CN117004621B - 马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4及其利用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4及其利用,所述StPIF4的CDS序列长1554bp,核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码517个氨基酸,氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示,该基因位于细胞核中,通过调节气孔开放程度降低马铃薯幼苗干旱胁迫下的水分散失,增强马铃薯耐旱性。这对解析马铃薯耐旱分子机制和耐旱育种改良提供了新的遗传材料和理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术和马铃薯育种技术领域,具体涉及一种马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4及其利用。
背景技术
植物的生长发育受到自然界各种环境胁迫的限制,干旱是阻碍植物正常生长发育的非生物因素之一。经受干旱胁迫后,植物光合作用受到抑制,膜结构与透性改变,植物体内原有的动态平衡遭到破坏;严重的干旱会导致光合作用终止和代谢紊乱,最终导致植物死亡。
干旱胁迫同时影响着植物体内基因的表达,目前已有大量干旱胁迫应答基因被报道,这些基因主要分为功能性蛋白基因和调节性蛋白基因两类。前者编码关键酶和代谢蛋白,如LEA蛋白、水通道蛋白、热休克蛋白等,其编码产物在水分胁迫发生时直接在细胞内发挥保护功能;后者编码各种调节蛋白,如转录因子、蛋白激酶、磷脂酶等,其编码产物主要起调节作用。植物中参与干旱胁迫响应的转录因子主要有AP2、MYB、NAC、bZIP和WRKY五种,作为植物体内重要的调控因子,它们在干旱信号传导过程起着末端传感器的作用,通过与启动子区的特定顺式元件相互作用直接调节一系列下游基因的表达,通过不同干旱胁迫应答信号通路引起植物体内生理生化变化,最终使植物适应干旱逆境或增强植物抗旱能力。
植物光敏色素作用因子PIF家族属于碱性螺旋-环-螺旋bHLH转录因子家族中第15亚家族,是连接光、温度与其它环境信号的关键因子。PIF4被报道能够与PIF家族其他成员一起调控植物的光形态建成,同时还影响着植物的昼夜节律,参与避荫反应及开花过程。
虽然PIF4的功能在不同植物中都有一定研究,但在马铃薯中关于PIF4,特别是关于PIF4调控马铃薯耐旱性方面的功能未见报道。因此,探索马铃薯中PIF4的功能及作用机制对于揭示马铃薯耐旱分子机理有着重要意义。
发明内容
基于此,本发明的目的在于提供一种马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4及其利用。
为了实现上述目的,本发明提供了如下技术方案:
本发明提供了一种马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4,其CDS全长1554bp,核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码517个氨基酸,氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了上述马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4编码的蛋白,所述蛋白具有1个保守的bHLH结构域,氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了上述马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4的重组表达载体。
本发明还提供了上述马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4、上述马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4编码的蛋白、上述马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4的重组表达载体在马铃薯耐旱性改良育种中的应用。
本发明的发明过程为:发明人从马铃薯PGSC数据库环境胁迫转录组数据中筛选到对高温、盐及干旱有明显响应的马铃薯PIFs家族成员StPIF4。该基因受干旱胁迫诱导,在叶片及侧茎中高表达,亚细胞定位结果显示其定位于细胞核。经测序鉴定,其CDS全长1554bp,核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码517个氨基酸,氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。通过农杆菌转化法进行遗传转化获得干涉转基因株系,对转基因株系和野生型进行干旱处理,结果显示StPIF4能够增强马铃薯耐旱性。气孔观察结果显示干涉株系的完全开放气孔数多于WT,表明StPIF4通过调节气孔开放程度增强马铃薯耐旱性。
本发明的有益效果在于:本发明提供了一种马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4,其CDS序列长1554bp,序列如SEQ ID No.1所示,编码517个氨基酸,序列如SEQ IDNo.2所示,该基因位于细胞核中,通过调节气孔开放程度降低马铃薯幼苗干旱胁迫下的水分散失,增强马铃薯耐旱性。这对解析马铃薯耐旱分子机制和耐旱育种改良提供了新的遗传材料和理论依据。
附图说明
图1为StPIF4序列特征分析;其中A为系统进化树分析;B为氨基酸序列比对分析。
图2为StPIF4表达模式分析;其中A为StPIF4组织表达的qRT-PCR鉴定;B为20%PEG6000模拟干旱处理诱导StPIF4表达的qRT-PCR鉴定。
图3为StPIF4亚细胞定位。
图4为StPIF4转基因株系鉴定;其中A图为载体引物对干涉转基因植株琼脂糖凝胶电泳鉴定;B图为StPIF4基因引物对干涉转基因植株琼脂糖凝胶电泳鉴定;C图为StPIF4干涉转基因株系干涉效率检测。
图5为WT和StPIF4转基因植株苗期干旱处理前后表型。
图6为StPIF4转基因植株气孔统计分析;其中A图为不同开放程度气孔;B图为不同类型气孔比例分析;C图为气孔密度分析。
图7为WT和StPIF4转基因植株叶片温度统计;A图为正常情况下WT和StPIF4转基因植株叶片温度分析;B图为干旱处理下WT和StPIF4转基因植株叶片温度分析。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解,下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。需要说明的是,本发明实施例中未注明实验材料来源的实验材料均能商业获得,本发明实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规实验方法或按照实验材料厂商建议方法进行。另外,需要说明的是本发明中所述的马铃薯E3为鄂马铃薯3号,StPIF4表示马铃薯的PIF4基因。
实施例1StPIF4的克隆和序列特征分析
从马铃薯PGSC数据库环境胁迫转录组数据中筛选出对干旱有明显影响的到对高温、盐及干旱有明显响应的马铃薯PIFs家族成员StPIF4,该基因受干旱胁迫诱导,在叶片及侧茎中高表达。
以马铃薯E3叶片cDNA为模板,进行StPIF4的序列克隆分析,序列克隆分析结果显示StPIF4基因CDS序列长1554bp,核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码517个氨基酸,氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。对StPIF4进行系统进化树分析,与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄(Solanum lycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)和茄子(Solanummelongena)等物种的系统进化分析结果显示StPIF4蛋白与同属植物番茄的同源蛋白遗传距离较近(图1A)。与拟南芥及同属植物的同源蛋白进行序列比对,结果显示StPIF4蛋白序列具有1个保守的bHLH结构域(图1B)。
实施例2StPIF4表达模式分析
取马铃薯E3的不同组织进行qRT-PCR表达分析,不同组织表达分析结果显示StPIF4在叶片及侧茎中的表达量最高(图2A)。使用20%的PEG6000对培育14天后的E3组培苗进行处理,对处理前后的叶片取样进行qRT-PCR检测,结果显示StPIF4的转录水平受诱导升高,并在6h时达到最大值(图2B),表明StPIF4可能参与了马铃薯干旱胁迫响应。
为了探究StPIF4蛋白的细胞定位,利用带有绿色荧光标记(eGFP)的pCAMBIA1300-StPIF4-eGFP载体转入农杆菌后侵染烟草进行瞬时表达,实验结果显示StPIF4蛋白定位于细胞核(图3)。
实施例3StPIF4转基因株系筛选与鉴定
以pCAMBIA1300为骨架构建StPIF4干涉表达载体,以E3为受体,采用农杆菌转化法进行遗传转化,构建StPIF4干涉转基因株系。经PCR鉴定后共获得19个阳性沉默株系。对干涉株系进行qRT-PCR检测,结果显示除Ri-6外,其余干涉株系中StPIF4转录水平与WT相比均有显著下调,干涉效率较高(图4A-C)。
实施例5表型鉴定
(1)StPIF4增强马铃薯幼苗耐旱性
为了研究StPIF4是否调控马铃薯幼苗的耐旱性,移栽了野生型与StPIF4干涉转基因植株并进行干旱处理,25天后,干涉转基因植株相较WT表现出明显萎蔫,且复水后未恢复或未完全恢复。以上结果表明StPIF4提高了马铃薯幼苗的耐旱性(图5)。
(2)StPIF4通过调节气孔开放程度增强耐旱性
对野生型及StPIF4干涉转基因株系的气孔进行观察统计,结果显示两者的气孔密度并无差异,但干涉株系的完全开放及部分开放气孔数多于野生型,完全关闭气孔数少于野生型,造成了干涉株系更多的水分散失(图6A-C)。对叶片温度的分析结果显示,在正常及干旱处理条件下,StPIF4干涉转基因植株叶片温度显著低于WT(图7A-B)。上述结果表明,StPIF4干涉株系可能由于气孔开放程度增加导致水分散失快,叶片温度降低,进而表现出较弱的耐旱性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所有的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4、马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4编码的蛋白、马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4的重组表达载体在马铃薯耐旱性改良育种中的应用,所述马铃薯耐旱相关转录因子基因StPIF4的CDS序列长1554bp,核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,编码517个氨基酸,氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
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