CN115125255B - 一种植物响应氮磷调控重要基因GmNLA4的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物响应氮磷调控重要基因GmNLA4的应用。本发明提供大豆E3泛素连接酶GmNLA4基因和GmNLA4蛋白在调控植物根系氮磷协同中的应用，其核苷酸和氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～2所示。本发明研究显示，干涉表达植物中GmNLA4后，其表达量降低，植物根部的全磷浓度增加，表明GmNLA4基因负调控大豆根部的磷平衡；同时在低氮胁迫下，干涉GmNLA4表达后，也会显著增加大豆离体毛根的全磷浓度，表明GmNLA4参与了低氮胁迫下对大豆根部的磷平衡调控；因此，通过GmNLA4能调节植物根部的全磷浓度，改善土壤中磷缺乏的问题，降低磷肥的施用。

Description

一种植物响应氮磷调控重要基因GmNLA4的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及一种植物响应氮磷调控重要基因GmNLA4的应用。
背景技术
氮素和磷素不仅是植株生长发育所需的大量元素，而且还参与了参与许多重要的生化反应和代谢过程，包括能量转移、氧化磷酸化、酶活性调节和细胞信号传导等过程。在农业生产中，肥料的使用是增加作物产量的有效途径之一。但是，由于农业系统低效的氮磷利用效率，大部分施用的氮磷肥不能被植物吸收并流失到环境中。过多的施用氮肥和磷肥会增加氮磷在排水系统中的浸出，释放出活性温室气体，污染对流层，导致全球变暖，加速河流富营养化和土壤酸化等严重问题。因此，了解氮、磷元素之间的相互关系，对培育养分高效利用作物品种，减少肥料用量具有重要意义。
在自然环境中生长的植物总是面临着土壤中不断变化的养分，特别是氮磷养分的变化，氮和磷是植物生长发育所必需的两种主要元素，植物在长期的适应过程中进化出了相应的策略来协调氮和磷利用。由于植物的磷利用效率较低，多数磷常常不能为植物所吸收利用，而土壤中磷利用率也很低，常常依靠大量施磷以保证和增加可利用磷。但过度的磷施用会导致成本增加、水土污染、磷矿资源枯竭等许多负面影响和潜在危机。而植物在酸性土壤会受到生长抑制，由于过高的H+浓度危害植物，会在植物生长和产量表现出对有效磷的缺乏。因此，提高作物在酸性土壤中或低磷/氮胁迫下的适应性对农业生产有重要意义。而早期在烟草、大麦和菜豆中的研究发现，与正常磷浓度处理相比，磷饥饿处理降低了植株对硝酸盐的吸收和同化，揭示了低磷胁迫会抑制植物对硝酸盐的吸收，从而影响氮的吸收和利用效率。对禾本科作物的研究发现，当氮:磷的供应比为15:1时，植株的生物量达到最大值。氮磷供应比例的变化对植株的磷浓度、氮磷比例以及植株对氮和磷的吸收速率有十分显著的影响，适宜的氮磷供应比例对作物的籽粒产量和生产性能的影响大于氮和磷的绝对供应量。
氮限制适应因子(NITROGEN LIMITATION ADAPTATION，NLA)是植物中的一类RING型的E3泛素连接酶，含有SPX和RING两个蛋白结构域。近年来以模式植物拟南芥和水稻为研究材料，揭示了NLA作为泛素化途径中的E3泛素连接酶，可以和E2泛素结合酶PHO2互作，协同调控了下游磷转运蛋白的泛素化降解，进而调控拟南芥和水稻植株的磷平衡。NLA基因家族在拟南芥和水稻等虽已被克隆及报道，但其在豆科作物氮磷信号网络方面的生物学功能并不清楚。大豆属于我国主要的农作物之一，关于大豆中参与氮磷胁迫调控的基因还鲜有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种植物响应氮磷调控重要基因GmNLA4的应用。
本发明的第一个目的是提供基因GmNLA4基因或GmNLA4蛋白或其表达抑制剂的应用。
本发明的第二个目的是提供一种提高大豆根系全磷浓度的产品。
本发明的第三个目的是提供一种提高大豆根系全磷浓度的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究显示GmNLA4基因参与调控大豆根系的磷平衡，GmNLA4多表达于大豆毛根的根茎中，GmNLA4蛋白定位于细胞核和细胞膜中。在低磷、低氮处理下GmNLA4在根中的表达量下调。本发明通过构建大豆转基因毛根材料，在正常磷或低磷条件下，干涉GmNLA4表达能增加大豆根系的全磷浓度；同时在低氮胁迫下，干涉GmNLA4的表达，也会显著增加大豆离体毛根的全磷浓度，表明大豆GmNLA4基因参与了正常磷、低磷、正常氮或低氮条件下对大豆根部的磷平衡调控，负调控大豆根部的全磷浓度。通过GmNLA4能调节大豆根部的全磷浓度，改善土壤中磷缺乏的问题，同时能够降低磷肥的施用。本发明研究的GmNLA4基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，GmNLA4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
因此，本发明提供SEQ ID NO:1所示GmNLA4基因或SEQ ID NO:2所示GmNLA4蛋白或其表达抑制剂在调控大豆根系磷平衡和/或全磷浓度、在提高大豆根系全磷浓度、在氮胁迫下提高大豆根系全磷浓度、在培育耐低氮的大豆转基因植物、在制备大豆根系全磷浓度调节剂中、在提高植物对酸性土壤的适应性中的应用。
本发明提供一种提高大豆根系全磷浓度的产品，含有GmNLA4蛋白的干扰或表达抑制剂。
优选地，所述GmNLA4蛋白的干扰或表达抑制剂包含GmNLA4基因的RNAi干扰载体。
进一步优选地，所述GmNLA4基因的RNAi干扰载体的GmNLA4-RNAi基因正向片段的特异引物如SEQ ID NO:3～4所示；GmNLA4-RNAi基因反向片段的特异引物为如SEQ ID NO:5～6所示。
本发明提供一种提高大豆根系全磷浓度的方法，对植物中的GmNLA4基因进行定点敲除、干扰或表达抑制来提高大豆根系全磷浓度。
优选地，通过RNA干扰技术对GmNLA4基因进行表达抑制，来提高大豆根系全磷浓度。
优选地，构建干涉GmNLA4基因的表达载体，转入植物体内，来提高大豆根系全磷浓度。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了大豆E3泛素连接酶GmNLA4的应用，本发明研究显示GmNLA4参与调控大豆根系的磷平衡，能改变根系全磷浓度。与正常供磷供氮条件下相比，低磷、低氮处理下GmNLA4在根中的表达量均下调了41.0％、47.8％。通过构建大豆转基因毛根材料(GmNLA4低表达植株)，在正常供磷和低磷条件下，抑制GmNLA4表达后，大豆离体毛根的全磷浓度分别增加了44.1％和16.5％；在正常氮和低氮胁迫下，抑制GmNLA4的表达，大豆根系全磷浓度增加了39.7％和39.4％；在低氮胁迫下对干涉转基因毛根的影响较大，低氮胁迫会显著增加大豆离体毛根的全磷浓度，显示GmNLA4参与了低氮胁迫下对大豆根部的磷平衡调控。通过GmNLA4能调节大豆根部的全磷浓度，改善土壤中磷缺乏的问题，同时能够降低磷肥的施用。GmNLA4基因对大豆离体毛根的全磷浓度有显著的影响，这对阐明NLA基因在豆科作物适应酸氮磷协同调控的生物学功能有着重要意义。
附图说明
图1为大豆GmNLA4在叶部和根部对低磷的响应(A为叶部，B为根部，星号表示不同氮磷浓度处理之间差异显著(t-检验)，*：P<0.05)；
图2为GmNLA4融合GUS在大豆离体毛根中的组织化学定位分析(图A、B、C为转化空载体的GUS染色结果(Pro:35S-GUS)；图D、E、F为GmNLA4融合GUS蛋白在大豆离体毛根中的染色结果(Pro:GmNLA4-GUS)；图A、B、D、E的标尺为20μm，图C和F的标尺为1.2cm)；
图3为GmNLA4融合GFP蛋白在烟草叶片的亚细胞定位分析(图A、B、C为转化空载体的烟草亚细胞定位图(35S:GFP)；图D、E、F为GmNLA4融合GFP蛋白在烟草叶片的亚细胞定位图(35S:GFP-GmNLA4)；图片分别为在激光共聚焦显微镜下绿色荧光通道(GFP)、红色荧光通道(mCherry)和重叠后的图片(Merge)拍摄的内容；标尺为20μm)；
图4为干涉表达GmNLA4对转基因大豆离体毛根响应磷有效性的影响(A为对照和干涉表达GmNLA4转基因毛根在正常磷与低磷条件下的表型；B为对照(CK)与干涉表达(RNAi)株系中GmNLA4基因的表达量；C为对照和干涉表达GmNLA4转基因毛根在正常磷与低磷处理下的全磷浓度；RNAi表示干涉表达株系；CK表示转化空载体的转基因株系；标尺为1cm。数据均为至少六次重复的平均值和标准误，星号表示干涉表达株系(RNAi)与对照株系(CK)之间差异显著(t-检验)，*：P<0.05，***：P<0.001)；
图5为干涉表达GmNLA4对转基因大豆离体毛根响应氮有效性的影响(A为对照和干涉表达GmNLA4转基因毛根在正常氮与低氮条件下的表型；B为对照和干涉表达GmNLA4转基因毛根在正常氮GmNLA4基因的表达量；C为对照和干涉表达GmNLA4转基因毛根在正常氮与低氮处理下的全磷浓度；RNAi表示干涉表达株系；CK表示转化空载体的转基因株系，标尺为1cm，数据均为至少六次重复的平均值和标准误，星号表示干涉表达株系(RNAi)与对照株系(CK)之间差异显著(t-检验)，***：P<0.001)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1载体的构建
1、干涉表达载体的构建(RNAi-GmNLA4-pFGC5941)
本发明在大豆根系的低磷低氮转录组数据库中发现了与低磷低氮胁迫响应相关的基因GmNLA4，GmNLA4基因属于氮限制适应因子(NITROGEN LIMITATION ADAPTATION，NLA)是植物中的一类RING型的E3泛素连接酶，GmNLA4基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
提取南方栽培大豆磷高效品种粤春03-3(YC03-3)的cDNA为模板，根据GmNLA4基因序列SEQ ID NO:1利用primer软件设计引物，具体引物序列如下表1所示。采用GmNLA4-RNAi基因正向片段的特异引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)扩增大豆基因CDS正向干涉序列。
表1引物序列表
Figure BDA0003713555010000051
Figure BDA0003713555010000061
PCR扩增体系为：25μL 2×Vazyme phata buffer，1μL Vazyme phata酶，1μLdNTP，正向、反向引物各1μL，3μL cDNA模板，最后加16μL的ddH2O补足至50μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃复性40秒，72℃延伸30秒，从变性到延伸循环30次，16℃保存PCR产物。
得到的扩增产物用凝胶电泳法检测，若条带大小正确，进一步用琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒(美吉生物，中国)回收纯化目的片段。选择BamH I为pFGC5941载体的单酶切位点，使用一步克隆法把目的基因片段连接到pFGC5941载体上。
将连接产物转入大肠杆菌Trans1-T1(TRANS，中国)感受态，37℃培养12小时后将阳性克隆摇菌，送公司测序成功后抽取质粒，构成干涉的中间载体。
2、以中间载体质粒为模板，用GmNLA4-RNAi基因反向片段的特异引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)扩增基因的反向片段，PCR扩增反应条件和程序同上。回收并纯化目的片段。选择Asc I为中间载体质粒的单酶切位点，使用一步克隆法把目的基因片段连接到干涉的中间载体上。将连接产物转入大肠杆菌Trans1-T1(TRANS，中国)感受态，37℃培养12小时后将阳性克隆摇菌，送公司测序，测序验证成功后将阳性菌株在-80℃冰箱保存，构建得到RNAi-GmNLA4-pFGC5941载体。
2、亚细胞定位(GFP-GmPLA4-pEGAD)表达载体的构建
采用大豆品种YC03-3的cDNA为模板，用GmNLA4-GFP基因的正向(SEQ ID NO:7)和反向(SEQ ID NO:8)特异引物扩增基因的CDS全长序列。PCR扩增体系为：25μL 2×Vazymephata buffer，1μL Vazyme phata酶，1μL dNTP，正向、反向引物各1μL，3μL cDNA模板，最后加16μL的ddH2O补足至50μL。PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃复性40秒，72℃延伸30秒，从变性到延伸循环30次，16℃保存PCR产物。得到的扩增产物用凝胶电泳法检测，若条带大小正确，进一步用琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒(美吉生物，中国)回收纯化目的片段。
选择Age I为pEGAD载体的单酶切位点，使用一步克隆法把目的基因片段连接到pEGAD载体上。反应产物保存在-20℃冰箱备用。
将连接产物转入大肠杆菌Trans1-T1感受态，37℃培养12小时后将阳性克隆摇菌，送公司测序成功将阳性菌株在-80℃冰箱保存。
3、GmNLA4融合GUS表达载体(GUS-GmNLA4-pTF102)的构建
采用大豆品种YC03-3的DNA为模板，用GmNLA4-GUS基因的正向(SEQ ID NO:9)和反向(SEQ ID NO:10)特异引物扩增基因的启动子序列。PCR扩增体系为：25μL 2×Vazymephata buffer，1μL Vazyme phata酶，1μL dNTP，正向、反向引物各1μL，3μL cDNA模板，最后加16μL的ddH2O补足至50μL。PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃复性3分钟，72℃延伸3分钟，从变性到延伸循环30次，16℃保存PCR产物。得到的扩增产物用凝胶电泳法检测，若条带大小正确，进一步用琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒(美吉生物，中国)回收纯化目的片段。
选择EcoR I为pTF102载体的单酶切位点，使用一步克隆法把目的基因片段连接到pTF102载体上，将连接产物转入大肠杆菌Trans1-T1(TRANS，中国)感受态，37℃培养12小时后将阳性克隆摇菌，送公司测序成功将阳性菌株在-80℃冰箱保存。
实施例2 GmNLA4基因表达模式及蛋白亚细胞定位分析
1、GmNLA4基因的表达模式分析
选取大小均一、干净饱满的大豆种子若干，采用砂培育苗的方法，将洗净的湿润石英砂装在合适大小的面包箱中。播种时，种脐朝下，每隔1厘米播种一颗种子，播种完后表面覆盖1～2厘米石英砂，在石英砂表面喷洒适量水，面包箱的表面用保鲜膜盖住。于恒温光照培养室萌发4～5天，待种子萌发后，挑选萌发良好且一致的幼苗分别转移至不同氮磷浓度的改良大豆全营养液中培养，每3天校正一次pH值(5.8～6.0)，采用0.1mM KOH或者H2SO4调pH值，培养期间通气装置设定为15分钟/小时。处理21天后收取完全展开的大豆新叶和根部样品，于液氮速冻后提取总RNA进行实时荧光定量PCR分析。
通过Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR system进行实时荧光定量PCR分析，采用Promega公司的定量试剂盒进行定量PCR。定量PCR的反应体系为(20μL)：10μL 2×Go Tap qPCR Master Mix、2μL cDNA模板上下游引物各0.4μL、7.2uL Nuclease-free water。反应条件为：95℃预变性1分钟，95℃变性15秒，60℃复性15秒，72℃延伸30秒，从变性到延伸循环40次。
以大豆看家基因(Glyma17g23900)EF1-α-F(SEQ ID NO:11)和EF1-a-R(SEQ IDNO:12)作为内参，大豆GmNLA4定量引物为：GmNLA4-RT-F(SEQ ID NO:13)和GmNLA4-RT-R(SEQ ID NO:14)。相对表达量用目的基因的表达量与内参基因表达量的比值表示。
结果如图1所示，如图1A所示GmNLA4在新叶不受氮磷的调控；在正常供磷(+P)条件下，与正常供氮(+N)相比，低氮处理(-N)21天，GmNLA4在根中的表达量下调了47.8％。同时如图1B所示，在正常供氮(+N)条件下，与正常供磷(+P)相比，低磷处理(-P)21天，GmNLA4在根中的表达量下调了41.0％。
2、GmNLA4组织化学定位分析
采用上述实施例1中构建的载体GUS-GmNLA4-pTF102转入大豆离体毛根中，以构建好的GmNLA4启动子驱动GUS报告基因的转基因大豆离体毛根为材料，并通过GUS染色的方法，分析GmNLA4在大豆离体毛根中的组织化学定位。
结果如图2所示，转化Pro:35S-GUS空载体的转基因毛根在整个根系都有明显的GUS染色，Pro:GmNLA4-GUS在大豆离体毛根的根茎有明显的GUS染色(图2A、B、C)，在根尖中没有GUS染色(图2D、E、F)。
3、GmNLA4亚细胞定位分析
通过农杆菌侵染法，将实施例1中构建得到的GFP-GmPLA4-pEGAD载体和pEGAD空载体分别导入烟草表皮细胞中进行瞬时表达。然后用激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞的GFP荧光信号。
结果如图3所示，与转化Pro:35S-GUS空载体相比(图3A、B、C)，明显看出35S:GmNLA4-GFP的荧光主要分布于细胞核和细胞膜中(图3D、E、F)，说明GmNLA4蛋白定位于细胞核和细胞膜中。
实施例3转基因试验
1、转基因大豆离体毛根材料的获得
(1)种子萌发：选取大小一致，干净饱满的大豆种子，放入干燥皿中用氯气灭菌。氯气产生反应为：100mL次氯酸钠溶液中加入4.2mL HCl。种子灭菌14小时后从干燥皿中取出，在超净工作台打开培养皿盖子30分钟，以去除多余的氯气，之后把种子种植在无菌的MS萌发培养基中，在28℃光照培养箱中萌发4～6天，待子叶变绿完全竖起时可进行转化实验。
(2)摇菌：种子萌发两天后，取在-80℃用甘油储存的含有实施例1中制备的RNAi-GmNLA4-pFGC5941的农杆菌K599划线活化菌株，根据载体和质粒的抗性选择含有对应抗生素的YEP固体培养基进行划线，划线后于28℃培养箱暗培养，2天后挑取单克隆进行检测，检测为阳性的菌株备用。在侵染的前一天晚上，把阳性菌株接种于含有5mL YEP液体培养基的50mL离心管中，放置于28℃恒温摇床培养箱黑暗培养12～16小时，备用。
(3)侵染和共培养：在超净工作台中用解剖刀在距离子叶节大约0.5厘米的下胚轴区域切下发芽的种子，剥落种皮，沿下胚轴对半切开种子，去除子叶节处的幼芽。用解剖刀蘸取菌液，轻轻地在子叶节和下胚轴区域处切割7～10个切口，把外植体转移至装有用无菌水湿润的双层滤纸的培养皿上，用保鲜膜封闭培养皿，25℃光照培养5～7天，然后把外植体转移至发根诱导培养基中进行培养，每个培养皿(120mm×25mm)移植3～4颗外植体，25℃黑暗培养，培养基中需要加入合适浓度的筛选剂除草剂和抑菌剂羧苄青霉素。
(4)处理：在发根培养基上培7～10天时可见毛状根产生，待培养14～20天时，毛状根生长状态良好，挑取大小一致的毛状根移植在不同氮磷浓度的发根培养基中培养，25℃黑暗培养14天后收获毛根。
2、转基因大豆离体毛根的检测
提取获得的转基因系毛根的总RNA，反转录成cDNA后，用定量PCR检测GmNLA4的表达量，以大豆看家基因EF1-a作为参照基因，相对表达量为目的基因GmNLA4的表达量与看家基因EF1-a表达量的比值，具体定量PCR检测的引物同实施例2。
定量PCR的20μL反应体系为：10μL 2×Go Tap qPCR Master Mix、2μL cDNA模板上下游引物各0.4μL、7.2uL Nuclease-free water；反应条件为：95℃预变性1分钟，95℃C变性15秒，60℃复性15秒，72℃延伸30秒，从变性到延伸循环40次。
结果显示，GmNLA4在干涉表达GmNLA4的转基因毛根中的表达量显著低于对照组，表明成功获得干涉表达GmNLA4的转基因大豆离体毛根材料。
实施例4 GmNLA4的功能分析
1、干涉表达GmNLA4对大豆转基因离体毛根响应磷有效性的影响
为探究GmNLA4对大豆转基因离体毛根响应磷有效性的影响，采用实施例3获得的转基因大豆毛根，将约0.2克的转基因毛根接种于正常磷(+P:1.25mM KH2PO4)或低磷(-P:0μM KH2PO4)浓度的固体MS培养基中培养14天，每个处理设置十个独立的生物学重复，收获后测定毛根的鲜重和全磷浓度，并通过实时荧光定量PCR检测不同磷处理后GmNLA4的表达量。
结果：干涉表达GmNLA4的转基因毛根在正常磷与低磷条件下的表型如图4A所示，低磷胁迫限显著抑制了毛根的生长；实时荧光定量PCR结果如图4B所示，表明在正常供磷和低磷条件下，干涉表达GmNLA4转基因毛根中GmNLA4的表达量都显著低于空载对照(CK)，表达量分别降低了73.6％和63.2％。在图4C中，在正常磷(+P)条件下，干涉GmNLA4的表达，与空载对照(CK)相比，全磷浓度增加了44.1％。在低磷(-P)条件下，干涉GmNLA4的表达，全磷浓度增加了16.5％。这些结果说明，大豆GmNLA4基因参与了大豆根部的磷平衡调控。
2、干涉表达GmNLA4对大豆转基因离体毛根响应氮有效性的影响
为探究GmNLA4对大豆转基因离体毛根响应氮有效性的影响，采用实施例3获得的转基因大豆毛根，将约0.2克的转基因毛根接种于正常氮(+N:6.6mM)或低氮(-N:0.6mM)浓度的固体MS培养基中培养14天，每个处理设置十个独立的生物学重复，收获后测定毛根的鲜重和全磷浓度，并通过实时荧光定量PCR检测不同氮处理后GmNLA4的表达量。
结果：干涉表达GmNLA4的转基因毛根在正常氮与低氮条件下的表型如图5A所示，低氮胁迫显著抑制了毛根的生长；实时荧光定量PCR结果如图5B所示，表明在正常氮(+N)和低氮处理(-N)下，与空载对照(CK)相比，干涉GmNLA4转基因毛根中的GmNLA4的表达量分别降低了74.3％和93.7％。在图5C中，在正常氮(+N)条件下，干涉GmNLA4的表达，与空载对照(CK)相比，全磷浓度增加了39.7％。低氮(-N)条件下，与空载对照(CK)相比，干涉GmNLA4的表达，大豆离体毛根的全磷浓度增加了39.4％。同时，与正常氮(+N)相比，空载对照(CK)的全磷浓度在低氮(-N)条件下增加了59.5％，在干涉大豆GmNLA4转基因毛根的全磷浓度增加了67.3％；相比空载对照(CK)，低氮胁迫对GmNLA4干涉转基因毛根的影响更大。这些结果揭示了低氮胁迫会显著增加大豆离体毛根的全磷浓度，干涉GmNLA4的表达后，全磷浓度增加的幅度更大，表明GmNLA4参与了低氮胁迫下对大豆根部的磷平衡调控。因此，可以通过GmNLA4来调节大豆根部的全磷浓度，改善土壤中磷缺乏的问题，降低磷肥的施用，同时缓解在低磷或低氮胁迫下对作物的抑制作用。
以上结果表明，大豆GmNLA4基因参与了正常磷、低磷、正常氮或低氮条件下对大豆根部的磷平衡调控，负调控大豆根部的全磷浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种植物响应氮磷调控重要基因GmNLA4的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 975
<212> DNA
<213> GmNLA4基因(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 1
atgaagttct gcaaaaagta tcaggaatac atgcaaggcc aggagaagaa acttccatgt 60
gtaggattca agaagctcaa gaagattctg aagaagtgca ggagaaactc ttcatccctg 120
aaacccctta atgcatccct tgccgccaaa acctgccccg accattgccc agtgtgcgat 180
gggaccttct tcccttccct tctcaatgaa atgtcagata tagtggggtg ctttaatcag 240
cgggcgcaga aattgttgga gctacatctc gcttctgggg tcagaaagta cttcttctgg 300
atcaaaggca aattacaagg gaaccatact gcactgattc aagagggcaa agatcttgtt 360
acttatgcac tcataaatgc cattgcaatt cgaaaaatac taaagaaata tgataagatt 420
cattattcca agcaagggca attgttcaag tcacaagtcc agagtatgca caaggagatt 480
cttcaaagtc cctggctttg tgagcttatg gccttccaca tcaatttaag ggaaactaag 540
gtcaagtcaa ggaaggcaca tgctttgttc gatggatgtt ctctcacatt caaggatggg 600
aaaccgtcac ttacttgtga gctctttgat tctatcaaag ttgacattga cttgacttgt 660
tctatatgct tggacacagt gtttgatcca gtttctctga cttgtggcca tatattctgc 720
tatatttgtg catgctcggc tgcatcggta tctattgtca atggacttaa gtctgcagat 780
cctaaaatga aatgtcctct atgtcgtgag ggtgcagttt atgaaggtgc tgtgcgcttg 840
gaagaactaa atattctgtt aagccgaagt tgtcaggaat actgggagca gaggcttcag 900
acagagaggg tggagagggt taagcaaata aaggaacact gggattcaca gtgtagggca 960
ttcgtgggcg tctaa 975
<210> 2
<211> 324
<212> PRT
<213> GmNLA4蛋白(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 2
Met Lys Phe Cys Lys Lys Tyr Gln Glu Tyr Met Gln Gly Gln Glu Lys
1 5 10 15
Lys Leu Pro Cys Val Gly Phe Lys Lys Leu Lys Lys Ile Leu Lys Lys
20 25 30
Cys Arg Arg Asn Ser Ser Ser Leu Lys Pro Leu Asn Ala Ser Leu Ala
35 40 45
Ala Lys Thr Cys Pro Asp His Cys Pro Val Cys Asp Gly Thr Phe Phe
50 55 60
Pro Ser Leu Leu Asn Glu Met Ser Asp Ile Val Gly Cys Phe Asn Gln
65 70 75 80
Arg Ala Gln Lys Leu Leu Glu Leu His Leu Ala Ser Gly Val Arg Lys
85 90 95
Tyr Phe Phe Trp Ile Lys Gly Lys Leu Gln Gly Asn His Thr Ala Leu
100 105 110
Ile Gln Glu Gly Lys Asp Leu Val Thr Tyr Ala Leu Ile Asn Ala Ile
115 120 125
Ala Ile Arg Lys Ile Leu Lys Lys Tyr Asp Lys Ile His Tyr Ser Lys
130 135 140
Gln Gly Gln Leu Phe Lys Ser Gln Val Gln Ser Met His Lys Glu Ile
145 150 155 160
Leu Gln Ser Pro Trp Leu Cys Glu Leu Met Ala Phe His Ile Asn Leu
165 170 175
Arg Glu Thr Lys Val Lys Ser Arg Lys Ala His Ala Leu Phe Asp Gly
180 185 190
Cys Ser Leu Thr Phe Lys Asp Gly Lys Pro Ser Leu Thr Cys Glu Leu
195 200 205
Phe Asp Ser Ile Lys Val Asp Ile Asp Leu Thr Cys Ser Ile Cys Leu
210 215 220
Asp Thr Val Phe Asp Pro Val Ser Leu Thr Cys Gly His Ile Phe Cys
225 230 235 240
Tyr Ile Cys Ala Cys Ser Ala Ala Ser Val Ser Ile Val Asn Gly Leu
245 250 255
Lys Ser Ala Asp Pro Lys Met Lys Cys Pro Leu Cys Arg Glu Gly Ala
260 265 270
Val Tyr Glu Gly Ala Val Arg Leu Glu Glu Leu Asn Ile Leu Leu Ser
275 280 285
Arg Ser Cys Gln Glu Tyr Trp Glu Gln Arg Leu Gln Thr Glu Arg Val
290 295 300
Glu Arg Val Lys Gln Ile Lys Glu His Trp Asp Ser Gln Cys Arg Ala
305 310 315 320
Phe Val Gly Val

Claims (5)

1. SEQ ID NO:1所示GmNLA4基因或SEQ ID NO:2所示GmNLA4蛋白的表达抑制剂在提高大豆根系全磷浓度中的应用，其特征在于，所述表达抑制剂为GmNLA4基因的RNAi干扰载体。
2. SEQ ID NO:1所示GmNLA4基因或SEQ ID NO:2所示GmNLA4蛋白的表达抑制剂在低氮胁迫下提高大豆根系全磷浓度中的应用，其特征在于，所述表达抑制剂为GmNLA4基因的RNAi干扰载体。
3. SEQ ID NO:1所示GmNLA4基因或SEQ ID NO:2所示GmNLA4蛋白的表达抑制剂在培育耐低氮胁迫的大豆转基因植物中的应用，其特征在于，所述表达抑制剂为GmNLA4基因的RNAi干扰载体。
4. 一种提高大豆根系全磷浓度的方法，其特征在于，对大豆中的GmNLA4基因进行RNA干扰来提高大豆根系中的全磷浓度；GmNLA4基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，构建干涉GmNLA4基因的表达的RNAi干扰载体，转入大豆植物体内，来提高大豆根系全磷浓度。
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