CN109553667B

CN109553667B - 烟草kup2基因及应用

Info

Publication number: CN109553667B
Application number: CN201811355451.1A
Authority: CN
Inventors: 张洁; 任学良; 李立芹; 鲁黎明; 王仁刚; 王自力
Original assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2038-11-14
Also published as: CN109553667A

Abstract

本发明涉及烟草KUP2基因及应用。所述烟草KUP2基因及其编码蛋白质的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明首次从烟草中克隆得到KUP2基因并通过酵母功能互补实验验证了该基因的生物学功能，烟草KUP2基因具有促进钾离子吸收和转运的功能。

Description

烟草KUP2基因及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及烟草KUP2基因及应用。

背景技术

钾转运体是一种能在外界钾离子浓度极低时将钾离子转运至细胞内的载体蛋白。钾转运体通常是一些跨膜蛋白，通过构象变化完成钾离子的跨膜转运，是一种需要ATP提供能量的主动运输过程，通常是K⁺/H⁺或K⁺/Na⁺协同运输。

现有技术对于钾转运体基因的研究在模式植物拟南芥中比较广泛，例如，研究表明拟南芥突变体kup6较野生型植株在干旱胁迫下的存活率降低，而35S::KUP6过表达转基因植株耐旱能力却得到了明显增强(Shabala et al.,2007)；而KUP7基因的突变体幼苗在低钾胁迫下表现出叶片黄化的低钾敏感表型，其根部的钾离子含量显著下降，KUP7基因功能的缺失使拟南芥幼苗在低钾条件下对钾的吸收能力降低、木质部汁液中钾离子浓度降低(Min et al.,2016)。

烟草是一种耗钾量很大的作物，烟叶钾含量是衡量烟叶品质的的重要指标，目前，对于烟草中钾转运体基因的研究较少，烟草KUP基因的功能未知。

发明内容

本发明的目的是提供烟草KUP2基因及其编码的蛋白质。

本发明的另一目的是提供烟草KUP2基因的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的烟草KUP2基因，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

本发明烟草KUP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因全长2310bp。本发明采用如下方法克隆得到烟草KUP2基因：

①在进行KUP2基因PCR扩增之前，提取烟草细胞总RNA，并将提取得到的总RNA反转录为cDNA。在本发明中，所述的烟草细胞总RNA的提取采用本领域常用的提取细胞总RNA的技术方案即可，本发明的实施例中具体的可采用Trizol法。在本发明中，所述的烟草细胞总RNA提取的原料为烟草的新鲜叶片，所述烟草采用为本领域常规的烟草品种，如K326。

②在提取得到烟草细胞总RNA后，将所述烟草细胞总RNA反转录合成cDNA。在本发明中，所述的cDNA的合成采用本领域常规的cDNA的合成方法即可，无其他特殊要求；具体的本发明实施例中采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒完成cDNA的合成。

③在得到cDNA之后，进行KUP2基因PCR扩增，得到目的片段。在本发明中，所述KUP2基因PCR扩增的体系优选为20μL体系，包括Premix ExTaq 10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，烟草细胞cDNA 1μL，ddH₂O 8μL。在本发明中，所述KUP2基因的PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35个循环。

④在KUP2基因PCR扩增得到目的片段后，将所述目的片段进行测序，得到KUP2基因。本发明在所述的PCR扩增后优选的对目的片段进行纯化，本发明对所述纯化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DNA纯化试剂盒进行即可。

⑤纯化完成后，优选将所述纯化后的目的片段导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行菌落PCR，验证为阳性克隆后进行测序。本发明在得到阳性克隆后，优选采用菌落PCR的方法来验证阳性克隆。在本发明中，所述菌落PCR的所述的正向引物核苷酸序列为：5'-ATGGATATTGAAAGTTGGG-3'(SEQ ID NO:3)；所述反向引物的核苷酸序列为5'-TTATACATGGTAAATCATTC-3'(SEQ ID NO:4)，所述菌落PCR的体系为10μL，包括Premix ExTaq5μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，ddH₂O 4μL。在本发明中，所述的将纯化后的目的片段导入大肠杆菌DH5α感受态细胞所采用的方法为本领域常规的转化大肠杆菌感受态细胞的方法，具体如下：将所述目的片段与pMD19-T载体在16℃的条件下连接10～14h，得到连接产物；将所述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到转化后的大肠杆菌DH5α；将所述的转化后的大肠杆菌DH5α接种于涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选培养，得到阳性克隆。

⑥在菌落PCR验证阳性克隆后，优选的，从已验证的阳性克隆中随机选取2～4个独立的阳性克隆进行测序，得到所述烟草KUP2基因的序列。

本发明还提供含有所述烟草KUP2基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系。

本发明还提供所述烟草KUP2基因或含有该基因的生物材料在促进植物或微生物钾离子吸收和转运中的应用。

本发明所述植物包括但不限于烟草、拟南芥。所述微生物包括但不限于酵母。

本发明还提供所述烟草KUP2基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供所述烟草KUP2基因或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用。所述育种的目的为促进植物钾离子吸收和转运。

优选地，将所述烟草KUP2基因转入到烟草植株中，使烟草KUP2基因超量表达以提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。更优选地，采用农杆菌介导法将烟草KUP2基因转入到烟草植株中，获得KUP2基因过表达的转基因植株。

本发明还提供用于扩增烟草KUP2基因的特异性PCR引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。该引物对是以GenBank：NM_001349001.1为参考序列，使用软件primer 5设计得到的。

本发明还提供一种促进植物钾离子吸收和转运的方法，所述方法为:

1)使植物包含所述烟草KUP2基因；或者，

2)使植物过表达所述烟草KUP2基因。

所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

本发明首次从烟草中克隆得到KUP2基因并通过酵母功能互补实验验证了该基因的生物学功能，将烟草KUP2基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后的重组酵母具有钾离子吸收，转运功能。因此，本发明提供的烟草KUP2基因具有促进钾离子吸收和转运的功能。

附图说明

图1为本发明实施例2中酵母功能互补实验结果。其中，A：培养基中钾离子浓度为20uM，B：培养基中钾离子浓度为2mM。图中，1为转入烟草KUP2基因的重组酵母，2为阴性对照组(转入空载体)，3为阳性对照组(转入拟南芥AtAKT1基因)的重组酵母；从左到右依次为菌原液、10倍稀释液、100倍稀释液在培养基上的生长结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1烟草KUP2基因的克隆

取0.5g烟草(烟草品种为K326)新鲜叶片，采用Trizol法提取烟草细胞的总RNA，然后采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA，进一步采用Primer5.0软件设计并经过人工优化得到引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物核苷酸序列为：5'-ATGGATATTGAAAGTTGGG-3'；所述反向引物的核苷酸序列为5'-TTATACATGGTAAATCATTC-3'，以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为为20μL体系，包括Premix ExTaq 10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，烟草细胞cDNA 1μL，ddH₂O 8μL；所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35个循环。

PCR扩增完成后，使用DNA纯化试剂盒进行目的片段的纯化，将纯化后的目的片段与pMD19-T载体16℃连接12h得到连接产物，将所述得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞得到转化后的大肠杆菌DH5α，将所述的转化后的大肠杆菌DH5α接种于涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选培养得到阳性克隆。在得到阳性克隆后，采用菌落PCR的方法来验证阳性克隆，所述菌落PCR的正向引物为：5'-ATGGATATTGAAAGTTGGG-3'；反向引物为5'-TTATACATGGTAAATCATTC-3'；所述菌落PCR的体系为10μL，包括Premix ExTaq 5μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，ddH₂O 4μL。然后从已验证的阳性克隆中随机选取3个独立的阳性克隆送到生物技术公司进行测序，经测序得到烟草KUP2基因的序列如SEQ IDNO:1所示。

实施例2烟草KUP2基因的生物学功能分析

1、实验目的

通过酵母功能互补实验验证烟草KUP2基因的生物学功能。

2、实验方法

以钾吸收缺陷型酵母突变株R5421作为受体菌。菌株R5421可参见Maathuis F J Mand Sanders D 1996Mechanisms of potassium absorption by higher plantroots.Physiol.Plant.96,158–168.

将连接有实施例1烟草KUP2基因的T-载体与表达载体P416(酵母游离型穿梭表达载体，TEF组成型启动子，CYC1终止子，CEN6ARSH4复制起点，酵母中筛选标记为URA3，大肠杆菌中筛选标记为Amp。载体P416可参见Functional Expression of aω-3Fatty AcidDesaturase Gene from Glycine max in Saccharomyces cerevisiae)分别进行双酶切(酶切位点为XbaⅠ和XhoⅠ)，回收目的基因和表达载体P416，然后用连接酶连接，将连接后的重组酵母表达载体转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞，对转化后的大肠杆菌单菌落进行PCR扩增、酶切来验证是否构建成功。

将构建成功的重组酵母表达载体转入到酵母R5421中具体步骤如下：用接菌环取保存的R5421酵母菌划线于固体培养基YPDA上，28℃培养12h；挑取R5421酵母单菌落于Ep管中，加1mL YPDA培养液涡旋；将上述菌液全部转入装有YPDA培养液的三角瓶中，于30℃，250rpm摇菌至OD₆₀₀＝1.2，16h；按1:10体积比转接，摇至OD₆₀₀＝1.0～1.2；于28℃，1000rpm离心5min集菌，用1/2体积的灭菌超纯水重悬；于28℃，1000rpm离心5min集菌，吸干上清；依次加入下列成分(每5mL原始菌液)：

涡旋1min，使转化体系完全混匀；置于30℃的水浴中温育30min；再放入42℃的水浴中热击28min，冰上冷却10min；7000rpm离心15s，弃上清；用1mL的无菌水轻轻重悬沉淀；取200μL转化混合物铺于营养缺陷型平板上；30℃培养3天。提取酵母质粒并鉴定转化结果。

3、实验结果

实验结果如图1所示，在钾离子浓度为20uM、2mM培养基(AP培养基(1L)：磷酸546μL，L-精氨酸1.742g，1000×维生素溶液1mL，1000×微量元素溶液1mL，尿嘧啶0.77g，100×Ura 10mL，葡萄糖20g，琼脂粉15g)上，阴性对照组酵母菌(转入P416空载体)几乎不生长，转入烟草KUP2基因的重组酵母和阳性对照组(转入拟南芥AtAKT1基因)的重组酵母菌均可以生长。随着稀释倍数的增加，转入烟草KUP2基因的重组酵母和阳性对照组的重组酵母菌仍然可以生长。以上结果证明，本发明的烟草KUP2基因具有钾吸收和转运功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 贵州省烟草科学研究院

<120> 烟草KUP2基因及应用

<130> KHP171117865.7

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2310

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 1

atggatattg aaagttgggg tcgtgaaaat ccaataaaga aagaatcttg gaggacagtt 60

ttagccttag cttatcagag tttaggtgtg gtgtatggag atttgagcac ttcacctttg 120

tatgtataca agagcacatt tgcagaggat attcatcatt cagagtctaa tgacgagata 180

tttggagttt tatcatttgt gttttggaca ttaactctta ttccattgct taaatatgtg 240

ttcatagtat taagagctga tgataatggt gaaggtggga cttttgcctt gtattcctta 300

ttgtgccgtc atgcccgtgt cagtactttg cctaatggcc aattggctga tgaggattta 360

tatgagtaca agaatgatag aaatttgtca gctgatagga ttggaatgag cttgaaatca 420

actcttgaga aacacagatt tttgaagaaa attttgctca ttttagcttt gattgggact 480

tgtatggtta ttggtgatgg agtccttact cctgcaatct cagtgttctc tgctgtctct 540

ggacttgaac tttcaatggc aaagcatcat caccaatatg tagaagttcc agttgcttgt 600

gtgatactcg tgttcttatt ttttctccaa cactatggga cgcatcgaat aggatttcta 660

tttgcaccga ttgtgattac gtggcttttg tgcattagtg caattgggtt atacaacatc 720

ttcctctgga accctcatgt ttaccaagca ttatctcctt actacatgta caaattcttg 780

aagaagaccc aaagaggagg atggatgtcc ctcggtggga ttttattatg tataacaggt 840

tcagaagcta tgtttgctga tcttggacac ttttcgcagc tgtctattca gatagctttt 900

acgtttgttg tctacccgtc attaattctt gcttatatgg gacaagctgc gtatctttcc 960

aagcatcatg ttatccaagg tgattaccac attgggttct atgtatcagt gcctgaaaaa 1020

ctacggtatc ctgttctggc tattgcgata cttgctgcag tggttggaag ccaggccatc 1080

atcactggga cgttttccat aatcaagcaa tgctctgctt taggttgctt cccaagggtc 1140

aaaatagtac atacatcgtc taaaatccat ggccagattt acattccaga gataaactgg 1200

acgttgatgt tgctatgctt ggcagttact attggcttcc gtgacacgaa acacataagc 1260

aatgcatcag gtctggcagt tataactgtt atgctggtca ctacgtgctt tatgtctttg 1320

gtcattgtcc tgtgctggca caaaaacgtg ttactcgcca tttgctttat attcttcttt 1380

ggttccattg aagccctcta cttttcagct tccctaatca agttcctcga aggggcctgg 1440

gtaccaatcg ttctctcttt gatatttcta gttgtcatgt atagttggca ttacggcacc 1500

ctgaaaaagt acgagtttga tgttgaaaac aaaattccca tcaactggct gctcaccttg 1560

agtcccaacc tgggtattac acgggtccgt ggcattggcc tcatccacac cgagcttgtt 1620

tcaggaattc cagctatttt ctcacatttt gtcaccaacc tacctgcttt ccaccaggtt 1680

cttgttttcc tttgcatcaa gtccgtccca gtacctcacg tgagacctga agaaaggttc 1740

ttggtgggaa gaattggacc caaagagtac cgcgtctaca gatgtatagc acgatatggt 1800

tatcgagaca ttcacatgga cgacgtagag tttgaaaagg atctagtttg tagcatagct 1860

gaattcatcc gctcagaggg accagcacag agttttgaaa ctgttgaagg tatagacgac 1920

aacgaaaaac tgacagttat tggaacaact tcaacacatg ttgatggagt aacaatgtgc 1980

gaggatgtag acactaaaga tacagaaatg atcgagatca gttcaccaga agtgccaaga 2040

aagagagtga gatttctggt gccagagagt ccacaaatgg atttaagcgt tcgagcagag 2100

ttgcaagaac tgatggaagc gcgggaagca ggcatggcgt ttatacttgg acattgttat 2160

gtaagagcta aaaggggttc aagtttgata aaaaaactgg tggttgacat aggatatgac 2220

tttttgagaa ggaattgtcg cgggccaacc tatgcattga gcttccctcg tgcttcaact 2280

ttggaggttg gaatgattta ccatgtataa 2310

<210> 2

<211> 787

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 2

Met Asp Ile Asp Tyr Gly Lys Cys Trp Asp Thr Ser Lys Ser Trp Lys

1 5 10 15

Ser Thr Leu Ile Leu Ala Tyr Gln Ser Leu Gly Val Val Tyr Gly Asp

20 25 30

Leu Ser Ile Ser Pro Leu Tyr Val Tyr Lys Ser Thr Phe Ala Glu Asp

35 40 45

Ile His His Ser Glu Thr Asn Glu Glu Ile Phe Gly Val Leu Ser Phe

50 55 60

Val Phe Trp Thr Leu Thr Leu Val Pro Leu Phe Lys Tyr Val Phe Ile

65 70 75 80

Val Leu Arg Ala Asp Asp Asn Gly Glu Gly Gly Thr Phe Ala Leu Tyr

85 90 95

Ser Leu Ile Cys Arg His Ala Lys Val Ser Leu Leu Pro Asn Arg Gln

100 105 110

Val Ala Asp Glu Ala Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu His Pro Pro Glu

115 120 125

Thr Lys Asn Ser Ser Arg Val Lys Leu Leu Leu Glu Lys His Lys Phe

130 135 140

Leu His Thr Ala Leu Leu Ile Leu Val Leu Leu Gly Thr Cys Met Val

145 150 155 160

Ile Gly Asp Gly Leu Leu Thr Pro Ala Ile Ser Val Phe Ser Ala Val

165 170 175

Ser Gly Leu Glu Leu Ser Met Ser Arg Asp His His Gln Tyr Ala Val

180 185 190

Ile Pro Ile Thr Cys Phe Ile Leu Val Cys Leu Phe Ala Leu Gln His

195 200 205

Tyr Gly Thr His Arg Val Gly Phe Cys Phe Ala Pro Ile Val Leu Ile

210 215 220

Trp Leu Leu Cys Ile Ser Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Ile Ile His Trp

225 230 235 240

Asn Pro Leu Val Tyr Lys Ala Leu Ser Pro Tyr Tyr Met Val Lys Phe

245 250 255

Leu Lys Lys Thr Arg Lys Gly Gly Trp Met Ser Leu Gly Gly Ile Leu

260 265 270

Leu Cys Ile Thr Gly Ser Glu Ala Met Phe Ala Asp Leu Gly His Phe

275 280 285

Ser Tyr Ser Ala Ile Gln Ile Ala Phe Thr Phe Leu Val Tyr Pro Ala

290 295 300

Leu Ile Leu Ala Tyr Met Gly Gln Ala Ala Phe Leu Ser Lys His His

305 310 315 320

His Thr Ile His Lys Ile Gly Phe Tyr Val Ser Val Pro Asp Cys Val

325 330 335

Arg Trp Pro Val Leu Val Ile Ala Ile Leu Ala Ser Val Val Gly Ser

340 345 350

Gln Ala Ile Ile Ser Gly Thr Phe Ser Ile Ile Asn Gln Ser Gln Ser

355 360 365

Leu Gly Cys Phe Pro Arg Val Lys Val Val His Thr Ser Ala Lys Ile

370 375 380

His Gly Gln Ile Tyr Ile Pro Glu Ile Asn Trp Ile Leu Met Ile Leu

385 390 395 400

Cys Val Ala Val Thr Ile Gly Phe Arg Asp Thr Lys His Met Gly Asn

405 410 415

Ala Ser Gly Leu Ala Val Met Ala Val Met Leu Val Thr Thr Cys Leu

420 425 430

Thr Ser Leu Val Ile Ile Leu Cys Trp Asn Lys Pro Pro Ile Leu Ala

435 440 445

Leu Gly Phe Leu Leu Leu Phe Gly Ser Ile Glu Leu Leu Tyr Phe Ser

450 455 460

Ala Ser Val Ile Lys Phe Leu Glu Gly Ala Trp Leu Pro Ile Leu Leu

465 470 475 480

Ala Leu Phe Leu Val Thr Val Met Phe Val Trp His Tyr Ala Thr Val

485 490 495

Lys Lys Tyr Glu Tyr Asp Leu His Asn Lys Val Ser Leu Glu Trp Leu

500 505 510

Leu Ala Leu Gly Pro Ser Leu Gly Ile Thr Arg Val Pro Gly Ile Gly

515 520 525

Leu Val Phe Thr Asp Leu Thr Ser Gly Ile Pro Ala Asn Phe Ser Arg

530 535 540

Phe Val Thr Asn Leu Pro Ala Tyr His Arg Ile Leu Val Phe Val Cys

545 550 555 560

Val Lys Ser Val Pro Val Pro Phe Val Pro Pro Ala Glu Arg Tyr Leu

565 570 575

Val Gly Arg Val Gly Pro Ala Ala His Arg Ser Tyr Arg Cys Ile Val

580 585 590

Arg Tyr Gly Tyr Arg Asp Val His Gln Asp Val Asp Ser Phe Glu Ser

595 600 605

Glu Leu Val Ser Lys Leu Ala Asp Phe Ile Arg Tyr Asp Trp Tyr Lys

610 615 620

Thr His Gly Ile Ile Asp Asn Glu Asp Asp Gly Ser Arg Ser Gly Ala

625 630 635 640

Ser Ser Gly Glu Cys Arg Leu Thr Val Ile Gly Thr Leu Ala Phe Ser

645 650 655

Gly Thr Pro Ala Phe Glu Leu Glu Asp Asn Val Gln Leu Ala Ser Val

660 665 670

Ser Val Gly Phe Pro Thr Ala Glu Ser Val Thr Asp Val Ile Glu Met

675 680 685

Arg Pro Val Glu Arg Arg Val Arg Phe Ala Ile Asp Asn Glu Ser Glu

690 695 700

Val Asp Ser Arg Glu Glu Met Asp Thr Gln Leu Gln Glu Glu Leu Glu

705 710 715 720

Asp Leu Tyr Ala Ala Gln Gln Ala Gly Thr Ala Phe Val Leu Gly His

725 730 735

Ser His Val Lys Ala Lys Gln Gly Ser Ser Met Leu Lys Arg Leu Ala

740 745 750

Ile Asn Tyr Gly Tyr Asn Phe Leu Arg Arg Asn Cys Arg Gly Ala Asp

755 760 765

Val Ser Leu Lys Val Pro Pro Ala Ser Leu Leu Glu Val Gly Met Val

770 775 780

Tyr Ile Val

785

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggatattg aaagttggg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttatacatgg taaatcattc 20

Claims

1.烟草KUP2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含有权利要求1所述基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。

3.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在促进酵母钾离子吸收和转运中的应用。