CN110643617A

CN110643617A - 一种水稻粒重相关的OsGASR9基因及应用、蛋白质、表达载体和转基因水稻的方法

Info

Publication number: CN110643617A
Application number: CN201911038016.0A
Authority: CN
Inventors: 李相伯; 周勇; 朱韵; 梁国华; 缪军; 史双月; 陶亚军; 彭秀荣; 李畅; 杨泽峰
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2020-01-03

Abstract

本发明提供了一种水稻粒重相关的OsGASR9基因及应用、蛋白质、表达载体和转基因水稻的方法，属于植物基因工程技术领域，所述OsGASR9基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明将OsGASR9基因插入到载体后，得到的表达载体再转化到水稻中，使得OsGASR9基因在水稻中进行过表达，增加了水稻种子的粒长和粒宽，提高了水稻种子的千粒重，而且提高了水稻单株的产量。

Description

一种水稻粒重相关的OsGASR9基因及应用、蛋白质、表达载体和转基因水稻的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻粒重相关的 OsGASR9基因及应用、蛋白质、表达载体和转基因水稻的方法。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物，水稻的持续稳定生产对保障粮食安全和农业可持续发展具有重要意义。我国水稻生产经过高产育种、超高产育种、超级稻育种和绿色超级稻育种等计划的实施，产量提高明显，实现了产需平衡略有余(程式华,中国农业科学,2016,49(2):205-206)。但随着我国人口的持续增加，耕地面积和自然资源减少，以及环境的恶化，提高水稻产量和品质仍是保障我国粮食安全和社会稳定的重大需求。粒重作为水稻产量的重要构成因子，与产量形成密切相关(Shomura等,Nature Genetics,2008,40: 1023-1028；Zuo and Li,Annual Review of Genetics,2014,48:99-118)。

与传统育种相比，分子育种具有选择效率高、育种周期短等优势，而开展分子育种的基础是重要目标性状基因的克隆和功能研究，准确了解了目标基因的生物学功能和遗传效应才能开展分子育种。因此，挖掘水稻粒重调控相关基因，阐明其效应并应用于育种实践，就可以为开展水稻高产分子育种提供重要遗传信息和基因资源。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻粒重相关的OsGASR9基因及应用、蛋白质、表达载体和转基因水稻的方法，本发明提供的OsGASR9 基因具有提高水稻粒重的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种水稻粒重相关的OsGASR9基因，所述OsGASR9基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的OsGASR9基因在提高水稻粒重中的应用。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的OsGASR9基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种表达载体，将上述技术方案所述的OsGASR9基因插入到初始载体中，得到表达载体。

优选的，所述初始载体包括pC1300Actin-3×Flag载体。

优选的，所述表达载体的构建方法包括以下步骤：

1)提取水稻叶片总mRNA，将所述总mRNA反转录为cDNA，以所述 cDNA为模板用扩增引物对进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物与pLB-Simple载体连接、热击、转化大肠杆菌，将得到的转化物在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到阳性克隆，提取得到质粒；

所述扩增引物对包括扩增上游引物和扩增下游引物，所述扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

2)将所述步骤1)得到的质粒经Xma I和Xba I双酶切，得到OsGASR9 基因；将pC1300Actin-3×Flag载体经Xma I和Xba I双酶切，得到酶切载体；将所述OsGASR9基因和酶切载体经T4连接酶连接，得到表达载体。

优选的，所述步骤1)PCR使用的体系每50μL包括：2×GC Buffer 25μL、 10mM dNTPMix 4μL、浓度为10μmol/L的扩增上游引物1μL、浓度为10 μmol/L的扩增下游引物1μL、cDNA模板2μL、5U/μL的高保真Taq酶0.5 μL和ddH₂O 16.5μL。

优选的，所述PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，53℃30s， 72℃40s，30个循环；72℃10min。

优选的，所述步骤2)连接的体系每10μL包括：OsGASR9基因6μL、酶切载体2μL、10х连接Buffer 1μL和T4连接酶1μL。

本发明还提供了一种培育转基因水稻的方法，将上述技术方案所述的表达载体转化根癌农杆菌，将转化后的根癌农杆菌转化水稻，得到转基因水稻。

本发明提供了一种水稻粒重相关的OsGASR9基因及应用、蛋白质、表达载体和转基因水稻的方法，所述OsGASR9基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，本发明提供的OsGASR9基因具有提高水稻粒重的作用，粒重为千粒重，增加水稻种子的粒长和粒宽。

附图说明

图1为OE-GASR9过量表达载体的酶切鉴定，其中Marker为DL2000 (购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：3427A)；

图2为水稻β-Actin启动子驱动OsGASR9基因的植物表达载体图；

图3为野生型日本晴(NIP)和含OE-GASR9载体转基因株系NIP-OE1 和NIP-OE2的mRNA转录水平的定量PCR分析，其中OsActin基因的表达水平作为内参，数值代表的是3次独立实验的平均值±标准差(**，P<0.01)；

图4为野生型日本晴(NIP)和含OE-GASR9载体转基因株系NIP-OE1 和NIP-OE2的植株形态，标尺＝10cm；

图5为野生型日本晴(NIP)和含OE-GASR9载体转基因株系NIP-OE1 和NIP-OE2的穗部形态，标尺＝10cm；

图6为野生型日本晴(NIP)和含OE-GASR9载体转基因株系NIP-OE1 和NIP-OE2的籽粒形态，标尺＝1cm；

图7为野生型日本晴(NIP)和含OE-GASR9载体转基因株系NIP-OE1 和NIP-OE2在株高、穗长、每穗粒数、结实率、每株穗数、粒长、粒宽、粒厚、千粒重和单株产量的比较，数据均以平均值±标准差表示(n≥15)，t 测验：*，P<0.05；**，P<0.01；ns，不显著。

具体实施方式

本发明提供了一种水稻粒重相关的OsGASR9基因，所述OsGASR9基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：

atgagggttcctcctcttcgtgccaccacggctctcctggccaccctcctggtcgccgcctcgttccaggatct caccgtcgctgcagacggcggcggcggcgtggttccggtcccggatagcgtgtgcgacgccaagtgccagaag cggtgctcgctgaaggtggccgggcggtgcatggggctgtgcaagatgtgctgccacgactgcggcggctgcgt gccgtcggggccgtacgccagcaaggacgagtgcccctgctaccgcgacatggtctcccccaagagccgacggcccaagtgcccgtga。

本发明还提供了上述技术方案所述的OsGASR9基因在提高水稻粒重中的应用。在本发明中，所述粒重优选为千粒重。在本发明中，所述OsGASR9 基因能够增加水稻种子的粒长和粒宽。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的OsGASR9基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：

MRVPPLRATTALLATLLVAASFQDLTVAADGGGGVVPVPDSVCDAKC QKRCSLKVAGRCMGLCKMCCHDCGGCVPSGPYASKDECPCYRDMVSPK SRRPKCP。

本发明还提供了一种表达载体，将上述技术方案所述的OsGASR9基因插入到载体中，得到表达载体。

本发明对所述载体的种类没有特殊限定，采用常规载体即可，在本发明具体实施方式中优选为pC1300Actin-3×Flag载体。

在本发明中，所述表达载体的构建方法优选包括以下步骤：

本发明对所述提取水稻叶片总mRNA的方法没有特殊限定，采用常规即可，本发明对所述总mRNA反转录为cDNA的方法没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，所述PCR使用的体系每50μL优选包括：2×GC Buffer 25 μL、10mMdNTP Mix 4μL、浓度为10μmol/L的扩增上游引物1μL、浓度为10μmol/L的扩增下游引物1μL、cDNA模板2μL、5U/μL的高保真Taq 酶0.5μL和ddH₂O 16.5μL。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述PCR扩增的程序优选包括：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min。

本发明优选将所述扩增产物与pLB-Simple载体连接、热击、转化大肠杆菌，将得到的转化物在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到阳性克隆，提取得到质粒。在本发明中，所述连接的条件优选包括：连接的温度优选为 16℃，连接的时间优选为30min。在本发明中，所述热击的条件优选包括：热击的温度优选为42℃，热击的时间优选为60s。在本发明中，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌DH5α，本发明对所述转化大肠杆菌的方法没有特殊限定，采用常规转化大肠杆菌的方法即可。在本发明中，俗螦瑚培养基优选为 LB固体培养基，本发明对所述含氨苄青霉素的培养基中氨苄青霉素的含量没有特殊限定，采用常规含量即可，本发明对所述培养的条件没有特殊限定，采用常规培养转化后的大肠杆菌的培养条件即可。本发明对提取质粒的方法没有特殊限定，采用常规提取质粒的方法即可。

在本发明中，所述扩增引物对优选包括扩增上游引物和扩增下游引物，所述扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下所示： aaacccgggatgagggttcctcctcttcgtgccac；下划线序列为Xma I位点；

所述扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下所示：

aaatctagacgggcacttgggccgtcggctcttgg。下划线序列为Xba I位点。

在本发明中，所述质粒经Xma I和Xba I双酶切的酶切条件优选包括：酶切的体系优选包括：10×酶切Buffer 5μL、浓度为0.5μg/μL的质粒15μL， Xba I(5U/μL)和Xma I(5U/μL)各1μL、ddH₂O 28μL；在37℃下酶切12h。

在本发明中，所述pC1300Actin-3×Flag载体经Xma I和Xba I双酶切的酶切条件优选包括：酶切的体系优选包括：10×酶切Buffer 5μL、浓度为0.5 μg/μL的pC1300Actin-3×Flag载体15μL，Xba I(5U/μL)和Xma I(5U/μL)各 1μL、ddH₂O 28μL；在37℃下酶切12h。

在本发明中，所述连接的体系优选每10μL包括：浓度为0.02μg/μL的 OsGASR9基因6μL、浓度为0.1μg/μL的酶切载体2μL、10х连接Buffer 1μL 和T4连接酶1μL。在本发明中，所述连接的条件优选包括：在16℃下连接 12h。

在本发明中，所述根癌农杆菌优选为根癌农杆菌EHA105，本发明对所述表达载体转化根癌农杆菌的方法没有特殊限定，采用常规转化根癌农杆菌的方法即可。本发明对所述转化后的根癌农杆菌转化水稻的方法没有特殊限定，采用常规转化水稻的方法即可。在本发明中，所述水稻的品种优选为日本晴。在本发明中，所述培育得到的转基因水稻的粒长大于原水稻的粒长，粒宽大于原水稻的粒宽，粒重大于原水稻的粒重，单株产量大于原水稻的单株产量。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中的实验方法，包括DNA提取、RNA提取、cDNA的制备、酶切、克隆和表达载体的构建、连接、菌株转化和筛选等，如无特别说明，均为本领域内的常规方法。

下述实施例中，所使用的各种实验材料、试剂、酶、载体等，均可通过商业途径获得。

实施例1

OsGASR9基因的克隆：

利用RNA抽提试剂盒(购天根生化科技(北京)有限公司，产品号： DP419)提取水稻叶片总mRNA，DNase I(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：2270A)处理后，用反转录试剂盒(购天根生化科技(北京) 有限公司，产品号：KR106-02)反转录合成cDNA，反应体系和反应条件参考相关试剂盒说明。利用该cDNA为PCR模板，扩增OsGASR9基因的编码序列SEQID No:1，扩增所用特异性引物如下：

上游引物(SEQ ID No:3)：

AAACCCGGGATGAGGGTTCCTCCTCTTCGTGCCAC，下划线序列为 Xma I位点；

下游引物(SEQ ID No:4)：

AAATCTAGACGGGCACTTGGGCCGTCGGCTCTTGG，下划线序列为 Xba I位点。

PCR反应体系：2×GC Buffer 25μL、10mM dNTP Mix 4μL、上游引物 (SEQ ID No:3)(10μmol/L)1μL、下游引物(SEQ ID No:4)(10μmol/L)1μL、cDNA模板2μL、高保真Taq酶(5U/μL)0.5μL和ddH₂O 16.5μL。

PCR反应程序：95℃充分变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s；30个循环，72℃充分延伸10min。

扩增的PCR产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：9761)回收该片段，获得回收产物。将PCR产物与pLB零背景快速克隆试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，产品号：VT205)中的pLB-Simple载体在16℃下用T4 连接酶连接30min，42℃热击60s，转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选阳性克隆，提取质粒并测序(委托上海生工生物技术有限公司完成)，该质粒中含有序列表SEQ ID No:1的核苷酸。将该质粒命名为p-OsGASR9。

实施例2

OsGASR9过量表达重组载体的获得：

用Xba I/Xma I双酶切实施例1得到的质粒p-OsGASR9和 pC1300Actin-3×Flag空载体。酶切反应体系为：酶切体系为：10х酶切Buffer 5μL、pC1300Actin-3×Flag空载体15μL，Xba I(5U/μL)和Xma I(5U/μL)各1 μL、ddH₂O 28μL。37℃酶切12小时。酶切产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品号：9761)回收OsGASR9基因编码区DNA片段和pC1300Actin-3×Flag空载体，分别溶解于30μLddH₂O中备用。

将上述回收的OsGASR9基因片段和pC1300Actin-3×Flag载体片段进行连接反应，连接体系为：浓度为0.02μg/μL的OsGASR9基因片段6μL、浓度为0.1μg/μL的pC1300Actin-3×Flag载体片段2μL、10х连接Buffer 1μL、 T₄连接酶1μL；混合均匀后，16℃连接12小时，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化物在含卡那霉素的LB平板培养基上生长，挑选阳性克隆，提取质粒并测序鉴定(委托上海生工生物技术有限公司完成)，将该质粒命名为OE-GASR9。该重组载体的物理图谱如图2所示。

实施例3

含有OE-GASR9重组载体转基因水稻的获得

实施例2得到的OE-GASR9重组质粒转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105，在含有卡那霉素的LB培养基上挑单克隆，并用PCR鉴定阳性克隆。

将此导入OE-GASR9重组质粒的农杆菌转化水稻日本晴愈伤，经过愈伤诱导、侵染、共培养、筛选具有抗性的愈伤、分化、生根、移栽，最终获得转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系主要参照Hiei等人的方法 (Agrobacterium-mediated transformation ofrice using immature embryos or calli induced from mature seed,NatureProtocols,2008(3):824-834)基础上开展。主要遗传转化步骤如下：

1、挑选饱满的日本晴种子，将成熟的种子去壳，用75％的酒精消毒 30-60s，然后加入次氯酸钠灭菌(次氯酸钠/蒸馏水＝1:2，充分混匀)，再加 1-2滴Tween-20，静置35-40min，期间每隔10min轻轻摇一次。然后用无菌水漂洗3-5次，风干，接种于N₆D₂培养基上，28℃暗培养10-15天。将诱导出来的愈伤切下，于N₆D₂培养基上继代3-5天。

2、挑取导入OE-GASR9重组质粒的农杆菌单菌落接种于3ml含50mg/l 卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃振荡培养16h，再按1/100(v/v)接种量接种入LB液体培养基中。当培养至对数生长期时，离心收集农杆菌并重悬于适量的AAM(含100-400μmol/l的乙酰丁香酮)液体培养基中，将已培养日本晴的愈伤组织浸泡入此农杆菌菌液中。侵染15-20min后，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去过多的菌液，然后将愈伤组织转入N₆D₂C培养基上于 28℃黑暗条件下进行共培养。共培养3天后，将愈伤组织转入含25mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的选择培养基CCD₂S₁上进行第一轮筛选培养；10 天后将长出的新鲜抗性愈伤再转入含50mg/L潮霉素和300mg/L头孢霉素的选择培养基CCD₂S₂上继续筛选。

3、愈伤组织经过2代筛选后，选择生长旺盛的新鲜抗性愈伤组织转移到含50mg/L潮霉素和300mg/L头孢霉素的CCA培养基上于28℃黑暗条件下进行预分化培养。10天后，再将预分化培养的抗性愈伤组织转移至含 50mg/L潮霉素和300mg/L头孢霉素的分化培养基MSR上于16h光/8h暗、 28℃条件下进行分化。

4、再生的小苗在含12.5mg/l潮霉素和150mg/l头孢霉素的1/2MS培养基上生根壮苗，最后转移到田间栽培。转基因水稻的栽培管理按常规方法进行。

表1水稻组织培养和转化中使用的培养基及其成分

上述分子操作过程中所涉及的PCR、酶切、连接、大肠杆菌细胞转化和农杆菌的转化均为本领域的常规操作。

实施例4

实施例3得到的含有OE-GASR9转基因植物的分子鉴定和表型分析

共获得了20个独立的T₀代转OE-GASR9水稻植株，收获种子然后种植T₁代，然后再次单株收获种子种植T₂代，在T₂代，将这些株系和未转化受体日本晴一起在大田种植。抽穗前利用筛选标记潮霉素进行纯合株系鉴定，鉴定过程如下：取新鲜的水稻叶片，将其浸泡在浓度为千分之一的潮霉素溶液中，两周后观察叶片形态，如果表现正常绿色则为阳性单株，如果表现黄化或者褐色则为阴性单株，如果一个株系内的所有单株表现正常绿色，则该株系为阳性纯合株系。

随机选取了两个独立的OsGASR9过量表达阳性纯合株系进行进一步分析，分别命名为NIP-OE1和NIP-OE2。首先，转基因植株和未转化受体日本晴叶片中的总mRNA，反转录获得第一链cDNA，利用定量PCR分析，以基因特异序列为引物随机对其中的3个转基因植株中OsGASR9的mRNA 转录水平进行分析。用于反转录的试剂盒为FastQuant RT Kit(购天根生化科技(北京)有限公司，产品号：KR106-02)，反应体系和反应条件参照说明书。用于定量PCR的试剂为ChamQ SYBR Color qPCR MasterMix(南京诺唯赞生物科技有限公司，产品号：Q411-02)。仪器为美国Life Technologies 公司实时荧光定量PCR仪ABI ViiA7，反应体系参照说明书。

OsGASR9基因特异上游引物序列为(SEQ ID No.5)：

5'-gggttcctcctcttcgtgc-3'；

下游引物序列为(SEQ ID No.6)：

5'-gcaccgcttctggcactt-3'。

用OsActin基因作物内参，其上游引物序列为(SEQ ID No.7)： 5'-gatgacccagatcatgtttg-3'；

其下游引物序列为(SEQ ID No.8)：5'-gggcgatgtaggaaagc-3'。PCR程序为：预变性3min，然后进入PCR循环，循环参数为94℃15s变性→55℃15s 复性→72℃40s延伸，进行40个循环。

结果如图3所示，与未转化对照日本晴相比，在OsActin基因作为内参的情况下，2个转基因植株中OsGASR9的转录水平均有极显著上调，说明目标基因OsGASR9已经成功在受体日本晴中过量表达。

性状分析表明：与日本晴相比，过量表达转基因株系NIP-OE1和NIP-OE2 的株高、穗长和每穗粒数都显著增加(图4、图5和图7)；然而，结实率和单株穗数没有显著变化(图7)。与对照相比，过量表达株系的粒长和粒宽显著增加，其中NIP-OE1和NIP-OE2的粒长分别增加了6.13％和6.59％，粒宽分别增加了3.65％和6.08％(图6、图7)，因此，两个过量表达株系的千粒重分别增加了7.82％和8.50％(图7)，NIP-OE1和NIP-OE2的单株产量分别显著增加了9.93％和15.32％(图7)

由以上实施例可以得出，本发明将OsGASR9基因插入到载体后，得到的表达载体再转化到水稻中，使得OsGASR9基因在水稻中进行过表达，增加了水稻种子的粒长和粒宽，提高了水稻种子的千粒重，而且提高了水稻单株的产量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种水稻粒重相关的OsGASR9基因及应用、蛋白质、表达载体和转基因水稻的方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagggttc ctcctcttcg tgccaccacg gctctcctgg ccaccctcct ggtcgccgcc 60

tcgttccagg atctcaccgt cgctgcagac ggcggcggcg gcgtggttcc ggtcccggat 120

agcgtgtgcg acgccaagtg ccagaagcgg tgctcgctga aggtggccgg gcggtgcatg 180

gggctgtgca agatgtgctg ccacgactgc ggcggctgcg tgccgtcggg gccgtacgcc 240

agcaaggacg agtgcccctg ctaccgcgac atggtctccc ccaagagccg acggcccaag 300

tgcccgtga 309

<210> 2

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Val Pro Pro Leu Arg Ala Thr Thr Ala Leu Leu Ala Thr Leu

1 5 10 15

Leu Val Ala Ala Ser Phe Gln Asp Leu Thr Val Ala Ala Asp Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Val Val Pro Val Pro Asp Ser Val Cys Asp Ala Lys Cys Gln

35 40 45

Lys Arg Cys Ser Leu Lys Val Ala Gly Arg Cys Met Gly Leu Cys Lys

50 55 60

Met Cys Cys His Asp Cys Gly Gly Cys Val Pro Ser Gly Pro Tyr Ala

65 70 75 80

Ser Lys Asp Glu Cys Pro Cys Tyr Arg Asp Met Val Ser Pro Lys Ser

85 90 95

Arg Arg Pro Lys Cys Pro

100

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacccggga tgagggttcc tcctcttcgt gccac 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaatctagac gggcacttgg gccgtcggct cttgg 35

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggttcctcc tcttcgtgc 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaccgcttc tggcactt 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatgacccag atcatgtttg 20

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggcgatgta ggaaagc 17

Claims

1.一种水稻粒重相关的OsGASR9基因，其特征在于，所述OsGASR9基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的OsGASR9基因在提高水稻粒重中的应用。

3.一种权利要求1所述的OsGASR9基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的OsGASR9基因插入到初始载体中，得到表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述初始载体包括pC1300Actin-3×Flag载体。

6.根据权利要求4或5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法包括以下步骤：

1)提取水稻叶片总mRNA，将所述总mRNA反转录为cDNA，以所述cDNA为模板用扩增引物对进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物与pLB-Simple载体连接、热击、转化大肠杆菌，将得到的转化物在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到阳性克隆，提取得到质粒；

2)将所述步骤1)得到的质粒经XmaI和XbaI双酶切，得到OsGASR9基因；将pC1300Actin-3×Flag载体经Xma I和Xba I双酶切，得到酶切载体；将所述OsGASR9基因和酶切载体经T4连接酶连接，得到表达载体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述步骤1)PCR使用的体系每50μL包括：2×GC Buffer 25μL、10mM dNTP Mix 4μL、浓度为10μmol/L的扩增上游引物1μL、浓度为10μmol/L的扩增下游引物1μL、cDNA模板2μL、5U/μL的高保真Taq酶0.5μL和ddH₂O 16.5μL。

8.根据权利要求6或7所述的表达载体，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min。

9.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述步骤2)连接的体系每10μL包括：OsGASR9基因6μL、酶切载体2μL、10х连接Buffer 1μL和T4连接酶1μL。

10.一种培育转基因水稻的方法，其特征在于，将权利要求4～8任一项所述的表达载体转化根癌农杆菌，将转化后的根癌农杆菌转化水稻，得到转基因水稻。