgc tgtggaggcg 300

gtactcaaag gaactccaat tactcccata gcttctgaaa ttgctgtaaa caacaacggt 360

cctcctttga aattgcctta cgatattagg catattaaca aagatgaaaa ctctaccaag 420

tccagcgagc tgcatcgggt caggacccga tgtcgattca agcgctcagg tgctaacaca 480

aaagcaaaaa actcgaatcc ggtatgttcc gggtcgggtg atgaattggc ccatgagaaa 540

atgaacgggt ctacgagcca tgagtcttcg ttgagtcacc agtctgaaga agaagctgcg 600

gcggcggcgg ctgtggctat gaatgtggaa tgcgatagct cgggtatggc tgaagtggaa 660

gattcagcta aagatgtcga attggaactg actttaggtt tttcgtcttt aggaactgtt 720

gacagtaaac cgaaggaaac taaacggaat aaagatgttc agttggtgaa cggcgccggc 780

gaatgtaaaa tagagcttcg acttcattga 810

<210> 13

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Arg Met Ser Cys Asn Gly Cys Arg Val Leu Arg Lys Gly Cys Ser

1 5 10 15

Glu Ser Cys Ser Ile Arg Pro

20

Claims (8)

1.番茄SlMIP蛋白的编码基因的抑制因子在提高番茄灰霉病抗性中的应用，所述番茄SlMIP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.番茄SlMIP蛋白的编码基因的抑制因子在番茄灰霉病抗性遗传育种中的应用，所述番茄SlMIP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过降低所述番茄SlMIP蛋白的编码基因的表达量，提高植物的抗病性。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述降低所述番茄SlMIP蛋白的编码基因的表达量为失活SlMIP蛋白的编码基因。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述番茄SlMIP蛋白的编码基因的抑制因子为能够抑制番茄SlMIP蛋白的编码基因表达的gRNA或干扰RNA。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述gRNA的靶序列为所述番茄SlMIP蛋白的编码基因的第一个外显子的第59-78位；所述gRNA包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

7.一种提高番茄灰霉病抗性的方法，其特征在于，包括：通过降低所述番茄中番茄SlMIP基因的表达量，提高所述番茄的灰霉病抗性；或者，通过将所述番茄SlMIP基因的失活突变株系与其他株系杂交，培育灰霉病抗性株系；

所述番茄SlMIP基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述降低所述番茄中番茄SlMIP基因的表达量为利用CRISPR-Cas9系统实现，所述CRISPR-Cas9系统使用的gRNA的靶序列包含所述番茄SlMIP基因的第一个外显子的第59-78位。

Images