CN109456394A

CN109456394A - 番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温性中的应用

Info

Publication number: CN109456394A
Application number: CN201811377090.0A
Authority: CN
Inventors: 周艳虹; 王峰; 陈笑笑; 喻景权
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: CN109456394B

Abstract

本发明公开了番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温能力中的应用，所述基因SlPIF4的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过基因手段构建番茄SlPIF4过表达植株或基因敲除植株，调控所述基因SlPIF4的表达水平来研究其对番茄低温抗性的调控机制，结果发现，低温下SlPIF4过表达可以促进植物激素脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的积累，抑制赤霉素(GA)的积累，进而诱导番茄低温抗性基因的表达，提高番茄的低温抗性。因此，番茄SlPIF4基因通过诱导体内激素ABA与JA形成从而增强其耐低温能力。本发明为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究番茄植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

Description

番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温性中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程、分子生物学及生理学等领域，具体地说，涉及番茄SlPIF4基因的克隆、转基因载体构建及番茄的转化，尤其涉及SlPIF4基因在提高植物耐低温能力中的应用。

背景技术

番茄原产地为南美洲热带地区，是世界上栽培最广泛的蔬菜作物之一，为喜温植物，其生长发育对环境变化极其敏感，尤其是温度变化。当遭受低温等外界非生物胁迫时，由于植物的不可移动性，其生长发育及作物产量严重受限。近年来，随着全球极端气候现象的频繁发生，低温已成为限制蔬菜生产发展的瓶颈问题之一。因此，研究番茄响应低温逆境的生理生化变化与分子机理，挖掘调控番茄低温响应的关键基因，为提高番茄的耐低温性及获得耐低温番茄提供重要的理论支撑，这对提高番茄的产量有着重要的应用价值。

低温弱光是园艺作物生产的主要限制因子，而光与植物的关系不仅局限于光合作用的辐射能供应，而且光还作为一个信号，参与调节植物生长发育的各个过程，所以研究光信号和温度互作的调控网络，对提高蔬菜的产量、品质和经济效益，以及保障蔬菜均衡供应皆具有十分重要的科学和现实意义。

光敏色素互作因子(PIFs)是一类bHLH转录因子，是光和其它环境信号联结的重要调控因子，它通过影响激素、糖、昼夜节律等信号的变化调控植物的生长发育及逆境抗性。植物形态建成中，PIFs与光敏色素互作，被磷酸化、泛素化，随后被降解。有关PIFs的研究大多集中在模式植物拟南芥上，主要研究PIFs对植物下胚轴生长的影响，如拟南芥PIF4在高温下直接调控生长素的含量及其合成基因的表达，诱导植物下胚轴、叶柄的伸长，促使叶片偏下生长以及提早开花。另外，PIFs还参与植物对干旱、盐害等的应答过程，如水稻OsPIL1通过调控下游细胞壁相关基因的表达，促进水稻的节间长度，影响水稻在干旱环境中的植株高度；干旱和高盐处理下，过表达PIF3的转基因玉米较野生型其植株生长状况更好。这些均说明PIFs参与植物对逆境胁迫的应答过程，然而番茄PIFs在低温胁迫中的作用及其调控机制均鲜见报道。因此，通过对SlPIF4基因的克隆、转基因技术培育不同表达量SlPIF4的番茄材料，在提高番茄对低温胁迫的抗性以及挖掘逆境胁迫基因资源方面，具有很好的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高番茄耐低温能力中的应用。

为了实现本发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

番茄SlPIF4基因，所述基因为以下1)-4)中的任意一种核苷酸序列：

1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有不改变原核苷酸序列功能的核苷酸序列；

3)在严格条件下与SEQ ID NO：1所示序列杂交获得的具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供由上述的番茄SlPIF4基因编码获得的蛋白质，该蛋白质具有以下之一的氨基酸序列：

1)SEQ ID No：2所示的氨基酸序列；

2)SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供上述的番茄SlPIF4基因在提高植物耐低温能力中的应用。

进一步的，通过基因过表达技术使得所述番茄SlPIF4基因的表达水平上升；所述基因过表达技术具体如下：

提取番茄总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增SlPIF4基因，将扩增产物构建到植物过表达载体上；所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和4所示；

将植物过表达载体导入宿主细胞中，再利用其侵染目的植株，筛选阳性转基因植株，获得耐低温的转基因植株。

进一步的，通过基因编辑技术使得所述基因SlPIF4发生突变；所述基因编辑技术具体如下：

利用CRISPR-P网站设计SlPIF4基因靶序列，合成的靶序列退火后连接到 AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体的Bbs I位点，然后将新得到的AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9片段连接到pCAMBIA1301载体的Hind III/Kpn I位点，构建出番茄SlPIF4基因CRISPR表达载体；其中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IN NO：5所示；

本发明使用的植物表达载体为具有35S启动子的表达载体，例如载体pFGC1008-HA或 pCAMBIA1301。

进一步的，过表达载体质粒为pFGC1008::SlPIF4-HA，基因编辑载体质粒pCAMBIA1301:: AtU6-sgRNA(SlPIF4)-AtUBQ-Cas9。

进一步的，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，优选所述农杆菌为EHA105。

通过本发明的基因构建转基因番茄，所述转基因番茄能够提高对低温胁迫的抗性。为了便于对转基因番茄植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。前面所述过表达载体pFGC1008中加入了3HA标签蛋白。

本发明的有益效果如下：通过基因手段构建番茄SlPIF4过表达植株或基因敲除植株，调控所述基因SlPIF4的表达水平来研究其对番茄低温抗性的调控机制，结果发现，低温下SlPIF4 过表达可以促进植物激素脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的积累，抑制赤霉素(GA)的积累，进而诱导番茄低温抗性基因的表达，提高番茄的低温抗性。因此，番茄SlPIF4基因通过诱导体内激素ABA与JA形成从而增强其耐低温能力。本发明为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究番茄植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

本发明首次构建了番茄SlPIF4基因过表达和基因敲除的转基因植株，并进行功能研究。通过低温处理实验，发现SlPIF4基因在番茄耐低温胁迫中起到正向调控的作用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明实施例2中SlPIF4基因过表达番茄株系的植物蛋白Western Blot检测结果；

图2为本发明实施例3中SlPIF4基因敲除番茄株系的sgRNA序列的测序结果；

图3为本发明实施例4中在常温与低温条件下，SlPIF4基因及其蛋白含量的结果；其中，A 为SlPIF4基因的表达水平，B为SlPIF4蛋白含量的水平；

图4为本发明实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄pif4#3和pif4#10、OE#87和 OE#89表现耐低温的表型；

图5为本发明实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄pif4#3和pif4#10、OE#87和OE#89的电导率变化；

图6为本发明实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄pif4#3和pif4#10、OE#87和 OE#89的PSII最大光化学量子产量(Fv/Fm)变化；

图7为本发明实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄pif4#3和pif4#10、OE#87和 OE#89中抗冷基因表达水平的变化；其中，A为番茄CBF1基因的表达水平，B为番茄COR413-like基因的表达水平；

图8为本发明实施例5中在常温与低温条件下，转基因番茄pif4#3和pif4#10、OE#87和 OE#89中植物激素脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、赤霉素(GA)的含量及其合成基因表达水平的变化；其中，A为番茄NCED6基因的表达水平，B为番茄ABA含量，C为番茄AOS2基因的表达水平，D为番茄JA含量，E为番茄GA3ox2基因的表达水平，F为番茄GA₁含量；

图9为本发明实施例5中在常温与低温条件下，转基因番茄pif4#3和pif4#10、OE#87和 OE#89中番茄赤霉素信号负调控因子PRO基因表达水平的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明旨在涵盖本发明公开的范围和精神内的其他更改和变型。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、组织培养、分子生物学、生物生理生化、DNA重组及生物信息学技术。这些技术在文献中进行了充分解释。

实施例1：SlPIF4基因过表达载体的构建

为了解植物响应低温的分子机制，从番茄基因组中克隆了SlPIF4基因。根据编码区序列分析，设计特异性引物SlPIF4-F和SlPIF4-R，并在引物上分别加上限制性酶切位点(Asc I和Kpn I)，序列如SEQ ID NO：3和4所示。用PrimerSTAR高保真酶PCR扩增SlPIF4片段，然后对PCR 扩增片段及载体进行酶切，将SlPIF4片段连接到pFGC1008-HA上，得到过表达载体OE。将上述重组质粒送到擎科公司测序确认，所得的基因SlPIF4的核苷酸序列如SEQID No：1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。结果表明所克隆的序列与 Solgenomics中公布的序列(Solyc07g043580)一致。

实施例2：SlPIF4基因突变载体的构建

利用CRISPR-P网站设计SlPIF4基因靶序列，具体序列如SEQ ID No：5所示，为AGGTCATCCAATGTGCAGCT。合成的靶序列退火后连接到AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体的Bbs I位点，然后将新得到的AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9片段连接到pCAMBIA1301载体的 Hind III/Kpn I位点。将上述重组质粒送到擎科公司测序确认。

实施例3：番茄SlPIF4转基因材料的构建与检测

将过表达载体pFGC1008::SlPIF4-HA和基因编辑载体pCAMBIA1301::AtU6-sgRNA(SlPIF4)-AtUBQ-Cas9。转化农杆菌EHA105，并进行番茄子叶侵染，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，将T2代突变体种子和过表达种子分别进行卡那霉素抗性和氯霉素抗性的测试，选择3/4具有抗性而其余1/4没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入。将这些植株移除，再进行单株收种。利用Western Blot 验证SlPIF4过表达阳性转基因植株，结果显示野生型没有蛋白条带，而过表达株系有 SlPIF4-HA的条带(图1)，利用PCR和测序技术验证阳性SlPIF4突变转基因植株，发现pif4#3 缺失一个碱基，pif4#10增加两个碱基，分别在原始相邻基序(PAM)的第4个和第5个碱基处突变，并立即停止翻译(图2)。

实施例4：SlPIF4基因转基因材料的耐低温能力检测

首先将五叶一心的野生型番茄幼苗进行25℃和4℃处理，结果显示(图3，A和B)，低温6小时可以诱导SlPIF4基因的表达(图3A)，同时低温12小时促进SlPIF4蛋白的大量积累(图3B)，这说明番茄SlPIF4响应低温胁迫。

将五叶一心的野生型番茄幼苗和实施例3中所得的SlPIF4基因过表达株系和突变体株系在人工培养箱内进行25℃和4℃处理，低温处理7天后，将低温胁迫处理组与相同条件下未进行低温处理的对照组进行比较，观察野生型、过表达株系和突变体株系番茄植株的表型(图 4)、电导率(图5)、PSII最大光化学量子产量(Fv/Fm，图6)及番茄抗冷基因CBF1(图7A) 和COR413-like(图7B)表达水平的变化，结果显示，过表达番茄植株能够显著提高番茄的耐低温性(图4)，电导率显著低于野生型(WT)和pif4突变株系(图5)。此外，过表达植株的Fv/Fm(图6)和抗冷基因(CBF1和COR413-like，图7)均高于野生型番茄(WT)，而突变体株系最低。由此可见，番茄SlPIF4正调控植物的耐低温能力。

实施例5：番茄SlPIF4转基因材料低温下体内植物激素变化的检测

将五叶一心的野生型番茄幼苗和实施例3中所得的SlPIF4基因过表达株系和突变体株系在人工培养箱内进行25℃和4℃处理12小时后，取低温处理组与未进行低温处理的对照组番茄叶片样品进行激素ABA、JA和GA含量的测定。

其中激素ABA与JA测定的具体方法为：取100mg的叶片冻样在1mL的乙酸乙酯中研磨均匀，乙酸乙酯中含有内参标样D6-ABA及D5-JA(OlChemIm Ltd,Czechoslovakia)，内参标样在样品中的终浓度为100ng mL^-1。研磨充分的匀浆样品在4℃暗下振荡12h，然后4℃18,000g 离心10min，收集上清液，用1mL的乙酸乙酯复溶残渣，4℃18,000g离心10min，合并上清液，并利用N₂气将液体吹干。利用0.5mL 70％(v/v)的甲醇将提取物复溶，并4℃18,000g离心2min，上清液利用安捷伦1290高效液相色谱系统及安捷伦6460三级串联杆质谱仪(Agilent Technologies,Germany)检测。使用Agilent Zorbax XDB C18column(150mm×2.1mm,3.5μm) 液相分析柱进行HPLC分析。流动相包括溶剂A(0.1％的甲酸；E.Merck,Germany)及B(甲醇；E.Merck,Germany)，流速为0.3mL min-1。梯度洗脱程序为0-1.5min A:B为60:40；随后溶液A:B为0:100进行6.5min；然后A:B为60:40进行5min直到程序结束。柱温为40℃,进样体积为20mL。阴离子模式进行检测，实验中所用的母离子、子离子及碰撞能量见下表1。

GA的测定需取1g番茄叶片样品委托武汉绿剑可瑞信科技有限公司进行测定。

表1 LC-MS/MS检测植物激素的相关参数及成份

化合物名称	碰撞解离电压(V)	母离子(m/z)	子离子(m/z)	碰撞能量(V)
					JA	50	209.1	59.1	2
D<sub>5</sub>-JA(IS)	116	214.3	62.1	8
					ABA	75	263.1	153	0
D<sub>6</sub>-ABA(IS)	162	269.3	159.2	0

以上结果显示，番茄叶片中的ABA和JA含量及其合成基因(NCED6和AOS2)均被低温诱导(图8，A-D)，而GA含量及其合成基因(GA3ox2)低温下受到抑制(图8，E-F)。另外，低温下SlPIF4过表达植株中ABA和JA含量及其合成基因(NCED6和AOS2)均高于野生型番茄 (WT)，但GA含量及其合成基因(GA3ox2)却低于野生型(WT)。这说明低温胁迫下，SlPIF4 基因通过诱导番茄体内激素ABA和JA，同时降低GA，来调控植物的耐低温能力。此外，结果显示，低温诱导番茄赤霉素信号负调控因子PRO基因表达上调(图9)，且过表达植株中PRO 的表达量高于野生型，这说明番茄SlPIF4可能通过诱导赤霉素信号负调控因子PRO来提高番茄对低温的抗性。

由此可见，番茄SlPIF4通过诱导植物激素ABA和JA、抑制GA，以及调控抗冷途径相关基因，进而正调控植物的耐低温能力。

基于以上实施例，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有不改变原核苷酸序列功能的核苷酸序在番茄中过表达或利用基因编辑技术进行突变，然后转化农杆菌，接着用转化的农杆菌侵番茄子叶，并进行植物组织培养，筛选阳性转基因番茄植株，同样能获得耐低温的转基因番茄。

基于以上实施例，将在严格条件下与SEQ ID NO：1所示序列杂交获得的具有相同功能的核苷酸序列在番茄中过表达或利用基因编辑技术进行突变，然后转化农杆菌，接着用转化的农杆菌侵番茄子叶，并进行植物组织培养，筛选阳性转基因番茄植株，同样能获得耐低温的转基因番茄。所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

基于以上实施例，将与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列在番茄中过表达或利用基因编辑技术进行突变，然后转化农杆菌，接着用转化的农杆菌侵番茄子叶，并进行植物组织培养，筛选阳性转基因番茄植株，同样能获得耐低温的转基因番茄。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温性中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

atgggatttg atcatgagct agtggagttg ttgtggcgaa acggggaggt agtattacat 60

agccaaacac ataaaaaaca gccaggttat gatcctaatg aatgcagaca gtttaacaaa 120

catgatcaac caacaataag agttgctgga aatcagacta atttgattca agatgatgaa 180

actgtcgcgt ggctaaactg ccctatcgat gattcgtttg acaaagaatt ttgttcccct 240

ttcttatctg atatttcaac aaatcctcac ctgggggagg agcctgataa gtcaattagg 300

caatcagagg acaataacaa ggttttcaag tttgatcctt tagagatcaa ccatgttctt 360

ccgcaatcac atcattctgg tttcgatcca aatccaatgc cacctccaag atttcacaac 420

tttggatcag cgcaacagaa acatcatata gtaggggggg atcagaaagg tgttaacttt 480

cctccaccga taaggtcatc caatgtgcag cttggtggca aagaagctag aagcaatctg 540

atgctgcaag atattaaaga ggggtctgtg atgacagttg gttcaagcca ctgtggcagc 600

aatcaagttg atactagccg gttttcaagt agtgcaaata gagggctgtc tgcagcaatg 660

atcactgatt ataccggaaa aatcagtcca caaagtgata caatggaccg agacacattt 720

gaaccagcta atacatcttc gtcttcagga agatcgggta gtagttatgc aagagcatgc 780

aatcaatcta cagcgaccaa tagccagggc cacaaaagga agagtagaga tggtgaagaa 840

ccagaatgcc agagtaaagc tgatgagcta gaatcagctg gaggaaacaa gtcagcccaa 900

aaatctggaa ctgcccgaag gagccgtgct gcagaagtgc ataatctctc tgaaaggaga 960

cggagggata gaatcaatga gaaaatgaag gccttgcaag agcttcttcc tcactctact 1020

aagacagaca aagcatcaat gctggatgag gctattgaat acttgaaatc acttcagatg 1080

caactgcaga tgatgtggat gggaagtggc atggcatcaa tgatgttccc tggtgtccaa 1140

cactacattt ccagaatggg aatggggatg ggtccgcctt cggtgccttc catgcacaat 1200

gctatgcatt tagctaggct tcctttggtt gatccagcaa tccctttgac acaagctgcc 1260

cctaataatc aagcagctgc aatgtgccag aattcaatgt tgaatcaagt taactatcaa 1320

cgccatttgc agaatcccaa ttttccagat caatatgcta gttacatggg gttccatcca 1380

cttcaaggcg cttctcagcc tataaacatt tttggcttag gttcacatac agcacagcaa 1440

actcagcagt taccgcatcc aactaatagt aatgcacctg ccacttga 1488

<210> 2

<211> 495

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Gly Phe Asp His Glu Leu Val Glu Leu Leu Trp Arg Asn Gly Glu

1 5 10 15

Val Val Leu His Ser Gln Thr His Lys Lys Gln Pro Gly Tyr Asp Pro

20 25 30

Asn Glu Cys Arg Gln Phe Asn Lys His Asp Gln Pro Thr Ile Arg Val

35 40 45

Ala Gly Asn Gln Thr Asn Leu Ile Gln Asp Asp Glu Thr Val Ala Trp

50 55 60

Leu Asn Cys Pro Ile Asp Asp Ser Phe Asp Lys Glu Phe Cys Ser Pro

65 70 75 80

Phe Leu Ser Asp Ile Ser Thr Asn Pro His Leu Gly Glu Glu Pro Asp

85 90 95

Lys Ser Ile Arg Gln Ser Glu Asp Asn Asn Lys Val Phe Lys Phe Asp

100 105 110

Pro Leu Glu Ile Asn His Val Leu Pro Gln Ser His His Ser Gly Phe

115 120 125

Asp Pro Asn Pro Met Pro Pro Pro Arg Phe His Asn Phe Gly Ser Ala

130 135 140

Gln Gln Lys His His Ile Val Gly Gly Asp Gln Lys Gly Val Asn Phe

145 150 155 160

Pro Pro Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Gln Leu Gly Gly Lys Glu Ala

165 170 175

Arg Ser Asn Leu Met Leu Gln Asp Ile Lys Glu Gly Ser Val Met Thr

180 185 190

Val Gly Ser Ser His Cys Gly Ser Asn Gln Val Asp Thr Ser Arg Phe

195 200 205

Ser Ser Ser Ala Asn Arg Gly Leu Ser Ala Ala Met Ile Thr Asp Tyr

210 215 220

Thr Gly Lys Ile Ser Pro Gln Ser Asp Thr Met Asp Arg Asp Thr Phe

225 230 235 240

Glu Pro Ala Asn Thr Ser Ser Ser Ser Gly Arg Ser Gly Ser Ser Tyr

245 250 255

Ala Arg Ala Cys Asn Gln Ser Thr Ala Thr Asn Ser Gln Gly His Lys

260 265 270

Arg Lys Ser Arg Asp Gly Glu Glu Pro Glu Cys Gln Ser Lys Ala Asp

275 280 285

Glu Leu Glu Ser Ala Gly Gly Asn Lys Ser Ala Gln Lys Ser Gly Thr

290 295 300

Ala Arg Arg Ser Arg Ala Ala Glu Val His Asn Leu Ser Glu Arg Arg

305 310 315 320

Arg Arg Asp Arg Ile Asn Glu Lys Met Lys Ala Leu Gln Glu Leu Leu

325 330 335

Pro His Ser Thr Lys Thr Asp Lys Ala Ser Met Leu Asp Glu Ala Ile

340 345 350

Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Gln Met Gln Leu Gln Met Met Trp Met Gly

355 360 365

Ser Gly Met Ala Ser Met Met Phe Pro Gly Val Gln His Tyr Ile Ser

370 375 380

Arg Met Gly Met Gly Met Gly Pro Pro Ser Val Pro Ser Met His Asn

385 390 395 400

Ala Met His Leu Ala Arg Leu Pro Leu Val Asp Pro Ala Ile Pro Leu

405 410 415

Thr Gln Ala Ala Pro Asn Asn Gln Ala Ala Ala Met Cys Gln Asn Ser

420 425 430

Met Leu Asn Gln Val Asn Tyr Gln Arg His Leu Gln Asn Pro Asn Phe

435 440 445

Pro Asp Gln Tyr Ala Ser Tyr Met Gly Phe His Pro Leu Gln Gly Ala

450 455 460

Ser Gln Pro Ile Asn Ile Phe Gly Leu Gly Ser His Thr Ala Gln Gln

465 470 475 480

Thr Gln Gln Leu Pro His Pro Thr Asn Ser Asn Ala Pro Ala Thr

485 490 495

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttggcgcgcc atgaatccat atcttcct 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgtcgacag tggcaggtgc attactat 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggtcatcca atgtgcagct 20

Claims

1.番茄SlPIF4基因，其特征在于，所述基因为以下1)-4)中的任意一种核苷酸序列：

1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

2.由权利要求1所述的番茄SlPIF4基因编码获得的蛋白质，其特征在于，该蛋白质具有以下之一的氨基酸序列：

1)SEQ ID No：2所示的氨基酸序列；

3.权利要求1所述的番茄SlPIF4基因在提高植物耐低温能力中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过基因过表达技术使得所述番茄SlPIF4基因的表达水平上升。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因过表达技术具体如下：

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过基因编辑技术使得所述基因SlPIF4发生突变。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因编辑技术具体如下：

利用CRISPR-P网站设计SlPIF4基因靶序列，合成的靶序列退火后连接到AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体的Bbs I位点，然后将新得到的AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9片段连接到pCAMBIA1301载体的Hind III/Kpn I位点，构建出番茄SlPIF4基因CRISPR表达载体；其中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IN NO：5所示；

8.根据权利要求5或7所述的应用，其特征在于，过表达载体质粒为pFGC1008::SlPIF4-HA，基因编辑载体质粒pCAMBIA1301::AtU6-sgRNA(SlPIF4)-AtUBQ-Cas9。

9.根据权利要求5或7所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。