CN106699856A

CN106699856A - 抗逆相关蛋白SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用

Info

Publication number: CN106699856A
Application number: CN201710012846.0A
Authority: CN
Inventors: 陈明; 马有志; 徐兆师; 李连城; 周永斌; 陈隽; 谢丽娜
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2037-01-09
Also published as: CN106699856B

Abstract

本发明公开了抗逆相关蛋白SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用。本发明所提供的抗逆相关蛋白SiMYB148为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质。实验证明，在水稻Kitaake中过表达SiMYB148基因，得到转SiMYB148基因水稻；与水稻Kitaake相比，转SiMYB148基因水稻的抗逆性增强。因此，蛋白质SiMYB148在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

Description

抗逆相关蛋白SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗逆相关蛋白SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和养分缺乏等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用。

上述应用中，所述蛋白质SiMYB148可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由304个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质SiMYB148的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，编码所述蛋白质SiMYB148的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质SiMYB148的DNA分子；

b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质SiMYB148的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由915个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述应用中，所述调控植物抗逆性可为增加植物抗逆性。

上述应用中，所述抗逆性可为耐低氮性、抗盐性和抗旱性中的三种、任意两种或任一种。

上述应用中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种Kitaake。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，包括将编码所述蛋白质SiMYB148的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗逆性增强。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。

本发明所提供的植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质SiMYB148的含量或活性，从而增加抗逆性。

上述方法中，所述抗逆性可为耐低氮性、抗盐性和抗旱性中的三种、任意两种或任一种。

上述方法中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种Kitaake。

实验证明，在水稻Kitaake中过表达SiMYB148基因，得到转SiMYB148基因水稻；与水稻Kitaake相比，转SiMYB148基因水稻的抗逆性增强。因此，蛋白质SiMYB148在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

附图说明

图1为实施例2的实验结果。

图2为实施例3的实验结果。

图3为实施例4步骤二中低氮处理的实验结果。

图4为实施例4步骤二中干旱处理的实验结果。

图5为实施例4步骤三的实验结果。

图6为实施例4步骤四的实验结果。

图7为实施例4步骤四的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)(Kim H,Hyun Y,ParkJ,Park M,Kim M,Kim H,Lee M,Moon J,Lee I,Kim J.A genetic link between coldresponses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.NatureGenetics.2004,36:167-171)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)在下文中简称野生型拟南芥。

载体16318hGFP记载于如下文献中：Li ZY,Xu ZS,He GY,Yang GX,Chen M,Li LC,Ma YZ.(2012)Overexpression of soybean GmCBL1enhances abiotic stress toleranceand promotes hypocotyl elongation in Arabidopsis.Biochem Biophys Res Commun，427:731-736.

谷子品种H214记载于如下文献中：王二辉，胡利芹，薛飞洋，李微微，徐兆师，李连城，周永斌，马有志，刁现民，贾冠清，陈明，闵东红.谷子转录因子基因SiNAC45在拟南芥中对低钾及ABA的响应.作物学报，2015，41(9)：1445-1453.。公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人处)获得谷子品种H214，以重复本发明的相关实验，不可作为其它用途使用。谷子品种H214在下文中简称谷子。

低氮培养基的溶质及其浓度为：MS粉0.78g/L，N⁺母液1mL/L，K⁺母液10mL/L，盐酸硫胺素1mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，甘氨酸1mg/L，烟酸1mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30.00g/L，植物凝胶2g/L；溶剂为蒸馏水；pH值5.9。

N⁺母液的溶质及其浓度为：1.36g/L NH₄NO₃，3.33g/L KNO₃；溶剂为水；pH值自然。

K⁺母液的溶质及其浓度为：139.908g/L KCl；溶剂为水；pH值自然。

植物总RNA快速提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品。反转录试剂盒为TaKaRa公司的产品。

农杆菌介导法记载于如下文献中：刘选明，彭玉冲等.水稻bHLH转录因子Os11g39000的功能研究.湖南大学学报(自科版)，2016，43(6):109-116.)

载体pBI121记载于如下文献中：Li ZY,Xu ZS,He GY,Yang GX,Chen M,Li LC,MaYZ.(2012)Overexpression of soybean GmCBL1enhances abiotic stress toleranceand promotes hypocotyl elongation in Arabidopsis.Biochem Biophys Res Commun，427:731-736.。公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人处)获得，以重复本发明的相关实验，不可作为其它用途使用。

低氮的Hoagland营养液的溶质及其浓度为：二水氯化钙595mg/L，氯化钾180mg/L，磷酸二氢钾136mg/L，硫酸镁493mg/L，铁盐溶液1mL/L，微量元素液1mL/L；溶剂为蒸馏水；pH值6.0。

Hoagland营养液的溶质及其浓度为：四水硝酸钙945mg/L，硝酸钾506mg/L，硝酸铵80mg/L，磷酸二氢钾136mg/L，硫酸镁493mg/L，铁盐溶液1mL/L，微量元素液1mL/L；溶剂为蒸馏水；pH值6.0。

铁盐溶液：将七水硫酸亚铁2.78g和乙二胺四乙酸二钠3.73g溶于500mL水得到。

微量元素溶液的溶质及其浓度为：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L；溶剂为水；pH值自然。

水稻Kitaake记载于如下文献中：李季航，向珣朝，何立斌，李平.水稻亚种间杂种F1光合特性研究.植物学通报，2005,22(4)：432-438.

实施例1、抗逆相关蛋白SiMYB148编码基因的克隆

1、将在MS培养基上培养至10d的谷子幼苗整株取出并洗去营养土，作为实验材料。所述培养的条件为：温度22℃；湿度65％；光照周期为光照培养16h，黑暗培养8h；光照强度40-60μmol/m².s^-1

2、取步骤1得到的实验材料，用植物总RNA快速提取试剂盒提取总RNA，得到谷子的总RNA。

3、按照反转录试剂盒的操作步骤，将谷子的总RNA反转录出第一链cDNA，得到谷子的cDNA。谷子的cDNA中，DNA浓度为500ng/μL。

4、以谷子的cDNA为模板，以F：5'-atggggaggcagccgtgctg-3'和R：5'-ctaataactagagaagaggg-3'为引物进行RT-PCR扩增，得到约920bp的PCR扩增产物。

5、将步骤4获得的PCR扩增产物连接至pZeroBack/Blunt Vector，得到重组质粒pBlunt-SiMYB148。

pZeroBack/Blunt Vector为pZeroBack Fast Ligation Kit中的组件；pZeroBackFast Ligation Kit为天根生化科技(北京)有限公司的产品。

对重组质粒pBlunt-SiMYB148进行测序。测序结果表明，重组质粒pBlunt-SiMYB148中含有序列表中序列1所示的DNA分子(以下命名为SiMYB148基因)。SiMYB148基因编码序列表中序列2所示的蛋白质(以下命名为SiMYB148蛋白或蛋白质SiMYB148)。蛋白质SiMYB148的等电点为5.65，分子量大小为33.5kD。

实施例2、表达模式分析

一、干旱胁迫下SiMYB148基因的表达模式

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

1、将在MS培养基培养3d的3株谷子幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于20％(m/m)的PEG6000水溶液中，培养1h，然后用植物总RNA快速提取试剂盒提取谷子幼苗的总RNA，得到的RNA命名为干旱处理1h RNA。按照反转录试剂盒的操作步骤，将干旱处理1h RNA反转录出第一链cDNA，得到的cDNA命名为干旱处理1h cDNA。

按照上述方法，将1h分别替换为6h、12h、24h和48h，其它步骤均不变，分别得到干旱处理6h cDNA、干旱处理12h cDNA、干旱处理24h cDNA和干旱处理48h cDNA。

用植物总RNA快速提取试剂盒提取在MS培养基培养3d的3株谷子幼苗的总RNA，得到对照RNA。按照反转录试剂盒的操作步骤，将对照RNA反转录出第一链cDNA，得到的cDNA命名为对照cDNA。

2、采用Real Master Mix Plus(SYBR Green)试剂盒对步骤1得到的各个cDNA中SiMYB148基因的相对表达量进行实时荧光定量分析。

反应体系：10μL 2×SuperReal PreMix Plus、0.6μL上游引物(浓度为10μmol·L-1)、0.6μL下游引物(浓度为10μmol·L-1)、0.5μl 50×ROX Reference Dye、1μL cDNA模板和7.3μL RNase free ddH₂O。

扩增程序：95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃31s，41个循环。

2×SuperReal PreMix Plus和50×ROX Reference Dye均为Real Master MixPlus(SYBR Green)试剂盒中的组件；Real Master Mix Plus(SYBR Green)试剂盒为天根生化科技有限公司的产品，产品目录号为ABI7500。

检测SiMYB148基因的引物为5’-GACGAGATCATGGTGCCACT-3’和5’-CATGTCCATGAACGCGAACG-3’。

检测谷子Actin(Si001873m.g)的引物为：5’-GGCAAACAGGGAGAAGATGA-3’和5’-GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG-3’。

实验结果见图1中A(0h为对照cDNA，1h为干旱处理1h cDNA，6h为干旱处理6hcDNA，12h为干旱处理12h cDNA，24h为干旱处理24h cDNA，48h为干旱处理48h cDNA)。结果表明，在干旱胁迫下，随着处理时间的延长，SiMYB148基因的相对表达量也在不同程度的上升。

二、高盐胁迫下SiMYB148基因的表达模式

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

1、将在MS培养基培养3d的3株谷子幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于200mM的氯化钠水溶液中，培养1h，然后用植物总RNA快速提取试剂盒提取谷子幼苗的总RNA，得到的RNA命名为氯化钠处理1h RNA。按照反转录试剂盒的操作步骤，将氯化钠处理1h RNA反转录出第一链cDNA，得到的cDNA命名为氯化钠处理1h cDNA。

按照上述方法，将1h分别替换为6h、12h、24h和48h，其它步骤均不变，分别得到氯化钠处理6h cDNA、氯化钠处理12h cDNA、氯化钠处理24h cDNA和氯化钠处理48h cDNA。

反应体系、扩增程序、检测SiMYB148基因的引物和检测谷子Actin(Si001873m.g)的引物均同步骤一中2。

实验结果见图1中B(0h为对照cDNA，1h为氯化钠处理1h cDNA，6h为氯化钠处理6hcDNA，12h为氯化钠处理12h cDNA，24h为氯化钠处理24h cDNA，48h为氯化钠处理48hcDNA)。结果表明，在高盐胁迫下，随着处理时间的延长，SiMYB148基因的相对表达量先上升后缓慢下降。

三、低氮胁迫下SiMYB148基因的表达模式

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

1、将在MS培养基上培养3d的3株谷子幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于低氮培养基中，培养1h，然后用植物总RNA快速提取试剂盒提取谷子幼苗的总RNA，提取得到的RNA命名为低氮处理1h RNA。按照反转录试剂盒的操作步骤，将低氮处理1hRNA反转录出第一链cDNA，得到的cDNA命名为低氮处理1h cDNA。

按照上述方法，将1h分别替换为6h、12h、24h和48h，其它步骤均不变，分别得到低氮处理6h cDNA、低氮处理12h cDNA、低氮处理24h cDNA和低氮处理48h cDNA。

用植物总RNA快速提取试剂盒提取在MS培养基培养3d的3株谷子幼苗植株的总RNA，得到对照RNA。按照反转录试剂盒的操作步骤，将对照RNA反转录出第一链cDNA，得到的cDNA命名为对照cDNA。

实验结果见图1中C(0h为对照cDNA，1h为低氮处理1h cDNA，6h为低氮处理6hcDNA，12h为低氮处理12h cDNA，24h为低氮处理24h cDNA，48h为低氮处理48h cDNA)。结果表明，在低氮胁迫下，随着处理时间的延长，SiMYB148基因的相对表达量先上升后缓慢下降，在处理时间为12h时达到最大值。

四、脱落酸胁迫下SiMYB148基因的表达模式

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

1、将在MS培养基培养3d的3株谷子幼苗取出并洗去营养土，吸干根上的水分后将幼苗置于100μM的ABA水溶液中，培养1h，然后用植物总RNA快速提取试剂盒提取谷子幼苗植株的总RNA，得到的RNA命名为脱落酸处理1h RNA。按照反转录试剂盒的操作步骤，将脱落酸处理1h RNA反转录出第一链cDNA，得到的cDNA命名为脱落酸处理1h cDNA。

按照上述方法，将1h分别替换为6h、12h、24h和48h，其它步骤均不变，分别得到脱落酸处理6h cDNA、脱落酸处理12h cDNA、脱落酸处理24h cDNA和脱落酸处理48h cDNA。

实验结果见图1中D(0h为对照cDNA，1h为脱落酸处理1h cDNA，6h为脱落酸处理6hcDNA，12h为脱落酸处理12h cDNA，24h为脱落酸处理24h cDNA，48h为脱落酸处理48hcDNA)。结果表明，在脱落酸胁迫下，随着处理时间的延长，SiMYB148基因的相对表达量先上升后缓慢下降，在处理时间为12h时达到最大值。

上述结果表明，SiMYB148基因对干旱胁迫、高盐胁迫、低氮胁迫和脱落酸胁迫均有一定程度的响应。

实施例3、亚细胞定位

1、将序列表中序列1自5’末端起第1至912位所示的DNA分子插入载体16318hGFP的限制性内切酶BamHI的酶切识别位点，得到重组质粒35S：SiMYB148-GFP。重组质粒35S：SiMYB148-GFP表达序列表中序列2所示的蛋白质SiMYB148。重组质粒35S：SiMYB148-GFP中，SiMYB148基因的插入方向与GFP阅读框一致。

2、将重组质粒35S：SiMYB148-GFP通过瞬时转染法导入野生型拟南芥原生质体中，室温条件下培养过夜，然后使用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)观察野生型拟南芥原生质体内的荧光信号。

将载体16318hGFP通过瞬时转染法导入野生型拟南芥原生质体中，室温条件下培养过夜，然后使用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)观察野生型拟南芥原生质体内的荧光信号，作为对照。

实验结果见图2(A为载体16318hGFP(从左至右依次为绿色荧光，明场，红色荧光，绿色荧光、明场和红色荧光的叠加)；B为重组质粒35S：SiMYB148-GFP(从左至右依次为绿色荧光，明场，红色荧光，绿色荧光、明场和红色荧光的叠加))。结果表明，GFP蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核，SiMYB148蛋白定位于细胞核。

实施例4、转SiMYB148基因水稻的获得和抗逆性鉴定

一、转SiMYB148基因水稻的获得

本发明的发明人将序列表中序列1自5’末端起第1至912位所示的DNA分子插入载体pBI121的限制性内切酶XbaI的酶切识别位点和限制性内切酶BamHI的酶切识别位点之间，得到重组质粒。将该重组质粒采用农杆菌介导法转化水稻Kitaake的愈伤组织，经过繁殖培养，获得5个T₂代转SiMYB148基因水稻纯合株系，依次命名为OE1、OE2、OE3、OE4和OE5。经鉴定，与水稻Kitaake相比，OE1、OE2、OE3、OE4或OE5中SiMYB148基因的表达量显著增加。

本发明的发明人将载体pBI121采用农杆菌介导法转化水稻Kitaake的愈伤组织，经过繁殖培养，获得转空载体水稻。经鉴定，水稻Kitaake和转空载体水稻中SiMYB148基因的表达量无显著差异。

二、水培实验

待测水稻为水稻Kitaake、转空载体水稻、OE1、OE2、OE3、OE4或OE5。

光暗交替培养的条件为：28℃。光照培养时的光照强度为5000Lx。光暗交替培养的周期具体为：12h光照培养/12h黑暗培养。

实验重复三次，每次实验的步骤如下：

1、将50粒待测水稻种子放入培养皿，加入少量水，然后置于恒温培养箱(温度设置为38℃)培养至待测水稻种子发出白芽及少许短根(培养过程中，每12h换一次水)，即得到发芽的待测水稻。

2、完成步骤1后，将发芽的待测水稻转移至96孔板，然后置于水中光暗交替培养1周，得到一周幼苗。

3、完成步骤2后，取装有一周幼苗的96孔板，然后置于Hoagland营养液中光暗交替培养一周，得到两周幼苗。

4、完成步骤3后，取装有两周幼苗的96孔板，然后置于含20％(m/m)的PEG6000的Hoagland营养液中光暗交替培养三周，得到干旱处理的待测水稻。

5、完成步骤3后，取装有两周幼苗的96孔板，然后置于低氮的Hoagland培养液中光暗交替培养三周，得到低氮处理的待测水稻。

6、完成步骤3后，取装有两周幼苗的96孔板，然后置于Hoagland营养液中光暗交替培养三周，得到正常处理的待测水稻(作为对照)。

观察正常处理的待测水稻和低氮处理的待测水稻的表型，并统计平均株高(cm)、平均鲜重(g)、平均根表面积(cm²)和平均主根长(cm)。部分实验结果见图3(A为对照的表型，B为低氮处理的待测水稻的表型，C为低氮处理的待测水稻的平均株高统计结果，D为低氮处理的待测水稻的平均鲜重统计结果，E为低氮处理的待测水稻的平均根表面积统计结果，F为低氮处理的待测水稻的平均主根长统计结果，CK为水稻Kitaake)。结果表明，低氮处理的待测水稻的叶片较黄，正常处理的待测水稻的叶片较绿；正常处理的待测水稻的表型无显著差异；低氮处理的待测水稻的表型则有显著差异，OE1、OE2、OE3、OE4或OE5的平均株高、平均鲜重、平均根表面积和平均主根长均显著高于水稻Kitaake；在低氮处理或正常处理的条件下，转空载体水稻和水稻Kitaake的平均株高、平均鲜重、平均根表面积和平均主根长均无显著差异。

观察正常处理的待测水稻和干旱处理的待测水稻的表型，并统计平均株高(cm)、平均鲜重(g)、平均主根长(cm)和平均侧根数(个)。部分实验结果图4(A为对照的表型，B为干旱处理的待测水稻的表型，C为干旱处理的待测水稻的平均株高统计结果，D为干旱处理的待测水稻的平均鲜重统计结果，E为干旱处理的待测水稻的平均主根长统计结果，F为干旱处理的待测水稻的平均侧根数统计结果，CK为水稻Kitaake)。结果表明，干旱处理的待测水稻的叶片较黄且根较黄，正常处理的待测水稻的叶片较绿且根较白；正常处理的待测水稻的表型无显著差异；干旱处理的待测水稻的表型则有显著差异，OE1、OE2、OE3、OE4或OE5的平均株高、平均鲜重和平均主根长均显著高于水稻Kitaake，平均侧根数显著多于水稻Kitaake；在干旱处理或正常处理的条件下，转空载体水稻和水稻Kitaake的平均株高、平均鲜重、平均主根长和平均侧根数均无显著差异。

上述结果表明，与水稻Kitaake相比，OE1、OE2、OE3、OE4或OE5的抗旱性和耐低氮性均有一定的提高。

三、氮含量的测定

待测样本1：步骤二得到的低氮处理的水稻Kitaake的地上部分；

待测样本2：步骤二得到的低氮处理的OE1的地上部分；

待测样本3：步骤二得到的低氮处理的OE2的地上部分；

待测样本4：步骤二得到的低氮处理的OE3的地上部分；

待测样本5：步骤二得到的低氮处理的OE4的地上部分；

待测样本6：步骤二得到的低氮处理的OE5的地上部分；

待测样本7：步骤二得到的低氮处理的水稻Kitaake的地下部分；

待测样本8：步骤二得到的低氮处理的OE1的地下部分；

待测样本9：步骤二得到的低氮处理的OE2的地下部分；

待测样本10：步骤二得到的低氮处理的OE3的地下部分；

待测样本11：步骤二得到的低氮处理的OE4的地下部分；

待测样本12：步骤二得到的低氮处理的OE5的地下部分；

待测样本13：步骤二得到的低氮处理的转空载体水稻的地上部分；

待测样本14：步骤二得到的低氮处理的转空载体水稻的地下部分。

1、取待测样本，杀青烘干，得到待测样本的干物质。

2、取0.2g待测样本的干物质，用研磨棒研磨成粉末，放入试管(规格为100mL)中，加入0.5mL水和400mL的浓硫酸，静置过夜；然后180℃消煮30min，350℃消煮150min，之后350℃继续消煮至溶液完全透明(期间每隔20min加一次双氧水)，得到待测样本溶液。

由中国农业科学院土壤肥料研究所测定待测样本溶液中的氮含量。然后通过计算，得到待测样本的氮含量(mg/g干重)。

部分实验结果见图5(左图为地上部分的氮含量，CK为待测样本1，OE1为待测样本2，OE2为待测样本3，OE3为待测样本4，OE4为待测样本5，OE5为待测样本6；右图为地下部分的氮含量，CK为待测样本7，OE1为待测样本8，OE2为待测样本9，OE3为待测样本10，OE4为待测样本11，OE5为待测样本12)。结果表明，OE1、OE2、OE3、OE4或OE5的地上部分的氮含量和地下部分的氮含量均显著高于水稻Kitaake；水稻Kitaake和转空载体水稻的地上部分的氮含量无显著差异，地下部分的氮含量也无显著差异。

四、萌发实验

待测水稻为水稻Kitaake、转空载体水稻、OE1、OE2或OE3。

实验重复两次，每次重复的步骤如下：

1、取规格为10mL的试管，加入28粒待测水稻种子，先依次用超纯水清洗两遍(每次使用超纯水4mL)，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡3min，超纯水清洗两遍(每次使用超纯水4mL)；再依次用40％(v/v)84消毒液水溶液浸泡30min(期间进行不间断的晃动试管，确保水稻表面充分的接触到84消毒液)，超纯水清洗三遍(每次使用超纯水4mL)，得到无菌的待测水稻种子。

2、完成步骤1后，将无菌的待测水稻种子播种于MS培养基、含6μmol/L ABA的MS培养基或含150mM NaCl的MS培养基，然后置于湿度为65％的温室光暗交替培养7d，统计萌发率。光暗交替培养的条件为：30℃。光照培养时的光照强度为5000Lx。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。

部分实验结果见图6(A为生长状态；B为MS培养基上待测水稻种子的萌发率统计结果；C为含150mM NaCl的MS培养基上待测水稻种子的萌发率统计结果，CK为水稻Kitaake)。结果表明，在MS培养基上，待测水稻种子的长势基本一致，萌发率也无显著差异；在含150mMNaCl的MS培养基上，水稻Kitaake只萌发了1粒、而OE1、OE2和OE3分别萌发了11粒、6粒和2粒；OE1、OE2或OE3的萌发率均显著高于水稻Kitaake；在含150mM NaCl的MS培养基上，转空载体水稻和水稻Kitaake的萌发率无显著差异。可见，与水稻Kitaake相比，OE1、OE2或OE3的抗盐性提高。

部分实验结果见图7(A为生长状态；B为MS培养基上待测水稻种子的萌发率统计结果；C为含6μmol/L ABA的MS培养基上待测水稻种子的萌发率统计结果，CK为水稻Kitaake)。结果表明，在MS培养基上，待测水稻种子的长势基本一致，萌发率也无显著差异；在含6μmol/L ABA的MS培养基上，水稻Kitaake的萌发率大于90％，而OE1、OE2和OE3的萌发率在40％-60％之间，均显著低于水稻Kitaake；在含6μmol/L ABA的MS培养基上，转空载体水稻和水稻Kitaake的萌发率无显著差异。可见，与水稻Kitaake相比，OE1、OE2或OE3对ABA更敏感。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 抗逆相关蛋白SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用

<160> 2

<170> PatentInversion3.5

<210>1

<211>915

<212>DNA

<213>谷子（Setaria italica）

<400>1

atggggaggc agccgtgctg cgacaaggtg gggctgaaga aggggccgtg gacggcggag 60

gaagaccaga agctcgtcag cttcatcctc ggcaacggcc agtgttgctg gcgcgccgtg 120

cccaagctcg ccgggctgct ccggtgcggc aagagctgcc ggctgcggtg gacgaactac 180

ctgcggccgg acctgaagag gggcctcctc tccgacgccg aggagaagct cgtcatcgac 240

ctgcatgccc agctcggcaa caggtggtca aagattgcgt cgcaattgcc tgggcgaacg 300

gacaacgaga tcaagaacca ctggaacacc cacatcaaga agaagctcaa gaagatgggg 360

atcgaccccc tcacccacaa gcccctctcg ccgccgcagg agcaccaaca gagtccaccg 420

cccgccggcg gttcgtcgga agctcagccg ccatcgccgc ctccggagag gaatcctcca 480

gaggagaagg cggcgacggg aagtagcagc gagcacggcg acgacgagct gatcctccgc 540

aagtcccccg gcttctgcac agacgaggtg ccgatgatgc acccagacga gatcatggtg 600

ccactgggcg accagccgcc gccgccatta ccagcgttga cttgcgcccc caccgccgcc 660

gccgcggtct cgacaccgac gacgtcctac tccacctcgg ggtcgtcgtc ctgcttgacc 720

cgcgacgtgg agtcgccgtt cgcgttcatg gacatgggct tgccggagtt cgtgttccag 780

acgacggggc tagaggacga catggtggac gacgcgcggt ggcacgacct cttgctgcca 840

ccgtcgccgg cctacgagga ccccttcgat tcttaccagt tccagaggaa cggcgccctc 900

ttctctagtt attag 915

<210>2

<211>304

<212>PRT

<213>谷子（Setaria italica）

<400>2

Met Gly Arg Gln Pro Cys Cys Asp Lys Val Gly Leu Lys Lys Gly Pro

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Ser Phe Ile Leu Gly Asn

20 25 30

Gly Gln Cys Cys Trp Arg Ala Val Pro Lys Leu Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Leu Leu Ser Asp Ala Glu Glu Lys Leu Val Ile Asp

65 70 75 80

Leu His Ala Gln Leu Gly Asn Arg Trp Ser Lys Ile Ala Ser Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn His Trp Asn Thr His Ile

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Lys Lys Met Gly Ile Asp Pro Leu Thr His Lys Pro

115 120 125

Leu Ser Pro Pro Gln Glu His Gln Gln Ser Pro Pro Pro Ala Gly Gly

130 135 140

Ser Ser Glu Ala Gln Pro Pro Ser Pro Pro Pro Glu Arg Asn Pro Pro

145 150 155 160

Glu Glu Lys Ala Ala Thr Gly Ser Ser Ser Glu His Gly Asp Asp Glu

165 170 175

Leu Ile Leu Arg Lys Ser Pro Gly Phe Cys Thr Asp Glu Val Pro Met

180 185 190

Met His Pro Asp Glu Ile Met Val Pro Leu Gly Asp Gln Pro Pro Pro

195 200 205

Pro Leu Pro Ala Leu Thr Cys Ala Pro Thr Ala Ala Ala Ala Val Ser

210 215 220

Thr Pro Thr Thr Ser Tyr Ser Thr Ser Gly Ser Ser Ser Cys Leu Thr

225 230 235 240

Arg Asp Val Glu Ser Pro Phe Ala Phe Met Asp Met Gly Leu Pro Glu

245 250 255

Phe Val Phe Gln Thr Thr Gly Leu Glu Asp Asp Met Val Asp Asp Ala

260 265 270

Arg Trp His Asp Leu Leu Leu Pro Pro Ser Pro Ala Tyr Glu Asp Pro

275 280 285

Phe Asp Ser Tyr Gln Phe Gln Arg Asn Gly Ala Leu Phe Ser Ser Tyr

290 295 300

Claims

1.蛋白质SiMYB148在调控植物抗逆性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质SiMYB148为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

3.编码权利要求1或2所述蛋白质SiMYB148的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用。

4.如权利要求1至3任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物抗逆性为增加植物抗逆性。

5.如权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为耐低氮性、抗盐性和抗旱性中的三种、任意两种或任一种。

6.如权利要求1至5任一所述的应用，其特征在于：所述植物为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种Kitaake。

7.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码权利要求1或2所述蛋白质SiMYB148的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗逆性增强。

8.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1或2所述蛋白质SiMYB148的含量或活性，从而增加抗逆性。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为耐低氮性、抗盐性和抗旱性中的三种、任意两种或任一种。

10.如权利要求7至9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种Kitaake。