CN101255428B

CN101255428B - 一种与植物抗盐性相关的基因及其在植物育种中的应用

Info

Publication number: CN101255428B
Application number: CN2008100256046A
Authority: CN
Inventors: 王正询; 康国章; 杨礼香
Original assignee: Guangzhou University
Current assignee: Guangzhou University
Priority date: 2008-01-03
Filing date: 2008-01-03
Publication date: 2010-07-21
Anticipated expiration: 2028-01-03
Also published as: CN101255428A

Abstract

本发明提供了一种与植物抗盐性相关的F1基因，该基因是从经过0.5 mmol/L水杨酸和7℃冷胁迫处理的香蕉幼苗叶片中分离出来的，编码区序列为SEQ NO.1，编码由416个氨基酸组成的蛋白。本发明还提供了一种利用本发明F1基因培育抗盐转基因植物的方法，该方法是通过农杆菌介导将本发明F1基因以重组的方式整合到植物基因组DNA中。

Description

一种与植物抗盐性相关的基因及其在植物育种中的应用

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种脱氧核糖核酸及其在植物育种中的应用。

背景技术

目前，世界上有100多个国家存在着不同类型的盐碱地10亿公顷，约占全球可耕地面积10％。我国就有216×10⁷公顷，其中耕地约61×10⁶公顷，主要分布在新疆、甘肃等西北干旱半干旱地区。随着工业污染加剧、灌溉农业的发展和化肥使用不当等原因，次生盐碱化土壤面积有不断加剧的趋势，给农业生产造成重大损失。因此综合治理盐渍土、提高植物的耐盐性、开发利用盐水资源已成为未来农业发展及环境治理所亟待解决的重要课题。

近百年来，人们从基因工程角度对植物抗盐性进行了大量研究，取得了很大的进展。1987年Hickock发现蕨类植物Ceratopteris的配子体中的与抗盐性有关的两种单基因核突变st1₁和st1₂，这两个基因位于配子体1023品系的核基因组中，该品系自交产生的同源孢子体也具有明显的抗盐性，在孢子体第一叶期遗传分析表明，所有突变体结和型相都抗能60mmol/LNaCl，而野生型不能，其中+/st1₁和st1₁/st1₂两种基因型的植株能在含有100mmol/L NaCl的培养基上生长，但对其它逆境的抗性却不如野生型(郭善利、王秀芝(1998)。“植物抗盐性及其遗传工程”聊城师院学报：自然科学版11(002)：53-58。)。

热激蛋自是一种分子陪伴(moleculer chaperon)，可以使因温度升高而构型发生改变的蛋白质恢复并维持原有的三维构象，不致丧失功能而使机体得以存活。已有研究表明，除在热胁迫表达提高外，热激蛋白基因还在其它许多逆境如冷、干旱、重金属、病原菌等胁迫下高表达，是植物对逆境胁迫的一种防御机制，它可作为调控基因表达的转录因子，从而调控基因的表达，提高植物对逆境的耐受能力，如寒冷、干旱、盐渍等。唐国强等人发现用水杨酸处理香蕉幼苗的抗寒性明显提高，并用mRNA差异显示法分离出其中两个差异片段G和A，其中G片段的序列与大豆的两个与冷胁迫相关的高表达基因片段的部分序列有92％同源性，A片段未发现其同源性基因片段(康国章，朱国辉，等。(2004)。“用mRNA差异显示法分离冷胁迫香蕉幼苗叶片内水杨酸诱导表达的基因。”植物生理与分子生物学学报30(002)：225-228。)，表明这两个基因片段可能属于新的基因，但该文对这两个基因片段所在的基因全序列以及功能均未提及。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与植物抗盐性相关的基因。

本发明的另一目的在于提供该基因在植物育种中的应用。

本发明实现上述目的的技术方案是：

一种与植物抗盐性相关的F1基因，其特征在于该基因的编码区序列为SEQ NO.1。

本发明基因是从经过0.5mmol/L水杨酸和7℃冷胁迫处理的香蕉幼苗叶片中分离出来的，命名为F1，编码区序列长1251bp，编码由416个氨基酸组成的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为SEQ NO.2。通过在genbank中的比对结果发现，本发明F1基因与所编码的氨基酸序列与玉米的热激蛋白AAC08009有88％的同源性，与水稻的热激蛋白AAX95135也有88％的同源性，与其他基因的同源性都较低，因此可以推断本发明F1基因所编码的蛋白质可能属于热激蛋白。

本发明人发现，将本发明F1基因转入普通植株后，植株的抗盐性明显提高，这可能与该基因的表达产物能调节植物体内活性氧代谢系统的平衡有关。在盐胁迫下，植物体内活性氧代谢系统的平衡受到影响，活性氧的含量大大增加，抗氧化系统的活性大大降低。本发明F1基因在植物中表达后，其表达产物可能是作为调控基因表达的转录因子，调控活性氧代谢系统相关基因的表达，提高细胞的抗氧化系统的活性，从而增强了植物对盐的耐受性。另一方面，已有实验证明钙离子对盐胁迫信号调节也起着非常重要的作用，而F1基因的表达可能也有助于维持细胞体内钙离子的内稳态。

本发明F1基因可用于抗盐胁迫转基因植物的育种，具体方法可以是采用基因直接导入法将F1基因重组整合到植物基因组中，也可以通过构建F1基因的植物表达载体并转染到植物细胞中。

所述的采用基因直接导入法将所述F1基因重组整合到植物基因组中的方法由以下步骤组成：

(1)用引物SEQ NO.21和SEQ NO.22扩增所述F1基因获得序列为SEQ NO.1的DNA片段；

(2)将序列为SEQ NO.1的DNA片段正向插入到表达载体中构建出含有序列为SEQ NO.1的DNA片段的重组载体；

(3)将序列为SEQ NO.1的DNA片段的重组载体转化到农杆菌中，然后按照农杆菌介导转基因法将含有序列为SEQ NO.1的DNA片段的重组载体以重组的方式整合到植物的基因组DNA中；

(4)通过所用表达载体携带的标记筛选出成功转入序列为SEQ NO.1的DNA片段的重组载体的植株，然后将所得植株正常培养，最后收获种子，即可。

其中步骤(3)中所述的农杆菌介导转基因法(floral dip)的具体操作步骤参见《Asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana》(Clough SJand Bent AF(1998)Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana．Plant J 16：735-743)

附图说明

图1是在3’-RACE中，通过5′CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3′，和3′，RACEOuter Primer引物对香蕉cDNA扩增的PCR产物电泳图，得到一条1100bp的条带。其中1为DNA Marker DL2,000，2为Outer PCR产物。

图2是在3’-RACE中，通过5′CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3′，和3′，RACEInner Primer引物，以Outer PCR产物为模板扩增的PCR产物，其中1为DNA Marker DL2,000，2为用Inner primer和Outer PCR产物作模板扩增的条带。

图3是通过5’-RACE得到的片段的电泳图，其中，M：DNA Marker DL2,000；1：PCR产物(57℃退火)；2：阴性对照(57℃退火)；3：PCR产物(55℃退火)；4：阴性对照(55℃退火)。

图4是用引物FIF1和F1R1扩增F1基因获得的编码区片段的电泳图。其中，2为Takara的2000bp的Marker，1为目的基因F1 PCR扩增产物。

图5是转F1基因拟南芥植株的PCR鉴定。其中，1：质粒pMD/F1对照，2：野生型拟南芥植株对照，3～9：7株转基因拟南芥的PCR结果，M：Takara的2000bp的Marker。

图6是野生型和转F1基因拟南芥幼苗含有NaCl和不含NaCl的1/2MS固体培养基上生长情况。其中，6-A为在不含NaCl的1/2MS固体培养基中的生长情况图，黑线左边的是转F1基因拟南芥幼苗，黑线右边的是野生型拟南芥幼苗；6-B为在含有100mM NaCl的1/2MS固体培养基中的生长情况图，黑线左边的是转F1基因拟南芥幼苗，黑线右边的是野生型拟南芥幼苗；6-C为在含有150mM NaCl的1/2MS固体培养基中的生长情况图，黑线左边的是转F1基因拟南芥幼苗，黑线右边的是野生型拟南芥幼苗。

图7是野生型和转F1基因拟南芥幼苗含有NaCl和不含NaCl的1/2MS固体培养基上生长情况的柱型比较图，其中■表示野生型的根长度，

表示转F1基因型的根长度。

具体实施方式

例1本发明F1基因的分离

1、水杨酸诱导冷胁迫香蕉幼苗差异基因的表达

用0.5mmol/L水杨酸(salicylic acid，SA)在常温下以喷洒和灌根的方式对香蕉(威廉姆斯8188 Musa acumina)幼苗进行处理，常温放置1天后，而后对香蕉幼苗进行7℃低温胁迫处理3天。

2、RNA的提取

以7℃低温胁迫3天后SA处理的香蕉幼苗最上部刚全展叶片，和不施用SA(施用蒸馏水)的低温胁迫香蕉幼苗最上部刚全展开叶片为材料，提取总RNA(核糖核酸)，再进一步分离mRNA(信使核糖核酸)，RNA分离方法见上海生工生物工程技术服务有限公司UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒使用说明。

3、cDNA的合成

通过反转录将上述mRNA转录为cDNA(互补脱氧核糖核苷酸)，具体方法见上海生工生物工程技术服务有限公司MMLV第一链cDNA合成试剂盒使用说明。

4、对上述SA处理和对照的cDNA进行差异显示分析

用两对锚定引物：

SEQ NO.3： 5’-AAgCT₁₁A-3’

SEQ NO.4： 5’-AAgCT₁₁C-3’

和8对随机引物：

SEQ NO.5： 5’-AAgCTTgATTgCC-3’

SEQ NO.6： 5’-AAgCTTcgACTgT-3’

SEQ NO.7： 5’-AAgCTTTggTCAg-3’

SEQ NO.8： 5’-AAgCTTCTCAACg-3’

SEQ NO.9： 5’-AAgCTTAgTAggc-3’

SEQ NO.10： 5’-AAgCTTgCACCAT-3’

SEQ NO.11： 5’-AAgCTTAAcgAgg-3’

SEQ NO.12： 5’-AAgCTTTTACCgc-3’

共做了16个引物组合的扩增，以上述SA处理和对照的cDNA为模板进行PCR扩增。扩增程序为：94℃5分钟；30个循环的94℃15秒，65℃30秒，72℃2分钟；最后在72℃延伸10分钟。扩增产物经PAGE电泳后，再进行银染显色。每个组合的银染图谱上大约有15～50条带，共显示出的带有500多条，其中有100多条差异带。对SA诱导的高水平表达的或诱导新出现的条带进行了回收，共回收了18条差异带。

对差异片段进行反向Northern杂交，以鉴定这些差异片段的真假，发现其中7个点的杂交亮度存在着明显差异，其中一个片段在水杨酸处理的叶片中高表达，而在对照叶片中表达量非常低，差异非常显著。

扩增这个片段所用的引物组合为：5’-AAgCTTAAcgAgg-3’(SEQ NO.11)和5’-AAgCT₁₁C-3’(SEQ NO.4)。

把此片段回收后，克隆进pEGM easy T载体中，然后再转入大肠杆菌中，通过蓝白斑筛选，挑选白色单菌落斑，经菌落PCR扩增验证后，对能扩增出目的条带的白色菌落进行摇菌，取部分菌液进行测序(大连宝生物公司用ABI377测序仪测序)，测序结果表明此片段的碱基序列为SEQ NO.13，长度为254bp。

5、基因全长的获得

(1)3’-RACE：

试剂：

TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒(Code No.D314)，购自TaKaRa。

TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)购自TaKaRa。

特异性引物：

SEQ NO.14：5′CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3′

SEQ NO.15：5′TGTCGTTGTGGTAACCTTGTGGCT 3′。

方法：

使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0，以香蕉总RNA为模板合成cDNA；以cDNA为模板，5′CGAGGAGGATGACGATATGCATGG 3′和3′RACE Outer Primer一对引物进行Outer PCR扩增。取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示；以Outer PCR产物为模板，5′TGTCGTTGTGGTAACCTTGTGGCT 3′和3′RACE Inner Primer两条引物，进行Inner PCR扩增。取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示；使用TaKaRaAgaroseGel DNAPurification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收目的片段，并将此片段克隆到pMD18-T上，经蓝白斑筛选，挑选阳性菌落，进行摇菌，测序，得到基因的3’端序列SEQNO.16。

(2)5’-RACE：

试剂：

First Choice

RLM-RACE试剂盒，购自Ambion

TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)购自TaKaRa

TaKaRa LA Taq，购自TaKaRa

TaKaRa DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(Code No.D6023)，购自TaKaRa

pMD18-T simple Vector(Code No.D104)，购自TaKaRa。

特异性引物：

SEQ NO.17：5′ATTAGGGTTCGGTCGGCAAGATGT 3′

SEQ NO.18：5′AGCCACAAGGTTACCACAACGACA 3′。

方法：

使用First Choice

RLM-RACE试剂盒对香蕉Total RNA进行去磷，去帽并与5′RACEAdaptor连接后反转录成cDNA。然后使用TaKaRa LA Taq

，以5′RACE Outer Primer和5′ATTAGGGTTCGGTCGGCAAGATGT-3′一对引物进行Outer PCR扩增，再以Outer PCR产物为模板，5′RACE Inner Primer和5′-AGCCACAAGGTTACCACAACGACA-3′为引物进行Inner PCR扩增。取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。使用TaKaRa AgaroseGel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收上述片段。使用TaKaRa DNALigation Kit<Mighty Mix>(Code No.D6023)中的连接酶，将上述PCR产物(CTA856-1)与pMD18-T simple Vector(Code No.D104)连接后，热转化至大肠杆菌(Code No.D9052)中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌落摇菌，提取质粒后，将质粒DNA进行测序，得基因的5′端序列SEQ NO.19。

把此序列与上述通过差异显示得到的片段序列进行同源性比较分析，发现存在着许多相同的序列，表明得到了完整的5’端序列。

(3)全长的获得：把通过差异显示得到的基因片段、3’-RACE和5’-RACE得到的序列进行拼接，从而得到了此基因的全长序列SEQ NO.20，全长1783bp，包括221bp的5′-非编码区、299bp的3′-非编码区、1251bp的编码区、终止子和12bp的多聚腺苷酸尾，其编码区位于基因全长的第222bp-1472bp之间。

6、基因全长的同源性比较：

本发明基因的CDS为SEQ NO.1，1251bp，编码了417个氨基酸，其中富含亲水性氨基酸，在GenBank中进行对其编码域(CDS)序列进行同源性比较，结果显示，未发现同源性高的的基因，证明本发明基因为新的香蕉基因。本发明基因所编码的氨基酸与玉米的热激蛋白AAC08009有88％的同源性，与水稻的热激蛋白AAX95135也有88％的同源性，表明所获得的全长基因可能是一种热激蛋白基因。

本发明F1基因编码的氨基酸与玉米AAC0800热激蛋白的比较结果如下所示：

Identities＝372/419(88％)，Positives＝397/419(94％)，Gaps＝3/419(0％)

F1 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKNASQEDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60

MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPK+ASQ+DLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV

AAC0800 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKSASQDDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60

F1 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGGH-NPFDIFESFFGGNPFGGGGSSRGRRQRRGED 119

LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGG H +PFDIF SFFG + GGGGSSRGRRQRRGED

AAC0800 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGSHVDPFDIFSSFFGPSFGGGGGSSRGRRQRRGED 120

F1 VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVICQKCKGKGSKSGASMKCSGCQGSGMKVTIRQLG 179

V+HPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVIC KCKGKGSKSGASM+C GCQGSGMKVTIRQLG

AAC0800 VVHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVICSKCKGKGSKSGASMRCPGCQGSGMKVTIRQLG 180

F1 PGMIQQMQHPCNECKGTGETINDKDRCPQCKGEKVVPEKKVLEVIVEKGMQNGQKITFPG 239

P MIQQMQ PCNECKGTGE+IN+KDRCP CKGEKV+ EKKVLEV VEKGMQ+ QKITFPG

AAC0800 PSMIQQMQQPCNECKGTGESINEKDRCPGCKGEKVIQEKKVLEVHVEKGMQHNQKITFPG 240

F1 EADEAPETVTGDIVFVLQQKDHPKFKRKGDDLFYEHALSLTEALCGFRFVLTHLDNRQLL 299

EADEAP+TVTGDIVFVLQQKDH KFKRKG+DLFYEH LSLTEALCGF+FVLTHLDNRQLL

AAC0800 EADEAPDTVTGDIVFVLQQKDHSKFKRKGEDLFYEHTLSLTEALCGFQFVLTHLDNRQLL 300

F1 IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMRGKLYIHFTVDFPDSMTPEQCKALEAVLPP 359

IKS+PGEVVKPDQFKAINDEGMP+YQRPFM+GKLYIHFTV+FPDS+ PEQCKALE VLPP

AAC0800 IKSDPGEVVKPDQFKAINDEGMPIYQRPFMKGKLYIHFTVEFPDSLAPEQCKALETVLPP 360

F1 KPASQMTDMELDECEETTLHDV-NI EEEMRRKQAQ-AQEAYEEDDDMHGGAQRVQCAQQ 416

+P+S++TDME+DECEETT+HDV NI EEEMRRKQA AQEAYEEDD+M GGAQRVQCAQQ

AAC0800 RPSSKLTDMEIDECEETTMHDVNNI EEEMRRKQAHAAQEAYEEDDEMPGGAQRVQCAQQ 419

本发明所述的F1基因编码的氨基酸与水稻AAX95135热激蛋白的比较结果如下所示：

Identities＝371/418(88％)，Positives＝391/418(93％)，Gaps＝4/418(0％)

F1 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKNASQEDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60

MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPK ASQ+DLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV

AAX95135 MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKTASQDDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYEV 60

F1 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGGH-NPFDIFESFFGGNPFGGGGSSRGRRQRRGED 119

LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGG H+PFDIF S P GGGSSRGRRQRRGED

AAX95135 LSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGSHVDPFDIFSS--FFGPSFGGGSSRGRRQRRGED 118

F1 VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVICGKCKGKGSKSGASMKCSGCQGSGMKVTIRQLG 179

VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNV+C KCKGKGSKSGASM+C GCQGSGMK+TIRQLG

AAX95135 VIHPLKVSLEDLYNGTSKKLSLSRNVLCAKCKGKGSKSGASMRCPGCQGSGMKITIRQLG 178

F1 PGMIQQMQHPCNECKGTGETINDKDRCPQCKGEKVVPEKKVLEVIVEKGMQNGQKITFPG 239

P MIQQMQ PCNECKGTGE+IN+KDRCP CKGEKV+EKKVLEV VEKGMQ+ QKITFPG

AAX95135 PSMIQQMQQPCNECKGTGESINEKDRCPGCKGEKVIQEKKVLEVHVEKGMQHNQKITFPG 238

F1 EADEAPETVTGDIVFVLQQKDHPKFKRKGDDLFYEHALSLTEALCGFRFVLTHLDNRQLL 299

EADEAP+TVTGDIVFVLQQKDH KFKRKGDDLFYEH LSLTEALCGF+FVLTHLDNRQLL

AAX95135 EADEAPDTVTGDIVFVLQQKDHSKFKRKGDDLFYEHTLSLTEALCGFQFVLTHLDNRQLL 298

F1 IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMRGKLYIHFTVDFPDSMTPEQCKALEAVLPP 359

IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFM+GKLYIHFTV+FPDS+ PEQCKALEAVLPP

AAX95135 IKSNPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMKGKLYIHFTVEFPDSLAPEQCKALEAVLPP 358

F1 KPASQMTDMELDECEETTLHDV-NI EEEMRRKQAQAQEAYEEDDDMHGGAQRVQCAQQ 416

KPASQ+T+ME+DECEETT+HDV NI EEEMRRK AQEAY+EDD+M GGAQRVQCAQQ

AAX95135 KPASQLTEMEIDECEETTMHDVNNI EEEMRRKAQAAQEAYDEDDEMPGGAQRVQCAQQ 416

例2 转F1基因拟南芥的制备

1、实验材料

拟南芥(Arabidopsis thaliana)，Columbia生态型(Col-0)，在温室中(22±2℃，长日照：16h光照，8h黑暗)种植：取拟南芥种子灭菌后，均匀地平铺1/2MS+kan抗生素固体培养基(1.0％的琼脂)上，在超净台上将平板吹干。4℃冰箱放置春化培养3天后，22℃光照培养箱中培养7天或8天，挑选生长到一定程度且长出绿色叶片的幼苗转种到营养土中，供给适宜水分，在温室中培养。

pMD载体，由Scofield，S.R.教授惠赠，该载体相关的文章发表在《Molecular basis ofgene-forgene specificity in bacterial speck disease of tomato》(Scofield，S.R.，Tobias，C.M.，Rathjen，J.P.，Chang，J.H.，Lavelle，D.T.，Michelmore，R.W.and Staskawicz，B.J.(1996)Molecular basis of gene-forgene specificity in bacterial speck disease of tomato.Science274：2063-2065.)，在各国菌种保藏中心或生物公司均可购得。

LB培养基配方：10g Trypton，5g Yeast extract，5g NaCl，1.5g琼脂，pH7.3-7.4。

质粒提取试剂盒(UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒)，DNA回收试剂盒(UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒)以及PCR相关试剂均购于上海生物工程有限公司。

未说明的试剂，如配制MS培养基的药品、琼脂糖、酚、氯仿、异戊醇、甲醇、乙醇、甲酸等，均为国产分析纯以上等级试剂。

引物由上海生物工程有限公司合成。

2、转F1基因拟南芥的制备

(1)目的基因的处理

将实施例1所得F1基因用以下引物进行PCR扩增：

F1F1(SEQ NO.21)：5′CGGGATCCATTAGGGTTCGGTCG 3′，

F1R1(SEQ NO.22)：5′CGGGATCCTCACTGCTGAGCACATTG 3′；

反应体系为：

10x Buffer 5μl

MgCl2 3μl

dNTP 1μl

F1F1(SEQ NO.20) 3μl

F1R1(SEQ NO.21) 3μl

Temple 1μl

Taq 1μl

ddH2O 33μl；

反应程序为：

94℃变性3min；

72℃延伸10min。

PCR扩增结果如图4所示。

(2)pMD载体的处理

a.用质粒提取试剂盒并按说明书中的方法从含有pMD质粒的大肠杆菌中提取出pMD质粒；

b.用BamHI酶切所得pMD质粒，使其线性化，方法是：取pMD质粒150μl、10x Bam Buffer20μl和BamHI 3μl，混合，用无菌水补充到200μl，37℃反应过夜。

c.用碱性磷酸酶处理已线性化的pMD质粒，使其去磷酸化，方法是：取已线性化的载体500ng、10X Buffer 3μl和碱性磷酸酶(CIAP，2U/μl)1μl，混合，用无菌水补充到30μl，点动离心，然后37℃条件下温育30min；再加入1μl CIAP，37℃条件下温育30min；最后加入0.1M EDTA(pH8.0)，使其终浓度为5mM，65℃条件下处理1h，终止反应。

(3)F1/pMD重组质粒的构建

将步骤(1)所得的扩增产物和步骤(2)所得产物用T4 DNA连接酶混合，于16℃反应过夜。

(4)转F1基因拟南芥的制备

①将F1/pMD重组质粒转化DH5α，提取F1基因正向插入的F1/pMD重组质粒。

a.感受态细胞的制备：将-20℃或-80℃贮存的DH5α原始菌液于LB平板上37℃培养16h活化后，从该平板上挑取一个单菌落分别在LB、LB/Amp和LB/kan三种平板上划线，37℃培养16h，后二者用于检查保存的菌种是否被污染，如果后二者都没有DH5α生长，表明菌种没有没污染。挑取单菌落接种于10ml LB液体培养基中，37℃，250r/min培养过夜；取1ml菌液转接到50ml 2×LB液体培养基(30℃预热)中，37℃、250r/min培养大约3h到OD达到0.45左右；冰上放置2h；4℃，3000r/min离心5min；弃上清，将沉淀重悬于25ml预冷的100mM CaCl₂中，冰上放置30-60min；4℃，3000r/min离心5min；弃上清，沉淀重悬于5ml冰上预冷的100mM CaCl₂中；加入1.6ml 80％的甘油至终浓度为20％；液氮中速冻，置于-80℃保存备用。

b.转化方法：将步骤a制备的感受态细胞置于冰上，待其融化后，加入F1/pMD重组质粒，轻敲壁以混匀；置于混合物冰上30min；于42℃水浴中热激45s，迅速置于冰中静置2min，然后加入800ul LB液，37℃100r/min培养1h；涂布于LB/Kan抗生素固体培养基上，吹干，37℃培养16h。

c.挑取LB/Kan抗生素固体培养基上的单菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，然后用引物35S(SEQ NO.23)和F1R1(SEQ NO.22)进行PCR扩增，能被扩增的质粒则为F1基因正向插入的F1/pMD重组质粒。

②转化农杆菌。

a.感受态农杆菌制备：将农杆菌GV3101划线在LB(Gen 25μg/ml)固体培养基，28℃培养48h；挑取单菌落接种到50ml LB(Gen 25μg/ml)液体培养基中，250rpm悬浮培养约24h；4℃，8000rpm，离心8min；弃上清，用4℃预冷的100mM CaCl₂重悬农杆菌；4℃，8000rpm，离心8min；弃上清，加入原始菌液1/50体积的100mM CaCl₂重悬菌体，置液氮中10秒钟，放入-80℃冰箱中保存备用；

b.转化：将感受态农杆菌置于冰上，加入F1基因正向插入的F1/pMD重组质粒，充分混匀，置冰上30min；置液氮中1分钟，迅速转入37℃水浴中，待其融化；加入1ml LB液体培养基，28℃，250rpm培养2～4h；6000rpm离心2min，将上清吸去500μl，振荡重悬菌体，并涂布到LB(Gen 25μg/ml，Kan 50μg/ml)固体培养基上，吹干；28℃，培养48h；挑取单菌落接种到LB(Gen 25μg/ml，Kan 50μg/ml)液体培养基中，28℃，250rpm培养48h。

③将转化后的农杆菌于22℃、5500rpm离心20min，去上清，用转化介质重悬；采用的拟南芥转化方法是floral dip方法(Clough SJ and Bent AF(1998)Floral dip：a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J 16：735-743)：取出转化过的拟南芥植株，避光保湿过夜。

④第二天将拟南芥放置在光下，正常培养，待其所有的角果完全枯黄、开裂时，即可收种子。

⑤取所收种子，重悬于10倍体积含0.01％Triton X-100的5％NaClO溶液中，放置5min，期间重悬数次；除去NaClO溶液，用0.1％的琼脂重悬种子，移至含50μg/ml Kan的1/2 MS固体培养基上，均匀地平铺，吹干；4℃冰箱放置2d，移至温室中，保证有充足的光照；约7d左右即可分辨出已转入F1/pMD重组质粒的拟南芥幼苗和野生型拟南芥幼苗：已转入F1/pMD重组质粒的植株具有Kan抗性，所以子叶为绿色，下胚轴较长，并具有较长的主根；而野生型没有Kan抗性，所以子叶为黄色，根较短；将绿色的拟南芥幼苗移至已用营养液浇透的营养土中，用薄膜保湿过夜。第二天移至光下，同野生型一样正常生长。

(5)转基因拟南芥的鉴定

①提取转基因植株T1代叶片的DNA，用引物F1F1(SEQ NO.21)和F1R1(SEQ NO.22)进行PCR扩增，PCR反应体系为：

DNA模板 10-100ng

10×PCR Buffer 2.0μl

2mM dNTP 2.0μl

25mM MgCl₂ 1.5μl

10mM F1F1 0.2μl

10mM F1R1 0.2μl

Taq Polymerase(5U/μl)0.2μl

ddH₂O 补充到20μl。

PCR扩增程序为：

94℃ 3min：

72℃ 10min；

4℃ forever。

②取扩增产物5μl在1.5％的琼脂糖凝胶上检测，检测结果如图5所示。

3、盐胁迫条件对野生型和转F1基因拟南芥幼苗的影响

(1)实验方法

①各取野生型和突变体种子50粒左右，装入1.5ml离心管中。

②经过表面灭菌后，通过0.1％的琼脂将种子分散地铺在1/2MS固体培养基上，吹干。

③4℃放置2天后移入温室，竖直生长4天。

④再将根长有1～1.5cm的野生型和突变体幼苗移至含有NaCl的1/2MS固体培养基上。

⑤倒置竖直生长5天，观察表型。

(2)实验结果如图6-A、6-B、6-C和图7所示，转F1基因拟南芥在不含NaCl的1/2MS固体培养基中正常生长、和野生型没有明显差异；但在含100mM和150mM NaCl的1/2MS固体培养基中，野生型拟南芥的幼苗的根较短，植株瘦小，明显发育不良，而本发明转F1基因拟南芥含100mM NaCl的1/2MS固体培养基中仍能正常生长，生长情况和在不含NaCl的1/2MS固体培养基中差异不大，在150mM NaCl的1/2MS固体培养基中生长受到较明显抑制，但总体生长情况也野生型的植株好。可见，本发明F1基因转入植物体内后能在盐胁迫环境下表达，并帮助植物提高对盐胁迫环境的抵抗能力。

序列表

<110>广州大学

<120>一种与植物抗盐性相关的基因及其在植物育种中的应用

<130>康国章，朱国辉，等。(2004)。″用mRNA差异显示法分离冷胁迫香蕉幼苗叶片内水

杨酸诱导表达的基因。″植物生理与分子生物学学报30(002)：225-228。

<160>23

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1251

<212>DNA

<213>Musa acumina

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1251)

<400>1

atg ttc ggg agg gcg ccg aag aag agc gac aac acc aag tac tac gag 48

Met Phe Gly Arg Ala Pro Lys Lys Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Tyr Glu

1 5 10 15

atc ctc ggg gta ccg aag aac gcg tcg cag gag gac ctc aag aag gcc 96

Ile Leu Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Gln Glu Asp Leu Lys Lys Ala

20 25 30

tac cgt aag gcc gcc atc aag aac cac ccc gat aag ggt ggc gat cca 144

Tyr Arg Lys Ala Ala Ile Lys Asn His Pro Asp Lys Gly Gly Asp Pro

35 40 45

gag aag ttc aag gag ttg gcc caa gct tat gag gtt ctg agc gat cct 192

Glu Lys Phe Lys Glu Leu Ala Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Pro

50 55 60

gag aaa cgt gag att tat gat cag tat ggt gaa gat gcc ctc aag gag 240

Glu Lys Arg Glu Ile Tyr Asp Gln Tyr Gly Glu Asp Ala Leu Lys Glu

65 70 75 80

gga atg ggt ggt gga ggt ggc cac aac cca ttc gat atc ttc gag tcg 288

Gly Met Gly Gly Gly Gly Gly His Asn Pro Phe Asp Ile Phe Glu Ser

85 90 95

ttc ttc ggt gga aat ccc ttc gga gga ggc gga agc agt cgc gga cga 336

Phe Phe Gly Gly Asn Pro Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Gly Arg

100 105 110

agg cag agg agg gga gag gat gtg atc cat cct ctg aag gtg tct ttg 384

Arg Gln Arg Arg Gly Glu Asp Val Ile His Pro Leu Lys Val Ser Leu

115 120 125

gag gac ctc tac aac ggg acc tcg aag aaa cta tcc ctt tcg cgg aat 432

Glu Asp Leu Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Lys Leu Ser Leu Ser Arg Asn

130 135 140

gtc atc tgc caa aag tgc aag ggg aag ggt tcg aag tct ggt gct tca 480

Val Ile Cys Gln Lys Cys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser

145 150 155 160

atg aag tgc tcc ggc tgt caa ggc tcg ggt atg aag gtc aca att cgt 528

Met Lys Cys Ser Gly Cys Gln Gly Ser Gly Met Lys Val Thr Ile Arg

165 170 175

cag tta ggg cct ggg atg atc caa caa atg cag cac cct tgc aac gag 576

Gln Leu Gly Pro Gly Met Ile Gln Gln Met Gln His Pro Cys Asn Glu

180 185 190

tgc aag ggg act ggg gag acc atc aat gat aag gat cgc tgc cca caa 624

Cys Lys Gly Thr Gly Glu Thr Ile Asn Asp Lys Asp Arg Cys Pro Gln

195 200 205

tgt aaa ggt gag aag gtt gtt ccc gag aag aaa gtg ctg gag gtt ata 672

Cys Lys Gly Glu Lys Val Val Pro Glu Lys Lys Val Leu Glu Val Ile

210 215 220

gtg gag aaa gga atg cag aat ggc cag aag atc acc ttc ccc gga gag 720

Val Glu Lys Gly Met Gln Asn Gly Gln Lys Ile Thr Phe Pro Gly Glu

225 230 235 240

gca gat gaa gca cct gag aca gtt act gga gac att gtg ttt gta ctt 768

Ala Asp Glu Ala Pro Glu Thr Val Thr Gly Asp Ile Val Phe Val Leu

245 250 255

caa cag aag gat cac cca aag ttc aag aga aag gga gat gat ctc ttc 816

Gln Gln Lys Asp His Pro Lys Phe Lys Arg Lys Gly Asp Asp Leu Phe

260 265 270

tac gag cac gca tta tcg ctc act gaa gct ctc tgt ggc ttc cga ttc 864

Tyr Glu His Ala Leu Ser Leu Thr Glu Ala Leu Cys Gly Phe Arg Phe

275 280 285

gtg ttg acc cat ttg gat aac aga cag cta ctg att aag tcc aac ccc 912

Val Leu Thr His Leu Asp Asn Arg Gln Leu Leu Ile Lys Ser Asn Pro

290 295 300

ggt gaa gtt gtg aag ccc gat caa ttc aag gca atc aat gac gag ggc 960

Gly Glu Val Val Lys Pro Asp Gln Phe Lys Ala Ile Asn Asp Glu Gly

305 310 315 320

atg ccg atg tac cag agg ccc ttc atg agg ggg aag ctc tac atc cac 1008

Met Pro Met Tyr Gln Arg Pro Phe Met Arg Gly Lys Leu Tyr Ile His

325 330 335

ttc acc gtg gac ttc cca gat tca atg aca cca gaa cag tgc aaa gcg 1056

Phe Thr Val Asp Phe Pro Asp Ser Met Thr Pro Glu Gln Cys Lys Ala

340 345 350

ctc gag gct gtt ctt ccc cca aag cct gca tcg cag atg acc gac atg 1104

Leu Glu Ala Val Leu Pro Pro Lys Pro Ala Ser Gln Met Thr Asp Met

355 360 365

gag ctg gat gag tgc gag gag acg aca ttg cat gat gtt aac atc gag 1152

Glu Leu Asp Glu Cys Glu Glu Thr Thr Leu His Asp Val Asn Ile Glu

370 375 380

gaa gag atg cgc agg aag cag gct cag gca cag gag gct tac gag gag 1200

Glu Glu Met Arg Arg Lys Gln Ala Gln Ala Gln Glu Ala Tyr Glu Glu

385 390 395 400

gat gac gat atg cat ggt ggt gcc cag aga gtg caa tgt gct cag cag 1248

Asp Asp Asp Met His Gly Gly Ala Gln Arg Val Gln Cys Ala Gln Gln

405 410 415

tga 1251

<210>2

<211>416

<212>PRT

<213>Musa acumina

<400>2

Met Phe Gly Arg Ala Pro Lys Lys Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Tyr Glu

1 5 10 15

Ile Leu Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Gln Glu Asp Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Tyr Arg Lys Ala Ala Ile Lys Asn His Pro Asp Lys Gly Gly Asp Pro

35 40 45

Glu Lys Phe Lys Glu Leu Ala Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Pro

50 55 60

Glu Lys Arg Glu Ile Tyr Asp Gln Tyr Gly Glu Asp Ala Leu Lys Glu

65 70 75 80

Gly Met Gly Gly Gly Gly Gly His Asn Pro Phe Asp Ile Phe Glu Ser

85 90 95

Phe Phe Gly Gly Asn Pro Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Gly Arg

100 105 110

Arg Gln Arg Arg Gly Glu Asp Val Ile His Pro Leu Lys Val Ser Leu

115 120 125

Glu Asp Leu Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Lys Leu Ser Leu Ser Arg Asn

130 135 140

Val Ile Cys Gln Lys Cys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser

145 150 155 160

Met Lys Cys Ser Gly Cys Gln Gly Ser Gly Met Lys Val Thr Ile Arg

165 170 175

Gln Leu Gly Pro Gly Met Ile Gln Gln Met Gln His Pro Cys Asn Glu

180 185 190

Cys Lys Gly Thr Gly Glu Thr Ile Asn Asp Lys Asp Arg Cys Pro Gln

195 200 205

Cys Lys Gly Glu Lys Val Val Pro Glu Lys Lys Val Leu Glu Val Ile

210 215 220

Val Glu Lys Gly Met Gln Asn Gly Gln Lys Ile Thr Phe Pro Gly Glu

225 230 235 240

Ala Asp Glu Ala Pro Glu Thr Val Thr Gly Asp Ile Val Phe Val Leu

245 250 255

Gln Gln Lys Asp His Pro Lys Phe Lys Arg Lys Gly Asp Asp Leu Phe

260 265 270

Tyr Glu His Ala Leu Ser Leu Thr Glu Ala Leu Cys Gly Phe Arg Phe

275 280 285

Val Leu Thr His Leu Asp Asn Arg Gln Leu Leu Ile Lys Ser Asn Pro

290 295 300

Gly Glu Val Val Lys Pro Asp Gln Phe Lys Ala Ile Asn Asp Glu Gly

305 310 315 320

Met Pro Met Tyr Gln Arg Pro Phe Met Arg Gly Lys Leu Tyr Ile His

325 330 335

Phe Thr Val Asp Phe Pro Asp Ser Met Thr Pro Glu Gln Cys Lys Ala

340 345 350

Leu Glu Ala Val Leu Pro Pro Lys Pro Ala Ser Gln Met Thr Asp Met

355 360 365

Glu Leu Asp Glu Cys Glu Glu Thr Thr Leu His Asp Val Asn Ile Glu

370 375 380

Glu Glu Met Arg Arg Lys Gln Ala Gln Ala Gln Glu Ala Tyr Glu Glu

385 390 395 400

Asp Asp Asp Met His Gly Gly Ala Gln Arg Val Gln Cys Ala Gln Gln

405 410 415

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aagctttttt ttttta 16

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aagctttttt tttttc 16

<210>5

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aagcttgatt gcc 13

<210>6

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

aagcttcgac tgt 13

<210>7

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

aagctttggt cag 13

<210>8

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

aagcttctca acg 13

<210>9

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

aagcttagta ggc 13

<210>10

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

aagcttgcac cat 13

<210>11

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

aagcttaacg agg 13

<210>12

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

aagcttttac cgc 13

<210>13

<211>254

<212>DNA

<213>Musa acumina

<400>13

aagcttaacg aggaggatga cgatatgcat ggtggtgccc agagagtgca atgtgctcag 60

cagtgagcaa aaatcttttt ggaatcagct gagttcgtga tgagctccgt actctttcag 120

ttgtctgcgt actgattact gtgtcgatca ttgtcgttgt ggtaaccttg tggccgaaca 180

ctatacctag ttcatgttgt cttgttcacg tttaaaccga tctcctcgat cttttctgga 240

aaaaaaaaaa gctt 254

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cgaggaggat gacgatatgc atgg 24

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

tgtcgttgtg gtaaccttgt ggct 24

<210>16

<211>370

<212>DNA

<213>Musa acumina

<400>16

cgaggaggat gacgatatgc atggtggtgc ccagagagtg caatgtgctc agcagtgaac 60

aaaaatcttt ttggaatcag ctgagttcgt gatgagctcc gtactctttc agttgtctgc 120

gtactgatta ctgtgtcgat cattgtcgtt gtggtaacct tgtggctgaa cactatacct 180

agttcatgtt gtcttgttca cgtttaaacc gatctcctcg atcttttctg gaaacattct 240

cttattccat gagcatatgt gaggtgcaat cgaggcagaa gaacattact accatcgtta 300

tttgtttgac tgatatttta gaatttaaat ggacaagtta tgtgatgcct gtttgagcaa 360

aaaaaaaaaa 370

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

attagggttc ggtcggcaag atgt 24

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

agccacaagg ttaccacaac gaca 24

<210>19

<211>1493

<212>DNA

<213>Musa acumina

<400>19

atccatcgac aagggttctc ggagtcgagg tcggcagcgt tgcggtggtc ttgaatcggg 60

agtaggcaag acctgggggc ccgatttctc attcagtttg gggaagatcg attagggttc 120

ggtcggcaag atgttcggga gggcgccgaa gaagagcgac aacaccaagt actacgagat 180

cctcggggta ccgaagaacg cgtcgcagga ggacctcaag aaggcctacc gtaaggccgc 240

catcaagaac caccccgata agggtggcga tccagagaag ttcaaggagt tggcccaagc 300

ttatgaggtt ctgagcgatc ctgagaaacg tgagatttat gatcagtatg gtgaagatgc 360

cctcaaggag ggaatgggtg gtggaggtgg ccacaaccca ttcgatatct tcgagtcgtt 420

cttcggtgga aatcccttcg gaggaggcgg aagcagtcgc ggacgaaggc agaggagggg 480

ggaggatgtg atccatcctc tgaaggtgtc tttggaggac ctctacaacg ggacatcgaa 540

tggtgcttca atgaagtgct ccggctgtca aggttcgggt atgaaggtca caattcgtca 600

gttagggcct gggatgatcc aacaaatgca gcacccttgc aacgagtgca aggggactgg 660

ggagaccatc aatgataagg atcgctgccc acaatgtaaa ggtgagaagg ttgttcccga 720

gaagaaagtg ctggaggtta tagtggagaa aggaatgcag aatggccaga agattacctt 780

ccccggagag gcagatgaag cacctgagac agttactgga gacattgtgt ttgtacttca 840

acagaaggat cacccaaagt tcaagagaaa gggagatgat ctcttctacg agcacgcatt 900

atcgctcact gaggctctct gtggcttccg attcgtgttg tcccatttgg ataacagaca 960

gctactgatt aagtccaacc ccagtgaagt tgtgaagccc gatcaattca aggcaatcaa 1020

tgacgagggc atgccgatgt accagaggcc cttcatgagg gggaagctct acatccactt 1080

caccgtggac ttcccagatt caatgacacc agaacagtgc aaagctctcg agtctgttct 1140

tcccccaaag cctgcatcgc agatgaccga catggagctg gatgagtgcg aggagacgac 1200

attgcatgat gttaacatcg aggaagagat gcgcaggaag caggctcagg cacaggaggc 1260

ttacgaggag gatgacgata tgcatggtgg tgcccagaga gtgcaatgtg ctcagcagtg 1320

arcaaaaatc tttttggaat cagctgagtt cgtgatgagc wccgtactct ttcagttgtc 1380

tgcgtactga ttactgtgtc gatcattgtc gttgtggtaa ccttgtggcc gaacactata 1440

cctagttcat gttgtcttgt tcacgtttaa accgatctcc tcgatctttt ctg 1493

<210>20

<211>1783

<212>DNA

<213>Musa acumina

<400>20

accggtgcga tagggcttct ggttctagag gcttcttttt ggccgcccca tccgccttat 60

agccctcgcc tctccttcct tgcctcgagc catccatcga caagggttct cggagtcgag 120

gtcggcagcg ttgaggtggt cttgaatcgg gagtaggcaa gccctgaggg cccgatttct 180

cattcagttt ggggaagatc gattagggtt cggtcggcaa gatgttcggg agggcgccga 240

agaagagcga caacaccaag tactacgaga tcctcggggt accgaagaac gcgtcgcagg 300

aggacctcaa gaaggcctac cgtaaggccg ccatcaagaa ccaccccgat aagggtggcg 360

atccagagaa gttcaaggag ttggcccaag cttatgaggt tctgagcgat cctgagaaac 420

gtgagattta tgatcagtat ggtgaagatg ccctcaagga gggaatgggt ggtggaggtg 480

gccacaaccc attcgatatc ttcgagtcgt tcttcggtgg aaatcccttc ggaggaggcg 540

gaagcagtcg cggacgaagg cagaggaggg gagaggatgt gatccatcct ctgaaggtgt 600

ctttggagga cctctacaac gggacctcga agaaactatc cctttcgcgg aatgtcatct 660

gccaaaagtg caaggggaag ggttcgaagt ctggtgcttc aatgaagtgc tccggctgtc 720

aaggctcggg tatgaaggtc acaattcgtc agttagggcc tgggatgatc caacaaatgc 780

agcacccttg caacgagtgc aaggggactg gggagaccat caatgataag gatcgctgcc 840

cacaatgtaa aggtgagaag gttgttcccg agaagaaagt gctggaggtt atagtggaga 900

aaggaatgca gaatggccag aagatcacct tccccggaga ggcagatgaa gcacctgaga 960

cagttactgg agacattgtg tttgtacttc aacagaagga tcacccaaag ttcaagagaa 1020

agggagatga tctcttctac gagcacgcat tatcgctcac tgaagctctc tgtggcttcc 1080

gattcgtgtt gacccatttg gataacagac agctactgat taagtccaac cccggtgaag 1140

ttgtgaagcc cgatcaattc aaggcaatca atgacgaggg catgccgatg taccagaggc 1200

ccttcatgag ggggaagctc tacatccact tcaccgtgga cttcccagat tcaatgacac 1260

cagaacagtg caaagcgctc gaggctgttc ttcccccaaa gcctgcatcg cagatgaccg 1320

acatggagct ggatgagtgc gaggagacga cattgcatga tgttaacatc gaggaagaga 1380

tgcgcaggaa gcaggctcag gcacaggagg cttacgagga ggatgacgat atgcatggtg 1440

gtgcccagag agtgcaatgt gctcagcagt gaacaaaaat ctttttggaa tcagctgagt 1500

tcgtgatgag ctccgtactc tttcagttgt ctgcgtactg attactgtgt cgatcattgt 1560

cgttgtggta accttgtggc tgaacactat acctagttca tgttgtcttg ttcacgttta 1620

aaccgatctc ctcgatcttt tctggaaaca ttctcttatt ccatgagcat atgtgaggtg 1680

caatcgaggc agaagaacat tactaccatc gttatttgtt tgactgatat tttagaattt 1740

aaatggacaa gttatgtgat gcctgtttgg caaaaaaaaa aaa 1783

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

cgggatccat tagggttcgg tcg 23

<210>22

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

cgggatcctc actgctgagc acattg 26

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

gaaacctcct cggattccat 20

Claims

1.一种与植物抗盐性相关的F1基因，该基因的编码区序列为SEQ NO.1。

2.权利要求1所述F1基因在抗盐胁迫转基因植物育种中的应用。

3.一种抗盐胁迫转基因植物育种的方法，该方法由以下步骤组成：

(1)用序列为SEQ NO.21和SEQ NO.22的引物扩增权利要求1所述F1基因获得序列为SEQ NO.1的DNA片段；

(3)将含有序列为SEQ NO.1的DNA片段的重组载体转化到农杆菌中，然后按照农杆菌介导转基因法将含有序列为SEQ NO.1的DNA片段的重组载体以重组的方式整合到植物的基因组DNA中；

(4)通过所用表达载体携带的标记筛选出成功转入含有序列为SEQ NO.1的DNA片段的重组载体的植株，然后将所得植株正常培养，最后收获种子，即可。