CN115927278A - 一种与甘薯γ-氨基丁酸代谢相关的蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与甘薯γ‑氨基丁酸代谢相关的蛋白及其编码基因和应用，涉及植物基因工程技术领域。该与甘薯γ‑氨基丁酸代谢相关的蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明还提供一种编码该蛋白的基因，所述基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现该基因可以影响甘薯中的γ‑氨基丁酸含量，通过构建过表达该基因的转基因甘薯植株，可以提高甘薯叶片中γ‑氨基丁酸含量。本发明利用基因工程技术升高该基因的表达量，能够获得叶片中γ‑氨基丁酸含量升高的甘薯植株，这为甘薯块根γ‑氨基丁酸代谢通路研究，富含γ‑氨基丁酸的甘薯新品种的遗传改良提供了遗传材料和靶标基因。

Description

一种与甘薯γ-氨基丁酸代谢相关的蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种与甘薯γ-氨基丁酸代谢相关的蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸，它普遍存在于动物、植物和微生物中，生物学功能十分丰富。它是哺乳动物中枢神经中重要的抑制性神经传递质，在植物中参与了对逆境胁迫响应、生长发育、信号传递和碳、氮营养平衡等一系列重要生命活动。在人体中GABA还有多种重要生理功能，有研究报道的包括：增加脑部血流量，保护神经细胞，保护免疫系统，预防老年痴呆，提高记忆力，预防糖尿病，预防高血压，保护肝肾，增加生长激素分泌，促进睡眠，稳定情绪，促进乙醇代谢和促进脂类代谢等多种功效。

甘薯作为世界第七大粮食作物，耐贫瘠、易管理、产量高、营养丰富，在保障国家粮食安全方面具有重要作用。目前关于甘薯γ-氨基丁酸合成基因的相关研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种与甘薯γ-氨基丁酸代谢相关的蛋白及其编码基因和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明发现将该编码基因可以影响甘薯中的γ-氨基丁酸含量，通过构建过表达该编码基因的转基因甘薯植株，可以提高甘薯叶片中γ-氨基丁酸含量。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与甘薯γ-氨基丁酸代谢相关的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种编码上述的蛋白的基因，所述基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种重组载体，包含上述的基因。

本发明还提供一种重组菌株，包含上述的重组载体。

本发明还提供上述的蛋白、基因、重组载体或重组菌株在提高甘薯中γ-氨基丁酸含量中的应用。

本发明还提供一种提高甘薯中γ-氨基丁酸含量的方法，包括提高上述的蛋白在甘薯中的表达量的步骤。

进一步地，提高上述的蛋白在甘薯中的表达量的方法包括：过表达上述的基因。

进一步地，过表达上述的基因的方法包括：构建含有上述的基因的转基因甘薯植株。

进一步地，所述转基因甘薯植株的构建方法包括：将上述的基因、重组载体或重组菌株转化入甘薯组织，之后经过组织培养得到所述转基因甘薯植株。

进一步地，所述甘薯组织为胚性愈伤组织。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过构建IbGAD4的过表达载体，经遗传转化后获得了IbGAD4基因表达量提高的转基因甘薯植株，其叶片中γ-氨基丁酸含量升高，表明该基因影响甘薯叶片中γ-氨基丁酸含量。

本发明利用基因工程技术升高IbGAD4基因的表达量，能够获得叶片中γ-氨基丁酸含量升高的甘薯植株，这为甘薯块根γ-氨基丁酸代谢通路研究，富含γ-氨基丁酸的甘薯新品种的遗传改良提供了遗传材料和靶标基因。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为包含IbGAD4ORF的cDNA片段；其中M:2000bpDNALadder；1：包含IbGAD4ORF的1158bp的cDNA目的片段；

图2为pCAMBIA1300-IbGAD4重组质粒的酶切鉴定；其中M：2000bpDNALadder；1：重组质粒；2：双酶切(KpnI+XbaI)重组质粒；3:IbGAD4ORF的PCR回收产物；

图3为胚性悬浮细胞为受体的甘薯遗传转化；其中A为剥取茎尖材料；B为诱导胚性愈伤组织；C为胚状愈伤液体悬浮培养；D为转化后筛选培养；E为继续筛选培养；F为抗性愈伤开始分化；G为诱导培养；H为诱导成再生苗；

图4为转IbGAD4基因甘薯的基因组PCR鉴定；其中M：2000bpDNALadder；1：H₂O为模板；2：重组质粒pCAMBIA1300-IbGAD4为模板；3：非转基因甘薯；4-8：转IbGAD4基因甘薯OE-1、OE-2、OE-3、OE-4和OE-5；

图5为转基因甘薯块根中IbGAD4的RT-qPCR鉴定：NT为非转基因甘薯‘栗子香’；OE-1、OE-2、OE-3、OE-4和OE-5为转IbGAD4基因甘薯；

图6为转IbGAD4基因甘薯叶片中γ-氨基丁酸组分及含量的检测；NT为非转基因甘薯‘栗子香’；OE-1、OE-2和OE-5为转IbGAD4基因甘薯。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

克隆载体pMD19-T和pCAMBIA1300为Cambia公司产品。植物总RNA提取试剂盒为全式金(TransGenBiotech，北京)的Transzol植物总RNA提取试剂盒(目录号：ET111)。QuantScriptRTKitQuantcDNA第一链合成试剂盒为天根(TIANGEN，北京)有限公司的产品(目录号：KR103)。γ-氨基丁酸比色法测试试剂盒为武汉伊莱瑞特(Elabscience，武汉)生物科技股份有限公司产品(目录号：E-BC-K852-M)。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述定量实验，如无特别说明，均设三次重复。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1过表达IbGAD4甘薯的制备

1、载体的构建

1.1IbGAD4基因的扩增

用植物总RNA提取试剂盒提取甘薯品系‘栗子香’的块根的总RNA，将该总RNA用QuantScriptRTKitQuantcDNAKit反转录出第一链cDNA。通过在甘薯数据库中比对拟南芥AtGAD4序列，获得相似度最高的序列，设计一对包含IbGAD4开放阅读框的特异性引物IbGAD4-KpnⅠ-F和IbGAD-XbaⅠ-R。以‘栗子香’块根获得的cDNA为模板，利用上述的特异性引物，进行PCR扩增，反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，66℃/30s，72℃/1min，35cycles；72℃/10min，得到包含‘栗子香’谷氨酸脱羧酶基因(简称IbGAD4)ORF的1158bp的目的片段(图1)。将含有限制性内切酶KpnI和XbaI的PCR产物连接至pMD19-T载体，得到重组质粒pMD19-T-IbGAD4。

IbGAD4-KpnⅠ-F(SEQ ID NO.3)：GGGGTACCATGATAGCGCGTCTGTTCAA，下划线为限制性内切酶KpnI的识别序列。

IbGAD-XbaⅠ-R(SEQ ID NO.4)：GCTCTAGAGCAGATGGCCGCAGCG，下划线为限制性内切酶XbaI的识别序列。

1.2目的基因与载体连接

用限制性内切酶KpnI和XbaI对重组质粒pMD19-T-IbGAD4双酶切，回收约1200bp的片段1。用限制性内切酶KpnI和XbaI对载体pCAMBIA1300双酶切，回收约12000bp的载体骨架2。将片段1与载体骨架2连接，得到重组载体pCAMBIA1300-IbGAD4。经KpnI和XbaI双酶切验证(图2)和测序后用于甘薯转化。pCAMBIA1300-IbGAD4重组载体含有IbGAD4的ORF(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

IbGAD4基因的ORF的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：

ATGATAGCGCGTCTGTTCAACGCTCCTTTGGGAGAGAGTGAGACAGCAGTTGGAGTAGGGACAGTTGGGTCGTCTGAGGCCATAATGCTCGCAGGCCTTGCCTTCAGGAGACAGTGGCAAAACAAACGAAGGGCCCAAGGAAAGCCATGTGATAAGCCCAACATTGTCACCGGCGCCAACGTCCAGGTATGTTGGGAGAAATTTGCAAACTACTTCGAGGTGGAGTTGAAAGAGGTGAAATTGAGAGAAGGGTACTATGTAATGGACCCGGTTAAGGCCGTGGAAATGGTGGACGAAAACACCATTTGTGTGGCCGCAATTTTGGGTTCAACCTTGAATGGCGAATTCGAAGATGTCAAGCTCCTCAATGATCTTCTTGCTAAGAAGAACAACGAAACCGGATGGGACACACCTATTCATGTGGATGCAGCAAGTGGAGGGTTCATAGCTCCATTTCTATACCCAGAGCTGGAGTGGGACTTTAGGTTGCCATTGGTGAAGAGTATAAATGTGAGTGGGCACAAATATGGACTTGTGTATGCTGGCATTGGATGGGTGATTTGGAGGAGCAAACAAGACTTGCCTGATGAACTCATATTTCACATTAACTACCTCGGAGCTGATCAACCAACTTTCACACTCAATTTCTCCAAAGGCTCAAGTCAAGTCATTGCTCAATATTACCAACTCATCCGCTTAGGTTTCGAGGGTTACAGAAACATCATGGAGAATTGTCGAGAAAACGCAATCGTGCTGAGGGAAGGGCTAGAGAAGACGGGGCGATTCAACATCGTGTCCAAGGACGAGGGAGTGCCGCTGGTGGCGTTCTCCCTCAAGGAAAACAAGCGACACAATGAGTTCGAGGTATCCGAGATGCTCCGCAGGTTCGGTTGGATCGTGCCGGCGTACACCATGCCGGCCGACGCGCAACACGTCACAGTGTTGCGCGTGGTCATTAGGGAAGACTTTTCCCGCACCCTCGCGGAGCGCCTCGTCCTCGACATCGTCAAGGTCCTACACGAGCTCGACGCGCTTCCGCCGCGTGTGAACCCAAACGCCGCCGCCAAGACGAGTAGTCTTGAAGTTCAGAGGAAAACGACTGAGGTTTGGAAGAAGTTTGTGATGGAGAGGAAAGCTGCCGCTGCGGCCATCTGCTAA。

IbGAD4基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：

MIARLFNAPLGESETAVGVGTVGSSEAIMLAGLAFRRQWQNKRRAQGKPCDKPNIVTGANVQVCWEKFANYFEVELKEVKLREGYYVMDPVKAVEMVDENTICVAAILGSTLNGEFEDVKLLNDLLAKKNNETGWDTPIHVDAASGGFIAPFLYPELEWDFRLPLVKSINVSGHKYGLVYAGIGWVIWRSKQDLPDELIFHINYLGADQPTFTLNFSKGSSQVIAQYYQLIRLGFEGYRNIMENCRENAIVLREGLEKTGRFNIVSKDEGVPLVAFSLKENKRHNEFEVSEMLRRFGWIVPAYTMPADAQHVTVLRVVIREDFSRTLAERLVLDIVKVLHELDALPPRVNPNAAAKTSSLEVQRKTTEVWKKFVMERKAAAAAIC。

2、植物材料及培养

2.1植物材料

甘薯品系‘栗子香’由江苏省农科院甘薯研究中心曹清河研究员惠赠。

2.2培养基

(1)诱导愈伤培养基的组成(MS2D)：MS(4.43g·L^-1)+蔗糖(30g·L^-1)+2，4-D(2mg·L^-1)+琼脂(3g·L^-1)，其余为水。

(2)共培养培养基的组成：MS(4.43g·L^-1)+蔗糖(30g·L^-1)+2，4-D(2mg·L^-1)+AS(200μmol·L^-1)+琼脂(3g·L^-1)，其余为水。

(3)筛选培养基的组成：MS(4.43g·L^-1)+蔗糖(30g·L^-1)+Hyg(潮霉素)(10mg·L^-1)+Cef(头孢菌素)(25mg·L^-1)+琼脂(3g·L^-1)，其余为水。

(4)分化培养基的组成：MS(4.43g·L^-1)+蔗糖(30g·L^-1)+Hyg(10mg·L^-1)+琼脂(3g·L^-1)，其余为水。

3、甘薯的遗传转化

将pCAMBIA1300-IbGAD4转化农瘤杆菌(根癌农杆菌)EHA105菌株，得到含有重组质粒pCAMBIA1300-IbGAD4的EHA105菌株，利用胚性悬浮细胞为受体转化甘薯，具体步骤如下：

(1)剥离茎尖分生组织及诱导愈伤组织：取5cm左右带茎尖的甘薯茎段，去掉肉眼可见的叶片，用肥皂水浸泡30min，然后用自来水冲洗30min；将茎段剪成1-1.5cm，于超净工作台中用体积分数为75％的乙醇溶液表面消毒30s，然后放入20wt％的次氯酸钠溶液中浸泡5min，最后用无菌水冲洗5次，备用；用镊子将茎尖分生组织周围的叶片及叶原基全部切除，将露出来的分生组织(0.5mm)切下并接种于MS2D固体培养基，置于培养箱在27±1℃黑暗培养6-8w后，诱导产生黄色颗粒状的胚性愈伤组织(图3中B)。

(2)胚性悬浮细胞的培养：用镊子将胚性愈伤组织破碎成小的细胞团，经网筛过滤，用MS2D培养基清洗3次，置于摇床进行悬浮培养(200rpm/min，27℃)。胚性悬浮细胞7d继代一次。继代时用吸管去除白色的非胚性愈伤组织，然后加入新鲜的MS2D液体培养基。培养8-12w后，挑选分散度好、颜色亮黄的胚性悬浮细胞作为转化受体(图3中C)。

(3)侵染和共培养：挑取农杆菌单克隆到10mL LB(加50mg·L^-1卡那霉素)液体培养基中，220rpm，28℃过夜培养。取3mL农杆菌菌液加入到50mL LB液体培养基中(加50mg·L^-1卡那霉素)，220rpm，28℃培养3h，至OD₆₀₀＝0.4-0.5。5000rpm室温离心10min收集菌体，弃上清后用LB液体培养基清洗一次，5000rpm，离心10min。弃上清，加入MS2D液体培养基重悬菌体，5000rpm室温离心10min收集菌体，重复一次。用50mLMS2D液体培养基重悬菌体细胞。转化前3d将胚性悬浮细胞过网筛(直径0.7mm)，用MS2D液体培养基清洗3次。将备好的农杆菌菌液加入甘薯胚性悬浮细胞中，在100rpm，26℃摇床培养30min。用吸管将菌液全部吸出，将悬浮细胞平铺在铺有滤纸的共培养培养基上，26℃黑暗条件下共培养3d(图3中D)。共培养3d后，将胚性悬浮细胞用刀片轻轻刮下放在三角瓶，用添加200mg·L^-1Cef的MS2D液体培养基洗涤3次，每次稀释Cef浓度至前一次浓度的1/2，摇晃5min。将悬浮细胞团转入MS2D+25mg·L^-1Cef的液体培养基中，在26℃，180rpm，条件下延迟培养1w，中间更换一次新鲜培养基。

(4)筛选培养：将延迟培养后的悬浮细胞用MS2D液体培养基清洗3次，吸干培养基，然后转移至铺有滤纸的筛选培养基上进行培养，培养条件为26℃，16h光照/8h黑暗，每2w继代一次(图3中E)。

(5)生根培养：将抗性愈伤组织或胚状体继代到新鲜的筛选培养基上，体细胞胚逐渐成熟，经4-6m后形成小植株。将再生的小植株切下，转移至MS培养基进行生根，生根后的抗性植株(图3中H)用于后续鉴定。培养条件为26℃，16h光照/8h黑暗，每6w继代一次。

4、过表达IbGAD4甘薯植株的鉴定

4.1基因组PCR鉴定

提取抗性植株基因组DNA进行PCR鉴定。以重组质粒pCAMBIA1300-IbGAD4为阳性对照，非转基因甘薯为阴性对照，使用正向引物35S-F：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’(SEQ IDNO.5)和反向引物GAD4-ORF-R：5’-ATTGCGGCCACACAAATGGT-3’(SEQ ID NO.6)进行PCR检测，反应条件为：94℃/3min；94℃/30s，60℃/30s，72℃/1min，35cycles；72℃/5min；12℃Forever。PCR产物约为350bp。结果如图4所示，最终得到25株转IbCCC4基因甘薯，随机取其中5株(OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5)进行PCR验证，结果表明均可扩增出IbGAD4基因的特异性条带，而非转基因甘薯(NT)中没有扩增出该条带(图4)，说明IbGAD4基因已经被成功转化到甘薯中。

4.2RT-qPCR鉴定

提取经基因组PCR鉴定后的转IbGAD4基因甘薯块根RNA，进行RT-qPCR鉴定。利用5株转IbGAD4基因甘薯OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5的总RNA反转录得到的cDNA作为模板，使用引物qRT-PCR-IbGAD-F：5’-ACAAACGAAGGGCCCAAGGA-3’(SEQ ID NO.7)和qRT-PCR-IbGAD-R：5’-ATTGCGGCCACACAAATGGT-3’(SEQ ID NO.8)检测IbGAD4基因的表达量，反应条件：95℃/2min；95℃/20s，60℃/20s，72℃/20s，35cycles；72℃/5min。以Actin(Ipomoeabatatas)-F：5’-GACTACCATGTTCCCCGGTA-3’(SEQ ID NO.9)，Actin(Ipomoeabatatas)-R：5’-TTGTATGCCACGAGCATCTT-3’(SEQ ID NO.10)为内参基因计算IbGAD4的相对表达量。结果如图5所示，OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5中IbGAD4表达量显著高于非转基因甘薯(NT)，表明IbGAD4在转基因甘薯中有不同程度的表达。

实施例2过表达IbGAD4甘薯叶片中γ-氨基丁酸含量测定

转基因甘薯为阳性T0代转IbGAD4甘薯OE-1的植株、阳性T0代转IbGAD4甘薯OE-2的植株，阳性T0代转IbGAD4甘薯OE-5的植株。

具体步骤：在超净工作台中取转基因甘薯OE-1、OE-2、OE-5植株瓶苗及非转基因甘薯‘栗子香’(NT)瓶苗的叶片，液氮研磨后，利用γ-氨基丁酸比色法测试试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)测定转基因甘薯植株OE-1、OE-2、OE-5及NT块根中总γ-氨基丁酸含量，样品均为3次生物学重复。

结果如图6所示，过表达IbGAD4转基因甘薯株系OE-1、OE-2叶片中总γ-氨基丁酸含量显著高于非转基因甘薯NT。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种与甘薯γ-氨基丁酸代谢相关的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码如权利要求1所述的蛋白的基因，其特征在于，所述基因的ORF序列如SEQID NO.1所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

4.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体。

5.一种如权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的基因、权利要求要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌株在提高甘薯中γ-氨基丁酸含量中的应用。

6.一种提高甘薯中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于，包括提高如权利要求1所述的蛋白在甘薯中的表达量的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，提高如权利要求1所述的蛋白在甘薯中的表达量的方法包括：过表达如权利要求2所述的基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，过表达如权利要求2所述的基因的方法包括：构建含有如权利要求2所述的基因的转基因甘薯植株。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述转基因甘薯植株的构建方法包括：将权利要求2所述的基因、权利要求要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌株转化入甘薯组织，之后经过组织培养得到所述转基因甘薯植株。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述甘薯组织为胚性愈伤组织。

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