CN105063068A - 编码突变的epsps基因、其表达载体、表达产物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的<i>EPSPS</i>基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.2所示，以及该<i>EPSPS</i>基因的表达产物，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？No.3所示；本发明还涉及一种抗除草剂基因CTP2-<i>EPSPS</i>，含有叶绿体转运肽CTP2和权利要求1所述<i>EPSPS</i>基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.5所示，以及其表达产物、表达载体和其在培育抗草甘膦转基因玉米中的应用<b>。</b>本发明抗除草剂基因可在作物中稳定表达、且表达量高、耐除草剂效果好，能转化玉米或其它植物，从而提高玉米等植物的耐除草剂特性，为解决玉米等植物生产中的耐除草剂特性提供一条有效途径。

Description

编码突变的EPSPS基因、其表达载体、表达产物及其应用

技术领域

本发明涉及基因生物工程领域，具体涉及一种新的5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因、其表达载体、表达产物及其在培育抗草甘膦转基因玉米中的应用，它对那些在EPSPS活性中作为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）竞争性抑制剂的除草剂表现出增强的抗性。

背景技术

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是细菌、真菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键酶，在莽草酸途径中催化底物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruate，PEP)和莽草酸-3-磷酸（shikimate-3-phosphate，S3P）合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP）。草甘膦是底物PEP的结构类似物，可以竞争性地与EPSPS结合，从而抑制EPSPS活性，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，扰乱生物体正常的氮代谢而使其死亡。EPSPS只在植物和微生物中存在，在动物中不存在。植物可以通过转化对草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而获得抗草甘膦的能力，而根癌农杆菌CP4的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。

EPSPS主要分为两种类型：I型和Ⅱ型。I型主要来源于植物和大肠杆菌，对草甘膦敏感；Ⅱ型通常来源于对草甘膦有一定耐受性的微生物，对草甘膦的敏感性较差，有一定的草甘膦抗性。目前，植物获得草甘膦抗性主要采用3种方法：（1）通过超表达EPSPS基因使得植物细胞对一定剂量的草甘膦产生抗性；（2）通过EPSPS的作用活性位点变化，改变其空间构型，一方面降低其与草甘膦的亲和能力，另一方面提高其与底物PEP和S3P的亲和能力，使植物细胞产生草甘膦抗性；（3）通过导入草甘膦降解基因，比如利用草甘膦乙酰转移酶将草甘膦乙酰化，从而使草甘膦失活的机制。

80年代美国孟山都(Monsnato)公司以其拥有广谱、高效除草剂农达(草甘麟)的优势而率先开始除草剂抗性基因的转移研究与抗性品种的开发。自此促进了全球抗除草剂转基因研究的蓬勃发展，抗除草剂种类不断增加，抗性品种范围快速扩大。国内进行耐除草剂基因研究主要集中于EPSPS基因。中山大学利用鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌aroA基因的重组，获得突变后与原底物亲和力增大，而对草甘膦亲和力下降的EPSPS（Heetal,2001）。北京大学王忆平课题组获得了一个新型高效抗草甘膦基因4G-1aroA，该基因在核酸水平上与已知基因没有同源性，在氨基酸水平上只有37%左右的相似性，为耐草甘膦转基因作物的研究提供了候选基因(Sunetal,2005)。中国农业科学院林敏课题组从长期被草甘膦污染的土壤中分离到一株草甘膦耐受菌株-荧光假单胞菌G2，其草甘膦耐受浓度为150mmol/L，并从中克隆了编码EPSPS的G2aroA基因。中国农业大学国家玉米改良中心赖锦盛课题组，在极端污染的土壤中得到高抗草甘膦的菌株并从中克隆到细菌EPSPS基因，通过定点突变植物内源基因获得抗草甘膦的EPSPS基因。目前，生产上常用的CP4-EPSPS基因，来自土壤农杆菌CP4，是通过细菌培养筛选分离出来的抗性优良的基因。应用的I型EPSPS基因主要是E.coli和玉米的EPSPS基因，基因种类单一稀少。因此，寻找新型高抗草甘膦基因是培育抗草甘膦转基因作物的一个重要途径。

玉米是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，农田杂草给玉米生产带来严重的干扰和损失，造成玉米大量减产，因此采取有效措施控制其危害对提高玉米产量、增加农民收入具有重要的意义。草甘膦是一种施用于叶片的、广谱的、非选择性的有机磷类除草剂，它对于许多一年生和多年生杂草都有极强的控制能力。但是，这种对重要农田杂草活性强的除草剂对农作物的伤害更大，除草剂消灭杂草和不伤害作物的选择性很难获得，培养和选育抗除草剂品种才是最根本最方便的控制杂草的方法。因此，寻找新型具有自主知识产权的高抗草甘膦基因以及培育新型抗除草剂转基因玉米是解决上述问题的最有效途径之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可在作物中稳定表达、且表达量高、耐除草剂效果好的EPSPS基因及其编码蛋白，并将其应用于表达载体、宿主细胞的转化构建等。

本发明的另一目的是将改造抗除草剂基因EPSPS转化玉米或其它植物，从而提高玉米等植物的耐除草剂特性。通过转基因及常规育种手段，把抗除草剂基因EPSPS转入生产中普遍应用的骨干自交系中，为解决玉米等植物生产中的耐除草剂特性提供一条有效途径。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

在对细菌培养筛选分离出来自土壤农杆菌抗性优良的基因CP4-EPSPS（SEQIDNo.1）进行的大量改造试验研究过程中，发现采用以下方法和步骤获得了预料不到的技术效果：

用部分的密码子置换序列相对应的密码子，排除常用限制性酶切位点（SacI和XbaI），然后通过置换密码子的方法进行改正消除，并在3端加上终止密码子TAG，并通过人工合成的方法实现第二位丝氨酸到亮氨酸的氨基酸突变，获得了一个改造后的突变的EPSPS基因序列（如SEQIDNO.2所示），其对应的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

另外，在改造的EPSPS基因5端前面加上了CTP2的叶绿体导肽序列（SEQIDNO.4）；然后确定并化学合成抗除草剂基因CTP2-EPSPS，如序列表SEQIDNO.5所示的编码序列；研究表明，在植物细胞中，EPSPS基因存在于细胞核中，但成熟蛋白位于叶绿体内，信号肽位于EPSPS前体的N端，引导其进入叶绿体基质后被水解，前体蛋白成为成熟的EPSPS；进一步研究发现，叶绿体转运肽对EPSPS行使正常功能是必须的，在蛋白结构及功能一致的前提下，如果去掉信号肽，植物组织中EPSPS蛋白表达量一致，但植株的草甘膦抗性不同，带有信号肽的EPSPS蛋白草甘膦抗性更强。

根据基因功能分析的需要，进一步对合成的产物进行PCR克隆并测序，并将合成正确的基因装载在质粒载体pUC57上。

本发明进一步的构建了包含35S启动子的DNA，该启动子在植物细胞中有启动目的基因表达的功能，可以有效地与改造后的EPSPS基因连接。

本发明还研究了培育转基因植物的方法，包括将本发明基因与植物表达载体可操作地连接，在允许植物表达载体能被受体植物细胞摄取的条件下，将受体细胞与植物表达载体共同培养；选择包含植物表达载体的受体细胞；受体细胞经过选择、再生、炼苗等阶段，获得转基因苗，得到耐受草甘膦的转基因植物。

本发明的又一个方面是包含具有改造的EPSPS植物表达载体的耐受草甘膦的转基因植物，以其与其它植物杂交，获得的耐受草甘膦的子代植物。

本发明的又一方面是将改造的EPSPS基因转化玉米、棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗除草剂活性。

例如，利用上述EPSPS基因培育抗草甘膦转基因玉米的方法，包括如下步骤：

（1）EPSPS基因合成：人工合成上述编码突变的EPSPS基因或抗除草剂基因CTP2-EPSPS，并将其装载在质粒载体pUC57上，得到含有CTP2-EPSPS基因的pUCCTP2-EPSPS载体质粒；

（2）植物表达载体构建

①用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切T载体质粒pUCCTP2-EPSPS，用凝胶回收纯化试剂盒回收CTP2-EPSPS片段；同时用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切植物表达载体CPB，用凝胶回收纯化试剂盒回收酶切后的CPB片段；

②将上步纯化后的两片段进行连接反应，构建成植物表达载体pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS，启动子为35S，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar；

③将质粒pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS用XbaI和SacI进行酶切鉴定，鉴定出植物表达载体中含有高赖氨酸基因CTP2-EPSPS片段，表明载体构建正确；

（3）农杆菌转化：采用根瘤农杆菌介导法将含抗除草剂基因CTP2-EPSPS片段的重组表达载体pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS导入玉米愈伤组织，经过侵染、恢复、选择、再生、炼苗阶段，获得转基因幼苗；

（4）育种：将转基因幼苗从培养瓶中取出移栽至营养钵或田间，常规条件下培育，转基因植物开花后套袋自交或姊妹交结实，成熟后收获种子。

本领域技术人员还可以将本发明基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产抗除草剂蛋白，并将其制备成除草剂农药，用于农作物杂草的防治。

本发明具有积极有益的效果：

本发明编码突变的EPSPS序列与改造前的EPSPS序列比较，改造后的基因包括EPSPS蛋白第二位亮氨酸到丝氨酸的置换，并在改造基因的前面加上CTP2叶绿体导肽，进一步增加了该基因耐草甘膦的抗性，取得了预料不到的技术效果；而且本发明抗除草剂基因CTP2-EPSPS能在植物细胞中高效稳定的表达。

本发明在载体构建中使用自玉米基因组高效表达启动子35S基因，负责启动EPSPS基因表达，所筛选应用的筛选标记基因为bar基因，bar基因在生物安全性上比其它标记基因要好，它的编码蛋白在人体内不存在，并且和已知的毒蛋白无同源序列，也不具过敏原，安全性好。

通过农杆菌介导的方法进行抗除草剂基因EPSPS的遗传转化，不但费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、同时具有转育周期短及能转化较大片段等独特优点；通过本发明方法使EPSPS基因成功转化到玉米中，并获得了稳定的转化苗。

本发明合成的定点突变基因EPSPS具有很强的耐受草甘膦抗性能力（如8倍于草甘膦正常施用浓度下的突变基因EPSPS转化植物仍能正常生长），该基因高效表达后可以大大提高玉米抗除草剂的的特性，可以作为培育抗草甘膦转基因玉米及其它作物的候选基因，使其具备较高的草甘膦抗性能力，节省人力物力提高作物产量，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为含有前导肽CTP2的新改造耐除草剂基因CTP2-EPSPS构建到质粒载体pUC57上的构建图谱，其中1：克隆载体PUC57XbaI/SacI双切；2：PUC57+CTP2-EPSPSXbaI/SacI双切；3：DNAmarkSM0331；4：CTP2-EPSPSPUC质粒。

图2为含有前导肽CTP2的新改造耐除草剂基因CTP2-EPSPS构建到植物表达载体pCAMBIA1300-Bar构建图谱，1：植物表达载体CPB载体XbaI/SacI双切；2：CPB载体+CTP2-EPSPSXbaI/SacI双切；3：DNAmarkSM0331；4：：CTP2-EPSPSCPB质粒。

图3为通过农杆菌介导法转化含有前导肽CTP2的新改造耐除草剂基因CTP2-EPSPS转化流程及再生过程，愈伤组织的筛选（左）、再生（中）以及转基因植株移栽到大田（右）。

图4为转化体目的基因EPSPS的PCR检测，M:DL2000plus；CK1：阳性质粒对照；CK2:未转基因阴性对照；空白：双蒸水对照；1-6是含有目的基因的阳性植株。

图5为转化体目的蛋白EPSPS的检测图谱，1～6是含有目的蛋白的阳性植株，7是非转基因材料对照。

图6转化体喷洒除草剂鉴定结果，左:未转基因苗阴性对照；右:改造后的CTP2-EPSPS转化植株。

图7为实施例1中PCR扩增示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1编码突变的EPSPS基因的合成

在前期大量筛选试验研究的基础之上，对细菌培养筛选分离出来自土壤农杆菌抗性优良的基因CP4-EPSPS（SEQIDNO.1）进行改造，用部分的密码子置换序列相对应的密码子，同时排除常用限制性酶切位点（SacI和XbaI），然后通过置换密码子的方法进行改正消除，并在3端加上终止密码子TAG，并通过人工合成的方法实现第二位丝氨酸到亮氨酸的氨基酸突变，获得一个改造后的突变EPSPS基因序列（如SEQIDNO.2所示），其对应的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；另外，在改造的EPSPS基因5端前面加上了CTP2的叶绿体导肽序列（如SEQIDNO.4所示），得到抗除草剂基因CTP2-EPSPS（SEQIDNO.5）；然后确定并化学合成CTP2-EPSPS如序列表SEQIDNO.5所示的编码序列。

含有叶绿体导肽的CTP2的新改造EPSPS抗除草剂基因CTP2-EPSPS（如序列表SEQIDNO.5所示）委托上海生物工程有限公司合成。

所用试剂：上海生物工程有限公司。

具体方法步骤如下；

（1）用DNAwork软件根据需要合成CTP2-EPSPS基因序列设计引物（寡核苷酸单链）58条，每条35～45bp，每条约33μg，约为1OD。

（2）PCR连接引物为双链DNA，两轮PCR。

第一轮：反应体系

引物11μl（1OD/400μlH₂O）约6nmol

引物21μl（1OD/400μlH₂O）约6nmol

dNTP1μl（10mmol/l）

Pfu10×Buffer5μl(200mmol/lTrisHCl，pH8.8；100mmol/lKCl；20mmol/lMgSO₄；160mmol/l(NH₄)₂HSO₄；1％Tritonand1mg/mlBSA)

模板26×0.2μl；28×0.2μl；24×0.2μl

Pfu酶0.25（5U/μl）

加水至50μl

(所有试剂均为上海生工生产)

反应参数

95℃3min；94℃1min，55℃45S，72℃1min，20个循环；72℃延伸2min；

第二轮：反应体系

引物11μl（1OD/400μlH₂O）约6nmol

引物21μl（1OD/400μlH₂O）约6nmol

dNTP1μl（10mmol/l）

Pfu10×Buffer5μl(200mmol/lTris-HCl，pH8.8；100mmol/lKCl；20mmol/lMgSO₄；160mmol/l(NH₄)₂HSO₄；1％Tritonand1mg/mlBSA)

模板第一轮反应液各2μl

Pfu酶0.25（5U/μl）

加水至50μl

(所用试剂均为上海生工生产)

反应参数

95℃3min；94℃1min，59℃45S，72℃1min，22个循环；2℃延伸3min。

（3）1%琼脂糖凝胶电泳，有清晰的特异性条带，大小与预计相符。

（4）凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。

（5）把PCR产物分别做克隆，提出质粒，酶切检测并测序；然后把得到正确质粒做模板设计全长PCR方案，进行PCR扩增就得到新改造的CTP2-EPSPS基因，基因全长1599bp。基因序列如序列表SEQIDNO.5所示。

（6）然后再次对CTP2-EPSPS基因全长PCR产物做克隆测序工作，克隆的基因装载在质粒载体pUC57，然后得到含有CTP2-EPSPS基因的质粒，命名为pUCCTP2-EPSPS载体。

2.植物表达载体构建

（1）用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切T载体质粒pUCCTP2-EPSPS，用凝胶回收纯化试剂盒回收CTP2-EPSPS片段。

（2）同时用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切植物表达载体CPB（由山东大学提供，也可以从市场中购买），用凝胶回收纯化试剂盒回收酶切后的CPB片段。

（3）将纯化后的两片段进行连接反应，构建好的植物表达载体为pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS（启动子为35S，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar）。

CUB植物表达载体（XbaI、SacI酶切后）1μl

T4DNA连接缓冲液1μl

T4DNA连接酶1μL

CTP2-EPSPS基因片段7μL

Total10μL

以上混合物在16^oC连接反应16小时。

（4）将质粒pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS用XbaI和SacI进行酶切鉴定，鉴定出植物表达载体中含有高赖氨酸基因CTP2-EPSPS片段，表明载体构建正确（图2）。

（5）转化E.ColiJM109感受态细胞（购自于上海生物工程有限公司）。

其中，CPB（pCAMBIA1300-35S-MCS-Bar，图2）质粒是在pCAMBIA1300质粒基础上构建的质粒，含有一个目的基因插入盒（35S－多克隆酶切位点－Tnos）和一个来自吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar。该基因序列位于花椰菜花叶病毒35S启动子（pCaMV）和3’尾部（TCaMV）之间。

质粒pCAMBIA1300购自澳大利亚CAMBIA(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)，参考网址http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html；该载体可用于玉米受体材料的遗传转化。

实施例2植物表达载体pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS玉米的农杆菌转化

本实验采用根瘤农杆菌介导法将含抗除草剂基因CTP2-EPSPS片段重组表达载体pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS导入玉米愈伤组织，经过侵染、恢复、选择、再生、炼苗等阶段，获得转基因苗（参见图4）。其具体步骤如下：

（1）幼胚的准备：取授粉10～14d的果穗进行消毒，取出果穗用灭菌水进行冲洗3次，用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，轻轻向上撬出幼胚，确保幼胚不受到任何损伤（取大小在1.5mm左右幼胚）。

（2）农杆菌侵染：把刚剥离的幼胚放入2ml含有D-inf（2ml）的离心管中，每管约50左右幼胚，浸泡1h以上，轻轻倒出D-inf，加入1.5ml特定浓度（OD₆₀₀=0.4）的农杆菌菌液，轻轻颠倒离心管20次后放置在无光的培养箱5分钟，五分钟后将含幼胚的菌液倒于灭菌过的吸水纸上晾干，大约5分钟左右（整个过程确保幼胚全部浸入农杆菌液体里，避免旋涡振荡）。

（3）共培养：把侵染过的幼胚转移到共培养基上并吸除培养基表面多余的农杆菌，盾片朝上，用封口膜封住培养皿，培养箱中20℃左右暗培养3天。

（4）恢复培养：共培养3天后，把幼胚（愈伤组织）转移到恢复培养基上，放在28℃条件下暗培养7～10天。

（5）选择培养：7～10天后，把所有的幼胚（愈伤组织）转移到选择培养基上，以经过多轮筛选，每次选择培养两周，选择培养基Ⅰ含有Bar1.5mg/L，第二轮筛选时Bar的浓度可以增加到3mg/L，第三轮筛选时Bar的浓度可以增加到4.5mg/L。

（6）转基因植株的再生经过多轮筛选后，将长出的颜色较鲜艳的抗性愈伤放在再生培养基I上面，25℃暗培养2～3周，之后把成熟的胞质胚转移到再生培养基II上光照培养，诱导分化，发芽；约2周后，会有幼苗分化出来，取长至2cm以上高的苗将其转入生根壮苗培养基中，继续在光照培养室培养；当幼苗高度约8cm以上时，打开瓶盖，在培养基上加少许灭菌水进行炼苗处理，并继续在光照培养室中生长。

（7）转基因苗的移栽：三天后将幼苗从培养瓶中取出，将苗移栽含有泥炭土和蛭石（3：1）的营养钵中，最后把苗移入人工气候室中。

实施例3转基因玉米植株分子检测

（一）转基因玉米植株PCR检测

转化植株长出7～8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，转基因植物开花后套袋自交或姊妹交结实。植物DNA提取以Saghai-Maroof等提出的CTAB的方法进行；采用PCR技术检测外源基因；

图4中显示了转化体目的基因EPSPS的PCR检测结果，其中M：M:DL2000plus；CK1：阳性质粒对照；CK2：未转基因阴性对照；空白：双蒸水对照；1-8：EPSPS-1到EPSPS-6。所用的PCR检测引物为（如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7所示）：

EPSPS-F:5'ACCGCCCGCAAATCCTCTGGC3'

EPSPS-R:5'CGGCACCGTGACGCCCTTCAG3'

目的片段大小：560bp，退火温度58℃，35个循环。

1.玉米植株DNA的提取步骤如下：

（1）取约1cm²左右新鲜幼嫩叶片放在1.5ml的Eppendorf管中，然后将放有叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度；

（2）取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入600μl提取缓冲液（65℃预热的CTAB，2%β-巯基乙醇），振荡混匀，在65℃水浴锅中温育30min，其间颠倒3～4次，混匀；

（3）将离心机降温，在4℃条件下，12500rpm离心10min；

（4）取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），混匀,抽提10min，至溶液呈乳浊状。在室温下离心，12500rpm，10min；

（5）取上清液(约400μl)移至一个新的1.5mL离心管中，并加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，在-20℃放置30min；

（6）将离心机降温，在4℃条件下12500rpm离心10min；

（8）沉淀用70％乙醇洗二次，7500rpm离心2min，将70%乙醇倒，空甩，用移液枪吸弃残存的乙醇，然后在37℃烘箱中烘干20min左右；

（9）将DNA溶于50-100μl无菌水中，4℃保存。

2.转基因植株PCR操作步骤如下:

（1）先在PCR板每个孔中，加入DNA模板；

（2）配制混合物：取一新的Eppendorf管，将除DNA模板以外的其它试剂按照所需要的总量混合在一起形成混合物，其试剂加入顺序为：无菌水、PCR反应缓冲液、引物、dNTP，最后加TaqDNA聚合酶。；

（3）分装混合物：将配制的混合物混匀后分装到PCR板每个孔中；

（4）混匀，在离心机上甩一下，加入一滴石蜡油；

（5）将PCR板放入PCR仪中，按所需程序操作，PCR反应体系:

DNA模板2μl

10×PCR反应缓冲液2μl

上游引物(10mmol/l)0.2μl

下游引物(10mmol/l)0.2μl

dNTP（10mmol/leach）0.4μl

TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl

无菌水15μl

（6）植物DNA电泳均按常规方法进行。

（二）转基因玉米植株目地蛋白检测（EPSPS免疫学检测））

1.分别对转基因植株进行EPSPS蛋白快速检测，每个转化体各检测3株，取约1cm²左右新鲜幼嫩叶片放在1.5ml的Eppendorf管中。然后将放有叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度。

2.取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入500μl-lmlSEB4样品提取缓冲液。

3.从桶中取出EPSPS蛋白检测试纸条，手持检测条顶端，做好检测标记。不要去掉保护膜。保持检测条垂直，将标记的末端插入至离心管或提取袋中。插入部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持插入状态。

4.如果样品是阳性的，检测线将出现。如果样品是阴性的，检测线将不出现。结果表明：目标基因PCR阳性植株蛋白水平均为阳性，PCR阴性植株蛋白水平均为阴性（见图5）。

实施例4转基因玉米植株田间草甘膦抗性鉴定

对改造前的CP4EPSPS及改造后的CTP2-EPSPS基因按照前述方法分别构建了植物转化载体并转化了玉米，获得了转化植株的阳性转化事件。

对生长至4～5片叶的转化CTP2-EPSPS基因玉米、转化CP4EPSPS基因玉米及对照玉米植株按800ml/亩进行喷施8倍正常施用浓度的商品化草甘膦（孟山都公司生产的农达，其有效成分草甘膦含量41％），10d后，对照玉米基本死亡或生长不正常，转改造后的CTP2-EPSPS基因的玉米转化事件抗草甘膦，转化植株无药害产生（见图6），而转化CP4EPSPS基因的转化事件在喷施浓度为800ml/亩的草甘膦时，均有不同的药害产生。

上述鉴定结果表明：将本发明改良的草甘膦靶标酶导入玉米中，可以提高转基因玉米对草甘膦的抗性，这说明本发明CTP2-EPSPS基因更容易获得有效的抗草甘膦的转化事件。

SEQUENCELISTING

<110>河南省农业科学院

<120>编码突变的EPSPS基因、其表达载体、表达产物及其应用

<130>/

<160>7

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1368

<212>DNA

<213>核苷酸序列

<400>1

atgtcgcacggtgcaagcagccggcccgcaaccgcccgcaaatcctctggcctttccgga60

accgtccgcattcccggcgacaagtcgatctcccaccggtccttcatgttcggcggtctc120

gcgagcggtgaaacgcgcatcaccggccttctggaaggcgaggacgtcatcaatacgggc180

aaggccatgcaggccatgggcgccaggatccgtaaggaaggcgacacctggatcatcgat240

ggcgtcggcaatggcggcctcctggcgcctgaggcgccgctcgatttcggcaatgccgcc300

acgggctgccgcctgaccatgggcctcgtcggggtctacgatttcgacagcaccttcatc360

ggcgacgcctcgctcacaaagcgcccgatgggccgcgtgttgaacccgctgcgcgaaatg420

ggcgtgcaggtgaaatcggaagacggtgaccgtcttcccgttaccttgcgcgggccgaag480

acgccgacgccgatcacctaccgcgtgccgatggcctccgcacaggtgaagtccgccgtg540

ctgctcgccggcctcaacacgcccggcatcacgacggtcatcgagccgatcatgacgcgc600

gatcatacggaaaagatgctgcagggctttggcgccaaccttaccgtcgagacggatgcg660

gacggcgtgcgcaccatccgcctggaaggccgcggcaagctcaccggccaagtcatcgac720

gtgccgggcgacccgtcctcgacggccttcccgctggttgcggccctgcttgttccgggc780

tccgacgtcaccatcctcaacgtgctgatgaaccccacccgcaccggcctcatcctgacg840

ctgcaggaaatgggcgccgacatcgaagtcatcaacccgcgccttgccggcggcgaagac900

gtggcggacctgcgcgttcgctcctccacgctgaagggcgtcacggtgccggaagaccgc960

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gcgaccgtgatgaacggtctggaagaactccgcgtcaaggaaagcgaccgcctctcggcc1080

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gtgcgcggccgccctgacggcaaggggctcggcaacgcctcgggcgccgccgtcgccacc1200

catctcgatcaccgcatcgccatgagcttcctcgtcatgggcctcgtgtcggaaaaccct1260

gtcacggtggacgatgccacgatgatcgccacgagcttcccggagttcatggacctgatg1320

gccgggctgggcgcgaagatcgaactctccgatacgaaggctgcctga1368

<210>2

<211>1368

<212>DNA

<213>核苷酸序列

<400>2

atgcttcacggtgcaagcagccggcccgcaaccgcccgcaaatcctctggcctttccgga60

accgtccgcattcccggcgacaagtcgatctcccaccggtccttcatgttcggcggtctc120

gcgagcggtgaaacgcgcatcaccggccttctggaaggcgaggacgtcatcaatacgggc180

aaggccatgcaggcgatgggcgcccgcatccgtaaggaaggcgacacctggatcatcgat240

ggcgtcggcaatggcggcctcctggcgcctgaggcgccgctcgatttcggcaatgccgcc300

acgggctgccgcctgacgatgggcctcgtcggggtctacgatttcgacagcaccttcatc360

ggcgacgcctcgctcacaaagcgcccgatgggccgcgtgttgaacccgctgcgcgaaatg420

ggcgtgcaggtgaaatcggaagacggtgaccgtcttcccgttaccttgcgcgggccgaag480

acgccgacgccgatcacctaccgcgtgccgatggcctccgcacaggtgaagtccgccgtg540

ctgctcgccggcctcaacacgcccggcatcacgacggtcatcgagccgatcatgacgcgc600

gatcatacggaaaagatgctgcagggctttggcgccaaccttaccgtcgagacggatgcg660

gacggcgtgcgcaccatccgcctggaaggccgcggcaagctcaccggccaagtcatcgac720

gtgccgggcgacccgtcctcgacggccttcccgctggttgcggccctgcttgttccgggc780

tccgacgtcaccatcctcaacgtgctgatgaaccccacccgcaccggcctcatcctgacg840

ctgcaggaaatgggcgccgacatcgaagtcatcaacccgcgccttgccggcggcgaagac900

gtggcggacctgcgcgttcgctcctccacgctgaagggcgtcacggtgccggaagaccgc960

gcgccttcgatgatcgacgaatatccgattctcgctgtcgccgccgccttcgcggaaggg1020

gcgaccgtgatgaacggtctggaagaactccgcgtcaaggaaagcgaccgcctctcggcc1080

gtcgccaatggcctcaagctcaatggcgtggattgcgatgagggcgagacgtcgctcgtc1140

gtgcgtggccgccctgacggcaaggggctcggcaacgcctcgggcgccgccgtcgccacc1200

catctcgatcaccgcatcgccatgagcttcctcgtcatgggcctcgtgtcggaaaaccct1260

gtcacggtggacgatgccacgatgatcgccacgagcttcccggagttcatggacctgatg1320

gccgggctgggcgcgaagatcgaactctccgatacgaaggctgcctga1368

<210>3

<211>455

<212>PRT

<213>氨基酸序列

<400>3

MetLeuHisGlyAlaSerSerArgProAlaThrAlaArgLysSerSer

151015

GlyLeuSerGlyThrValArgIleProGlyAspLysSerIleSerHis

202530

ArgSerPheMetPheGlyGlyLeuAlaSerGlyGluThrArgIleThr

354045

GlyLeuLeuGluGlyGluAspValIleAsnThrGlyLysAlaMetGln

505560

AlaMetGlyAlaArgIleArgLysGluGlyAspThrTrpIleIleAsp

65707580

GlyValGlyAsnGlyGlyLeuLeuAlaProGluAlaProLeuAspPhe

859095

GlyAsnAlaAlaThrGlyCysArgLeuThrMetGlyLeuValGlyVal

100105110

TyrAspPheAspSerThrPheIleGlyAspAlaSerLeuThrLysArg

115120125

ProMetGlyArgValLeuAsnProLeuArgGluMetGlyValGlnVal

130135140

LysSerGluAspGlyAspArgLeuProValThrLeuArgGlyProLys

145150155160

ThrProThrProIleThrTyrArgValProMetAlaSerAlaGlnVal

165170175

LysSerAlaValLeuLeuAlaGlyLeuAsnThrProGlyIleThrThr

180185190

ValIleGluProIleMetThrArgAspHisThrGluLysMetLeuGln

195200205

GlyPheGlyAlaAsnLeuThrValGluThrAspAlaAspGlyValArg

210215220

ThrIleArgLeuGluGlyArgGlyLysLeuThrGlyGlnValIleAsp

225230235240

ValProGlyAspProSerSerThrAlaPheProLeuValAlaAlaLeu

245250255

LeuValProGlySerAspValThrIleLeuAsnValLeuMetAsnPro

260265270

ThrArgThrGlyLeuIleLeuThrLeuGlnGluMetGlyAlaAspIle

275280285

GluValIleAsnProArgLeuAlaGlyGlyGluAspValAlaAspLeu

290295300

ArgValArgSerSerThrLeuLysGlyValThrValProGluAspArg

305310315320

AlaProSerMetIleAspGluTyrProIleLeuAlaValAlaAlaAla

325330335

PheAlaGluGlyAlaThrValMetAsnGlyLeuGluGluLeuArgVal

340345350

LysGluSerAspArgLeuSerAlaValAlaAsnGlyLeuLysLeuAsn

355360365

GlyValAspCysAspGluGlyGluThrSerLeuValValArgGlyArg

370375380

ProAspGlyLysGlyLeuGlyAsnAlaSerGlyAlaAlaValAlaThr

385390395400

HisLeuAspHisArgIleAlaMetSerPheLeuValMetGlyLeuVal

405410415

SerGluAsnProValThrValAspAspAlaThrMetIleAlaThrSer

420425430

PheProGluPheMetAspLeuMetAlaGlyLeuGlyAlaLysIleGlu

435440445

LeuSerAspThrLysAlaAla

450455

<210>4

<211>228

<212>DNA

<213>核苷酸序列

<400>4

atggcgcaagttagcagaatctgcaatggtgtgcagaacccatctcttatctccaatctc60

tcgaaatccagtcaacgcaaatctcccttatcggtttctctgaagacgcagcagcatcca120

cgagcttatccgatttcgtcgtcgtggggattgaagaagagtgggatgacgttaattggc180

tctgagcttcgtcctcttaaggtcatgtcttctgtttccacggcgtgc228

<210>5

<211>1596

<212>DNA

<213>核苷酸序列

<400>5

atggcgcaagttagcagaatctgcaatggtgtgcagaacccatctcttatctccaatctc60

tcgaaatccagtcaacgcaaatctcccttatcggtttctctgaagacgcagcagcatcca120

cgagcttatccgatttcgtcgtcgtggggattgaagaagagtgggatgacgttaattggc180

tctgagcttcgtcctcttaaggtcatgtcttctgtttccacggcgtgcatgcttcacggt240

gcaagcagccggcccgcaaccgcccgcaaatcctctggcctttccggaaccgtccgcatt300

cccggcgacaagtcgatctcccaccggtccttcatgttcggcggtctcgcgagcggtgaa360

acgcgcatcaccggccttctggaaggcgaggacgtcatcaatacgggcaaggccatgcag420

gcgatgggcgcccgcatccgtaaggaaggcgacacctggatcatcgatggcgtcggcaat480

ggcggcctcctggcgcctgaggcgccgctcgatttcggcaatgccgccacgggctgccgc540

ctgacgatgggcctcgtcggggtctacgatttcgacagcaccttcatcggcgacgcctcg600

ctcacaaagcgcccgatgggccgcgtgttgaacccgctgcgcgaaatgggcgtgcaggtg660

aaatcggaagacggtgaccgtcttcccgttaccttgcgcgggccgaagacgccgacgccg720

atcacctaccgcgtgccgatggcctccgcacaggtgaagtccgccgtgctgctcgccggc780

ctcaacacgcccggcatcacgacggtcatcgagccgatcatgacgcgcgatcatacggaa840

aagatgctgcagggctttggcgccaaccttaccgtcgagacggatgcggacggcgtgcgc900

accatccgcctggaaggccgcggcaagctcaccggccaagtcatcgacgtgccgggcgac960

ccgtcctcgacggccttcccgctggttgcggccctgcttgttccgggctccgacgtcacc1020

atcctcaacgtgctgatgaaccccacccgcaccggcctcatcctgacgctgcaggaaatg1080

ggcgccgacatcgaagtcatcaacccgcgccttgccggcggcgaagacgtggcggacctg1140

cgcgttcgctcctccacgctgaagggcgtcacggtgccggaagaccgcgcgccttcgatg1200

atcgacgaatatccgattctcgctgtcgccgccgccttcgcggaaggggcgaccgtgatg1260

aacggtctggaagaactccgcgtcaaggaaagcgaccgcctctcggccgtcgccaatggc1320

ctcaagctcaatggcgtggattgcgatgagggcgagacgtcgctcgtcgtgcgtggccgc1380

cctgacggcaaggggctcggcaacgcctcgggcgccgccgtcgccacccatctcgatcac1440

cgcatcgccatgagcttcctcgtcatgggcctcgtgtcggaaaaccctgtcacggtggac1500

gatgccacgatgatcgccacgagcttcccggagttcatggacctgatggccgggctgggc1560

gcgaagatcgaactctccgatacgaaggctgcctga1596

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>核苷酸序列

<400>6

accgcccgcaaatcctctggc21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>核苷酸序列

<400>7

cggcaccgtgacgcccttcag21

Claims (10)

1.一种编码突变的EPSPS基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.权利要求1所述EPSPS基因编码的EPSPS蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

3.一种抗除草剂基因CTP2-EPSPS，含有叶绿体转运肽CTP2和权利要求1所述EPSPS基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。

4.权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS表达的抗除草剂蛋白。

5.一种含有权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS的植物表达载体。

6.根据权利要求5所述表达载体，其特征在于，该表达载体为可直接转化玉米的双价载体。

7.一种由权利要求6所述植物表达载体转化的宿主细胞LBA4404。

8.权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS或权利要求5所述表达载体在培育转基因植物中的应用。

9.权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS或权利要求5所述表达载体在玉米遗传转化中的应用。

10.一种培育抗草甘膦转基因玉米的方法，包括如下步骤：

（1）EPSPS基因合成

人工合成权利要求1所述编码突变的EPSPS基因或权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS，并将其装载在质粒载体pUC57上，得到含有CTP2-EPSPS基因的pUCCTP2-EPSPS载体质粒；

（2）植物表达载体构建

①用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切T载体质粒pUCCTP2-EPSPS，用凝胶回收纯化试剂盒回收CTP2-EPSPS片段；同时用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切植物表达载体CPB，用凝胶回收纯化试剂盒回收酶切后的CPB片段；

②将上步纯化后的两片段进行连接反应，构建成植物表达载体pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS，启动子为35S，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar；

③将质粒pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS用XbaI和SacI进行酶切鉴定，鉴定出植物表达载体中含有高赖氨酸基因CTP2-EPSPS片段，表明载体构建正确；

（3）农杆菌转化

采用根瘤农杆菌介导法将含抗除草剂基因CTP2-EPSPS片段的重组表达载体pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS导入玉米愈伤组织，经过侵染、恢复、选择、再生、炼苗阶段，获得转基因幼苗；

（4）育种

将转基因幼苗从培养瓶中取出移栽至营养钵或田间，常规条件下培育，转基因植物开花后套袋自交或姊妹交结实，成熟后收获种子。