CN102776228A

CN102776228A - 一种拟南芥转录因子在培育抗旱耐盐性水稻中的用途

Info

Publication number: CN102776228A
Application number: CN2012102560259A
Authority: CN
Inventors: 陈学平; 汪洋; 曹树青; 郭家明; 李敏; 张银萍
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2011-07-27
Filing date: 2012-07-24
Publication date: 2012-11-14

Abstract

本发明涉及一种拟南芥转录因子在培育抗旱耐盐性水稻中的用途。拟南芥转录因子MYB44的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示；其编码的蛋白序列为SEQIDNo.2所示；符合下列条件之一：1)序列表SEQIDNO.1中第88-1005位所示DNA序列，或与SEQIDNO.1中第88-1005位所示的高度同源DNA序列；2)其它能编码与序列表SEQIDNO.2中的蛋白质相同的DNA序列；3)其功能相当于SEQIDNO.1中第88-1005位所示DNA序列或与SEQIDNO.1中第88-1005位所示的高度同源DNA序列所包含的亚片段，在培育抗旱耐盐性水稻中的应用。本发明的MYB44基因的表达载体可以生物技术方法导入植物细胞，可以使用包含本发明的MYB44基因的表达载体转化宿主可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、大豆等双子叶植物，培育抗旱、耐盐的植物品种。

Description

一种拟南芥转录因子在培育抗旱耐盐性水稻中的用途

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种拟南芥转录因子DNA片段（基因）的分离克隆、转化、功能验证及在水稻中的应用。特别涉及利用该基因增强水稻抗旱耐盐等抗逆性的应用及方法。

背景技术

干旱和盐渍问题是影响当今世界农业生产与生态环境的两个重要的逆境因子，对世界粮食生产造成巨大的损失。在人口不断增加、耕地面积日趋减少和淡水资源不足的严重压力下，如何高效地利用有限的淡水资源进行最大限度的农业生产，这是国际和国内生物科学技术迫切需要解决的重大课题之一。水稻是世界农业生产中用水最多的作物，其节水抗旱性对我国乃至世界的粮食、水、以及生态安全具有重要的意义。培育抗旱与耐盐作物品种是更好的发展农作物的经济而有效的方法。传统的方法培育抗旱耐盐品种受到育种时间和优良性状选择的限制，利用转基因技术提高作物的抗旱及耐盐能力具有重要的理论与经济意义，转基因技术为培育高效抗旱耐盐作物新品种开辟了一条崭新的途径。转基因技术是指将外源基因通过生物、物理或化学手段导入其它生物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的遗传改良体。基因转化的方法可分为两类：一是由载体介导的转化，主要的方法为农杆菌介导法；另一类是直接的基因转化，包括基因枪法、电击法、PEG法、脂质体转化法和花粉管通道法等。近年来，应用较多的为农杆菌介导法和基因枪法。但是，基因枪法具有价格昂贵、转化效率偏低、导入的外源基因拷贝数高、在后代中容易丢失甚至基因沉默、对片段大的基因难以导入且嵌合体不易排除等缺点，需要进一步改进；农杆菌介导法在水稻转基因种基因型依赖性小，可以很大程度上减少上述不足。抗旱耐盐分子育种的基础就是发掘新的抗旱耐盐基因，已发表的抗旱耐盐相关的基因及其蛋白越来越多。反式转录调节因子包括所有的具有调节基因转录功能的蛋白分子，它们在植物生长发育和抗逆性方面发挥着巨大的作用。利用拟南芥抗旱耐盐相关转录因子及转基因技术可以高效的培育出抗旱的高品质水稻等农作物。

发明内容

为了解决培育耐旱水稻品种受到育种时间和优良性状选育的限制问题，本发明提供一种拟南芥转录因子在培育抗旱耐盐性水稻中的用途。

本发明的目的是针对高效培育抗旱耐盐水稻品种的不足，利用农杆菌介导法转基因技术，以水稻为宿主，提供了分离克隆一个包含有抗逆转录因子MYB44的完整编码区段的DNA片段、编码蛋白、以水稻Actin1为启动子构建的MYB44表达载体。本发明所设计的序列来源于NCBI （http://www.ncbi.nih.gov/），在NCBI中Gene ID为 836865，在拟南芥资源中心，其位点是AT5G67300以及序列信息以以下网站为准（http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=132479&type=locus），所用的模板是拟南芥的幼苗和根的cDNA，按照其位点信息AT5G67300，我们将其简写为A300。

本发明从拟南芥的幼苗及根中分离得到一种包含MYB44的DNA片段，通过转化该片段赋予植物干旱耐盐等逆境条件下，增强耐受能力。其中，所述MYB44基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ ID NO.1 中第88-1005位所示DNA序列，或与SEQ ID NO.1中第88-1005位所示的高度同源DNA 序列；

2) 其它能编码与序列表SEQ ID NO.2中的蛋白质相同的DNA序列；

3) 其功能相当于SEQ ID NO.1 中第88-1005位所示DNA序列或与SEQ ID NO.1中第88-1005位所示的高度同源DNA 序列所包含的亚片段。

可以采用已经克隆的MYB44基因作为探针，从cDNA或基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因，也可以采用PCR(Ploymerase Chain Reaction)技术，从基因组DNA、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的MYB44基因以及任何感兴趣的一段DNA或其同源的一段DNA。

采用上述技术，可以分离得到包含MYB44基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体植株，可获得抗旱及耐高盐胁迫的耐受性增强的转基因植株，本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子，也可以使用增强子区域是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等的增强子，且与编码序列阅读框相同，以确保整个序列的翻译。本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物在逆境条件下（干旱、高盐及冷胁迫）的存活率和生长速度。

携带有本发明的MYB44基因的表达载体可以通过Ti质粒、植物病毒载体、农杆菌转化、基因枪等生物技术方法导入植物细胞。可以使用包含本发明的MYB44基因的表达载体转化宿主可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、大豆等双子叶植物，培育抗旱、耐盐的植物品种。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO.1显示的是本发明分离克隆的包含有MYB44基因编码区和启动子区得DNA片段序列。

序列表SEQ ID NO.2 显示的是本发明MYB44基因编码的蛋白质序列。

图1为MYB44基因的PCR扩增与克隆图；

提取拟南芥种荚、幼苗和根的RNA，经反转录后获得cDNA，再用Pfu高保真Taq酶以这些cDNA为模板进行PCR扩增；图中M代表Marker， 2、3为2个扩增出来的阳性克隆，1为阴性克隆。

图2为阳性克隆的筛选图；

将扩增出的目的片段用低熔点胶回收后，用平端连接的方法连到中间载体中。该载体中有一个Sma I酶切位点，两端分别是AttL1和AttL2，用于重组克隆用的序列。先将载体用Sma I酶切开，形成平端，然后用碱性磷酸酶 CIP进行去磷酸化处理防止自连接产生阴性克隆。由于高保真酶不能产生带有磷酸的末端，我们用T4 Polynucleotide Kinase 在PCR产物末端加磷酸。将该片段纯化后，放到一起用T4连接酶连接，转入大肠杆菌，筛选阳性克隆。下图是AT5G67300的PCR扩增的筛选图，如图2所示1、2、3、4、5、6、7均为阳性克隆，所用引物为A300FP和A300RP。

图3为转基因所用的pCAB水稻表达载体图。

图4、图5为转基因水稻MYB44基因逆境胁迫诱导的荧光定量表达图；

转基因水稻株系分别在干旱（失水）、冷胁迫（2℃）、200mM NaCl及100μM脱落酸（ABA）中胁迫诱导后提取叶（图4）和根（图5）中RNA并反转录后，采用SYBR Green I染料进行荧光定量PCR分析目的基因表达情况。

图6为转基因水稻过量表达图；且11、12、13、14、16、23号为过量表达植株。

图7为T₂代转基因株系的干旱胁迫下的表型图。

图8为T₂代转基因株系的干旱胁迫下的存活率图；

干旱胁迫下，T₂代过表达转基因株系存活率比WT植株高约48%（WT，12.9%；OEX-11，46.2%；OEX-12，63.3%；OEX-13，46.9%）。

图9为T₁代转基因株系的干旱胁迫下的表型图。

图10为T₁代转基因株系的干旱胁迫下的表型失水率图；

干旱胁迫下，T₁代转基因植株失水率要明显低于WT植株。

图11为T₁代转基因株系的干旱胁迫下的绿叶百分比图；

干旱胁迫下，T₁代转基因植株绿叶百分比比WT的高出约40%（WT，21.2%；ACT:MYB44-2，50.8%；ACT:MYB44-4，66.3%；ACT:MYB44-11，60.9%）。

图12为甘露醇胁迫下，过量表达转基因株系的表型图。

图13为氯化钠胁迫下，过量表达转基因株系的表型图。

图14为转基因株系在甘露醇胁迫下的表型及相对茎长图；

100mM甘露醇胁迫下，过量表达转基因株系相对茎长比WT长4.5cm左右，200mM甘露醇胁迫下，过量表达转基因株系相对茎长比WT长6.5cm左右。

图15为转基因株系在NaCl胁迫下的表型及相对茎长图；

150mM氯化钠胁迫下，过量表达转基因株系相对茎长比WT长1.5cm左右，200mM氯化钠胁迫下，过量表达转基因株系相对茎长比WT长1cm左右。

具体实施例

以下实施例定义了本发明，并描述了分离和克隆包含有MYB44基因编码区和启动子区得DNA片段序列，以及验证MYB44基因功能的验证方法。根据以下的描述及具体实施方法，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不偏离本分明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其使用于不同的物种及用途。

实施例一、水稻愈伤组织诱导

1）将水稻七八分成熟的种子去壳，仔细剔除有霉点籽粒，取饱满清亮籽粒先用70%乙醇浸泡（表面消毒）1-1.5min，再用含2%的活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20），放入摇床120rpm摇45min，接着用无菌蒸馏水漂洗处理过的种子4-5次；

2）将灭菌后的种子放在30mL含有2.0mg/L 2,4-D的NB₀固体愈伤组织诱导培养基的表面（培养基成分见后）；

3）将放有种子的培养基的平皿用封口膜包好后，25±1℃暗培养；

4）暗培养10天左右，诱导出初生愈伤组织，将其剥离，再在相同的新鲜愈伤组织诱导培养基中继代培养1-2次，直到得到生长旺盛的浅黄色易碎的胚形成的愈伤组织。将上述未成熟胚诱导的愈伤组织用于与农杆菌的共培养转化。

实施例二、分离及克隆MYB44基因

本发明所设计的序列来源于NCBI （http://www.ncbi.nih.gov/），在NCBI中Gene ID: 836865，在拟南芥资源中心，其位点（AT5G67300）及序列信息以以下网站为准（http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=132479&type=locus），所用的模板是拟南芥的幼苗和根的cDNA，按照其位点信息AT5G67300，我们将其简写为A300；在进行PCR时，在50μL体系中加入10ng的拟南芥种子的cDNA作为为模板，上述引物各20pmole进行反应。反应条件为：94℃（1 min）预变性；然后进行94℃（30 sec）、58℃（30 sec）、72 ℃（1 min）共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，所用Taq酶为高保真的PfuTaq酶。所用引物为A300FP：AGGATGTTCGCGCGAAGACTCTCCTC；A300RP：GGAAAGCGAAGAAGCG GTAAAAGCTC。将扩增出的目的片段，用平端连接的方法连到中间载体pDG01中。该中间载体是我们构建的一个载体pDG01，在pDG01载体中有一个酶切位点（Sma I为平端酶），两端分别是AttL1和AttL2，可用于通过Gateway系统的方法重组克隆到终载体中；将pDG01载体用Sma I酶切开，形成平端，然后用NEB公司的小牛肠碱性磷酸酶 CIP进行去磷酸化处理防止自连接产生假阳性克隆。方法是：用Sma I酶切pDG01质粒后，在反应体系中加入1μL NEB的小牛肠碱性磷酸酶CIP，37℃下温浴1小时，用低熔点胶回收后备用；由于高保真酶不能产生带有磷酸的末端的PCR产物，我们用T4 Polynucleotide Kinase 在PCR产物末端加磷酸。方法是：PCR产物用乙醇沉淀后，经70%乙醇洗盐后加入ddH₂O溶解，加入1倍反应Buffer、dATP和T4 Polynucleotide Kinase后在37℃下温浴1小时，用低熔点胶回收后备用；将去磷酸的Sma I酶切过的pDG01载体和加磷酸的pfu酶扩增的片段放到一起，并用T4连接酶连接，转入大肠杆菌，筛选阳性克隆获得pDGA300。经测序鉴定正确（序列表SEQ ID NO.1），再进行下面实验。

实施例三、水稻表达载体的构建及其遗传转化

得到中间质粒后，通过一个重组的LR反应，再经PCR筛选后克隆到水稻表达载体pCAB中，该水稻载体所用的启动子为水稻的Actin1启动子。在细菌中是卡那霉素抗性，在水稻中是抗除草剂PPT即Bar抗性。具体方法如下：在反应体系中加入75 ng左右 pCAB载体质粒DNA，150ng左右pDGA300中间载体质粒DNA，1μL invitrogen LR Clonase^TM II，并加入TE Buffer， pH 8.0补足至5μl，在25 ℃反应1 小时。反应产物用热激法转入大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得阳性克隆pCBA300。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将上述载体pCBA300导入到水稻品种皖粳97（由安徽省农业科学院提供）中，经愈伤组织诱导、侵染、共培养、筛选具有Bar抗性的愈伤，再分化、生根、壮苗、移栽得到转基因植株，具体方法见下面步骤。

实施例四、农杆菌的培养及其与水稻愈伤组织的共培养

1）挑取活化含有目的基因的单个农杆菌（AGL₁）菌落，在28℃于4mL含相应抗生素（卡那霉素，50mg/mL）的LB培养基中震荡过夜，第2天按1/100（V/V）接种量在LB液体培养基中培养，直到OD₆₀₀约为0.6-0.8；

2）离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM液体培养基（加1％的100～400μmol/l的As）中，至OD₆₀₀约为0.8-1.0；

3）将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟。并不时摇动；可将浸泡在农杆菌液体中的愈伤组织在真空抽滤5分钟左右；

4）将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基上，25±1℃暗培养2.5-3.0天。

实施例五、抗性愈伤组织的筛选及其再生

1）经共培养后的愈伤组织，切去胚芽等，置无菌滤纸上吸干农杆菌菌液；

2）转入筛选培养基上于25±1℃暗培养条件下筛选培养2周；

3）新鲜长出的抗性愈伤组织或不遏化的愈伤组织转入筛选培养基上，继续筛选培养2次，每次2周；

4）将抗性愈伤组织转入分化培养基上处理2周，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；

5）经预分化的愈伤组织转入分化培养基上分化再生，在光下培养（光照12h/d）,约1个月左右；

6）再生的小苗在1/2MS培养基上生根壮苗，约1个月左右；移入大田种。

培养基组分及其配方：

（1）试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素及抗生素的缩写表示如下：

6-BA（6-BenzylaminoPurine， 6-苄氨基腺嘌呤）

Kan （Kanamycin，卡那霉素）

Amp （Ampicillin，氨苄青霉素）

KT（Kinetin，激动素）

NAA （Napthalene acetic acid，萘乙酸）

IAA（Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸）

2 , 4-D （2 , 4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2, 4二氯苯氧乙酸）

AS （Acetosringone，乙酰丁香酮）

CH（CaseinEnzymatic Hydrolysate , 水解酪蛋白）

Bar（Bialaphos，除草剂）

DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜）

（2）基本培养基：

LB 10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、pH7.0

N₆ N₆大量元素、N₆微量元素、N₆有机成分

NB₀ N₆大量元素、B₅微量元素（B₅-M₁、B₅-M₂）和B₅有机成分

MS MS大量元素、MS微量元素和MS有机成分

AAM AA大量元素和微量元素、MS有机成分

（3）农杆菌介导转化水稻所用培养基：

愈伤诱导培养基：NB₀培养基、300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、2.5g/L植物凝胶、2.0 mg/L 2,4-D、 pH5.8

侵染培养基：AAM培养基、500mg/L水解酪蛋白、68.5 g/L蔗糖、36 g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮、pH5.2

共培养培养基：N₆培养基、1g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、2.5g/L植物凝胶、2.0 mg/L 2,4-D、 pH5.8

抗性愈伤筛选培养基：NB₀培养基、300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、2.5g/L植物凝胶、2.0 mg/L 2,4-D、250mg/L Cef、200mg/L Amp、4mg/L Bar、pH5.8

组织分化培养基：NB₀培养基、300mg/L水解酪蛋白、、500mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、2.5g/L植物凝胶、2.0 mg/L 2,4-D、2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、1.0mg/L NAA、1.0mg/L KT、4mg/L Bar、PH5.8

壮苗培养基：1/2MS培养基、30g/L蔗糖、2.5g/L植物凝胶、4mg/L Bar、PH5.8。

实施例六、转基因水稻的DNA分子水平及转录水平的鉴定

取抗性植株幼嫩叶片，小量叶片用CTAB法提取DNA，并用引物A300FP及A300RP进行PCR扩增鉴定，如图3所示，在1Kb左右附近有条带的均为阳性植株；用Trizol法提取阳性转基因植株的RNA，使用反转录试剂盒对RNA进行反转录合成第一链cDNA，并使用同样的引物在转录水平上进行过量表达鉴定，见图6。

实施例七、MYB44转基因过量表达T₁代及T₂代在干旱胁迫下的生长状况

本发明选取了3个MYB44过量表达的T₁代及T₂代转基因株系实验。具体步骤如下：将过量表达的转基因株系T₁代种子与野生型对照的种子去壳消毒后的种子播种到1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到新的1/2MS 培养基上，在光照培养室生长10天后，将幼苗移入装有泥土的方形托盘中，试验用的泥土为水稻田中直接取用的泥土，等幼苗生长至减数分裂期后，对植株进行断水干旱胁迫7天，然后浇水恢复9天，拍照并调查植株的存活率。试验表明，本实施例与野生型对照相比，MYB44过量表达转基因T₁代株系表现为干旱耐受，见图9、图10、图11；为了进一步验证MYB44过量表达转基因株系的干旱耐受功能，我们选用MYB44过量表达转基因T₂代株系做了进一步的干旱实验验证，将过量表达的转基因株系T₂代种子与野生型对照的种子去壳消毒后的种子播种到1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到新的1/2MS 培养基上，在光照培养室生长10天后，将幼苗移入装有泥土圆形小花盆中，试验用的泥土为水稻田中直接取用的泥土，等幼苗生长至4叶期时，对植株进行断水干旱胁迫5-7天，然后浇水恢复5-7天，拍照并调查植株的存活率。试验表明，本实施例与野生型对照相比，MYB44过量表达转基因T₂代株系也表现为干旱耐受；以上实验表明，本实例与野生型对照相比，表现出干旱耐受表型，见图7、图8。

实施例八、甘露醇胁迫及盐胁迫下的生长状况

本发明选取了3 个MYB44过量表达的T₁转基因株系进行了甘露醇胁迫及NaCl胁迫实验。具体步骤如下：将过量表达转基因株系种子去壳消毒后，分别与野生型对照同时播种到100 mmol/L、150 mmol/L及200 mmol/L的甘露醇（图12）和NaCl（图13）的1/2MS 培养基上，在光照培养室生长14天后观察表型和测量植株的株高及鲜重。每个家系的每种处理不少于20棵植株，实验设置3 次重复。结果表明：MYB44过量表达的转基因植株的生长在正常条件下与野生型对照无明显差异，但在逆境胁迫处理后生长要显著优于野生型对照，说明本发明的MYB44基因的表达可以缓解甘露醇胁迫及NaCl胁迫造成的植株生长发育受阻，增强了转基因植物对非生物逆境的抗性，见图12、13、14、15。

序列表1 SEQ ID No.1

（Nucleotide Sequence，Sequence Length (bp) ：1985）

ctcgaacttg tttttggttc atctctcaaa accaaaatca ctaaagagga gaagattgct 60

aaagtttgat aaaacattcc aaaatcaatg gctgatagga tcaaaggtcc atggagtcct 120

gaagaagacg agcagcttcg taggcttgtt gttaaatacg gtccaagaaa ctggacagtg 180

attagcaaat ctattcccgg tagatcgggg aaatcgtgtc gtttacggtg gtgcaaccag 240

ctttcgccgc aagttgagca tcggccgttt tcggctgagg aagacgagac gatcgcacgt 300

gctcacgctc agttcggtaa taaatgggcg acgattgctc gtcttctcaa cggtcgtacg 360

gacaacgccg tgaagaatca ctggaactcg acgctcaaga ggaaatgcgg cggttacgac 420

catcggggtt acgatggttc ggaggatcat cggccggtta agagatcggt gagtgcggga 480

tctccacctg ttgttactgg gctttacatg agcccaggaa gcccaactgg atctgatgtc 540

agtgattcaa gtactatccc gatattacct tccgttgagc ttttcaagcc tgtgcctaga 600

cctggtgctg ttgtgctacc gcttcctatc gaaacgtcgt cttcttccga tgatccaccg 660

acttcgttaa gcttgtcact tcctggtgcc gacgtaagcg aggagtcaaa ccgtagccac 720

gagtcaacga atatcaacaa caccacttcg agccgccaca accacaacaa tacggtgtcg 780

tttatgccgt ttagtggtgg gtttagaggt gcgattgagg aaatggggaa gtcttttccc 840

ggtaacggag gcgagtttat ggcggtggtg caagagatga ttaaggcgga agtgaggagt 900

tacatgacgg agatgcaacg gaacaatggt ggcggattcg tcggaggatt cattgataat 960

ggcatgattc cgatgagtca aattggagtt gggagaatcg agtagacaaa gtgagattat 1020

taggaaactg tttaaattgg agaagaagaa aaatgctctg tttttttctc ctttggatta 1080

ggcttaagaa ttttgggttt taaggaaatg tatagaggaa atcgagtgaa caaagctcga 1140

gagctgggga cgtagtgacg aagacgaaga tcaaatttct cttaagctat tcaggaaaat 1200

aaaataaatt tttatttata actacgctta atgatgataa tagatcaaat taatacacaa 1260

agtatcacaa agtgaaagat aaatgatcca gttaaagaac aagtttgtcg aggattggta 1320

aagacttgca tttggcaact aaaggcacag atttgggcat ggtaagaccc tttccttccg 1380

acatgtcaac ggcaacgtca ttgtctctct cccaatcgaa acactggatc aatgagccta 1440

aagctaagct cagtactagt tgggccaggc ccataccagg acatgctctc ctaccgattc 1500

cgaaaggcag aaacttacca cgatgggtct ctgattcaaa cctctctggt ttgaaagttt 1560

ctgggtcatc ccatacattt gggtctctct gaatagccca cgcattgata aatagccagg 1620

tgcgacgtgg aatgtcaaat ccagcgactt cacagtcagt ggatgaagcg tgtgggacaa 1680

gtaagggcgc cgccggaaac aaacgaagag tctcagagat cacattgttg agatagggac 1740

acttgccagt atctgattcc tcaaacacac gcccttcttt cgaaacctcg tttagttccg 1800

ttttgagttt ccttaaaact tccggatgat ttagaaggtt agccatagcc cactccaacg 1860

tcactgcggt tgtgtccgtt ccagcaagca acatcacctg caatgaatcc tttgaatctt 1920

tgatgaatca atcttgatca ctcctattaa cgattcaaaa ttataggaat taaaaactca 1980

tgtac 1985

序列表2 SEQ ID No.2

Met Ala Asp Arg Ile Lys Gly Pro Trp Ser Pro Glu Glu Asp Glu Gln

Leu Arg Arg Leu Val Val Lys Tyr Gly Pro Arg Asn Trp Thr Val Ile

Ser Lys Ser Ile Pro Gly Arg Ser Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp

Cys Asn Gln Leu Ser Pro Gln Val Glu His Arg Pro Phe Ser Ala Glu

Glu Asp Glu Thr Ile Ala Arg Ala His Ala Gln Phe Gly Asn Lys Trp

Ala Thr Ile Ala Arg Leu Leu Asn Gly Arg Thr Asp Asn Ala Val Lys

Asn His Trp Asn Ser Thr Leu Lys Arg Lys Cys Gly Gly Tyr Asp His

Arg Gly Tyr Asp Gly Ser Glu Asp His Arg Pro Val Lys Arg Ser Val

Ser Ala Gly Ser Pro Pro Val Val Thr Gly Leu Tyr Met Ser Pro Gly

Ser Pro Thr Gly Ser Asp Val Ser Asp Ser Ser Thr Ile Pro Ile Leu

Pro Ser Val Glu Leu Phe Lys Pro Val Pro Arg Pro Gly Ala Val Val

Leu Pro Leu Pro Ile Glu Thr Ser Ser Ser Ser Asp Asp Pro Pro Thr

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Pro Gly Ala Asp Val Ser Glu Glu Ser Asn

Arg Ser His Glu Ser Thr Asn Ile Asn Asn Thr Thr Ser Ser Arg His

Asn His Asn Asn Thr Val Ser Phe Met Pro Phe Ser Gly Gly Phe Arg

Gly Ala Ile Glu Glu Met Gly Lys Ser Phe Pro Gly Asn Gly Gly Glu

Phe Met Ala Val Val Gln Glu Met Ile Lys Ala Glu Val Arg Ser Tyr

Met Thr Glu Met Gln Arg Asn Asn Gly Gly Gly Phe Val Gly Gly Phe

Ile Asp Asn Gly Met Ile Pro Met Ser Gln Ile Gly Val Gly Arg Ile

Glu