CN116640195B - 柑橘CsPIF4基因及其编码的蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个类胡萝卜素代谢相关的CsPIF4基因及其编码的蛋白质和应用。所述基因的CDs序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。本发明中所述CsPIF4基因在茎、叶、花和不同发育时期的果实中均有表达，果实中CsPIF4表达量最低，且随果实成熟而不断下降，与类胡萝卜素积累呈显著的负相关关系。通过农杆菌介导的柑橘瞬时转化法将PHB‑CsPIF4‑GFP导入柑橘果实，获得了瞬时超表达CsPIF4的柑橘果实材料；利用农杆菌介导法将PHB‑CsPIF4‑GFP导入番茄植株，获得了稳定超表达CsPIF4的番茄材料。结果显示，超表达CsPIF4可显著降低果实类胡萝卜素的含量。本发明为CsPIF4基因调控的柑橘果实色泽和营养品质的调控提供理论和实践价值，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个柑橘CsPIF4基因、其编码的蛋白和应用。
背景技术
类胡萝卜素是自然界中广泛分布的一类次生代谢物，对植物生理和人体健康发挥着重要作用。对于植物而言，类胡萝卜素赋予植物组织丰富多彩的颜色，参与植物光合作用和光保护过程，抵御生物和非生物逆境胁迫。对于人类而言，类胡萝卜素能提供维生素A的合成前体，帮助机体增强免疫力、减少癌症等各种疾病的发生。柑橘是世界上第一大果树，其果实中的类胡萝卜素多达115种以上，而且，柑橘起源于我国及东南亚地区，在我国有悠久的栽培历史，存在着丰富的色泽变异类型以及突变体资源。因此，柑橘果实类胡萝卜素代谢基因的分子调控机制研究具有重要意义。
光敏色素作用因子PIF基因作为细胞内的一个信号中心，能整合多种环境因子和内部信号，在植物次生代谢中起重要作用。PIF1直接负调控PSY基因影响拟南芥种子颜色；成熟番茄果实中SlPIF4的沉默使果实内类胡萝卜素累积量显著提高；PIFs主要通过特异性抑制类胡萝卜素代谢途径的重要限速酶PSY基因的表达，进而减少类胡萝卜素的积累。目前，PIF同源基因的研究主要集中在模式植物拟南芥和番茄中。但是，柑橘作为世界上第一大果树，尚无有关其PIF同源基因的研究报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供柑橘CsPIF4基因及其编码的蛋白与应用。
首先，本发明提供柑橘CsPIF4蛋白，其为：
1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质包括bHLH结构域以及APB结构域。
本发明还提供编码所述的柑橘CsPIF4蛋白的基因。
优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。
本发明还提供所述基因在调控果实色泽和营养品质中的用途。
在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超表达，使所述植物的果实类胡萝卜素积累水平降低。
在本发明一个具体实施方案中，所述植物为柑橘或番茄。
本发明还提供一种降低果实类胡萝卜素含量的方法，其为将含有所述基因的载体转入植物基因组中，并在转基因植株中超量表达，从而降低果实中类胡萝卜素的含量。
本发明首次从柑橘果实中克隆了1个调控类胡萝卜素代谢的CsPIF4基因，通过实时荧光定量PCR证实了CsPIF4在果实中的表达水平，与类胡萝卜素积累呈显著的负相关关系，利用植物基因工程的手段在柑橘果实中瞬时过表达，在番茄植株中稳定超表达，能降低果实类胡萝卜素积累水平，为柑橘果实色泽和营养品质的改良提供了很好的应用前景。
附图说明
图1为柑橘CsPIF4基因ORF的PCR产物。
图2为本发明中CsPIF4基因所编码蛋白质的氨基酸序列、结构域和基序划分图。
图3是柑橘CsPIF4基因在柑橘的茎、叶、花和不同发育时期的果实表达量。
图4为CsPIF4基因在转基因柑橘果实中的表达分析。
图5为CsPIF4转基因番茄植株的阳性鉴定。PCR鉴定农杆菌转化的植株依次为CsPIF4-OE1、2、3、4、6和WT。
图6为三个稳定超表达CsPIF4番茄株系果实在花后三十(30DAB)和四十天(40DAB)表型与野生型的差异。
图7为稳定超表达CsPIF4番茄果实中类胡萝卜素含量测定。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中所使用的试剂主要包括分子生物学实验试剂、耗材和试剂盒等，均可通过商业途径获得，具体包括：RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Biospin全能型植物基因组DNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；SMARTerPrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、 Max DNA Polymerase、T-Vector pMDTM19(Simple)、BamHI和SpeI购自TaKaRa(宝生物工程(大连))有限公司；引物合成和测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。本发明实施例中所提供的方法如果没有特殊说明均为常规方法。
实施例1柑橘CsPIF4基因全长的克隆
以柑橘果实为原料，使用RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒提取柑橘果实总RNA。以总RNA为模板使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)试剂盒合成第一链cDNA。
使用 Max DNA Polymerase(R045A，Takara)扩增CsPIF4全长开放阅读框(ORF)，具体步骤如下：以甜橙基因组(Csi_valencia_1.0,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000317415.1)中CsPIF4(LOC102626817)序列信息设计扩增引物。以柑橘cDNA为模版，上游特异性引物CsPIF4-F：5’-ATGAATCCATGCATCCCTGAT-3’,下游特异性引物CsPIF4-R：5’-CTAACCCATCTTGCCACTTAG-3’，按98℃ 3min，98℃ 10sec，58℃ 10sec，72℃ 5sec/kb,72℃ 5min，2-4步循环38次进行扩增。随后利用1％琼脂糖凝胶电泳(图1)，按SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(B518131，SangonBiotech)说明书步骤进行回收。回收PCR产物，连接到pMD19-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，送样测序，柑橘CsPIF4 cDNA的全长序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
利用甜橙基因组(Csi_valencia_1.0,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000317415.1)中CsPIF4(LOC102626817)蛋白序列信息并根据PIF基因特点，对柑橘蛋白质序列进行bHLH结构域和AP结构域划分(图2)。
实施例2CsPIF4基因表达的组织特异性
分别提取柑橘茎、叶、花和果实4个不同组织及果实四个不同发育时期的总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA，作为模板。根据柑橘CsPIF4基因的cDNA序列全长，Primer 3(v.0.4.0)(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在线网站设计实时荧光定量引物qCsPIF4F:5'-CAGCAACCAGATGAAACCAAT-3'和qCsPIF4R:5'-AACCACTGCCCCTTAATGTCT-3'。在PCR特异性扩增前提下，进行实时荧光定量PCR。
以柑橘actin基因为内参基因，引物为qCsactinF：5'-GGAATGGGGCAGAAGGATG-3'和qCsactinR：5'-CGAAGCTCGTTGTAGAAGGTATG-3'。采用三步法进行扩增，每个反应3个生物学重复。PCR反应程序为:95℃预变性1min；95℃20s，58℃20s，72℃30s，40个循环；收集溶解曲线。
根据得到的Ct值，利用2-ΔΔCT方法，分别计算CsPIF4基因茎、叶、花和果实4个不同组织及果实四个不同发育时期的表达量。结果表明，CsPIF4在果实中的表达水平随果实成熟而下降，与类胡萝卜素积累呈显著的负相关关系(图3)。
实施例3柑橘CsPIF4基因的表达载体PHB-CsPIF4-GFP构建
利用PCR扩增引入酶切位点的引物：上游引物CsPIF4-F：5′-GCC GGA TCCATGAATCCATGCATCCCTGAT-3′(引入BamHⅠ酶切位点)，下游引物CsPIF4-R：5′-GGA CTA GTACCCATCTTGCCACTTAGAGG-3′(引入SpeⅠ酶切位点)。
以柑橘cDNA为模版，按98℃3min，98℃10sec，58℃10sec，72℃5sec/kb,72℃5min，2-4步循环38次进行扩增。随后利用1％琼脂糖凝胶电泳，按SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(B518131，Sangon Biotech)说明书步骤进行回收。回收PCR产物，连接到pMD19-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，送样测序。引入酶切位点的序列分析正确后，提取质粒，分别使用BamH1Ⅰ和SpeⅠ限制性内切酶对含有目的片段pMD19-CsPIF4重组质粒和PHB-GFP载体，分别进行双酶切后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测和回收。使用T4 DNA连接酶将CsPIF4基因与PHB-GFP连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，获得植物的表达载体PHB-CsPIF4-GFP基因。利用PCR检测后，送样测序，分析序列正确性，表明CsPIF4基因已经与PHB-GFP载体连接在一起。
实施例4含PHB-CsPIF4-GFP的农杆菌转入柑橘果实
取2μg纯化后的PHB-CsPIF4-GFP质粒DNA，迅速加入到100μL农杆菌感受态细胞中，混合均匀；冰浴30min，转入液氮，冷冻1min，迅速置于37℃，水浴4min；加入900μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡3h；将菌液移至LB(50mL LB+50μg/mL Rif+50μg/mL Kan)固体选择培养基中，均匀涂布，在28℃培养2-3d。
将PHB-CsPIF4-GFP阳性克隆农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上划线，倒置培养48h；挑取单克隆，在超净工作台中，接种到10mL液体LB培养基(含有10μg/mL Rif+10μg/mL Kan)中；在28℃、200rpm条件下，振荡培养过夜。第二天接种于新的YEP液体培养基(含Rif、Gm和Kan)中，确保初始OD600为0.2-0.3。随后在28℃摇床(220rpm)培养至OD600＝0.6-0.8，4000r/min离心10min收集菌体，用MS液体培养基(含10mMMES，10mM MgCl2，200μmol/L AS，pH＝5.6)悬浮菌体，用于转基因。
以‘莫洛’血橙和‘汤姆逊’、‘火焰’、‘鸡尾’葡萄柚为柑橘瞬时超表达材料(图4A)，用1mL注射器按每个柑橘果实0.8mL将菌液注射至果肉中，以空载PHB-GFP为对照(EV)。置于培养室中培养4天后，取注射孔附近果肉样品，用于后续超表达CsPIF4的鉴定和总类胡萝卜素含量的测定。
提取转基因柑橘RNA，将RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒中SL裂解液增加至750μL；使用40μL ddH2O连续洗脱两次CR3，以增加总RNA浓度。随后使用Nanodrop 2000和变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性。以总RNA为模板使用PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒合成第一链cDNA。以注射空载的果实cDNA作为对照，使用定量的特异性引物qCsPIF4F:5'-CAGCAACCAGATGAAACCAAT-3'和qCsPIF4R:5'-AACCACTGCCCCTTAATGTCT-3'，以柑橘actin基因为内参基因，引物为qCsactinF：5'-GGAATGGGGCAGAAGGATG-3'和qCsactinR：5'-CGAAGCTCGTTGTAGAAGGTATG-3'，通过qRT-PCR(方法同实例2)，对瞬时过表达CsPIF4果实的可靠性进行验证。共获得超表达CsPIF4成功的两种柑橘(‘莫洛’血橙和‘鸡尾’葡萄柚)果实，其果实中CsPIF4的表达水平显著高于EV(图4B)。
对转基因柑橘果实进行总类胡萝卜素含量分析，具体步骤如下：准确称取柑橘果肉冻样2g，加入少量CaCO3研磨至粉末状后转入15mL离心管中。在离心管中加入8mL 95％乙醇/80％丙酮的混合溶液(1:1，v/v)，混匀后超声波振荡浸提15min，随后8000rpm离心10min，取上清液至25mL容量瓶中。重复上述方法浸提三次，直至样品粉末发白为止，收集上清液定容至25mL。以浸提液为对照，取上述待测液分别于470nm、645nm和663nm处测定吸光值，重复3次，取平均值。其中类胡萝卜素浓度C(mg/L)＝4.37×A470+1.94×A470-10.35×A645。式中：A470、A645、A663分别为待测液于470nm、645nm和663nm处测定的吸光值的平均值。类胡萝卜素的含量(μg/g)＝(C×V)/FW。式中：C为果肉类胡萝卜素浓度(mg/L)；FW为果肉鲜重(g)；V为浸提液体积(mL)。相较于注射空载的柑橘果实(EV)，瞬时超表达CsPIF4的柑橘果实总类胡萝卜素的含量明显更低(图4C)。
实施例5含PHB-CsPIF4-GFP的农杆菌转入番茄植株
将PHB-CsPIF4-GFP阳性克隆农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上划线，倒置培养48h；挑取单克隆，在超净工作台中，接种到10mL液体LB培养基(含有10μg/mL Rif+10μg/mL Kan)中；在28℃、200rpm条件下，振荡培养过夜。第二天接种于新的YEP液体培养基(含Rif、Gm和Kan)中，确保初始OD600为0.2-0.3。随后在28℃摇床(220rpm)培养至OD600＝0.6-0.8，4000r/min离心10min收集菌体，用MS液体培养基(含10mMMES，10mM MgCl2，200μmol/L AS，pH＝5.6)悬浮菌体，用于转基因。
将Micro-Tom番茄子叶切割，保证子叶两端有切口存在，放入预培养培养基内，于培养室内培养2-3d即可用于遗传转化。将侵染液倒入已预培养两天的番茄子叶所在培养皿中，侵染10-15min，中途摇动几次，确保充分侵染。侵染完成后，经分化、继代、生根，获得转基因番茄植株。
按Biospin全能型植物基因组DNA提取试剂盒(BSC13S1B，bioer)方法，提取番茄叶片DNA。用PHB-CsPIF4-GFP基因扩增前引物CsPIF4-F：5′-GCC GGA TCCATGAATCCATGCATCCCTGAT-3′和PHB-GFP载体后引物CFP79A：5’-CTACGGCAAGCTGACCCTG-3’，以叶片DNA为模版，按98℃3min，98℃10sec，58℃10sec，72℃5sec/kb,72℃5min，2-4步循环38次进行扩增。随后利用1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定稳定超表达CsPIF4的阳性转基因番茄植株(图5)。
在对T3代阳性株系CsPIF4-OE1、4和6d的果实表型的观察上发现，在花后40天，超表达CsPIF4番茄果实呈现出的红色更浅(图6)。按实施例4方法对转基因柑番茄果实进行总类胡萝卜素含量进行测定，稳定超表达CsPIF4果实降低了番茄果实类胡萝卜素的含量，使其类胡萝卜素的积累显著低于野生型(图7)，这与表型呈现出的差异一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.编码柑橘CsPIF4蛋白的基因在调控果实色泽和营养品质中的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超表达，使所述转基因植物的果实类胡萝卜素积累水平降低，所述柑橘CsPIF4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种降低果实类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，将含有编码柑橘CsPIF4蛋白的基因的载体转入植物的基因组中，并在转基因植物中超量表达，降低转基因植物果实中的类胡萝卜素含量，所述柑橘CsPIF4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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