CN108570099A - OsGLP2-1蛋白及其编码基因在调控种子休眠中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种OsGLP2‑1蛋白及其编码基因在调控种子休眠中的应用。本发明提供了一种培育转基因植物的方法，是将编码OsGLP2‑1蛋白的基因导入目的植物中，得到种子休眠率高于所述目的植物的转基因植物。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中编码OsGLP2‑1蛋白的基因的表达，得到种子萌发率和/或出苗率高于所述目的植物的转基因植物。所述OsGLP2‑1蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明为培育禾谷类作物抗穗发芽品种提供了重要的基因资源，通过调控OsGLP2‑1基因的表达水平控制水稻等作物的种子休眠，具有重要应用价值。

Description

OsGLP2-1蛋白及其编码基因在调控种子休眠中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种OsGLP2-1蛋白及其编码基因在调控种子休眠中的应用。
背景技术
种子休眠是植物生长发育中的自然现象，是避免种子在不适宜环境下萌发的一种生理机能。种子休眠受外部环境(光，温度，湿度)、内部因素(如激素GA，ABA等)以及种子结构(种皮，胚效应)等多因素影响。生产中，重要禾谷类作物(如水稻、小麦、大麦和玉米等)在种子成熟期如遇高温高湿时容易引发穗发芽，严重影响作物的产量和品质。为解决穗发芽问题，目前主要通过筛选抗穗发芽作物品种进行杂交育种，耗费周期长，且难以保持原品种的优良性状。而使用穗发芽抑制剂喷洒方法存在污染环境，耗费人力等不足。随着植物基因组测序的迅速发展，寻找影响种子休眠相关的基因将为克服穗发芽问题提供更有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种OsGLP2-1蛋白及其编码基因在调控种子休眠中的应用。
本发明提供了一种培育转基因植物的方法(方法甲)，是将编码OsGLP2-1蛋白的基因导入目的植物中，得到种子休眠率高于所述目的植物的转基因植物。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法(方法乙)，是抑制目的植物中编码OsGLP2-1蛋白的基因的表达，得到种子萌发率和/或出苗率高于所述目的植物的转基因植物。
以上任一所述OsGLP2-1蛋白，获自水稻，是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有调控种子休眠功能的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a1)中的OsGLP2-1蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
上述(a2)中的OsGLP2-1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的OsGLP2-1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
以上任一所述“编码OsGLP2-1蛋白的基因(简称OsGLP2-1基因)”为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)其编码区如序列表的序列2自5’末端第50-700位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码具有调控种子休眠功能的蛋白质的DNA分子；
(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有调控种子休眠功能的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
所述方法甲中，所述编码OsGLP2-1蛋白的基因可以通过重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到目的植物中。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用所述基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。
所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pCambia1300-MCS的多克隆位点中插入了序列表的序列2自5′端第1-737位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
所述重组表达载体具体可为将植物表达载体pCambia1300-MCS的XbaI和SacI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2的自5′端第1-737位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
所述方法乙中，所述“抑制目的植物中编码OsGLP2-1蛋白的基因的表达”是通过干扰载体实现的。
所述干扰载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到目的植物中。
所述干扰载体具体可为含有干扰片段的重组表达载体。
所述干扰片段具体可为序列表的序列3自5′端第9-280位核苷酸所示的双链DNA分子。
所述干扰载体具体可为在植物表达载体pCambia1300-MCS的多克隆位点中插入了序列表的序列3的自5′端第9-280位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。
所述干扰载体具体可为将植物表达载体pCambia1300-MCS的XbaI和SacI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列3的自5′端第9-280位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。
以上任一所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如日本晴水稻。
本发明还保护OsGLP2-1蛋白的应用，为如下(c1)至(c7)中的至少一种：
(c1)调控植物种子萌发；
(c2)调控植物种子休眠；
(c3)调控植物种子对ABA的敏感性；
(c4)抑制植物种子萌发；
(c5)促进植物种子休眠；
(c6)降低植物种子对ABA的敏感性；
(c7)抑制植物穗发芽。
本发明还保护所述方法甲在植物育种中的应用。所述育种的目的是为了选育种子休眠率高的植物。
本发明还保护所述方法乙在植物育种中的应用。所述育种的目的是为了选育种子萌发率和/或出苗率高的植物。
本发明还保护一种植物育种方法，为方法A或方法B。
所述方法A包括如下步骤：增加植物中OsGLP2-1蛋白的表达量和/或活性，从而提高植物种子休眠率。
所述方法B包括如下步骤：降低植物中OsGLP2-1蛋白的表达量和/或活性，从而提高植物种子萌发率和/或出苗率。
本发明还保护一种特异DNA分子及所述特异DNA分子对应的RNA；所述DNA分子为序列表的序列3自5′端第9-280位核苷酸所示的双链DNA分子。
本发明还保护一种MicroRNA，其靶标为序列表的序列7所示的单链RNA分子。
所述特异DNA分子对应的RNA是所述MicroRNA的前体RNA。
本发明还保护含有所述特异DNA分子的重组表达载体。
本发明还保护所述特异DNA分子或所述MicroRNA或所述重组表达载体在培育转基因植物中的应用；所述转基因植物种子萌发率和/或出苗率高于出发植物。
以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如日本晴水稻。
本发明通过实验发现：(1)针对在易发生穗发芽的作物，在种子发育过程中，通过过量表达OsGLP2-1基因，可以使种子休眠加深，避免或降低穗发芽现象，从而使种子正常发育至种子成熟，保证种子的产量和质量。(2)针对深度休眠的种子(如花木种苗生产)，在种子发育过程中，可以通过抑制OsGLP2-1基因的表达，降低种子休眠，从而在播种时，提高种子萌发率和出苗率。综上所述，在植物生产中，通过基因工程改变种子中OsGLP2-1基因的表达水平，调控种子的休眠程度，使种子在生长发育中保持合理的休眠水平，既利于当代的高产，也能提供来年种子的出苗率。
本专利通过实验证明OsGLP2-1蛋白及其编码基因在水稻种子发育过程中作为ABA和GA两个信号途径的共同靶标调控种子休眠。本发明为培育禾谷类作物抗穗发芽品种提供了重要的基因资源，通过调控OsGLP2-1基因的表达水平控制水稻等作物的种子休眠，具有重要应用价值。
附图说明
图1为转基因植株中OsGLP2-1表达量检测结果。
图2为转基因植株种子萌发观察结果。
图3为不同培养条件下转基因植株种子萌发率统计结果。
图4为烟草中报告基因GUS的表达活性测定。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
水稻日本晴：参考文献：章俊丽，杨鵾，张玉满，等.水稻OsCIPK10基因的克隆和功能分析[J].生物工程学报，2009，25(9)：1394-1401.；公众可以从中国科学院微生物研究所获得。
植物表达载体pCambia1300-MCS：参考文献：章俊丽，杨鵾，张玉满，等.水稻OsCIPK10基因的克隆和功能分析[J].生物工程学报，2009，25(9)：1394-1401.；公众可以从中国科学院微生物研究所获得。
农杆菌EHA105：参考文献：章俊丽，杨鵾，张玉满，等.水稻OsCIPK10基因的克隆和功能分析[J].生物工程学报，2009，25(9)：1394-1401.；公众可以从中国科学院微生物研究所获得。
农杆菌GV3101：参考文献：Li JF，Chung HS，Niu YJ，Bush J，McCormack M，SheenJ(2013)Comprehensive Protein-Based Artificial MicroRNA Screens for EffectiveGene Silencing in Plants.[J].Plant Cell 25：1507-1522.；公众可以从中国科学院微生物研究所获得。
植物表达载体pCambia1300-35S-GFP：植物基因组学国家重点实验室。参考文献：Zhang Y，Zhang G，Xiao N，Wang L，Fu Y，Sun Z，Fang R and Chen X*.The rice‘NUTRITION RESPONSE AND ROOT GROWTH’(NRR)gene regulates headingdate.Molecular Plant，2013，6(2)：585-588.；公众可以从中国科学院微生物研究所获得。
植物表达载体1300-intGUS：植物基因组学国家重点实验室。参考文献：Liu ZZ，Wang JL，Huang X，Xu WH，Liu ZM，Fang RX(2003)The promoter ofa rice glycine-richprotein gene，Osgrp-2，confers vascular-specific expression in transgenicplants.[J].Planta，216：824-833.；公众可以从中国科学院微生物研究所获得。
水母荧光酶载体121-PNOS-RiLuc：植物基因组学国家重点实验室。参考文献：ZhangY M，Zheng Y M，Xiao N，et a1.Functional analysis of the HS185regulatory elementin the rice HSP70promoter.[J].Molecular Biology Reports，2012，39(2)：1649.；公众可以从中国科学院微生物研究所获得。
以下实施例中所涉及的OsGLP2-1基因均来源于水稻日本晴(Oryza sativassp.japonica cultivar Nipponbare)。所述OsGLP2-1基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，其中第50-700位为编码序列(ORF)。序列2编码序列表中序列1所示的蛋白质(OsGLP2-1蛋白)，由216个氨基酸残基组成。
实施例1、OsGLP2-1过表达和抑制表达的转基因植物的获得
一、OsGLP2-1过表达载体的构建
1、提取水稻日本晴的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用cup2Sxba和cup2RSac组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
cup2Sxba：5’-GCTCTAGAGCTAAAATTGACACGCACTTG-3’；
cup2RSac：5’-CGAGCTCTCACCCATGGATAAAGAAACA-3’。
cup2Sxba和cup2RSac中，下划线分别标注XbaI和SacI酶切位点。
2、限制性内切酶XbaI和SacI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切植物表达载体pCambia1300-MCS，回收约10kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组表达载体pCambia1300-GLP2-1。根据测序结果，对重组表达载体pCambia1300-GLP2-1进行结构描述如下：将植物表达载体pCambia1300-MCS的XbaI和SacI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2的自5′端第1-737位核苷酸所示的双链DNA分子。
二、OsGLP2-1抑制表达载体的构建
1、以水稻OsmiR159a前体为模板(5’-GTTGTGGACGTTGAGCTCCTTTCGGTCCAAAAAGGGGTGTTGCTGTGGGTCGATTGAGCTGCTGGGTCATGGATCCCGTTAGCCTACTCCATGTTCATCATTCAGCTCGAGATCTGAAAGAAACTACTCCAATTTATACTAATAGTATGTGTGTAGATAGGAAAATGATGGAGTACTCGTTGTTGGGATAGGCTTATGGCTTGCATGCCCCAGGAGCTGCATCAACCCTACATGGACCCTCTTTGGATTGAAGGGAGCTCTGCATCTTTTGT-3’)，采用引物C2-5aS-Xba和引物C2-5aR-Sac进行PCR，将其原有靶点序列替换为靶标于OsGLP2-1cDNA的序列5’-CTCAGTTCTGAAGTTTCTAAA-3’(该靶标位于OsGLP2-1基因第二个外显子和3′UTR之间，即序列2第690-710位核苷酸)，得到PCR产物。
C2-5aS-Xba：GCTCTAGAGTTGTGGACGTTCCGCTCTGAAGTTTCTAAAAAGGGGTGTTGCTGTGGGTCGATTGA(5’-3’)；
C2-5aR-Sac：AAAAGAGCTCACAAAAGATGCACCGCTCTGAAGTTTCTAAAGAGGGTCCATGTAGGGTTGATG(5’-3’)。
C2-5aS-Xba和C2-5aR-Sac中，下划线分别标注XbaI和SacI酶切位点。
2、限制性内切酶XbaI和SacI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切植物表达载体pCambia1300-MCS，回收约10kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组表达载体pCambia1300-amiR-GLP2-1。根据测序结果，对重组表达载体pCambia1300-amiR-GLP2-1进行结构描述如下：将植物表达载体pCambia1300-MCS的XbaI和SacI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列3的自5′端第9-280位核苷酸所示的双链DNA分子。
三、过表达转基因植物的获得
1、将步骤一得到的重组表达载体pCambia1300-GLP2-1导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
2、采用参考文献(Hiei Y，Ohta S，Komari T，et a1.Effficient transformationof rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis ofthe boundaries of the T-DNA.[J].Plant Journal，1994，6(2)：271-282.)中所述的方法将步骤1得到的重组农杆菌转化水稻日本晴，得到T0代植株。由T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。由T1代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T2代。由T2代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T3代。使用50μg/ml潮霉素对转基因植株进行抗性筛选，在T2代得到纯合过表达转基因水稻株系。
四、表达抑制转基因植物的获得
采用步骤二得到的重组表达载体pCambia1300-amiR-GLP2-1替代重组表达载体pCambia1300-GLP2-1，按照步骤三进行实验，得到纯合表达抑制转基因水稻株系。
五、转空载体植物的获得
采用植物表达载体pCambia1300-MCS替代重组表达载体pCambia1300-GLP2-1，按照步骤三进行实验，得到转空载体水稻株系。
六、转基因植物中OsGLP2-1表达量检测
待测植株为：步骤三得到的纯合过表达转基因水稻株系(OE-GLP2-1a、OE-GLP2-1b、OE-GLP2-1c)的T2代植株、步骤四得到的纯合表达抑制转基因水稻株系(amiR-GLP2-1a、amiR-GLP2-1b、amiR-GLP2-1c)的T2代植株、步骤五得到的转空载体水稻株系的T2代植株(EV)、水稻日本晴。
提取各待测植株的总RNA并反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，采用C2-RT-S385和C2-RT-R737组成的引物对通过实时荧光定量PCR扩增鉴定OsGLP2-1基因的相对表达量(以Actin为内参，用ActinF和ActinR组成的引物对鉴定内参)。
C2-RT-S385：5’-TGCGACCGAGATCCTGACTATAC-3’；
C2-RT-R737∶5’-TCACCCATGGATAAAGAAACAACT-3’；
ActinF：5’-CCCCCATGCTATCCTTCGTCTC-3’；
ActinR：5’-CGGCCGTTGTGGTGAATGAGTA-3’。
结果如图1所示。结果表明，OE-GLP2-1a、OE-GLP2-1b、OE-GLP2-1c中都能检测到OsGLP2-1基因的显著过表达，amiR-GLP2-1a、amiR-GLP2-1b、amiR-GLP2-1c中OsGLP2-1基因的表达受到抑制。
实施例2、转基因植株种子萌发情况检测
一、开花后第35天的种子萌发情况观察
待测种子：水稻日本晴(WT)、纯合过表达转基因水稻株系(OE-GLP2-1)的T3代种子、纯合表达抑制转基因水稻株系(amiR-GLP2-1)的T3代种子、转空载体水稻株系的T3代种子(EV)。
1、取各待测种子(均为水稻开花后第35天的种子，每个株系随机选取约20粒种子)，播种于MS固体培养基上，在植物培养箱(25℃；12光照/12h黑暗)中培养，在第9天和第19天，观察种子萌发情况。
水稻开花后第35天的种子为未成熟种子，种子正处于灌浆期，培养9天时野生型和转空载体水稻均不萌发，相对比，大部分amiR-GLP2-1株系(10/16；62.50％)的水稻种子的萌发率为4.00-60.71％，且萌发的种子可以生长成苗，相反大部分株系(11/17；64.71％)的OE-GLP2-1水稻种子均不萌发。第19天时种子萌发率与第9天相同，部分种子萌发情况如图2A所示，野生型、转空载体水稻和大部分OE-GLP2-1种子仍然不萌发，而amiR-GLP2-1水稻种子的萌发率明显高于空载体对照。
2、取各待测种子(均为水稻开花后第35天的种子，每个株系随机选取约20粒种子)，播种于含有50μMABA的MS固体培养基上，在植物培养箱(25℃；12光照/12h黑暗)中培养19天，观察种子萌发情况。
部分种子萌发情况结果如图2B所示。结果表明，amiR-GLP2-1水稻种子对ABA表现不敏感，仍然萌发成芽。
二、开花后第45天的种子萌发情况观察
待测种子：水稻日本晴(WT)、纯合过表达转基因水稻株系(OE-GLP2-1a、OE-GLP2-1b、OE-GLP2-1c)的T3代种子、纯合表达抑制转基因水稻株系(amiR-GLP2-1a、amiR-GLP2-1b、amiR-GLP2-1c)的T3代种子、转空载体水稻株系的T3代种子(EV)。
1、取各待测种子(均为水稻开花后第45天的种子，每个株系随机选取90-206粒种子)，播种于1/2MS培养液中，在植物培养箱(25℃；12光照/12h黑暗)中培养，分别在第3天、第5天和第7天统计种子萌发情况。
结果如图3A所示。水稻开花后第45天的种子为较成熟种子，在第5天和第7天，与转化空载体对照水稻(EV)种子的萌发率(66.44％-86.99％)相对比，OE-GLP2-1a、OE-GLP2-1b和OE-GLP2-1c种子表现为低萌发率(22.03％-62.91％)，相反，amiR-GLP2-1a、amiR-GLP2-1b和amiR-GLP2-1c种子展现了相对高萌发百分率(84.26％-98.63％)。野生型水稻种子的萌发率与转化空载体对照水稻种子的萌发率无显著性差异。
2、将各待测种子播种于含有10μM赤霉素(GA)的1/2MS培养液中，在植物培养箱(25℃；12光照/12h黑暗)中培养，分别在第3天、第5天和第7天统计种子萌发情况。
结果如图3B所示。水稻开花后第45天的种子为较成熟种子，在1/2MS培养液中添加GA可诱导OE-GLP2-1a、OE-GLP2-1b和OE-GLP2-1c种子萌发，但不能完全互补其低萌发率。野生型水稻种子的萌发率与转化空载体对照水稻种子的萌发率无显著性差异。
3、将各待测种子播种于含有50μM ABA的1/2MS培养液中，在植物培养箱(25℃；12光照/12h黑暗)中培养，分别在第3天、第5天和第7天统计种子萌发情况。
结果如图3C所示。水稻开花后第45天的种子为较成熟种子，amiR-GLP2-1a、amiR-GLP2-1b、amiR-GLP2-1c种子展现了对ABA非敏感表型，表现为高萌发率。野生型水稻种子的萌发率与转化空载体对照水稻种子的萌发率无显著性差异。
上述结果表明，在水稻种子的生长发育过程中，OsGLP2-1基因对维持种子的初级休眠起重要作用，降低OsGLP2-1基因的表达水平会打破种子休眠，促进种子萌发；相反，提高OsGLP2-1基因的表达则促进种子休眠，使萌发率下降。
实施例3、OsGLP2-1表达的调控机制
1、提取水稻日本晴的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用ABI5-S-Xba和ABI5-R-Xba组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物(即转录因子ABI5的开放阅读框)。
ABI5-S-Xba：5’-TCTAGATGGCATCGGAGATGAGCAAGAA-3’；
ABI5-R-Xba：5’-TCTAGACCGCTATGCCCGTTTCACCACA-3’。
ABI5-S-Xba和ABI5-R-Xba中，下划线标注XbaI酶切位点。
2、限制性内切酶XbaI酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶XbaI酶切植物表达载体pCambia1300-MCS，回收约10kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组表达载体pCambia1300-ABI5。根据测序结果，对重组表达载体pCambia1300-ABI5进行结构描述如下：将植物表达载体pCambia1300-MCS的XbaI酶切位点之间插入了序列表的序列4的自5′端第6-1186位核苷酸所示的双链DNA分子。
5、提取水稻日本晴的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用GAMyb-F-Xba I和GAMyb-R-flag-Bgl II组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物(转录因子GAMYB的开放阅读框)。
GAMyb-F-Xba I：5’TATTCTAGAATGTATCGGGTGAAGAGCGAG-3’；
GAMyb-R-flag-Bgl：5’-GAAGATCTTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTTTGAATTCTGACATTTCAC-3’。
GAMyb-F-XbaI和GAMyb-R-flag-BglII中，下划线分别标注XbaI酶切位点和Bgl II酶切位点。
6、用限制性内切酶XbaI和BglII双酶切步骤5得到的PCR扩增产物。
7、用限制性内切酶XbaI和BglII双酶切植物表达载体pCambia1300-35S-GFP，回收约10kb的载体骨架。
8、将步骤6得到的酶切产物和步骤7得到的载体骨架连接，得到重组表达载体pCambia1300-GAMYB。根据测序结果，对重组表达载体pCambia1300-GAMYB进行结构描述如下：将植物表达载体pCambia1300-GAMYB的XbaI和BglII双酶切位点之间插入了序列表的序列5的自5′端第9-1694位核苷酸所示的双链DNA分子。
9、构建重组质粒130-PGLP2-1：intGUS，根据测序结果，对重组质粒130-PGLP2-1：intGUS进行结构描述如下：将植物表达载体1300-intGUS的HindIII和BglII双酶切位点之间插入了序列表的序列6的自5′端第7-2092位核苷酸所示的双链DNA分子(OsGLP2-1启动子基因片段)。
10、以水母荧光酶载体121-PNOS-RiLuc作为内参载体。
11、将步骤4得到的重组表达载体pCambia1300-ABI5导入农杆菌GV3101，得到重组菌ABI5。
12、将步骤8得到的重组表达载体pCambia1300-GAMYB导入农杆菌GV3101，得到重组菌GAMYB。
13、将步骤9得到的重组质粒130-PGLP2-1：intGUS导入农杆菌GV3101，得到重组菌PGLP2-1：intGUS。
14、将载体121-PNOS-RiLuc导入农杆菌GV3101，得到重组菌PNOS-RiLuc。
15、分别将重组菌ABI5、重组菌GAMYB、重组菌PGLP2-1：intGUS和重组菌PNOS-RiLuc接种于在LB培养基，28℃、220rpm培养至菌液OD600nm＝1.0，离心收集菌体沉淀，将菌体沉淀采用MMA缓冲液(10mM MgCl2，10mM MES，100μM乙酰丁香酮)漂洗一次后，再重悬于MMA缓冲液中并调节菌浓度至菌悬液OD600nm＝1.5，分别得到ABI5菌悬液、GAMYB菌悬液、PGLP2-1：intGUS菌悬液和PNOS-RiLuc菌悬液。
16、制备如下农杆菌混合液，培养本氏烟草，注射1ml农杆菌混合液至烟草全伸展新叶片，继续培养三天后，收集注射农杆菌混合液的叶片，用液氮速冻并研磨后，按照文献(Zhang Y M，Zheng Y M，Xiao N，et al.Functional analysis of the HS185regulatoryelement in the rice HSP70promoter.[J].Molecular Biology Reports，2012，39(2)：1649.)中所述方法检测报告基因(GUS和RiLuc)的表达活性。
农杆菌混合液I：PGLP2-1：intGUS菌悬液、ABI5菌悬液和PNOS-RiLuc菌悬液按照体积比2∶3∶1混合。
农杆菌混合液II：PGLP2-1：intGUS菌悬液、GAMYB菌悬液和PNOS-RiLuc菌悬液按照体积比2∶3∶1混合。
农杆菌混合液III：PGLP2-1：intGUS菌悬液和PNOS-RiLuc菌悬液按照体积比2∶1混合。
采用MMA缓冲液作为空白对照(Mock)。
结果如图4所示，结果表明，ABI5能明显促进由PGLP2-1驱动GUS的表达，而GAMYB则起抑制作用(图4)。此结果表明OsGLP2-1基因对ABA和GA的反应是由ABI5和GAMYB直接介导的。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> OsGLP2-1蛋白及其编码基因在调控种子休眠中的应用
<160> 7
<210> 1
<211> 216
<212> PRT
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 1
Met Ala Ser Thr Trp Phe Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ala Val Ser Ile
1 5 10 15
Ser Asn Ala Phe Ala Ser Asp Pro Ser Gln Leu Gln Asp Phe Cys Val
20 25 30
Ala Asp Lys Met Ser Gln Val Leu Val Asn Gly Phe Ala Cys Lys Asp
35 40 45
Pro Ala Ala Ile Thr Val Glu Asp Phe Phe Phe Ser Gly Leu His Met
50 55 60
Ala Gly Asn Thr Ser Asn Arg Gln Gly Ser Ala Val Thr Gly Val Asn
65 70 75 80
Val Ala Gln Ile Ser Gly Leu Asn Thr Leu Gly Ile Ser Leu Ala Arg
85 90 95
Val Asp Tyr Ala Pro Tyr Gly Leu Asn Pro Pro His Ile His Pro Arg
100 105 110
Ala Thr Glu Ile Leu Thr Ile Leu Glu Gly Ser Leu Tyr Val Gly Phe
115 120 125
Val Thr Ser Asn Pro Glu Asn Lys Leu Phe Thr Lys Val Leu Asn Lys
130 135 140
Gly Asp Val Phe Val Phe Pro Gln Gly Leu Ile His Phe Gln Phe Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Lys Asp Val Ile Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ser Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Val Ile Thr Ile Ala Asn Ala Val Phe Gly Ser Lys Pro Phe
180 185 190
Ile Ser Asp Asp Ile Leu Ala Lys Ala Phe Gln Val Glu Lys Lys Ile
195 200 205
Val Asp Arg Ile Gln Ala Gln Phe
210 215
<210> 2
<211> 737
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 2
gctaaaattg acacgcactt gatttagtga ttagtgtcct aaactcctaa tggcctcaac 60
atggttcttc ctccttgccc tcctggctgt atcgatttcg aatgctttcg cctccgatcc 120
cagccaactc caggacttct gcgtcgctga caagatgtcg caagttctag tcaatggatt 180
tgcatgcaag gacccagcgg ccatcaccgt ggaagacttc ttcttctccg gccttcacat 240
ggctggaaac accagcaaca ggcagggatc ggccgtgaca ggagtcaacg tcgcccagat 300
ctctgggctc aacaccttgg gcatctcttt ggcccgcgtc gactatgcgc cctatggtct 360
taaccctccg cacattcacc cacgtgcgac cgagatcctg actatactgg agggctcact 420
ctacgtcggc ttcgttacct ccaaccccga gaacaagctg ttcaccaagg ttcttaacaa 480
gggggacgta ttcgtgtttc ctcaggggtt gatccacttt cagttcaact atggtacaaa 540
agatgttata gcccttgcgg ctctaagtag ccagaaccct ggagtcatca ccatagcaaa 600
tgcggtgttt ggatcgaagc cgttcatatc agatgatatc cttgccaagg cctttcaggt 660
ggagaagaag atagtagacc ggattcaagc tcagttctga agtttctaaa caaagttgtt 720
tctttatcca tgggtga 737
<210> 3
<211> 290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gctctagagt tgtggacgtt ccgctctgaa gtttctaaaa aggggtgttg ctgtgggtcg 60
attgagctgc tgggtcatgg atcccgttag cctactccat gttcatcatt cagctcgaga 120
tctgaaagaa actactccaa tttatactaa tagtatgtgt gtagatagga aaatgatgga 180
gtactcgttg ttgggatagg cttatggctt gcatgcccca ggagctgcat caaccctaca 240
tggaccctct ttagaaactt cagagcggtg catcttttgt gagctctttt 290
<210> 4
<211> 1192
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
tctagatggc atcggagatg agcaagaacg tgaaggtcac cgatgatcaa gaggttacat 60
cacaggagcg tgaccaaagt ggtggtacaa aagtaggtgg ggaggaggaa attgctccac 120
tggcgcggca gtcgtcaatc ctctccctca ccttggaaga gctacaaaac tccttgtgtg 180
agccaggacg caactttggt tccatgaaca tggacgagtt tgtggctaac atatggaatg 240
ctgaagaatt ccaggctacc accggaggtt gcaagggtgc catggaggaa gccaaggtgg 300
tagacagtgg aagcggaagc ggtgatgcag gaggaagcgg tttatgtcgg cagggatcat 360
tttccttgcc gctaccgctg tgccagaaga cggtggagga ggtgtggact gagatcaacc 420
aagcccctgc acacacctcc gctccggcct ccgcgctcca gccacatgcc gggagcggtg 480
gtgttgcagc taacgaccga caggtaacac taggtgagat gacacttgag gatttcttgg 540
taaaggccgg ggtggtccga gggtccttta ccgggcaagc ggccatggga tctggcatgg 600
tcaacgggcc ggtgaacccc atgcagcagg gccaaggcgg tcctatgatg ttcccagtag 660
gaccggtaaa cgccatgtat ccggtgatgg gtgatggcat ggggtacccc ggtgggtaca 720
acgggatggc gattgtgcca ccgccacctc ccgcccaagg tgccatggtt gtcgtgagtc 780
ctggatcatc agatgggatg agtgccatga cacatgctga tatgatgaat tgtattggga 840
atgggatgat gattgagaat ggaacaagaa agcgtcccca cagagaggat ggctgcgccg 900
agaagacggt ggagcgccgc caacggcgca tgatcaagaa ccgtgagtca gctgcacggt 960
cccgtgctag aaagcaggct tatacggtgg agctcgaagc tgaactgaac tatctcaagc 1020
aggagaacgc tcgtctcaaa gaggcagaga agacggttct actgacaaag aagcaaatgc 1080
tggttgagaa aatgatggag cagtccaagg agaagatgaa tgcaaatagg ggtggcagcc 1140
agctgcgccg cagcggcagc tgcatgtggt gaaacgggca tagcggtcta ga 1192
<210> 5
<211> 1702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
tattctagat gtatcgggtg aagagcgaga gcgactgcga gatgatccat caggagcaga 60
tggactcgcc ggtggccgac gacggcagca gcggggggtc gccgcaccgc ggcggcgggc 120
ccccgctgaa gaaggggcca tggacgtcgg cggaggacgc catcctggtg gactacgtga 180
agaagcacgg cgaggggaac tggaacgcgg tgcagaagaa caccgggctg ttccggtgcg 240
gcaagagctg ccgcctccgg tgggcgaacc acctgaggcc caacctcaag aagggggcct 300
tcaccgccga ggaggagagg ctcatcatcc agctccactc caagatgggg aacaagtggg 360
ctcggatggc cgctcatttg ccagggcgca ctgataatga aataaagaat tactggaata 420
ctcgaataaa gagatgccag cgagctggcc tacccatcta tcctaccagc gtatgcaatc 480
aatcctcaaa tgaagatcag cagtgctcca gtgattttga ctgtggcgag aatttgtcaa 540
acgatcttct gaatgcaaat ggtctttacc taccagattt tacctgtgac aatttcattg 600
ctaattcaga ggctttacct tatgcaccac atctttcagc cgtttctata agcaatctcc 660
ttggccagag ctttgcatca aaaagctgta gcttcatgga tcaggtaaac cagacaggga 720
tgctaaaaca gtctgatggt gtgcttcctg gattgagcga taccatcaac ggtgtgattt 780
cctcggtgga tcaattctca aatgactctg agaagctcaa gcaggctgtg ggttttgact 840
atctccatga agccaactct accagcaaga ttattgcacc tttcgggggt gcacttaatg 900
gcagccatgc ctttttaaat ggcaatttct ctgcttctag gcccacaagt ggtcctttga 960
agatggagct cccttcactc caagatactg aatctgatcc aaacagctgg ctcaagtaca 1020
ctgtagctcc tgcgttgcag cctactgagt tagttgatcc ctacctgcag tctccagcag 1080
caaccccttc agtgaaatca gagtgcgcgt cgccaaggaa tagtggcctt ttggaagagt 1140
tgattcatga agctcagacc ctaagatccg ggaagaacca acagacatct gtgataagtt 1200
ctagttcttc tgtcggtacg ccatgtaata ctacggttct tagcccagag tttgatatgt 1260
gtcaggaata ctgggaagaa caacatcctg gtccattcct caatgactgt gctcctttca 1320
gtggcaattc attcactgaa tccacccctc ctgttagcgc tgcatcgcct gacatctttc 1380
agctctccaa agtttcccca gcacaaagca cttcaatggg atctggagag caagtaatgg 1440
ggcctaaata tgaacctggg gacacttcac ctcatcctga aaacttcagg ccagatgcat 1500
tgttttctgg gaatacagct gatccatcag ttttcaacaa tgccatagca atgcttctgg 1560
gcaatgactt gagtatcgat tgcagacctg ttcttggcga cggtatcatg ttcaattctt 1620
cctcgtggag caacatgcca cacgcctgtg aaatgtcaga attcaaagac tacaaggacg 1680
acgatgacaa gtgaagatct tc 1702
<210> 6
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
aagcttacag catttcccac ggttatcacc cctgggttct ggctgctcag agcagcaaga 60
gccacagcat tgtttgttcc attgttaaac tgaaaatgga ctaatccttg tggaaacaca 120
aacacatcac ccttgttaag aaccttggtg aacaacttat tctcggggtt cgatatcacg 180
aagccgacat agagagatcc ttcgagaacg gtcgggatct cggtggcacg tggatgagtg 240
tgaggcgggt tgaggccgtt gggcgcatag tcgatgcgga cgagggagac gcccatggtg 300
ttcagacccg ggatctgtgc aacgttgacg gtggtaacgt tggatccctg cttgttggtg 360
gtgttgccgg ccatgtggag gccggagaag aagaagtcgc cggcgacaac gtccttggcg 420
tccttgcaag ggaacccatt tacacgcact gcatatggat ccgtgaacag aatcatcagt 480
atggtcagtc acacaaaatt acagtatata tatgcggagt tcttgcagat cgagtacctt 540
gagacatctt gtcgacgacg cagaagtcct gaagaaggcc aggatcggag gcgatggcgc 600
catgagagca ccacagagcc aagagggcaa cgacagcaag ctgctggagg aagcaggcgc 660
caacagcagc catagctgga gcctggagga ggcagagagt tctctataga aaagaatact 720
tatggtatag cagattgctc tgatgatata tatattgtga tgaactgatg atgaagaatg 780
tcatggattg agaggaaagc tggtatttat agggggagtt caggtttcag aatagcctat 840
tgaactctga aatctctggt aatgattgtg atgacagaga atattgtctg tctgtgcatg 900
ccatgcatgc gtcgtacagc accaagaacg agtcactgct agctagtagc tagataggaa 960
gaaggcgtca tacataaaat acataatatt gcgtggatgg gcaacctgca gtctgcagat 1020
acatatacct atctatcctg aaataaatct tattaatgtt atcatacatg ctttgtgctt 1080
gaagaagtct aagccatgga tgagtactgt atctgcagac ttagcagccg tggctattaa 1140
tgttgtccaa ggtggatata tggatcatat taattcttta ctggtttgct gtttgccggc 1200
cggcctgatc atcgattgac aatggtccga tctccattgt aatattctta tctcatcata 1260
gcaattaaaa ttaacaccat atttgttccg gagaaaaatg cacgtaagga aataataatg 1320
cttgcttttc attgcttgct tccttccaag aagacgggat taaaactcct tcgaccaacc 1380
gaaatgacag aggattgact acacgcctat actatctaca aaattatgcc taattaaacg 1440
ttggatataa gaggacggac tcccatatca aaatttatta agactctgca tgccttgaaa 1500
ccgagtacat cgactaatcc acaccttgtt gtggtgctaa ctgctgcatg cctttctcaa 1560
tgataatgat acctaattaa aacgtagttt tcccaaacag aatttgttaa ccgaacgacg 1620
aacgcgtaat gcatagccat tattaaattg ttgcttgacg taatttgttt aagcaggtgc 1680
cgttaccatc gagtccacct ggagagagca caatttacac atgatgaaga atcagtcaga 1740
agctatatta gcttcttact gaatttgctg tagccgctgc tgcaggcagg ccacaacacg 1800
tttattcaga cttgttccaa attaccagag aattggcgta gaccatttct tcaaacctca 1860
atacatatta aacatccaat taactttctc aacacaaagc aagcacaagc cagcttgatc 1920
ctcctactct actccatctc tatatatact gggtatctct caccccgttt gaagcacaca 1980
gcaaagcatc atcatcagtt catcacatca caagaaactt tgcgttgcat ccttttgttt 2040
cctgctaaaa ttgacacgca cttgatttag tgattagtgt cctaaactcc tagatct 2097
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
cucaguucug aaguuucuaa a 21

Claims (10)

1.一种培育转基因植物的方法，是将编码OsGLP2-1蛋白的基因导入目的植物中，得到种子休眠率高于所述目的植物的转基因植物；
所述OsGLP2-1蛋白是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有调控种子休眠功能的由序列1衍生的蛋白质。
2.一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中编码OsGLP2-1蛋白的基因的表达，得到种子萌发率和/或出苗率高于所述目的植物的转基因植物；
所述OsGLP2-1蛋白是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有调控种子休眠功能的由序列1衍生的蛋白质。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“编码OsGLP2-1蛋白的基因”为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)其编码区如序列表的序列2自5’末端第50-700位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码具有调控种子休眠功能的蛋白质的DNA分子；
(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有调控种子休眠功能的蛋白质的DNA分子。
4.权利要求1-3任一所述方法在植物育种中的应用。
5.一种植物育种方法，为方法A或方法B；
所述方法A包括如下步骤：增加植物中OsGLP2-1蛋白的表达量和/或活性，从而提高植物种子休眠率；
所述方法B包括如下步骤：降低植物中OsGLP2-1蛋白的表达量和/或活性，从而提高植物种子萌发率和/或出苗率；
所述OsGLP2-1蛋白是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有调控种子休眠功能的由序列1衍生的蛋白质。
6.OsGLP2-1蛋白的应用，为如下(c1)至(c7)中的至少一种：
(c1)调控植物种子萌发；
(c2)调控植物种子休眠；
(c3)调控植物种子对ABA的敏感性；
(c4)抑制植物种子萌发；
(c5)促进植物种子休眠；
(c6)降低植物种子对ABA的敏感性；
(c7)抑制植物穗发芽；
所述OsGLP2-1蛋白是如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有调控种子休眠功能的由序列1衍生的蛋白质。
7.一种特异DNA分子及其对应的RNA；所述DNA分子为序列表的序列3自5′端第9-280位核苷酸所示的双链DNA分子。
8.一种MicroRNA，其靶标为序列表的序列7所示的单链RNA分子。
9.一种含有权利要求8所述特异DNA分子的重组表达载体。
10.权利要求7所述的特异DNA分子，或，权利要求8所述的MicroRNA，或，权利要求9所述的重组表达载体在培育转基因植物中的应用；所述转基因植物种子萌发率和/或出苗率高于出发植物。
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