CN105821060B - 大豆耐低磷相关基因GmACP2、编码蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种大豆耐低磷相关基因GmACP2、编码蛋白及其应用。该基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。GmACP2基因的表达量在耐低磷材料中显著高于低磷敏感材料；利用可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明GmACP2基因导入大豆毛状根中，能显著提高大豆磷含量，干物质积累及磷吸收与利用效率。本发明公开的基因可作为目的基因导入植物，提高转基因植物磷体内代谢平衡的能力，对培育磷高效利用大豆品种有重要意义。

Description

大豆耐低磷相关基因GmACP2、编码蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种耐低磷相关基因GmACP2、编码蛋白及其应用。

背景技术

大豆是人类食用油和植物蛋白的主要来源，然而大豆也是一种需磷量较大的作物，其籽粒含磷量远远高于水稻、小麦和玉米。大豆缺磷以后，不仅影响植株的生长发育，增加花荚脱落，还会影响根瘤的形成从而降低固氮效率，并最终影响其产量和品质。因此，土壤磷素缺乏成为了限制大豆生产发展的重要因素。植物为了适应低磷环境，已在进化过程中形成了一系列应对低磷胁迫的适应性机制，以提高磷的吸收和利用效率，包括改变根构型，增加了有机酸分泌，形成菌根共生体系以及提高酸性磷酸酶的活性等。在低磷胁迫条件下，酸性磷酸酶的分泌可以水解土壤中含量丰富的有机磷，释放更多的无机磷供植物吸收利用，使植物适应缺磷环境。已有多项研究表明，缺磷能够显著增加水稻、小麦、大豆、拟南芥、番茄和玉米等植物的酸性磷酸酶的活性。酸性磷酸酶(简称ACP)是一种在动、植物和微生物细胞中广泛存在，调控磷代谢的重要酶类。因而对于酸性磷酸酶的研究对大豆抵抗磷胁迫能力以及产量和品质的提高具有重要意义。

近年来随着分子生物学的发展，酸性磷酸酶酶学性质、相关基因的克隆及其在植物磷效率中的生物学功能等都取得了许多研究成果。在拟南芥中，就已有29个紫色酸性磷酸酶基因被克隆，其中有多个基因的功能与磷营养相关，并且涉及了磷代谢调控网络的各个层面。在大豆中，Zhang等(2014)首次通过正向遗传学方法在大豆中图位克隆了一个耐低磷关键基因，GmACP1，该基因也编码一个酸性磷酸酶，在大豆毛状根中超量表达该基因不仅能够显著提高大豆磷利用效率，还可以增加大豆植株干物重。然而到目前为止，在大豆中，ACP基因家族的其它成员拷贝还未见报道。

发明内容

1、发明要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种大豆耐低磷相关基因GmACP2。

本发明的另一个目的是提供该基因所编码的蛋白。

本发明的另一个目的是提供含有上述基因的重组质粒。

本发明的又一个目的是提供上述基因或重组质粒在大豆抵抗磷胁迫作用中及培育磷高效大豆品种中的应用。

2、技术方案

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种大豆耐低磷相关基因GmACP2，其核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示。

本发明还提供了一种大豆耐低磷相关基因GmACP2所编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表Seq ID NO.2所示。

进一步地，本发明提供了一种含有该大豆耐低磷相关基因GmACP2的重组质粒，是将大豆耐低磷相关基因GmACP2插入pFGC5941植物过量表达载体中而成的。

进一步地，本发明提供了扩增所述大豆耐低磷相关基因GmACP2全长或其任意片段的引物对，该引物对的上游引物如序列表Seq ID No.3所示，下游引物如序列表Seq IDNo.4所示。

进一步地，本发明提供了所述的大豆耐低磷相关基因GmACP2或所述重组质粒在大豆抵抗磷胁迫作用中的应用。

进一步地，本发明提供了所述的大豆耐低磷相关基因GmACP2或所述重组质粒在培育磷高效大豆品种中的应用。

3、有益效果

⑴本发明所提供的大豆耐低磷相关基因GmACP2在大豆根中表达量最高，且在低磷胁迫条件下磷高效大豆材料中表达量显著上调，而在低磷敏感材料中表达量下调。利用发根农杆菌介导的转化系统将携带有本发明GmACP2的植物表达载体转化大豆毛状根，与对照相比过表达GmACP2的大豆毛状根的根毛的数量增加，根系磷酸酶的活性及磷吸收量也显著增加，说明GmACP2基因可能参与调控大豆根系对低磷胁迫的适应性。

⑵本发明所提供的大豆耐低磷相关基因GmACP2，位于第8号染色体上，读码框长度为789bp；其编码的蛋白262；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明GmACP2基因导入植物细胞，可获得耐低磷胁迫能力显著提高的转基因植株；

⑶使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)；

⑷携带有本发明GmSPX1的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株；被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物；

⑸本发明的基因对大豆体内磷元素代谢有积极的调控作用，特别的在培育高磷吸收大豆品种育种中具有重要意义。

附图说明

图1：不同磷效率基因型间GmACP2基因表达量差异图；

注：纵坐标为GmACP2基因在低磷(-P)和高磷(+P,control)处理7天后表达量的比值。红框为耐低磷材料(Nannong94-156，B20和Kefeng1)，蓝框为磷敏感材料(Bogao,B18和Suxie1)。

图2：pFGC5941的质粒图谱；

图3：含有GmACP2的植物表达载体的部分结构示意图；

图4：转化大豆毛状根PCR鉴定电泳图；

注：M，Marker；CK，以转入空载pFGC5941的大豆毛状根DNA为模板；1-7，以各个转基因植株DNA为模板。

图5：转基因根系酸性磷酸酶活性检测图；

注：转基因植株与对照在加入PNPP的营养液中处理48小时后根系的原位染色，溶液呈黄色表示根系分泌的酸性磷酸酶含量高。

图6：缺磷条件下过表达GmACP2的大豆毛状根的APA活性(A)，干重(B)，磷含量(C)，磷的利用效率(D)和根毛密度(E)图。

注：*，P≤0.05；**，P≤0.01；CK，转入空载pFGC5941的大豆毛状根；J-3和J-4，转GmACP2的大豆毛状根。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：大豆耐低磷相关基因GmACP2的克隆

(1)设计引物，提取RNA，反转cDNA：

用植物总RNA提取试剂盒(DP432，天根)提取大豆材料南农94-156(耐低磷大豆种质)叶片总RNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成参照TaKaRa PrimerScript^TMRT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒说明操作。设计引物如下:

Seq ID NO.3：GmACP2-F 5’-ATGTCTGGAATTGTGGTT-3’；

Seq ID NO.4：GmACP2-R 5’-TTAAGCAGAGACAGACAG-3’。

(2)PCR扩增，具体步骤如下：

步骤一：按照以下组份顺序配制PCR反应液(50μl体系)：10×PCR Buffer(25μl)，ddH₂O(9μl)，dNTP(10μl)，GmACP2-F(1.5μl)，GmACP2-R(1.5μl)，cDNA(2μl)，KOD FX酶(1μl)；

步骤二：反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，设定反应程序为：94℃变性2min；再98℃ 10sec，53℃ 30sec，68℃ 2min，共33个循环；然后68℃延伸7min；4℃保存；

步骤三：PCR产物回收后经连接PMD19-T载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5α、蓝白斑筛选、摇菌、测序，序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：大豆耐低磷相关基因GmACP2的荧光定量分析

(1)大豆耐低磷品种南农94-156和B20及大豆低磷胁迫敏感材料波高和B18在水培生长条件下，进行正常生长与低磷胁迫两种处理，正常条件为二分之一Hogland营养液，胁迫处理为二分之一的Hogland营养液(其中用KCl代替KH₂PO₄)，7天后采集根与叶样品液氮速冻并于-80℃保存；总RNA的提取及cDNA的反转同实施例1；

(2)设计引物

针对GmACP2基因序列设计荧光定量特异性引物为：

Seq ID NO.5：上游引物5'-GGTGGACATCTATCAAAAACAAATACAT-3'；

Seq ID NO.6：下游引物5'-TTTATCCTTTTGTGGCAATTCCTTAT-3'。

内参基因选用Tubulin，引物序列如下：

Seq ID NO.7：上游引物5’-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3’；

Seq ID NO.8：下游引物5’-CACTTACGCATCACATAGCA-3’。

(3)荧光定量PCR扩增，具体步骤如下：

步骤一：按照以下组份顺序配制PCR反应体系(20μl体系)：引物(各0.5μl)、H₂O(RNase free)(8μl)、PCR SYBR MIX(QPK-201；TOYOBO)(10μl)和cDNA(1μl)；

步骤二：按以下程序使用ABI 7500 system型荧光定量PCR仪进行PCR反应：95℃5min；然后再95℃ 15sec，60℃ 30sec共40个循环；

步骤三：运用SDS软件(V2.3)分析数据，结果采用2^-ΔΔCt(Livak，2001)方法进行基因表达相对定量。如图1所示，在低磷胁迫条件下，GmACP2在磷高效材料(如NN94-156，B20)中表达量显著升高8-18倍，而在低磷敏感材料(如Bogao，B18)中，表达量显著下调3-23倍。

实施例3：转GmACP2基因的大豆毛状根的获得

(1)选择XhoI和XbaI酶切位点，将实施例1中克隆的GmACP2全长序列正向插入pFGC5941(如图2所示)的CaMV35S启动子后，构建成重组植物表达载体pFGC5941-GmACP2(如图3所示)。

(2)用冻融法分别将pFGC5941-GmACP2和空载质粒pFGC5941转入发根农杆菌菌株K599(BioVector NTCC Inc.)中，pFGC5941-GmACP2和pFGC5941分别通过发根农杆菌K599介导的遗传转化系统转化大豆，具体方法如下：

步骤一：育苗：选择均匀一致的大豆种子，用氯气灭菌15小时，置于25℃光照培养箱12h/d光照条件下蛭石育苗；

步骤二：毛状根的诱导：将-80℃保藏的菌种在YEP固体培养基+卡那霉素(50mg/L)上划线，28℃下过夜培养后挑取单菌落于YEP+卡那霉素液体培养基中，220r/min、28℃下过夜振荡培养，选取菌落生长旺盛的菌液用于侵染试验；为了避免种子质量和播种深度的影响，选择长势一致、5d苗龄的大豆幼苗，每个大豆基因型60株，用注射器针头将发根农杆菌菌液注射大豆下胚轴3次；接种完毕后，置于含有通风孔和透明罩的育苗盆内保湿，28℃恒温、14h/d光照条件下进行毛状根的诱导；12天后，接种部位长出毛状根；去掉初生根，将形成的大豆“复合体”植株移入1/4中Hogland营养液中生长5天；

步骤三：低磷胁迫处理：在1/4中Hogland营养液中生长5天后，将转基因苗与转空载的苗移入低磷处理(1/4中Hogland营养液，其中用0.25mM肌醇六硫酸代替KH₂PO₄，25℃，12h/d光照)；每三天换一次营养液；低磷胁迫7天后，测定酶活性，磷含量等相关表型；

步骤四：阳性鉴定：以35S启动子+GmACP2基因为目的序列设计特异引物通过PCR鉴定阳性转化株系，鉴定结果如图4所示，引物序列如下：

Seq ID NO.9：上游引物5'-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3'；

Seq ID NO.10：下游引物5'-CACTTACGCATCACATAGCA-3'。

实施例4：GmACP2基因的功能验证

(1)在上述低磷胁迫处理5天时，将6株转基因株系及6株对照(转空载植株)移入加有对硝基苯磷酸二钠(PNPP，终浓度为0.25mmol/L)的1/4的Hogland营养液(0.25mM肌醇六硫酸代替KH₂PO₄)；根避光处理48h，25℃，12h/d光照；随后加入500μL1mol/L的NaOH溶液终止反应，比较处理和对照营养液颜色的深浅变化及测定根系酶活性；如图5所示，与对照相比培养转基因根系的溶液的指示黄色更深，结果表明过表达GmACP2的大豆毛状根能够分泌更多的酸性磷酸酶。

(2)取新鲜幼叶或根尖约0.2g放入冰冻研钵内，加入液氮研磨至粉末，加入1.5ml的0.1mol/L缓冲液(1mol/L冰醋酸溶液28.82ml和0.3mol/L醋酸钠溶液273.3ml，PH值4.0)继续研磨混匀，倒2.0ml离心管，在冰冻离心机4℃、12000r/min离心30min；取20μl上清液，加入480μl酶反应液(0.1mol/L缓冲液和0.25mmol/L硝基苯磷酸二钠溶液p-NPP)，30℃黑暗反应30min，加入0.2ml的2mol/LNaOH溶液终止酶促反应；吸取100μl加入酶标板检测孔内，设空白对照，p-NP标准浓度(0.005,0.01,0.015,0.02,0.025μmol/L)，在405nm波长下由酶标仪测定吸光值，从而检测APA活；如图6A所示，结果表明过表达GmACP2的大豆毛状根的APA活性显著增加。

(3)把植株分为地上部分和地下部分，放在烘箱内在105℃下杀青一小时，之后在60℃下烘干到恒重，再用电子天平称量干重；如图6B所示，结果表明过表达GmACP2的大豆毛状根干重显著增加。

利用AA3型连续流动分析仪测定磷含量，具体方法如下：

1、消煮(利用H₂SO₄-H₂O₂)

称取烘干、磨细，过0.50mm筛的植物样品0.2g，送入50mL消煮管中，先滴入1ml蒸馏水湿润样品，再加5mL浓硫酸，摇匀(放置过夜)，瓶口盖一弯颈小漏斗；次日，在电炉上初始温度250度左右先缓缓加热，待浓硫酸分解冒大量白烟时升高温度至330度再到380度；消煮至溶液呈均匀的棕黑色时，取下消煮管，稍冷后提起弯颈漏斗，滴加30％双氧水10数滴，并不断摇动消煮管，至溶液呈无色或清亮后，再加热5-10min(以赶尽剩余的H₂O₂)；取下消煮管冷却，用少量水冲洗漏斗，洗液流入消煮管中；将消煮液无损地洗入100ml容量瓶中，用水定容，摇匀；转移到小塑料管中，供氮、磷、钾测定；每批消煮时，均进行空白试验，以校正试剂和方法的误差。

2、AA3型连续流动分析仪测定磷含量

试剂配制：①钼酸铵溶液：溶解6.2g钼酸铵、0.17g酒石酸钾锑，溶解稀释至1L，储存于棕色瓶中；②盐溶液：溶解5g氯化钠于800mL去离子水中.定容至1000mL(去掉仪器所附方法中的硫酸)；③系统润洗液(0.2％SDS)：溶解2g SDS于l 000mL去离子水中(去掉仪器所附方法中的硫酸)；④抗坏血酸溶液：溶解1g抗坏血酸(仪器所附方法中用量为1.5g)于去离子水中并稀释至100mL(当天配制)，置于棕色瓶中；⑤清洗液：5％硫酸。

测定参数设置：根据仪器软件说明书进行操作，选择防酸进样针和高浓度进样管，设置进样速率50个样/h；进样与清洗比为2.6:1；测氮和测磷滤光片波长均为660nm，进样时间45s，平滑度均设零，磷主峰高度设为85％，通道均设置基线和漂移校正，自动基线参比为5％、样品初始峰延迟时间5min；灯强度均设置为大于1000mV。标准曲线制作：用磷酸二氢钾配制浓度1000mg.L^-1的P标准贮液，测定时配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg.L^-1浓度标准P溶液，按照上述条件进行测定，仪器测定峰高与标准溶液P浓度之间进行线性回归，制作校准曲线，相关系数r＝0.9999。

如图6C所示，测定结果表明过表达GmACP2的大豆毛状根的磷含量显著增加。

磷利用效率等于1/组织磷浓度，表示每毫克磷产生干物质的量；如图6D所示，结果表明过表达GmACP2的大豆毛状根的磷利用效率显著提高；除此之外，如图6E所示，低磷胁迫处理7天之后，过表达GmACP2的大豆毛状根的根毛密度显著增加，结合显著增加的地上部分干物质的量与吸磷量，说明根毛密度受到磷有效性的影响，过表达GmACP2能显著诱导根毛的增加和伸长。

Claims (2)

1.一种大豆耐低磷相关基因GmACP2在大豆抵抗磷胁迫作用中的应用，其特征在于，所述耐低磷相关基因GmACP2的核苷酸序列如序列表SeqIDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种大豆耐低磷相关基因GmACP2在大豆抵抗磷胁迫作用中的应用，其特征在于，所述应用还包括在培育磷高效大豆品种中的应用。

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