CN105039351B - 水稻敏热基因ubp21的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻中一种去泛素酶UBP21基因的应用。利用此基因提高植物的抗热性的方法。本发明所使用的水稻UBP21基因其核苷酸序列是序列表中序列1中的DNA序列；其所编码的氨基酸序列是序列表中序列2氨基酸残基序列。实验证明，将上述基因在水稻中敲减后，可以提高植物在热激条件下的存活率，并提高下游热激蛋白的表达量，从而提高植株的耐热性。本发明在利用分子育种提高农作物抗热上有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻耐热和干旱相关的基因UBP21的应用，利用该基因通过调控下游热激蛋白的变化来调节拟南芥抗热性，属于基因工程技术领域。
背景技术
泛素化在细胞分裂、分化、内吞作用、激素调节和转录调控中发挥重要作用。泛素是一个高度保守的，含有76个氨基酸残基的多肽，广泛存在于真核细胞。泛素分子通过E1，E2和E3与蛋白底物结合形成被蛋白酶体降解的识别信号，结合的泛素在泛素水解酶的作用下，从被降解蛋白上释放，参与循环。在水稻中已经证实存在E3蛋白参与了耐热胁迫，如HCl，但是对于去泛素化蛋白在水稻耐热性中的作用还并不清楚。关于这个问题，有研究者通过蛋白质组学寻找到一个参与早期热激响应的蛋白UBP21，本申请人通过实验证实该蛋白缺失后明显提高了植物对高温和干旱的耐受性，对解释水稻高温胁迫机制和提供耐热作物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻敏热基因UBP21的应用。
本发明的目的是这样实现的。UBP21基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
在水稻中减弱UBP21基因的表达量，可以提高植物在热激条件下的存活率，上调下游热激蛋白的表达量，可以提高植株的耐热性，用于农作物耐热品种的培育。
本发明取得的有益效果如下：本发明利用水稻UBP21基因来提高植物的耐热和耐旱性，在水稻中降低这一基因的表达水平，可以提高植物在热激条件下的存活率，上调下游热激蛋白的表达量，从而提高植株的耐热性。同时突变体明显提高了植物的耐旱性。
附图说明
图1是水稻UBP21基因在高温下的变化。
图1中：A图是双向差异荧光凝胶电泳结果，显示水稻UBP21蛋白及其拟南芥同源基因UBP13蛋白受热上调。双向电泳胶图中，热激处理前用cy3标记，处理后用cy5标记。箭头标记的为UBP蛋白。左图显示的是水稻中的结果，右图显示的是拟南芥中的结果。B图显示的是在转录水平检测UBP21在45℃下热激不同时间的表达情况。
图2是缺失突变体基础耐热性的表型观察。
图2中：A图显示的是缺失突变体插入位点的示意图（上），下图显示的是突变体中UBP21基因的转录水平表达情况。B图显示的是植物热激前后的表型图，热激条件为45℃热激15分钟。C图显示的是B图植物的存活率统计结果。
图3是野生型和突变体中热激蛋白17.9和热激蛋白70的表达图。
图3中：不同热激时间下，热激蛋白17.9和70在野生型突变体中不同热激时间下的转录水平表达，微管蛋白作为内参。
图4是野生型和突变体耐旱表型的观察。
图4中：水稻生长约3个月后，干旱处理7天，观察表型。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例
1、UBP21受热调节方式
提取野生型植物热激前后的可溶性蛋白，通过醋酸铵甲醇方法沉淀之后，将热激前的蛋白用荧光染料cy3标记，热激后的蛋白用荧光染料cy5标记。通过双向差异荧光凝胶电泳按照等电点和分子量进行分离，通过Typhoon 9410进行扫描后，用ImageQuant 5.0软件进行分析。用Trizol提取不同热激时间下的植物总RNA，然后以引物RT-F: AGCTGAAGTTGTTTTTGGAAGTAGA；RT-R: AATAGCAGTTATGGGATGTTAGACG检测UBP21的转录本。
2、突变体的获得
从水稻种子库得到UBP21（基因号：LOC_Os11g36470）的PFG_2D-00343.RT-DNA插入突变体，经过T-DNA插入的筛选鉴定得到DNA水平的纯合突变体，表明得到了UBP21基因敲减的株系。将野生型和突变体种子种在28℃弱光萌发4天后，移入Hoagland培养基中，16L/8D的光周期下，28℃生长7天后，45℃水浴热激15分钟后，将植物重新放入16L/8D的光周期下，28℃恢复7天后照相。
3、突变体对热激蛋白17.9和70表达的影响
种子种在28℃弱光萌发4天后，移入Hoagland培养基中，16L/8D的光周期下，28℃生长7天后，45℃水浴热激处理，半定量PCR分析观察核酸胶的条带亮度。如图3所示，热激蛋白17.9和70均受热激诱导，植株在正常生长条件下不表达，热激处理后开始表达，而突变体中上调的水平高于野生型，与植物的耐热性提高相对应。
4、突变体在土壤中进行干旱处理
将野生型和突变体种子种在28℃弱光萌发4天后，移入Hoagland培养基中，16L/8D的光周期下，28℃生长7天，然后将生长一致的苗移植到土壤中，大约生长70-80天，然后干旱处理7天，观察表型。
通过实施例1证实，在水稻中减弱UBP21基因的表达量，可以提高植物在热激条件下的存活率，上调下游热激蛋白的表达量，从而提高植株的耐热性，可以用于农作物耐热品种的培育。
序列1：UBP21基因的核苷酸序列：
TTGACAATTTACAAATTTTTCCTGAGTTGGGTGAAGGGAAAAGGTTGCAGAGAATACAATCTCTACTTGTACAGAGTAATACGCAGTTTTGTCATTCTTATCTCACCTAAATGATATATGTTCTTCTCCTGACTCTTGGCTATATCATCGGTGTTTGTTTTGTAAACTGAGCTCTACTAAAATTATTGCAGTTTACTTCTGGGATCAATTTTAGATAAATATATGTATTATTGTTCATGTCGGCGGTGTAGCTATGGTTGTGTTAAGAGGCCACTAATCCGATCAATTTTGAAGAGACAAGAGGATAGATGATGCCAGACGTTTTTGTAATTTTATAGATTAGGGAAGAGAAGACCTCAAAACTGTGGTAAAGAGCACTTCTAAATGTGGATGTCTTTCAACATATAGTCAAGTACCATATGAATATGATGATGAAAAGCACTTTTGTAGGGAACAAATGTTTAGATGATTTATCAATCTTCTGAAATTTGTATATTAGTCCATTTTTATTTAATGATATTTACATGGACAATGGAACCACAATTGTGGAGATTTAAGAACTTCAGAACCAGTACATCAAGCTATATATATCTTTGTCTTGATAGTTTGGTGCACACGGTGTAATTGCCCTGCACCACATATAGCTACTGTTTTTTCATGTTACTGACGGTAAATTTTTTACAGTAATAAGAATAGGAAGCAAAGATAAATTGAACTATGTGTACTGGTCTCTGCCTTCACTGTATTTTGTTGTTATTAACACTCAAGAAATTGAAGTGAGCCTCTCATTTGTTGTCCTTATTAGGTTAGCTATCACAGTATTTTTTTTCCCGTTGCAACGCATGGGCACCTAACTAGTTGTTTAGTAGTTTGGGAAGCGTGCGCGCGAAAAACGAGGGGTAAAGTTAGGAAAATGGACTTAAAAACATAGCTTAAGGCCATTCACAATACACACGTGTCGTTGGGCCTGAGCCATCCACTACGAATATTCGTTGCCACGTCCGCCTCGCGTGCCCCCTAGTGAACAATGCAGAGCCCAAATTGATCACTCGTTCTCCGAGTTGATTGATGGCGTGCGGGCGCATGGGGAGAGGCACGAAACCGCACTGTGGAGGTCAGAGCTTGGCGCTGAAACCTAAAAGGCAAAAAGTGGAGAAGGAAGGAGATGCCCTCACCGCCCCTGCGACCCCTGCAGAATGGAGAAGTGGATAAGCTCTTCGTCGGGGAGGGAAGATAAGAGAAGCTTGATTCACCATGAAGGGGAGGGAAGAGAAGCTCAATCCGGCGTCATCCCCGTCATGCGCCATCGAGCTCGTCGTCATCCCCGACTCGGCAAAGTCGTCGTCCCGTCGTCCACTTCGCGCTGAGGTGACCAAGCTAGCCAGGGCGCGAGGAAGATGCCGGAGAGCTCAGTGGCTCCACCCTGACTTGGCCTCCTTCGCTGCCACGGTCCCGGCCTCTTGACTGCCGCCGTGACGTGAAGAAAGGAGAGGAGAGAGGAAGTCATGACATAGGAGGAACGCCAGCTGTGGAAGCAGAGGGGGGAGCCGACGCTCCTGCGCTGCCAAGCTCCTACCATCCCCAACGTTGCTGCCGAGCCCCTGCCATCCCCCACACTTTGCGCCGCCGACCTCACCATCTCCCGCTTGGAGTCTCCCACCACTGAGGGGTGGTGCACGCGGAGGCTGCCAAGGAAGGAGGGCTGCTGGTCAGGGGAGAAGGAGAGGAGGCCAAGAGGGGTGTGCACCAGGCGATGAGTGGATCGGGCTGGCAACAGAGAACGCGAGGGAGGGGATAAGGGAGAGAGAAGGGGTGGGGAAGGGGAGGGATGGGATTTGATAATCTGTTCTAGGGTGTTTGTTGTAAATTTTGGACCTCCACATAAATTTTAAAAACATGAGGACCAAAACAAAGAGTTGTAGGGGTTGAAATATAAAATCAAAGCCACCCTTAGAGCCACTTGCACCATGAGAAATCTAAATTTTGAACTTGTAGCCAAGTCTACGTGGCACTCTAAGGTTTTTCGAATAGGGATGACGCACTGTGAATGCCTTAGCAAGCTTGATGGATATGCTAGTTTGGCTATTTAAATTGTATGTAGGTGATTTGCTTTCAAAGACGACCTTAAACGGTAAGTCAAAGAAAGAACTTAGTACATTTTTATTATGGGTTAAGGTTTTCCGATTCATGATCTATACAATTTTATTTCAACTCTTATGGGAGTTAGAAAGATTATTTCGAGCTTGAAGTGTATCCTACAAAAACTCATTAACACATTTTTTCCCGAAACAAAAACAATAATTTGTAAAAGTATCTTCATAATCAATCCGTGGTTCCTTTTCCTTCTCGTCTATGTTTTATACTCTTATAGCATCAGAAAAACTTTGACACTTTTAATTTCTTTATATTTTACTATCCTATGTTTCAAACCTGCCCTCACGATTTGAGCTTACGTGCTATAGGAAAAGGTAAGGAAAACCAACTAAGAAAAGCATCTTGTCCAAACATAAAATCTCACCAAAATTCTCATTGTAATCCATTTTGTTTTTTCATTAGAACATATGTGAGTTGGTTATGCGAAATACGATAATTGTACGGTGACGATTAAATTTACTGAGCTTAATAAAACTTTCATCATTAAGAAAAAAATAAAATCACATCGAAATTCGAGGGGCAGAGTAAAACGGCAACCGGCAAGGAAAAGGAACGAGATTTCTGCTTCCCTCGATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTCTCGCTCACCTGCGCTGCGAGCCTGCGGCACACGAAATCCCCAAACCACCCCCAACCTTCCAAAACTCCCAAACTCCTCCATTCCTCGTCGCACTCCCCCCTCCCTTCTCCTCCGCCCCCGACTCGCTGCTTCCACCTCCACCCGCTGCTCTCCTCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGGAGGCCGTACGCCACCGCTCTCACCGACGCCGACGACCTGCAGGCGCCCCTCTCCATGACTATGATGACGCCTCCCCCGCTCGAGGTAAGCAACCGCCTCTCCGCGCGCGCGCGAGAGAGATAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCTCTCCCCTCTCCTGTCTACCCGCCCGATCTCCCTCGCTAGGGCTGCACCGTTCTCCGGTGGCCCGTGCGGTGGGCGTCCGATCGGGTGGTGCCGCTTTTTTGCTAGGGTTTATGCCTCCGCGCTGGATCTGACCCCCCTTTCCGTTTTTTTCTTTTTGTCGATATGTTCTTTGCGCAGCCGGAGGAGGACGAGATGCTCGTGCCTCACCAGGAGC 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序列2：UBP21基因的氨基酸序列
MTMMTPPPLEPEEDEMLVPHQELVAADAAQPMEVVAQTEAASTAESQPAEDPQTSRFTWTIENFTRINAKKHYSDAFVVGGYKWRVLIFPKGNNVDHFSMYLDVADSANLPYGWSRYAQFSLAVVNQIQQKYTIRKDTQHQFNARESDWGFTSFMPLSELYDPSRGYLVDDTVVVEAEVAVRKMVDYWTYDSKKETGYVGLKNQGATCYMNSLLQTLYHIPYFRKAVYHMPTTENDMPSGSIPLALQSLFYKLQYSDNSVATKELTKSFGWDTYDSFMQHDVQELNRVLCEKLEDKMKVTNLRTVVEGTIEKLFEGHHINYIECINVDYKSNRKESFYDLQLDVKGCRDVYASFDKYVEVERLEGDNKYHAENHGLQDAKKGVLFLDFPPVLQLQLKRFEYDYMRDTMVKINDRYEFPLQLDLDRDDGKYLAPDADRSIRNLYALHRYKFDDERVTKEDTKKALEEQYGGEEELPQINPGFNNAPFKFTKYSNAYMLVYIRESDKDKIMCNVDEKDIAEHLRVRLKKEQEEKEHKKKEKAEAHLYTIIKVARDENLKEQIGKDIYFDLVDHEKVRSFRIQKQLLFTTFKEEVAKEYGIPVQFQRFWLWAKRQNHTYRPNRPLSPHEETQSVGQLREVSNKAHNAELKLFLEVELGPDLRPLPPPEKSKEDILLFFKLYNPEKEELCFVGRLFVKALGKPSEILTKLNEMAGFVPNEEIELYEARAKFMMLYLWDNLVYVTPLRRVLGEIKFEPNVMCEHIDKKATFRASQLEDGDIICFQKSPIPDSDTQMRYPDVPSYLEYVHNRQVVHFRLLEKPKDDDFSLELSKLHTYDDVVERVARQLGVDDPAKIRLTSHNCYSQQPKPQPIRYRGVEHLLDMLIHYNQTSDILYYEVLDIPLPELQGLKTLKVAFHHATKDEVVIHSIRLPKNSTIADVINDLKTKVELSSPSAELRLLEVFYHKIYKIFPLHEKIENINDQYWTLRAEEIPEEEKNLGPNDRLIHVYHFMKDPLQNQQIQNFGDPFYLAIREGETLAEVKERIQKKLQVPDEEFCKWKFAFISMNRPDYLQDSDVVSARFQRRDVYGAWEQYLGLEHADTAPKRAYTANQKKLTRITAAVSAALGSVIVIADEIFASTYILTILSKKLYLMSRIKFGVTRSIFFSRHYDLNKAPVHLTLQLPTSPMDNPTPSSSSGGGGAAAAANASSDEHRKTSPATAADFFDEEHTFDDILLPVDLFDFTHGLDAGDGCYVDDQAAIGQKPLSPAPEPAAEQQPSPAPEHGDDERLVMYYQGQEYIFDPVQPQKIENIFHHLNGQEMIPQSIRPQPTNLVRPITVPEDFDRFAALTRYREKKRNIKFIKKADYSARKEVALRMKRSKGKFAPRVQTSENSLAHRKGITFCTNCGESSDATPMMRHAPNGTKSFCNACGLMWANSRKIRKIRNPTSGEQEDQ.
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1.一种水稻敏热基因UBP21的应用，其特征是，通过降低作物中所述基因UBP21编码的蛋白质的表达，提高水稻对热或者干旱胁迫的耐受力，用于农作物耐热品种的培育；所述基因UBP21编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
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