CN103451227A - OsCIPK23蛋白在培育耐低钾胁迫植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OsCIPK23蛋白在培育耐低钾胁迫植物中的应用。本发明提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将OsCIPK23蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物对低钾逆境胁迫的耐受能力高于所述目的植物和/或所述转基因植物吸收钾离子的能力高于所述目的植物。本发明可用于提高植物耐低钾能力，为培育适用于钾贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。

Description

OsCIPK23蛋白在培育耐低钾胁迫植物中的应用

技术领域

本发明涉及OsCIPK23蛋白在培育耐低钾胁迫植物中的应用。

背景技术

钾是植物生长发育所必需的三大营养元素（氮、磷、钾）之一，也是植物体内含量最丰富的一价阳离子。许多植物对钾的需求量都很大，有些植物体内钾含量可高达5%-10%。钾以可溶性无机盐或离子形式存在于植物体内，具有分布广、含量高、移动性强等特点，主要集中在生命活动最旺盛的部位（通常优先分布于芽、幼叶、上部茎和根尖等生长活动旺盛的器官与组织中）。

钾并不直接参与任何有机物质的形成，但参与调节酶的活性，具有促进氮吸收和蛋白质合成、调节韧皮部溶质运输、影响光合作用、调节细胞膨压和渗透势、维持细胞电荷平衡等作用，对植物的生长发育、产量形成具有重要影响。

植物主要通过根从土壤中以离子的形式吸收钾，随着人们逐年累月的耕作，土壤中的钾离子逐渐匮乏。我国钾盐资源少，主要依靠进口，价格昂贵，作物不能充分吸收环境中的钾时又会造成严重的环境危害。植物通过一系列的低钾胁迫信号物质、钾通道和钾转运体以及它们的调控因子响应对钾营养的需求。

水稻作为全球重要的粮食作物，生产中面临很严重的钾缺乏问题。

发明内容

本发明的目的是提供OsCIPK23蛋白在培育耐低钾胁迫植物中的应用。

本发明提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将OsCIPK23蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物对低钾逆境胁迫的耐受能力高于所述目的植物和/或所述转基因植物吸收钾离子的能力高于所述目的植物；所述OsCIPK23蛋白是如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列1衍生的蛋白质；（c）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物钾离子吸收能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

所述OsCIPK23蛋白的编码基因可为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）的DNA分子：（1）序列表中序列2所示的DNA分子；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；（3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；（4）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码植株钾离子吸收相关蛋白的DNA分子；（5）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物钾离子吸收相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

所述OsCIPK23蛋白的编码基因可通过重组表达载体导入所述目的植物。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述编码基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为在1301-Ubiq质粒的Bam HI和Kpn I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如cipk23突变体。

所述低钾具体可为K⁺浓度为100μM以下。

所述低钾逆境胁迫具体可为下低钾培养基中培养。所述低钾培养基与MS培养基的差异仅在于：去除1.9g KNO₃、1.65g NH₄NO₃、0.332g CaCl₂和0.17g KH₂PO₄，加入706mgCa(NO₃)₂和144mg NH₄H₂PO₄。

本发明还保护一种培育转基因水稻的方法，包括如下步骤：将抑制水稻中所述OsCIPK23蛋白的编码基因表达的物质导入出发水稻，得到转基因水稻；所述转基因水稻对低钾逆境胁迫耐受能力低于所述出发水稻和/或所述转基因水稻吸收钾离子的能力低于所述出发水稻。

所述“抑制水稻中所述OsCIPK23蛋白的编码基因表达的物质”具体可为RNAi干扰载体。所述RNAi干扰载体可为含有DNA分子甲和DNA分子乙的重组质粒；所述DNA分子甲如序列2自5’末端第365-826位核苷酸所示，所述DNA分子乙与所述DNA分子甲反向互补。所述RNAi干扰载体具体可为如下重组质粒：以pTCK303质粒为骨架载体，其SpeI和SacI酶切位点之间具有所述DNA分子甲，其KpnI和BamHI酶切位点之间具有所述DNA分子乙。

所述出发水稻具体可为水稻品种日本晴。

所述低钾具体可为K⁺浓度为100μM以下。

本发明还保护所述OsCIPK23蛋白或其编码基因在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如cipk23突变体。

本发明还保护所述OsCIPK23蛋白或其编码基因在培育吸收钾离子的能力增高的植物中的应用。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如cipk23突变体。

本发明还保护所述OsCIPK23蛋白、所述OsCIPK23蛋白的编码基因或以上任一所述方法在植物育种中的应用。

本发明还保护所述OsCIPK23蛋白在调节OsAKT1蛋白活性中的应用。所述OsAKT1蛋白具体可为序列表的序列4所示的双链DNA分子编码的蛋白质。所述应用中，所述调节作用是在OsCBL1蛋白存在的条件下进行的。所述OsCBL1蛋白具体可为序列表的序列3所示的双链DNA分子编码的蛋白质，

本发明公开了水稻OsCIPK23蛋白及其编码基因的工程应用，特别公开了其在提高植物对土壤中有效钾利用效率方面的应用。OsCIPK23蛋白在水稻中负责调控从土壤中吸收K⁺。OsCIPK23基因的敲除突变体导致水稻对K⁺的吸收显著减少，并出现明显的缺钾褐斑。OsCIPK23基因过表达植物对K⁺的吸收能力大大增加。本发明可用于提高植物耐低钾能力，为培育适用于钾贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。

附图说明

图1为实施例2的步骤四中的PCR扩增产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳图。

图2为实施例2的步骤五中的照片。

图3为实施例2的步骤五中的冠部的K⁺含量。

图4为实施例3的步骤四中的分子鉴定结果。

图5为实施例3的步骤四中的照片。

图6为实施例3的步骤四中的冠部的K⁺含量。

图7为实施例4中的单个细胞电流图。

图8为实施例4中的I-V曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

哥伦比亚生态型拟南芥（Col-0）：TAIR网站（http://www.arabidopsis.org/）。

cipk23突变体(即文献中的“lks1-3T-DNA插入突变体”)：参考文献：Xu J，Li HD，Chen LQ，Wang Y，Liu LL，Wu WH.(2006)A protein kinase，interacting with twocalcineurin B-like proteins，regulates K⁺transporter AKT1in Arabidopsis.Cell，125:1347-1360；该突变体植株的出发植株为哥伦比亚生态型拟南芥。

1301-Ubiq质粒：参考文献：Baisheng Yu，Zhongwei Lin1，Haixia Li，XiaojiaoLi，Jiayang Li，Yonghong Wang，Xia Zhang，Zuofeng Zhu，Wenxue Zhai，XiangkunWang，Daoxin Xie and Chuanqing Sun.(2007)TAC1，a major quantitative traitlocus controlling tiller angle in rice.The Plant Journal52，891–898；1301-Ubiq质粒是将ubiquitin启动子插入pCAMBIA1301的PstⅠ酶切位点得到的质粒。

农杆菌菌株GV3101：参考文献：R.Berres，L.Otten，B.Tinland，E.Malgarini-Clog，B.Walter.(1992)Transformation of vitis tissue by differentstrains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant CellReports11，192-195。

水稻品种日本晴：购买自RiceGE韩国突变体种子库（http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE）。

pTCK303质粒：参考文献：Wenqiang Yang，Zhaosheng Kong，Edith Omo-Ikerodah，Wenying Xu，Qun Li，Yongbiao Xue.(2008)Calcineurin B-like interacting proteinkinase OsCIPK23functions in pollination and drought stress responses in rice(Oryza sativa L.).Journal of Genetics and Genomics35，531-543。

农杆菌菌株EHA105：参考文献：Jeroen S.C.van Roekel，Brigitte Damm，LeoS.Melchers，and Andr6Hoekema.(1993)Factors influencing transformationfrequency of tomato(Lycopersicon esculentum).Plant Cell Reports，12:644-647。

实施例1、OsCIPK23蛋白及其编码基因的获得

在TIGR网站（http://rice.plantbiology.msu.edu）上得到一段DNA序列（来源自水稻品种“Nipponbare”），该DNA序列编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为OsCIPK23蛋白（由450个氨基酸残基组成）。将编码OsCIPK23蛋白的基因命名为OsCIPK23基因，其基因组序列中具有14个外显子和13个内含子，其cDNA序列中的开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、转基因拟南芥植株表型检测

一、过表达载体构建

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用OsCIPK23-UN1301F和OsCIPK23-UN1301R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

OsCIPK23-UN1301F：5’–TTGGATCCATGAGCGTGTCGGGCGGGA-3’；

OsCIPK23-UN1301R：5’–TTGGTACCTCACGGTGACCTCCGATGCT-3’。

3、用限制性内切酶Bam HI和Kpn I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶Bam HI和Kpn I双酶切1301-Ubiq质粒，回收载体骨架（约11800bp）。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在1301-Ubiq质粒的Bam HI和Kpn I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。

二、过表达载体转化拟南芥

1、将步骤一得到的重组质粒转化农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌采用花浸泡法（Clough and Bent.(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J16:735-743.）转化侵染cipk23突变体，收获T₁代种子。

3、将T₁代植株自交并收获种子（T₂代种子），将T₂代种子培育为T₂代植株。

4、将T₂代植株在含50mg/L潮霉素的MS培养基上进行抗性筛选，对于某一T₁代植株，如果其T₂代植株在抗性筛选中显示3:1的分离比，该T₁代植株为单拷贝的OsCIPK23基因过表达植株。

5、将单拷贝的OsCIPK23基因过表达植株的T2代植株自交并收获种子（T₃代种子），将T₃代种子培育为T₃代植株。

6、将随机抽样的T₃代植株在含50mg/L潮霉素的MS培养基上进行抗性筛选，对于某一T₂代植株，如果其T₃代植株均为抗性植株，该T₂代植株为纯合的OsCIPK23基因过表达植株，该植株及其自交后代为一个OsCIPK23基因过表达株系。

随机选取的2个OsCIPK23基因过表达株系（株系1、株系2）进行后续试验。

三、转空载体拟南芥的获得

用1301-Ubiq质粒代替重组质粒进行步骤二，得到转空载体植株。

四、转基因拟南芥材料PCR鉴定

将株系1的T₃代植株、株系2的T₃代植株、cipk23突变体、哥伦比亚生态型拟南芥的一周龄苗分别进行如下操作：取整株幼苗，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用OsCIPK23-UN1301F和OsCIPK23-UN1301R组成的引物对（靶序列约为1400bp）鉴定OsCIPK23基因的表达量，采用Primer1和Primer2组成的引物对（靶序列约为600bp）鉴定AtEF基因（看家基因）的表达量，采用Primer3和Primer4组成的引物对（靶序列约为1500bp）鉴定AtCIPK23的表达量。

Primer1：5’-ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT-3’；

Primer2：5’-TTGGCGGCACCCTTACGTGGATCA-3’。

Primer3：5’-ATGGCTTCTCGAACAACGCCTT-3’；

Primer4：5’-TTATGTCGACTGTTTTGCAATT-3’。

PCR扩增产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳图见图1，泳道1为株系2，泳道2为株系1，泳道3为cipk23突变体，泳道4为哥伦比亚生态型拟南芥。

五、耐逆性鉴定

将株系1的T₃代种子、株系2的T₃代种子、转空载体植株的T₃代种子、cipk23突变体的种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子分别进行如下鉴定：将种子放置于MS培养基，22℃光照（光强60μmol·m^-2·s^-1）培养4天；然后将幼苗等分为两组，分别移至MS培养基和低钾培养基，继续22℃光照（光强60μmol·m^-2·s^-1），从分组开始第7天检测K⁺含量，第10天观察表型并拍照。

MS培养基：将1.65g NH₄NO₃、1.9g KNO₃、0.17g KH₂PO₄、0.37g MgSO₄·7H₂O、0.332gCaCl₂、22.3mg MnSO₄·4H₂O、8.6mg ZnSO₄·7H₂O、0.025mg CoCl₂·6H₂O、0.025mg CuSO₄·5H₂O、0.025mg Na₂MoO₄·2H₂O、0.83mg KI、6.2mg H₃BO₃，27.8mg FeSO₄·7H₂O和37.3mg Na₂EDTA溶于水并用水定容至1L。

低钾培养基与MS培养基的差异仅在于：去除1.9g KNO₃、1.65g NH₄NO₃、0.332g CaCl₂和0.17g KH₂PO₄，加入706mg Ca(NO₃)₂和144mg NH₄H₂PO₄。

K⁺含量的测定的方法如下：

（1）将全植株用双蒸水清洗干净，将地上部分放置于80℃烘箱中烘干一天，至其重量恒定；

（2）将烘干的地上部分在分析天平上称量并记录干重，然后分别放入坩埚内；

（3）将坩埚放入马弗炉中，300℃烘烤1小时，然后调至575℃再烘烤7小时，关闭马弗炉，待其冷却至200℃以下后取出坩埚；

（4）每个坩埚中加10mL0.1M HCl水溶液，以溶解剩余物；

（5）将步骤（4）得到的溶液用0.1M HCl水溶液稀释后作为待测溶液；

（6）用Z2000型原子吸收分光光度计面积法（采用KCl制作标准曲线）测定待测溶液中的K⁺浓度；

（7）换算每g干重的植物材料中含有多少mmol钾离子。

进行三次重复实验，每次重复实验中MS培养基上取60株植株，低钾培养基上取120株植株，结果取平均值。

照片见图2（低钾培养基中，各个株系的位置与MS培养基中的标注相同）。在MS培养基中，各个株系的表型均没有显著差异。在低钾培养基中，株系1、株系2和哥伦比亚生态型拟南芥的生长状态均显著优于cipk23突变体，株系1、株系2和哥伦比亚生态型拟南芥的表型无显著差异，转空载体植株和cipk23突变体的表型没有显著差异。

冠部的K⁺浓度见图3。根部的K⁺浓度见图4。在MS培养基中，株系1、株系2和哥伦比亚生态型拟南芥冠部的K⁺含量均高于cipk23突变体，转空载体植株和cipk23突变体冠部的K⁺含量没有显著差异。在低钾培养基中，株系1、株系2和哥伦比亚生态型拟南芥冠部的K⁺含量均高于cipk23突变体，转空载体植株和cipk23突变体冠部的K⁺含量没有显著差异。

实施例3、转基因水稻植株表型检测

一、RNAi载体构建

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用OsCIPK23-pTCK303F和OsCIPK23-pTCK303R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

OsCIPK23-pTCK303F：5’-GGGGTACCACTAGTACGCTGTCGATTACTGTCA-3’；

OsCIPK23-pTCK303R：5’-CGGGATCCGAGCTCTTGGAGGCTGATATCCC-3’。

3、用限制性内切酶SpeI和SacI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶SpeI和SacI双酶切pTCK303质粒，回收载体骨架（约11800bp）。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。

6、用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

7、用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切步骤5得到的重组质粒，回收载体骨架（约12300bp）。

8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：以pTCK303质粒为骨架载体，其SpeI和SacI酶切位点之间具有序列表的序列2自5’末端第365-826位核苷酸所示的双链DNA分子甲，其KpnI和BamHI酶切位点之间具有与所述双链DNA分子甲反向互补的双链DNA分子乙。

二、RNAi载体转化水稻

1、将步骤一得到的重组质粒转化农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌转化（Kong，Z.S.，Li，M.N.，Yang，W.Q.，Xu，W.Y.，and Xue，Y.B.(2006).A novel nuclear-localized CCCH-type zinc fingerprotein，OsDOS，is involved in delaying leaf senescence in rice.Plant Physiol.141:1376-1388.）水稻品种日本晴的愈伤组织，收获T₁代种子。

3、将T₁代植株自交并收获种子（T₂代种子），将T₂代种子培育为T₂代植株。

4、将T₂代植株在含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上进行抗性筛选，对于某一T₁代植株，如果其T₂代植株在抗性筛选中显示3:1的分离比，该T₁代植株为单拷贝的OsCIPK23基因RNAi植株。

5、将单拷贝的OsCIPK23基因RNAi植株的T₂代植株自交并收获种子（T₃代种子），将T₃代种子培育为T₃代植株。

6、将T₃代植株在含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上进行抗性筛选，对于某一T₂代植株，如果其T₃代植株均为抗性植株，该T₂代植株为纯合的OsCIPK23基因RNAi植株，该植株及其自交后代为一个OsCIPK23基因RNAi株系。

随机选取的2个OsCIPK23基因RNAi株系（株系3、株系4）进行后续试验。

三、转空载体水稻的获得

用pTCK303质粒代替重组质粒进行步骤二，得到转空载体植株。

四、耐逆性鉴定

将株系3的T₃代种子、株系4的T₃代种子、转空载体植株的T₃代种子和水稻品种日本晴的种子分别进行如下鉴定：将种子放置于玻璃培养皿内的滤纸上，12h光照（28℃）/12h黑暗（25℃）的条件下培养7天，然后移苗至正常水培液中在相同条件下培养一周；然后将幼苗等分为两组，分别移苗至正常水培液和低钾水培液，在相同条件下培养7天；然后观察表型并拍照，分子鉴定，检测K⁺含量。

正常水培液的配制方法：114.25mg NH₄NO₃、50.38mg NaH₂PO₄·2H₂O、89.25mg K₂SO₄、110.75mg CaCl₂、405mg MgSO₄·7H₂O、1.88mg MnCl₂·4H₂O、92.5μg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、1.17mg H₃BO₃、437μg ZnSO₄·7H₂O、388μg CuSO₄·5H₂O、34.75mg FeSO₄·7H₂O、46.53mgNa₂EDTA，用去离子水定容至1L，用NaOH调节pH为5.70-5.80。

正常水培液中的K⁺浓度约为1mM。

低钾水培液的配制方法：改变K₂SO₄的加入量，其它均同正常水培液。

低钾水培液中的K⁺浓度为100μM。

分子鉴定中，提取幼苗根部的总RNA并反转录得到的cDNA作为模板，采用OsCIPK23-UN1301F和OsCIPK23-UN1301R组成的引物对鉴定OsCIPK23基因的表达量，采用Primer5和Primer6组成的引物对靶序列约为600bp）鉴定OsACTIN基因（看家基因）的表达量。

Primer5：5’-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’；

Primer6：5’-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3’。

K⁺含量的测定的方法的测定方法同实施例2。

分子鉴定结果见图4。

照片见图5。无论采用正常水培液还是采用低钾水培液，水稻品种日本晴的长势均优于株系3和株系4，水稻品种日本晴的长势与转空载体植株没有显著差异。

冠部的K⁺浓度见图6。无论采用正常水培液还是采用低钾水培液，水稻品种日本晴的冠部的K⁺浓度均高于株系3和株系4。

实施例4、OsCIPK23蛋白在哺乳动物细胞中能够增大OsAKT1的内向钾电流

一、转染载体构建

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子并作为模板，用OsCIPK23-F和OsCIPK23-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（OsCIPK23）。

OsCIPK23-F：5’-AAGCTTATGAGCGTGT CGGGCG-3’；

OsCIPK23-R：5’-TCTAGATCACGGTGAC CTCCGATGC-3’。

2、合成序列表的序列3所示的双链DNA分子并模板，用OsCBL1-F和OsCBL1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（OsCBL1）。

OsCBL1-F：5’-CTCGAGATGGGGTGCT TCCAGTCGAC-3’；

OsCBL1-R：5’-CGAATTCTGTGACG AGATCATCAACCTC-3’。

3、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子并模板，用OsAKT1-F和OsAKT1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（OsAKT1）。

OsAKT1-F：5’-GAATTCATGGCGAGGT GGGGCGC-3’；

OsAKT1-R：5’-TCTAGACTAGCTCTTGCCTTTCATCTTCTCTG-3’。

4、用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切OsCIPK23，用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切OsCBL1，将其依次连入pBudCE4.1载体，得到重组质粒A。

5、用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切OsAKT1以及pCDNA3.1质粒，将两种回收产物连接，得到重组质粒B。

二、细胞复苏

1、冻存的HEK293细胞于37℃水浴锅中解冻1min（使大部分化冻，少部分保留冰晶）。

2、吸取细胞到15mL离心管，缓慢加入5-7mL DMEM培养液，混匀。

3、900r/min离心5min。

4、弃上清，用2mL预热的DMEM培养液吹吸均匀，转入相应的培养皿（一般1传1或1传2），画十字摇匀，放入37℃、5%CO₂培养箱。

三、细胞传代

1、吸弃培养皿中的上清，用无钙镁的PBS缓冲液洗2-3次，贴壁加液。

2、加入胰蛋白酶消化液，37℃消化1-2min，用手指轻弹皿底以帮助分散细胞。

3、加入含有血清的DMEM培养液，以终止反应。

4、轻轻吹起细胞，吹散，转移至离心管。

5、900r/m离心5min，弃上清，加入适量DEME培养液，轻轻吹散细胞团，分入3至6个培养皿中，前后左右摇匀细胞，使其均匀散开，放入温箱。

四、质粒DNA转染细胞

1、转染前24小时，进行细胞传代，至转染前细胞汇合度达到60%以上，以80%为宜。

2、转染前1小时，为细胞更换新鲜培养液，注意要尽量轻柔。

3、将质粒DNA（重组质粒A和重组质粒B）和转染试剂lipfection2000分别用不含血清的培养液稀释至一定体积，轻轻混匀。

4、室温放置5min，将含有转染试剂的培养液逐滴加入含有质粒DNA的培养液，轻混匀，室温放置20分钟-30分钟

5、轻混匀，将混合的培养液逐滴加入细胞培养皿中，放回温箱。

6、4至6小时后更换为新鲜完全培养液。

五、膜片钳记录

1、转染后的细胞用胰蛋白酶处理后，于160g离心5min，置于冰上。

2、挑选具有绿色GFP荧光的细胞，用Axopatch200B amplifier(Axon Instruments)进行全细胞模式记录。

单个细胞电流图见图7，I-V曲线见图8。OsCIPK23在OsCBL1存在的情况下，可以显著增大OsAKT1的内向钾电流，说明OsCIPK23对钾通道OsAKT1的活性具有一定的调节作用。

Claims (10)

1.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将OsCIPK23蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物对低钾逆境胁迫的耐受能力高于所述目的植物和/或所述转基因植物吸收钾离子的能力高于所述目的植物；

所述OsCIPK23蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列1衍生的蛋白质；

（c）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物钾离子吸收能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述OsCIPK23蛋白的编码基因为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）的DNA分子：

（1）序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

（3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

（4）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码植株钾离子吸收相关蛋白的DNA分子；

（5）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物钾离子吸收相关蛋白的DNA分子。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

4.一种培育转基因水稻的方法，包括如下步骤：将抑制水稻中OsCIPK23蛋白的编码基因表达的物质导入出发水稻，得到转基因水稻；所述转基因水稻对低钾逆境胁迫耐受能力低于所述出发水稻和/或所述转基因水稻吸收钾离子的能力低于所述出发水稻；

所述OsCIPK23蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列1衍生的蛋白质；

（c）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物钾离子吸收能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述OsCIPK23蛋白的编码基因为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）的DNA分子：

（1）序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

（3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

（4）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码植株钾离子吸收相关蛋白的DNA分子；

（5）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物钾离子吸收相关蛋白的DNA分子。

6.OsCIPK23蛋白或其编码基因在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用；

所述OsCIPK23蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列1衍生的蛋白质；

（c）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物钾离子吸收能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述OsCIPK23蛋白的编码基因为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）的DNA分子：

（1）序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

（3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

（4）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码植株钾离子吸收相关蛋白的DNA分子；

（5）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物钾离子吸收相关蛋白的DNA分子。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.权利要求1至5中任一所述方法在植物育种中的应用。

10.OsCIPK23在调节OsAKT1蛋白活性中的应用。

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