CN107435047B

CN107435047B - 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用

Info

Publication number: CN107435047B
Application number: CN201710698636.1A
Authority: CN
Inventors: 田江; 薛迎斌; 朱胜男
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2037-08-15
Also published as: CN107435047A

Abstract

本发明公开了一种植物磷信号网络中关键调控基因GmPHR25的克隆与应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明研究显示，超量表达GmPHR25可增加高低磷处理下的大豆离体毛根与复合植株的可溶性磷与总磷浓度，而且在低磷条件下提高了生物量，在高磷条件下降低了离体毛根与复合植株的生物量。因此，GmPHR25可以调控基因大豆生长和其体内磷动态平衡，对植物适应低磷胁迫具有重要作用；可以用于通过转基因技术调控植物对土壤中低磷胁迫的适应能力，还能用于豆科作物适应酸性土壤的遗传改良，具有十分重要的市场前景。

Description

一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。更具体地，涉及一种植物磷信号网络中耐低磷关键调控基因GmPHR25及其与应用。

背景技术

磷是植物生长发育过程中所必需的一个重要营养元素，参与了植物细胞多个生理生化和代谢过程（Vance et al., 2003; Richardson et al., 2009）。但是，土壤中的磷主要是以难溶性无机磷和有机磷等形式存在，难以被植物直接吸收利用。土壤磷有效性低已成为限制作物生长与生产的一个重要因素（Beardsley, 2011; Veneklaas et al.,2012）。而为了维持作物产量，农业生产中大量地施用磷肥导致了严重的环境污染；同时，据预测，磷矿石资源在未来不久也将消耗殆尽。因此，通过遗传改良的手段，提高作物自身的磷效率被认为是发展可持续性农业的重要途径（Shen et al., 2011; Tian et al.,2012;Veneklaas et al., 2012; Wu et al., 2013）。

植物在长期进化中形成了一套应对低磷胁迫的机制，例如：改变根的形态构型，增加有机酸和酸性磷酸酶的分泌，与菌根真菌或根瘤菌形成共生结构等（Liao et al.,2001; Liang et al., 2010; Wang et al., 2010; Tian et al., 2012）。研究表明，这些机制是由一系列低磷响应基因调控的，相互之间形成了一个复杂的磷信号网络。

以往的研究表明，含有MYB-CC结构域的转录因子PHR1（Phosphate StarvationResponse 1）家族成员被认为是磷信号途径的关键调控因子（Chiou and Lin, 2011;Liang et al., 2013; Sun et al., 2015），其成员在磷信号网络中的功能陆续被报道。首个低磷响应的MYB-CC型转录因子CrPSR1是在单细胞衣藻Chlamydomonasreinhardtii中被发现的（Wykoff et al., 1999）。2001年在拟南芥中克隆出CrPSR1的同源基因AtPHR1（Rubio et al., 2001），能够正调控低磷响应相关基因，phr1突变体表现出花青素积累减少，可溶性磷浓度及根冠比下降（Rubio et al., 2001; Bustos et al., 2010）。另外，在拟南芥中超量表达AtPHR1显著增加植株的可溶性磷浓度，同时，超量表达AtPHR1显著增加一系列磷饥饿响应基因的转录本，如miR399，RNase 1 and PHOSPHATE TRANSPORTER 1-7（Nilsson et al., 2007）。目前已证实miR399，PHO2和PHT位于PHR1基因下游，所形成的信号途径是磷信号网络中的一个重要分支。近年来，AtPHR1同源基因也相继被克隆出来，包括拟南芥AtPHL1和AtPHL2，水稻的OsPHR1，OsPHR2，OsPHR3和OsPHR4，小麦的ZmPHR1，菜豆的PvPHR（Valdés-lópez et al., 2008; Zhou et al., 2008; Busto et al., 2010; Wanget al., 2013a; Wang et al., 2013b; Guo et al., 2015; Sun et al., 2015; Ruanet al., 2017）。最近的研究证明，拟南芥AtSPX1、AtSPX2及水稻OsSPX1、OsSPX2、OsSPX4是磷信号途径中的负调控因子，能够负调控AtPHR1和OsPHR2与P1BS（PHR1-bindingsequence: GNATATNC）元件的结合（Lv et al., 2014; Puga et al., 2014; Wang et al., 2014; Zhou et al., 2015）。而且，OsSPX1也参与了磷动态平衡的调节，在磷充足情况下，超量表达OsSPX1的植株生长矮小，并且在叶部出现磷中毒斑点（Wang et al.,2009a; Wang et al., 2009b）。

大豆营养含量高，是世界上最重要的粮油作物之一（Herridge et al., 2008）。随着生物技术的发展，模式植物拟南芥和水稻中的磷信号网络已经逐渐清晰，但豆科作物的磷信号网络却鲜有报道。通过转录组学研究，已有报道证实，在低磷条件下，大豆中多个基因家族的表达量明显上调，包括：GmEXPBs，GmPAPs，GmPTs和GmSPXs等家族成员。其中，扩张蛋白（β-expansin）是一类细胞壁松弛蛋白，其家族成员中GmEXPB2的表达在磷缺乏的大豆根系中明显上调，在拟南芥中超量表达GmEXPB2，表现出根系生长与磷吸收都有所增加。此外，GmPT5作为一个高亲和磷转运子，主要在根瘤中表达，在维持根瘤磷平衡中发挥着重要的作用（Qin et al., 2012b）。在大豆中GmPHRs家族有35个成员，但是目前尚未有关于大豆GmPHR参与磷信号网络的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有植物磷信号网络关键基因的研究不足，提供一种磷信号网络关键调控转录因子基因。本发明通过实时荧光定量PCR方法，鉴定了一个低磷增强表达的基因GmPHR25，该基因的表达受外源磷浓度的调控。通过大豆离体毛根转化和下胚轴转基因技术试验，结果表明GmPHR25基因具有调控大豆根系生长和维持大豆体内磷动态平衡的功能。

本发明的目的是提供一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25。

本发明另一目的是提供所述基因GmPHR25的编码蛋白。

本发明再一目的是提供所述基因GmPHR25在调控大豆生长及磷动态平衡方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明公开了一种植物磷信号网络中耐低磷胁迫基因GmPHR25，是一种植物磷信号途径关键基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述基因GmPHR25编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种含有所述基因GmPHR25的表达载体，以及含有该所述表达载体的基因工程菌，也都应在本发明的保护范围之内。

上述含有GmPHR25基因的表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有GmPHR25基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如pYLRNAi (由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见文献：胡旭霞和刘耀光，2006，分子植物育种)或其它衍生植物表达载体。

本发明还涉及细胞，其包含本发明的GmPHR25基因或重组载体。所述细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，例如酵母细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。

本发明还涉及植物或者植物部分，植物材料，植物种子，其包含本发明的细胞。所述植物可以是豆科植物，例如菜豆和大豆，也可以是其它植物，例如单子叶植物如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦、或黑麦等，或者其他双子叶植物如烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯、番茄等。

本发明研究发现，GmPHR25是在大豆叶部与根部显著受低磷增强表达的基因，基因GmPHR25和蛋白质能够调控包含它的转基因根系的生长和磷的动态平衡。

因此，所述耐低磷胁迫基因GmPHR25在调控植物生长及磷动态平衡方面的应用也在本发明的保护范围之内。

优选地，具体是指在低磷胁迫下调控植物生长及磷动态平衡。

另外，所述耐低磷胁迫基因GmPHR25或包含该基因的表达载体在制备转基因植物中的应用，以及在制备促进植物适应酸性土壤的制剂方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述转基因植物是指能够耐低磷胁迫的转基因植物。

优选地，所述植物为双子叶植物。

更优选地，所述双子叶植物为豆科作物。

更优选地，所述豆科作物为大豆。

因此，本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括：从本发明的植物细胞再生转基因植物。

本发明还涉及GmPHR25基因或重组载体在调控植物根系生长和磷动态平衡中的用途，包括制备转基因植物以及制备促进植物适应酸性土壤的制剂。

本发明还涉及调控植物适应酸性土壤的方法，该方法包括制备含有本发明的GmPHR25基因或重组载体的植物。例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物。

本发明所提供的一个优选实施方案是：将包含上述基因GmPHR25的重组载体导入大豆离体毛根和大豆下胚轴转基因毛根中，得到大豆体外诱导再生离体毛根和下胚轴转基因复合植株株系；所述大豆离体毛根与下胚轴转基因复合植株株系的生长和磷浓度发生明显变化。

所述基因GmPHR25可以例如是通过所述重组表达载体导入受体大豆离体毛根和大豆下胚轴转基因复合植株中。携带有本发明的基因GmPHR25的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的转化法转化到大豆离体毛根中。携带有本发明的基因GmPHR25的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的转化法转化到烟草表皮细胞中。

本发明还提供了一种明确的构建耐低磷胁迫转基因植物的方法，是利用转基因技术将权利要求1所述基因GmPHR25重组入植物的基因组，进而获得耐低磷胁迫转基因植物。如：将本发明的基因GmPHR25通过发根农杆菌转入植物中，与其本身的基因组进行重组，诱导再生新的毛根，即得到耐低磷胁迫转基因植物根系，从而培育成新的转基因植株。

以大豆为例，获得耐低磷胁迫转基因大豆的方法为：运用上述包含基因GmPHR25的基因工程菌，侵染大豆子叶结或下胚轴，得到大豆体外诱导再生转基因离体毛根和下胚轴转基因复合植株。

具体地，作为一种可选择的实施案例，一种明确的构建耐低磷胁迫转基因大豆的方法，包括如下步骤：

1）种子的萌发：种子先用3%的H₂O₂消毒，然后播于MS培养基（同实施例中大豆离体毛根的获取）或石英砂中（同实施例中大豆下胚轴复合转基因株系的获取）进行萌发；

2）基因工程菌的准备：将包含基因GmPHR25的重组载体转入发根农杆菌K599，挑取阳性克隆进行液体或平板扩大培养，分别用于离体毛根和下胚轴复合转基因株系的获取；

3）侵染及诱导生根：MS培养基萌发的大豆用解剖刀切去胚根，然后将子叶连带胚轴用沾菌液的解剖刀轻轻纵切划出伤口，切口朝上置于湿润的灭菌滤纸上，光照培养3天，然后将子叶转移到毛根诱导培养基培养以获取离体毛根。对于砂培萌发的幼苗，用1毫升的注射器针头蘸取平板上长好的农杆菌菌体，在大豆下胚轴靠近子叶部位穿孔，并将菌体覆盖伤口，后移入营养液水培系统培养，约10天后可见毛根长出，剪掉主根，剔除非转基因毛根即可获得转基因复合植株。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次在豆科作物中克隆出基因GmPHR25，并研究发现该基因在豆科作物磷信号网络方面具有重要的作用。本发明研究显示，基因GmPHR25对大豆离体毛根根系生长和磷浓度有显著的影响，同时对下胚轴转基因复合植株的根系生长和磷浓度也有显著的影响，这对阐明PHR基因在豆科作物适应酸性土壤低磷胁迫的生物学功能有着重要意义。

本发明研究显示，超量表达GmPHR25可增加高低磷处理下的大豆离体毛根与复合植株的可溶性磷与总磷浓度，而且在低磷条件下提高了生物量，在高磷条件下降低了离体毛根与复合植株的生物量。因此，GmPHR25可以调控基因大豆生长和其体内磷动态平衡，对植物适应低磷胁迫具有重要作用；可以用于通过转基因技术调控植物对土壤中低磷胁迫的适应能力，还能用于豆科作物适应酸性土壤的遗传改良，具有十分重要的市场前景。

基因GmPHR25不仅影响了根系生长和磷浓度，超量表达该基因还增强了一系列低磷响应基因的表达，该基因的功能研究对于解析豆科作物适应低磷胁迫的分子机理有着深远的研究意义。

另外，本发明不仅在理论上具有十分重要的意义，而且还能用于豆科作物适应酸性土壤的遗传改良，可以通过转基因育种手段用于豆科作物的抗逆遗传改良，对植物营养学科的发展具有十分重要的作用，具有十分重要的市场前景。

附图说明

图1为大豆GmPHR25在叶部和根部对缺磷的响应；数据为四次重复的平均值与标准误；星号表示缺磷处理（-P）与正常磷处理（+P）之间差异显著（t-检验）。*：P<0.05，***：P<0.001。

图2为GmPHR25融合GFP蛋白在烟草叶片的亚细胞定位分析结果；图中第一排为转化空载体的烟草亚细胞定位图（35S:GFP），第二排为GmPHR25融合GFP蛋白在烟草叶片的亚细胞定位图（35S:GFP-GmPHR25）；图片分别为在激光共聚焦显微镜下绿色荧光通道（GFP）、红色荧光通道（细胞膜标记基因）和重叠后的图片（融合）观察拍摄的内容；标尺=20 µm。

图3为超量表达GmPHR25对转基因大豆离体毛根生长的影响；A，对照（control）与超量表达（OE）株系中GmPHR25基因的表达量；B，对照和超量表达GmPHR25转基因毛根在高低磷条件下的表型；C，对照和超量表达GmPHR25转基因毛根在高低磷处理下的干重；D，对照和超量表达GmPHR25转基因毛根在高低磷处理下的可溶性磷浓度；OE1和OE2代表两个不同的GmPHR25基因超量表达株系；control表示转化空载体的转基因株系；标尺= 1 cm；数据采用三次重复的平均值和标准误；星号表示超量表达株系（OE）与对照株系（control）之间差异显著（t-检验）。*：P<0.05。

图4为超量表达GmPHR25对大豆转基因复合植株生长的影响；A，转基因复合植株生长表型；B，GmPHR25在转基因毛根中的表达量；C，转基因复合植株的干重、全磷浓度、叶部可溶性磷浓度及根部可溶性磷浓度；标尺= 10 cm；数据采用六次重复的平均值和标准误；星号表示超量表达株系（OE）与对照株系（control）之间差异显著（t-检验）；*：P<0.05。

图5为超量表达GmPHR25对大豆磷转运子基因GmPTs表达的影响；OE表示超量表达GmPHR25转基因株系；control表示转化空载体的转基因系；数据采用六次重复的平均值和标准误；星号表示超量表达株系（OE）与对照株系（control）之间差异显著（t-检验）；*：P<0.05。

图6为超量表达GmPHR25对磷饥饿响应基因表达的影响；OE表示超量表达GmPHR25转基因株系；control表示转化空载体的转基因系；数据采用六次重复的平均值和标准误；星号表示超量表达株系（OE）与对照株系（control）之间差异显著（t-检验）；*：P<0.05。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 GmPHR25基因克隆及载体构建

1、超量（OE-GmPHR25-pYL）表达载体的构建

（1）设计GmPHR25基因特异引物OE-GmPHR25-pYL-F和OE-GmPHR25-pYL-R：

引物OE-GmPHR25-pYL-F（SEQ ID NO.3）：

5’-GAGCTCATGTATCATTCAAAGAATGTTCCTAG-3’

引物OE-GmPHR25-pYL-R（SEQ ID NO.4）：

5’-GACGTCTCACAGATTACCGCCACC-3’。

（2）PCR扩增：以大豆基因型YC03-3缺磷处理根系cDNA为模板，用基因特异引物OE-GmPHR25-pYL-F（SEQ ID NO.3）和OE-GmPHR25-pYL-R （SEQ ID NO.4）扩增出GmPHR25编码区片段。PCR反应体系为50微升，包含5微升的10×LaTaq Buffer，4微升2.5毫摩尔/升的dNTP，3微升的cDNA模板，10微摩尔/升的正反向引物各1微升，La Taq酶0.5微升，最后用双蒸水补足至50微升。反应条件为：94℃，3分钟（预变性）；94℃，30秒（变性）；58℃，30秒（复性）；72℃，1分钟（延伸）；重复35个循环的变性-复性-延伸；72℃，10分钟。

（3）将PCR扩增所得片断插入pMD18-T载体，在16℃连接6小时后转化DH10B并涂板，37℃培养12小时后将阳性克隆摇菌，抽提得到重组质粒。用Sac I和PstI双酶切重组质粒和pYLRNAi载体，回收酶切片段，将目的基因片段和载体片段用连接试剂盒在16℃，进行连接反应，6小时后，将获得的重组质粒OE-GmPHR25-pYL转化DH10B，12小时后将阳性克隆摇菌，送样测序无误后抽提质粒在-20℃保存待用。

2、亚细胞定位分析表达载体的构建：

（1）设计特异引物GFP-GmPHR25-F和GFP-GmPHR25-R：

引物GFP-GmPHR25-F（SEQ ID NO.5）：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTATCATTCAAAGAATGTTCCTA-3’

引物GFP-GmPHR25-R（SEQ ID NO.6）：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAGCTGGGTCTCACAGATTACCGCCACC-3’

（2）PCR扩增：以大豆基因型YC03-3低磷处理的根系cDNA为模板，用基因特异引物GFP-GmPHR25-F（SEQ ID NO.5）和GFP-GmPHR25-R （SEQ ID NO.6）对大豆GmPHR25基因ORF全长进行扩增。反应条件为94℃，3分钟（预变性）；94℃，30秒（变性）；60℃，30秒（复性）；72℃，1分钟（延伸）；重复35个循环的变性-复性-延伸；72℃，10分钟。

（3）PCR扩增的产物通过凝胶电泳，利用试剂盒进行回收纯化。获得纯化PCR产物后，与pDONR207进行重组反应。反应体系为10微升，包含PCR产物150纳克，pDONR207载体质粒150纳克，用TE Buffer（pH=8.0）补足至8微升，再加入BP酶2微升。将试剂混合物于25℃反应1小时。然后加入1微升蛋白酶K，37℃反应10分钟。待反应结束，将获得的pDONR207- GmPHR25质粒转化大肠杆菌并进行测序，无误后提取质粒。将pDONR207-GmPHR25的质粒与pMDC43载体质粒进行重组反应，反应体系为10微升，包含pDONR207-GmPHR25的质粒150纳克，pMDC43载体质粒150纳克，用TE Buffer（pH=8.0）补足至8微升，再加入LR酶2微升。将试剂混合物于25℃反应1小时。下一步加入1微升蛋白酶K，37℃反应10分钟。待反应结束将获得的pMDC43-GmPHR25质粒转化大肠杆菌并进行测序，无误后提取质粒。将pMDC43-GmPHR25质粒转化农杆菌GV3101，检测无误后保存备用。

3、本发明获得一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25，是一种植物磷信号途径关键基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因GmPHR25编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2 GmPHR25基因表达模式及蛋白亚细胞定位分析

1、GmPHR25基因的表达模式分析

（1）实验方法

挑选种皮无破损，大小均一的YC03-3种子，用3%过氧化氢（H₂O₂）表面消毒一分钟，随后用去离子水冲洗2次，用1/4 Hoagland营养液浸泡半小时，进行纸培催芽。5天后，转移到大豆完全营养液（+P）和缺磷营养液（-P）中。处理14天后收取完全展开的新叶以及根部样品，提取总RNA进行定量PCR分析。

荧光定量PCR参照SYBR Green （Promega, USA）定量试剂盒说明书的方法进行，用Rotor-Gene 3000 qRT-PCR系统（Corbett Research，澳大利亚）运行。将cDNA样品稀释50倍作为qRT-PCR反应模板，选取多个待测基因一定会表达的cDNA原液稀释4倍作为1倍标样制作标准曲线。反应体系为20微升，包括2×SYBR Green PCR master mix 10微升，Mili-Q水7微升，浓度为10微摩尔/升的正反向引物各0.5微升，稀释的cDNA模板2微升。反应程序为，95℃变性1分钟；然后进行40次循环的94℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 30秒。用Real-TimeAnalysis Software 6.0（Corbett Research，澳大利亚）计算分析每个样品的表达量。大豆的看家基因（Glyma.17G186600）EF1-a-F（SEQ ID NO.7）和EF1-a-R（SEQ ID NO.8）作为内参。大豆GmPHR25定量引物为：GmPHR25-RT-F (SEQ ID NO.9)和GmPHR25-RT-R (SEQ IDNO.10)。

大豆的看家基因EF1-a-F（SEQ ID NO.7）：

5’-TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3’

大豆的看家基因EF1-a-R（SEQ ID NO.8）：

5’-CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3’

定量引物GmPHR25-RT-F（SEQ ID NO.9）：

5’- AAAGGCCGACAAGAAAGAAACAGG -3’

定量引物GmPHR25-RT-R（SEQ ID NO.10）：

5’- AACCACCGCTACAGCACCAGAAC -3’

（2）结果如图1所示。幼苗分别在正常营养液及缺磷营养液中生长至14天，进行收样，收取新叶，根部样品，提取RNA进行定量PCR分析。

从图1可以看出，GmPHR25在大豆叶部和根部受缺磷处理上调表达。与正常供磷处理（+P）相比，缺磷（-P）条件下GmPHR25的表达量在叶部增加了16倍，在根部增加了2倍，差异显著。

2、GmPHR25亚细胞定位分析

通过农杆菌侵染法，将装载pMDC43-GmPHR25载体和pMDC43空载体导入烟草表皮细胞中进行瞬时表达。然后用激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞的GFP荧光信号。

结果如图2所示。由结果可知，35S：GFP-GmPHR25的荧光主要分布于细胞核中，说明GmPHR25蛋白定位于细胞核中。

实施例3 转基因材料的研究

1、转基因材料的获得

（1）大豆离体毛根的获取

将构建好的超量表达OE-GmPHR25-pYL载体以及空载体质粒用冻融法转入发根农杆菌K599。挑取阳性克隆接种于含相应抗性的YEP培养液，28℃，200 rpm培养16小时。将在MS培养基上萌发4天的大豆用沾有菌液的解剖刀切去胚根，留约3 mm胚轴并用手术刀从中间一分为二，然后将子叶连带胚轴用沾菌液的解剖刀轻轻纵切划出伤口。子叶切口朝上置于湿润的灭菌滤纸上，于25℃光照培养3天。然后将子叶转移到毛根诱导培养基培养。毛根长出后，将长度大于1 cm的毛根切下转移到毛根生长培养基，每周继代一次。

（2）大豆下胚轴复合转基因株系的获取

将构建好的转基因载体OE-GmPHR25-pYL以及空载体转化农杆菌K599后，通过下胚轴毛根转化的方法获得转基因的毛状根，地上部分为野生型，方法参照Kereszt等（2007）并根据实际条件稍作修改，具体操作如下：取适量饱满均匀大豆种子，用3%过氧化氢（H₂O₂）表面消毒一分钟，随后用去离子水冲洗2次，之后播于营养液润湿的石英砂中萌发。准备农杆菌，将冻存农杆菌取出划板活化，然后挑取单克隆重新划板培养，长出菌体后用涂布棒涂满整个培养皿继续培养。种子萌发5天后待豆苗长出，子叶还未张开时，用于扎针，用1毫升的注射器针头蘸取培养好的农杆菌菌体，在大豆下胚轴靠近子叶部位穿孔，并将菌体覆盖伤口。将注射菌体的幼苗移入水培系统，每天在伤口周围喷水保持湿润，约10天后可见毛根长出，待毛根长度约10厘米后可剪掉主根，恢复2-3天后可做相应的试验处理。

2、转基因材料的检测

转基因大豆离体毛根与下胚轴复合植株转基因毛根的检测：提取获得的转基因系毛根的总RNA，反转录成cDNA后，用定量PCR检测GmPHR25的表达量。大豆看家基因EF1-a作为参照基因，相对表达量为目的基因GmPHR25的表达量与看家基因表达量的比值。

反应体系为：20微升，包括2×SYBR Green PCR master mix 10微升，Mili-Q水7微升，浓度为10微摩尔/升的正反向引物各0.5微升，稀释的cDNA模板2微升。反应程序为，95℃变性1分钟；然后进行40次循环的94℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 30秒。GmPHR25在转基因毛根的表达量检测结果表明GmPHR25在转基因毛根中已经被显著地超量表达。

3、GmPHR25功能分析

（1）超量表达GmPHR25对大豆转基因离体毛根生长的影响

在进行不同磷浓度处理时，接种约0.2 克鲜重的转基因毛根到正常供磷+P（1.25mM KH₂PO₄）或者缺磷-P（0 μM KH₂PO₄）的MS培养基中培养。每周继代一次，培养14天后收样，测定转基因毛根的干重及可溶性磷浓度。每个处理设置三个独立的生物学重复。

结果如图3所示，超量表达GmPHR25显著影响大豆离体毛根的生长与磷浓度。在磷充足（+P）的条件下，超量表达GmPHR25大豆离体毛根转基因株系（OE）的毛根干重与对照株系（control）相比减少了37%到57%；在磷缺乏（-P）条件下，超量表达GmPHR25的大豆离体毛根较对照组增加了80%到170%。不同于干重的变化，超量表达GmPHR25的转基因毛根的可溶性磷浓度在正常供磷和缺磷磷处理条件下都显著增加。与对照株系（control）相比，超量表达GmPHR25转基因毛根（OE）的可溶性磷浓度在正常供磷（+P）和缺磷磷（-P）处理条件下分别增加了30%以及110%以上。这些结果表明，GmPHR25能够调控大豆离体毛根的生长与维持大豆毛根的磷平衡。

（2）超量表达GmPHR25对大豆转基因复合植株生长的影响

依据上述下胚轴注射法获得大豆转基因复合植株后，进行营养液水培处理，设置高磷（+P）500 μM的KH₂PO₄和低磷（-P）25 μM的KH₂PO₄两个处理，14天后，收取地上部分与地下部分的样品，测定干重、全磷浓度和可溶性全磷浓度。

结果如图4所示，在磷充足的条件下，超量表达GmPHR25的转基因复合植株（OE）与对照（control）相比，干重减少了56%，全磷浓度增加了23%；叶部和根部可溶性磷浓度分别增加了38%和52%。在磷饥饿条件下，与对照（control）相比，超量表达GmPHR25显著增加了复合植株的干重与叶部可溶性磷浓度。这些结果进一步表明GmPHR25能够调控大豆磷稳态，影响大豆生长。

（3）超量表达GmPHR25对大豆磷转运子GmPTs基因表达的影响

转基因复合植株在完全营养液中（即上述正常供磷（+P）处理下）生长14天后，收获根部样品，提取总RNA，进行定量PCR，检测GmPTs的表达量，分析超量表达GmPHR25对大豆14个高亲和磷转运子基因表达量的影响。

结果如图5所示，与对照（control）相比，除了GmPT1，GmPT3和GmPT13，其他的11个GmPTs成员的表达量在超量表达GmPHR25的毛根（OE）中均显著上调。这些结果说明超量表达GmPHR25能够调控GmPTs的表达，影响大豆磷的吸收和转运，从而调控大豆的磷营养。

大豆14个高亲和磷转运子基因的定量引物分别如下所示：

GmPT1-RT-F (SEQ ID NO.11)：5’- CAGGTTCTGGCTAGGGTTTG -3’

GmPT1-RT-R (SEQ ID NO.12)：5’- ACATAGTCAAATGCGGGGTC -3’

GmPT2-RT-F (SEQ ID NO.13)：5’- GACATAGCGCGAAATCTGTC -3’

GmPT2-RT-R (SEQ ID NO.14)：5’- CAAACACGGCCGCAATGAAG -3’

GmPT3-RT-F (SEQ ID NO.15)：5’- ACAAGAAGACAAGAGGGTCG -3’

GmPT3-RT-R (SEQ ID NO.16)：5’- AACCGAGCATGAGAATCAAC -3’

GmPT4-RT-F (SEQ ID NO.17)：5’- AGGTGCACCAAAGCCGGGAACT -3’

GmPT4-RT-R (SEQ ID NO.18)：5’- TGGCCATGACACCCTCTGCA -3’

GmPT5-RT-F (SEQ ID NO.19)：5’- GAACACTTTCAGGGCAACTC -3’

GmPT5-RT-R (SEQ ID NO.20)：5’- GTCATCACAGTCTTTGCATCG -3’

GmPT6-RT-F (SEQ ID NO.21)：5’- CTGCTCACATACTATTGGCGT -3’

GmPT6-RT-R (SEQ ID NO.22)：5’- GTCCAACAGGAACCAAGTAAC -3’

GmPT7-RT-F (SEQ ID NO.23)：5’- TGACCACAAGTACGATCTTCC -3’

GmPT7-RT-R (SEQ ID NO.24)：5’- CGCCAATAGTAGGTAAGAGCA -3’

GmPT8-RT-F (SEQ ID NO.25)：5’- TCATTTTCGCGGGTTTAGTC -3’

GmPT8-RT-R (SEQ ID NO.26)：5’- GCTTGCTTCACGTTTCCTTC -3’

GmPT9-RT-F (SEQ ID NO.27)：5’- ATGTTTAACTGTGGGCGGCG -3’

GmPT9-RT-R (SEQ ID NO.28)：5’- CCCTATTATTGGGCGTCGGT -3’

GmPT10-RT-F (SEQ ID NO.29)：5’- GGACTCCCGAATGAATGCTA -3’

GmPT10-RT-R (SEQ ID NO.30)：5’- AGCTGCAGTCAACTCCCCTA -3’

GmPT11-RT-F (SEQ ID NO.31)：5’- GAGCACTCCCAGCTGCATTG -3’

GmPT11-RT-R (SEQ ID NO.32)：5’- GGCGACTGAGGAAGTCCTTG -3’

GmPT12-RT-F (SEQ ID NO.33)：5’- GGCGACTGAGGAAGTCCTTG -3’

GmPT12-RT-R (SEQ ID NO.34)：5’- CCCAGAAATGCCATGACAAC -3’

GmPT13-RT-F (SEQ ID NO.35)：5’- GAGGGGCATTCATTGCTGCA -3’

GmPT13-RT-R (SEQ ID NO.36)：5’- AGCGAATCCACCTTCGAACCT -3’

GmPT14-RT-F (SEQ ID NO.37)：5’- GAGCAATTGGACACAAGAAG -3’

GmPT14-RT-R (SEQ ID NO.38)：5’- TCCAACAGGAACCAAGTAGT -3’

（4）过量表达GmPHR25对磷饥饿响应相关基因表达的影响

下胚轴转基因复合植株在完全营养液中（即上述正常供磷（+P）处理下的转基因复合植株）生长14天后，，收获根部样品，提取总RNA，进行定量PCR，，分析超量表达GmPHR25对大豆5个磷饥饿响应相关基因表达量的影响。

结果如图6所示，与对照（control）相比，超量表达GmPHR25显著增加了磷饥饿相关基因GmHAD1-2、GmSPX5、GmEXPB2、GmPAP14和GmPAP21的表达量。其中GmEXPB2已被报道正调控大豆根系和根瘤生长发育从而增加磷的获取，GmPAP21也被报道参与大豆根瘤磷营养的正调控。这些结果说明GmPHR25在大豆磷信号网络中扮演了重要的角色，可能位于这些磷饥饿响应基因的上游，通过正调控一些磷饥饿响应基因来调控大豆生长及磷平衡。

大豆5个候选磷饥饿响应基因的定量引物分别为：

GmHAD1-2-RT-F(SEQ ID NO.39)：5’-TTGCACCCCAGAGTGATTCC-3’

GmHAD1-2-RT-R(SEQ ID NO.40)：5’-AGGGCATAAACTGCAGCCAT-3’

GmSPX5-RT-F(SEQ ID NO.41)：5’-GATGCCAACGAACTCAACC-3’

GmSPX5-RT-R(SEQ ID NO.42)：5’-GAGCGAAGTAGAGCACCA-3’

GmEXPB2-RT-F(SEQ ID NO.43)：5’-GAGGTCACCATCACCACTCTCAT-3’

GmEXPB2-RT-R(SEQ ID NO.44)：5’-GGTGGTGCTTGTGGTTATGGAAGT-3’

GmPAP14-RT-F(SEQ ID NO.45)：5’-CTCGGGGACAAGAAACAAAAGT-3’

GmPAP14-RT-R(SEQ ID NO.46)：5’-CAAACCAGATGGGGAGATGATAG-3’

GmPAP21-RT-F(SEQ ID NO.47)：5’-GCTGATGGTGTTTGGATTG-3’

GmPAP21-RT-R(SEQ ID NO.48)：5’-TGTTGGGTGTCAAAGTTGAG-3’

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用

<130>

<160> 48

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 990

<212> DNA

<213> 基因GmPHR25序列

<400> 1

atgtatcatt caaagaatgt tcctagtgca agtttaattg gtggtaattc attaagtcat 60

ggtcagcaca tagattgtgg tggcagcaca atggatcctg gcagtggagg aaatggtctt 120

agcaacaact ctaatctcac ctcaaaacaa cgtttacggt ggacacatga attgcatgag 180

cgctttgttg atgctgtggc tcaacttggt gggccagatc gtgccacacc caaaggcgtg 240

ctcagagtta tgggtgtaca aggcttgacc atttaccatg tcaaaagtca tttacagaaa 300

taccgacttg caaaatattt acctgactcc tcatctgatg aagggaaaaa ggccgacaag 360

aaagaaacag gggatatgct ttccaatctt gatggttcat ctgggatgca gattactgaa 420

gcactaaagc ttcaaatgga ggttcagaag cgactacatg aacaattgga ggtgcaaaga 480

cagctacaat tacggataga agcccagggt aaatacctga aaaagataat tgaagaacaa 540

cagcgactca gtggtgttct ttcggaggca cctggttctg gtgctgtagc ggtggttcca 600

ggggatgcgt gccaagaacc tgataataag actgacccgt caacccctga ccctgaaaag 660

gctgccaaag accgtgctcc agcgaagagt ctttcaatag aatctttttc atctcaccct 720

gaaccaatga caccagattc tggctgtcat gttggttccc ctgctgaaag ccctaaaggg 780

gagagatcgg ccaagaagca acgagtaacc atggatggtg tgtattctaa accagaaatg 840

gtgcttccac atcagatact ggagtcaagc atgtcatcat accagcaacc taacactgtt 900

tttcttggcc aagagcaatt tgatccttct ttggatatat ctaccaaaag tgatgaggaa 960

ttggttaaga ttggtggcgg taatctgtga 990

<210> 2

<211> 329

<212> PRT

<213> 基因GmPHR25编码蛋白序列

<400> 2

Met Tyr His Ser Lys Asn Val Pro Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Ser His Gly Gln His Ile Asp Cys Gly Gly Ser Thr Met Asp

20 25 30

Pro Gly Ser Gly Gly Asn Gly Leu Ser Asn Asn Ser Asn Leu Thr Ser

35 40 45

Lys Gln Arg Leu Arg Trp Thr His Glu Leu His Glu Arg Phe Val Asp

50 55 60

Ala Val Ala Gln Leu Gly Gly Pro Asp Arg Ala Thr Pro Lys Gly Val

65 70 75 80

Leu Arg Val Met Gly Val Gln Gly Leu Thr Ile Tyr His Val Lys Ser

85 90 95

His Leu Gln Lys Tyr Arg Leu Ala Lys Tyr Leu Pro Asp Ser Ser Ser

100 105 110

Asp Glu Gly Lys Lys Ala Asp Lys Lys Glu Thr Gly Asp Met Leu Ser

115 120 125

Asn Leu Asp Gly Ser Ser Gly Met Gln Ile Thr Glu Ala Leu Lys Leu

130 135 140

Gln Met Glu Val Gln Lys Arg Leu His Glu Gln Leu Glu Val Gln Arg

145 150 155 160

Gln Leu Gln Leu Arg Ile Glu Ala Gln Gly Lys Tyr Leu Lys Lys Ile

165 170 175

Ile Glu Glu Gln Gln Arg Leu Ser Gly Val Leu Ser Glu Ala Pro Gly

180 185 190

Ser Gly Ala Val Ala Val Val Pro Gly Asp Ala Cys Gln Glu Pro Asp

195 200 205

Asn Lys Thr Asp Pro Ser Thr Pro Asp Pro Glu Lys Ala Ala Lys Asp

210 215 220

Arg Ala Pro Ala Lys Ser Leu Ser Ile Glu Ser Phe Ser Ser His Pro

225 230 235 240

Glu Pro Met Thr Pro Asp Ser Gly Cys His Val Gly Ser Pro Ala Glu

245 250 255

Ser Pro Lys Gly Glu Arg Ser Ala Lys Lys Gln Arg Val Thr Met Asp

260 265 270

Gly Val Tyr Ser Lys Pro Glu Met Val Leu Pro His Gln Ile Leu Glu

275 280 285

Ser Ser Met Ser Ser Tyr Gln Gln Pro Asn Thr Val Phe Leu Gly Gln

290 295 300

Glu Gln Phe Asp Pro Ser Leu Asp Ile Ser Thr Lys Ser Asp Glu Glu

305 310 315 320

Leu Val Lys Ile Gly Gly Gly Asn Leu

325

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物OE-GmPHR25-pYL-F

<400> 3

gagctcatgt atcattcaaa gaatgttcct ag 32

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物OE-GmPHR25-pYL-R

<400> 4

gacgtctcac agattaccgc cacc 24

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 引物GFP-GmPHR25-F

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgtatcat tcaaagaatg ttccta 56

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 引物GFP-GmPHR25-R

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga agctgggtct cacagattac cgccacc 47

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆的看家基因EF1-a-F

<400> 7

tgcaaaggag gctgctaact 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆的看家基因EF1-a-R

<400> 8

cagcatcacc gttcttcaaa 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 定量引物GmPHR25-RT-F

<400> 9

aaaggccgac aagaaagaaa cagg 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 定量引物GmPHR25-RT-R

<400> 10

aaccaccgct acagcaccag aac 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT1-RT-F

<400> 11

caggttctgg ctagggtttg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT1-RT-R

<400> 12

acatagtcaa atgcggggtc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT2-RT-F

<400> 13

gacatagcgc gaaatctgtc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT2-RT-R

<400> 14

caaacacggc cgcaatgaag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT3-RT-F

<400> 15

acaagaagac aagagggtcg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT3-RT-R

<400> 16

aaccgagcat gagaatcaac 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT4-RT-F

<400> 17

aggtgcacca aagccgggaa ct 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT4-RT-R

<400> 18

tggccatgac accctctgca 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT5-RT-F

<400> 19

gaacactttc agggcaactc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT5-RT-R

<400> 20

gtcatcacag tctttgcatc g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT6-RT-F

<400> 21

ctgctcacat actattggcg t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT6-RT-R

<400> 22

gtccaacagg aaccaagtaa c 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT7-RT-F

<400> 23

tgaccacaag tacgatcttc c 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT7-RT-R

<400> 24

cgccaatagt aggtaagagc a 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT8-RT-F

<400> 25

tcattttcgc gggtttagtc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT8-RT-R

<400> 26

gcttgcttca cgtttccttc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT9-RT-F

<400> 27

atgtttaact gtgggcggcg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT9-RT-R

<400> 28

ccctattatt gggcgtcggt 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT10-RT-F

<400> 29

ggactcccga atgaatgcta 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT10-RT-R

<400> 30

agctgcagtc aactccccta 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT11-RT-F

<400> 31

gagcactccc agctgcattg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT11-RT-R

<400> 32

ggcgactgag gaagtccttg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT12-RT-F

<400> 33

ggcgactgag gaagtccttg 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT12-RT-R

<400> 34

cccagaaatg ccatgacaac 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT13-RT-F

<400> 35

gaggggcatt cattgctgca 20

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT13-RT-R

<400> 36

agcgaatcca ccttcgaacc t 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT14-RT-F

<400> 37

gagcaattgg acacaagaag 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPT14-RT-R

<400> 38

tccaacagga accaagtagt 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmHAD1-2-RT-F

<400> 39

ttgcacccca gagtgattcc 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmHAD1-2-RT-R

<400> 40

agggcataaa ctgcagccat 20

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 定量引物GmSPX5-RT-F

<400> 41

gatgccaacg aactcaacc 19

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 定量引物GmSPX5-RT-R

<400> 42

gagcgaagta gagcacca 18

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 定量引物GmEXPB2-RT-F

<400> 43

gaggtcacca tcaccactct cat 23

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 定量引物GmEXPB2-RT-R

<400> 44

ggtggtgctt gtggttatgg aagt 24

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 定量引物GmPAP14-RT-F

<400> 45

ctcggggaca agaaacaaaa gt 22

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> 定量引物GmPAP14-RT-R

<400> 46

caaaccagat ggggagatga tag 23

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> 定量引物GmPAP21-RT-F

<400> 47

gctgatggtg tttggattg 19

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 定量引物GmPAP21-RT-R

<400> 48

tgttgggtgt caaagttgag 20

Claims

1.耐低磷胁迫基因GmPHR25在调控植物生长和/或磷动态平衡方面的应用，其特征在于，所述耐低磷胁迫基因GmPHR25的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是指在低磷胁迫下调控植物生长和/或磷动态平衡。

3.耐低磷胁迫基因GmPHR25在制备转基因植物中的应用，其特征在于，所述耐低磷胁迫基因GmPHR25的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述转基因植物是指能够耐低磷胁迫的转基因植物。

5.一种构建耐低磷胁迫转基因植物的方法，其特征在于，利用转基因技术将基因GmPHR25重组入植物的基因组，进而获得耐低磷胁迫转基因植物；所述基因GmPHR25的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。