CN110016479B

CN110016479B - 一个紫花苜蓿MsGPF基因

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Publication number: CN110016479B
Application number: CN201910411746.4A
Authority: CN
Inventors: 杜红旗; 冯长松; 徐照学; 房卫平; 娄治国; 袁华祎
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2039-05-17
Also published as: CN110016479A

Abstract

本申请属于苜蓿基因组技术领域，具体涉及一个紫花苜蓿生长相关MsGPF基因专利申请事宜。该基因的DNA序列长度为1782bp，其中包含8个外显子和7个内含子。该基因与植物生长发育相关。本申请中，发明人在筛选鉴定叶片中调控紫花苜蓿秋眠性关键基因过程中，通过转录组测序获得了大量的未知核酸序列，对这些未知序列分析和研究过程中，发明人发现本申请欲请求保护的MsGPF基因在秋眠型苜蓿秋眠时期叶片中含量显著低于未秋眠时的含量和秋季时非秋眠型苜蓿叶片中的含量，进一步通过转基因技术证明该MsGPF基因的高表达可促进苜蓿的生长。基于此特性，可为高产苜蓿品种培育和苜蓿品种改良奠定良好技术基础。

Description

一个紫花苜蓿MsGPF基因

技术领域

本申请属于苜蓿基因组技术领域，具体涉及一个紫花苜蓿生长相关MsGPF基因专利申请事宜。

背景技术

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种世界上广泛种植的多年生豆科牧草。生产应用中，为适应饲喂需要，在其栽培和品种选育中考虑的首要指标是秋眠性。紫花苜蓿的秋眠性是指夏末秋季由于日照时间缩短和温度下降，其植株表现为缓慢匍匐生长或停止生长的一种特性。根据苜蓿秋眠特定时期刈割后植株的再生高度，将其分为三种类型：秋眠型苜蓿（秋眠1-3级）、半秋眠型苜蓿（秋眠4-6级）和非秋眠型苜蓿（秋眠7-9级）。后来又扩展到11 个秋眠级别（10-11 级），其中包括 2 个极不秋眠品种。

基因工程是研究植物生长发育的重要技术手段之一，也是未来品种改良和品种培育的重要技术手段之一。对于紫花苜蓿的相关基因研究工作目前尚较为有限，急需就特定功能性基因进行深入挖掘和开发，以为将来新品种培育奠定基础。

发明内容

本发明目的在于提供一个紫花苜蓿生长相关的MsGPF基因，从而为苜蓿基因组、特定功能性基因开发以及苜蓿新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一个紫花苜蓿MsGPF基因，该基因的DNA序列长度为1782bp，具体如SEQ ID NO.1所示，其中包含8个外显子和7个内含子；该基因的cDNA序列长度为991bp，具体如SEQ ID NO.2所示；其中CDS区长度为663bp，共编码220个氨基酸，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述紫花苜蓿MsGPF基因的制备获得方法，通过PCR扩增方法制备获得，具体包括如下步骤：

（1）提取基因组

以紫花苜蓿WL903品种叶片为样品，提取其基因组DNA；

（2）设计扩增用引物；

设计扩增用引物序列如下：

MsGPF DNA-s: 5’-ATTCTTTCAAAAAAAAAAAAATTC-3’，

MsGPF DNA-a: 5’- CGACACAAAAGCCATTTCATAG-3’；

（3）PCR进行扩增

以步骤（1）中所制备的DNA为模板，利用步骤（2）中所设计引物，进行PCR扩增，扩增产物即为MsGPF基因。

需要介绍的时，前期研究过程中，针对MsGPF基因的cDNA获得，是通过对苜蓿叶片RNA-seq结果中未注释核酸序列采用RACE法扩增获得的，即，根据苜蓿WL903的叶片样品中未注释RNA-seq核酸序列，设计了特异性引物序列如下：

GSP1: 5’-GATTACGCCAAGCTTATTTTCACTCTGGGCATTGGCTGATGC-3’，

GSP2: 5’-GATTACGCCAAGCTT TGCCTCCACCCATGCGGAACGAACGAG-3’；

然后参考说明书，利用the SMARTer® RACE 5’/3’试剂盒Cat. Nos. 634858(Clontech Laboratories, Inc.)，同时基于5’RACE 和 3’RACE各自的反转录特性进行特异性的PCR扩增获得了cDNA序列；所述RNA-seq结果中未注释核酸序列，具体如下：

ATTCTTTCAAAAAAAAAAAAATTCAACAACTCAGAAAAGAAAACCTAGGGTTCCGCGGAATCGAAAGAGAAGAAAAGAGAGGATTTTAGGGTTTTCAATTCAACAACTCGTTCGTTCCGCATGGGTGGAGGCAGCAAAAGCCGAACAAAAAAGAAATCCAAGTCTATGAAGAAGAAACTGACATCTTCTGAACGTCAATCTATTTATGATCAGATTTATGGTCAGGTACTATCTGATATACAAGCCAAAAAAGTAGCAGAAGAAGAGGAAGCCCGTCGATTAGCAGAAGAGGCTCTTGCTAAAAAAAAAGCAGAAGAAGAAGAAGCCCGTCGATTAGCAAAAGAGGCTCTTGCTCAAAAAAAACTGCAGGCCCGCAAAGCAAAAGAGGCAGCAGAAAAGACTCGTACTCTATTTTCACTCTGGGCATTGGCTGATGCAATGCGCCGTTCTTACTACCCAGACATGACTAGAGAAACGCTTTTTCGAAAACTTGCAAAATCTACAAACACAGCCCTGGACCATG。

所述紫花苜蓿MsGPF基因在植物生长培育中的作用，MsGPF与植物生长发育相关；具体与植物株高、植株直径、叶面积等生长特性相关；进一步而言，通过转基因技术将MsGPF超表达后，可促进植物（例如苜蓿，进一步例如转入苜蓿驯鹿品种）的生长。

一种提高苜蓿生长特性的转基因品种培育方法，利用基因工程技术手段，借助于表达载体将MsGPF基因在目标植物内进行表达，从而提高其生长量；所述表达载体，具体例如为：pCAMBIA3301；所述目标植物，具体例如为苜蓿驯鹿品种。

本申请中，发明人在筛选鉴定叶片中调控紫花苜蓿秋眠性关键基因过程中，通过转录组测序获得了大量的未知核酸序列，对这些未知序列分析和研究过程中，发明人发现本申请欲请求保护的MsGPF基因在秋眠型苜蓿秋眠时期叶片中含量显著低于未秋眠时的含量和秋季时非秋眠型苜蓿叶片中的含量，进一步通过转基因技术证明该MsGPF 基因的高表达可促进苜蓿的生长。基于此特性，可为高产苜蓿品种培育和苜蓿品种改良奠定良好技术基础。

附图说明

图1为本申请所提供MsGPF的PCR扩增后电泳图；

图2为本申请所提供MsGPF过表达后阳性驯鹿植株生长表现。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

秋眠型9级苜蓿WL903品种的叶片样品获得过程为：将种植于大田三块试验地中的秋眠型9级苜蓿WL903品种（生长期间进行良好灌溉但未施肥，人工除杂草）分别在5、9月份刈割后第14天取叶片，并将样品立刻放于液氮罐中，回实验室后-80℃冰箱中储存备用。

实施例1

发明人在筛选鉴定叶片中调控紫花苜蓿秋眠性关键基因中，通过测序工作获得了大量的未知核酸序列，经分析发现部分未知序列中含有大的可编码区和完整编码区，进一步结合部分基因在不同生长阶段表达量差异情况，依据表达量差异倍数和可编码序列长度和完整性从众多的未知序列中选定了1个未知基因序列，并将其命名为MsGPF基因。

初步基因表达分析表明，MsGPF基因在秋眠型苜蓿秋眠时期叶片中含量显著低于未秋眠时的含量和秋季时非秋眠型苜蓿叶片中的含量，因此初步分析认为MsGPF可能与苜蓿生长高度性状相关。为进一步确定MsGPF基因的表达特性及其结构功能，发明人进一步利用PCR扩增技术以及RACE法克隆获得了MsGPF基因序列并对其进行了初步分析，相关实验过程简要介绍如下。

（一）基因组DNA以及总RNA的提取

利用植物基因组DNA提取试剂盒 9768 (Takara Bio, Inc.) ，参考其说明书，提取获得苜蓿样品叶片基因组DNA，具体操作可参考如下：

（1）首先在离心管中加入100mg液氮冷冻粉碎后的植物样品，500ul的Buffer HS I和10μL的50×DTT Buffer；混合均匀后，加入10μL的RNase A (10mg/ml)，充分振荡混匀，于56℃水浴温育10分钟；

（2）加入62.5μL的Buffer KAC （Buffer HS I或Buffer HS I I的1/8），充分混匀；然后冰上放置5分钟，12000rpm离心5分钟；取上清，加入与上清液等体积的Buffer GB，充分混匀；

（3）将Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；洗涤两次，每次操作为：

将500μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；

将500μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；

（4）将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心2分钟；然后将SpinColumn安置于1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入20-50ul的ElutionBuffer或灭菌水，室温静置5分钟；

12000rpm离心2分钟洗脱DNA。

最后对所洗脱的基因组DNA采用电泳方式或测定吸光度方式进行定量测定。

提取总RNA时，利用TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 试剂盒，参考其说明书进行提取操作，具体操作步骤可参考如下：

（1）取液氮冷冻粉碎后100mg组织样品，加入至含有1.2ml Trizol的离心管中，混合均匀后，室温静置不少于5分钟；

（2）加入300μL氯仿，剧烈震荡混匀，室温静置10分钟，4℃、12000g离心15分钟；

（3）将上清液转移到新的2ml离心管中，加入等体积异丙醇（约800μL）；上下颠倒混匀，置-20℃冰箱放置2小时； 4℃、12000g离心30分钟；

（4）去掉上清液，沉淀用2ml 的75%乙醇洗涤（将沉淀飘浮起来即可，不需打碎）；4℃、12000g离心15分钟；弃掉乙醇，室温干燥沉淀3分钟，溶于DEPC水，检测分装后直接应用或者-70℃冰箱中保存备用。

（二）合成制备cDNA

首先设计特异性引物序列如下：

GSP1: 5’-GATTACGCCAAGCTTATTTTCACTCTGGGCATTGGCTGATGC-3’，

GSP2: 5’-GATTACGCCAAGCTT TGCCTCCACCCATGCGGAACGAACGAG-3’；

参考说明书，利用the SMARTer® RACE 5’/3’试剂盒Cat. Nos. 634858(Clontech Laboratories, Inc.)，同时基于5’RACE 和 3’RACE各自的反转录特性进行特异性的反转录以合成第一链cDNA，具体操作参考如下：

（1）分别配制Buffer Mix、5’RACE 第一条cDNA 链的合成试剂、3’RACE 第一条cDNA 链的合成试剂：

Buffer Mix：DTT (100 mM)，0.5μL；dNTPs (20 mM)，1μL；5X First-StrandBuffer，4μL；

5’RACE 第一条cDNA 链的合成试剂（共11μL）：

无菌H₂O，5μL；

5’-CDS Primer A，1μL；

RNA，5μL；

3’RACE 第一条cDNA 链的合成试剂（共12μL）：

无菌H₂O，6μL；

3’-CDS Primer A，1μL；

RNA，5μL；

（2）将5’RACE 第一条cDNA 链的合成试剂、3’RACE 第一条cDNA 链的合成试剂分别进行变性预处理，处理方式为：

72℃热浴3min，42℃冷却2 min；冷却后，14000 ×g 下离心10 sec；

处理完成后，为使反应体系一致，在5‘RACE cDNA 合成反应试剂中，添加1μL 的SMARTer II A Oiigonucleotide；

（3）分别配制5‘RACE 和3‘RACE cDNA 合成反应液，8μL体系设计如下：

Buffer Mix，5.5μL；

RNase Inhibitor (40 U/μl), 0.5μL；

SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U), 2μL；

分别将此8μL体系加入到步骤（2）中变性处理后的5’RACE 第一条cDNA 链的合成试剂和3’RACE 第一条cDNA 链的合成试剂中，以构成20μL反应体系，

42℃孵育90 min，再70℃加热10 min；

最后利用Tricine-EDTA Buffer 稀释步骤（3）中所合成的第一链cDNA。

利用所合成的第一链cDNA，利用PCR扩增方式，进一步分别进行5’-RACE 和3’-RACE末端扩增，

PCR扩增过程中，50μL扩增体系设计为：

PCR-Grade H₂O，15.5μL；

2X SeqAmp Buffer，25.0μL；

SeqAmp DNA Polymerase，1.0μL；

5’- RACE-cDNA第一链产物（或3’-RACE- cDNA第一链产物），2.5 μL；

10X UPM，5 μL；

5’ GSP（或3’ GSP） (10 μM)，1 μL；

PCR扩增程序为：94℃、30 sec，68℃、30 sec，72℃、3 min；25个循环。

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR扩增产物，连接至pMD18-T easyvector (Takara Bio, Inc.)，鉴定正确后最后由上海生工公司测序，最终cDNA序列由5’RACE获得的序列、3’RACE获得的序列、RNA-seq获得的序列三个序列拼接而得。

所述RNA-seq序列，具体如下：

（三）PCR扩增获得MsGPF基因

首先设计扩增用引物序列如下：

MsGPF DNA-s: 5’-ATTCTTTCAAAAAAAAAAAAATTC-3’，

MsGPF DNA-a: 5’- CGACACAAAAGCCATTTCATAG-3’；

以步骤（一）中所获得的DNA为模板，利用上述引物，以及利用2×Taq plus PCRMaster Mix PT302试剂盒进行PCR扩增，

PCR扩增时，50μL扩增体系设计如下：

H₂O，18μL；

MsGPF DNA-s (10umol/L)，1μL；

MsGPF DNA-a (10umol/L)，1μL；

2×PCR master Mix，25μL；

基因组DNA (40ng/μL )，5μL；

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR扩增产物，连接至pMD18-T easy vector(Takara Bio, Inc.)，鉴定正确后由上海生工公司测序，最终获得MsGPF基因的DNA序列，其序列长度为1782bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

MsGPF的DNA序列：

ATTCTTTCAAAAAAAAAAAAATTCAACAACTCAGAAAAGAAAACCTAGGGTTCCGCCGAATCGAAGGAATTTCAGAAGAGAAGAGAAGAAAAGAGGATTTTAGGGTGAAATTTCCATTTCCTAATCATTCTCTTTCGTTCTTGTTTCAATTTCCAATTTCGTTCTTCGATTCTGTCCTTTTCAGGTTTTCAATTCAGCAAGAAGAGAAGAAAAGAGAGGATTTTAGGGTGAAATTTCCGTTCCCGTTCGTTCCCATGGGTGGAGGCAGCAAAAGCCGAACAAAAAAGAAATCCAAGTCTAAGAAGAAGAAACTGAGTCTGTTCCTCTCTCTATCTATCTATCTTTTCCAATTTTCATAACATTTAGTATTTATCTTTCAACTAATTCCATTTTTTATTTTTATTTTGTAGCATCTTCTGAACGTCAATCTATTTATGATCAGATTTATCGTCAGGTGTGTTTAATTTGGTTATGGTAACAAAAACTTATAACATAATGATGATGATGATGATCTTGGTTCTCTGTATAGGTACTATCTGATATACAAGCCAAAAAAGTAGCAGAAGAAGAGGAAGCCCGTCGATTAGCAGCAGAGGCTCTTGCCCAAAAAAAACTGCAGGCCCGCAAAGCAAAAGAGGCAGCAGAAAAGACTCTTGCTCTAAATTCACTCTGGTCATTGGCTGATGCAATGCGCTGTCATTCCTACCCAAACATGACTACAAAAACGCTTTTTCTAAAACTTGCAAAATCTACAAACACAGCCGTAGGTTTTCTTAAAAATTGCTCTAGGATTGTCTTGTCCTTTCCTTACTAAGAAACAACGTGCTTGAATTTTGAATTTATTCATGAAATTTTGTAATCTGTATGCAGCTGGACCATGAAGATGATACGCTTTTTCGAAAACTTGCAAAAGCTACAAACACAGCCGTAGGTTTTCTTAAAAATTCCTCTAGGATTGTCTTGKCCTTTCCTTACTAAGAAACAACGTGCTTGAATTTTGAATTTATTCATGAAATTTTGTAATCTGTATGCAGCTGGACCATGAAGATGATACAGCTCCACCAATTCAACCTGTGCACATGCCAACACAATATGGCAAGGTGGTGAGCCTTCTACAAGACTTTTTTTTATTTTTATATGACCTGCATAAACCTATCTCCTGTTCATGAAACTGCCTAATGTGTGTGTCTGGATATTAGTTGAATGCAACCTGAACATTCATGTCAATCAATAAGTATACCACTTCTATTCACTTTTCATCTTGAAGTCAGTGTTAACTTACTTTGTACTCAGTGATTCAAACATAGCCATAGCTTTTCTTTAAAATTGGGATACTTCTTGCTAATACACCAAATGGAGAGAGCCTTAGGCAATGCCCTCTAGGACTGTCTTCTTTCCTTACTTATAAGAAATTAAGCAAAAGGGACGTGCTTCAATTTTTAATTATGTATTTGCAGGTCAACTATGAAAATGATATGAAGCCCTTGGATGCCAGCAGCAGCCAGCCGTTGGATGAGCTCAACAAGTCAACACAAAACATTAGCCTTGAGGATAAAGCTGCTGTTCAGGAGGGGGGTATTGGCAGCGCCCAACTACTCTAGATATTGGACCTAGGTTTATTATTTTGTGTCGCATAGCCTAGTTGTTGCAAGTGTACTATGAAATGGCTTCTGGAGTAAGCGAGCAACCAGAGAAACAATATTTATAACTAATAGTGTGGCTTTGTAATATGTTCTGAATCCTTCTACTTCCTATGCATACTATG

AAATGGCTTTTGTGTCG。

而如前所述，该基因的cDNA序列长度为991bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

MsGPF的cDNA序列：

ATTCTTTCAAAAAAAAAAAAATTCAACAACTCAGAAAAGAAAACCTAGGGTTCCGCGGAATCGAAAGAGAAGAAAAGAGAGGATTTTAGGGTTTTCAATTCAACAACTCGTTCGTTCCGCATGGGTGGAGGCAGCAAAAGCCGAACAAAAAAGAAATCCAAGTCTATGAAGAAGAAACTGACATCTTCTGAACGTCAATCTATTTATGATCAGATTTATGGTCAGGTACTATCTGATATACAAGCCAAAAAAGTAGCAGAAGAAGAGGAAGCCCGTCGATTAGCAGAAGAGGCTCTTGCTAAAAAAAAAGCAGAAGAAGAAGAAGCCCGTCGATTAGCAAAAGAGGCTCTTGCTCAAAAAAAACTGCAGGCCCGCAAAGCAAAAGAGGCAGCAGAAAAGACTCGTACTCTATTTTCACTCTGGGCATTGGCTGATGCAATGCGCCGTTCTTACTACCCAGACATGACTAGAGAAACGCTTTTTCGAAAACTTGCAAAATCTACAAACACAGCCCTGGACCATGAAGATGATACGCTTTTTCAAAAACTTGCAAAAGCTACAAACACAGCCCTGGACCATGAAGATGATACAGCTTCACCAATTCAACCTGTGCACATGCCAACACAATATGGCAAGGAGGTCAACTATGAAAATGATATGAAGCCCTTGGATGCCAGCAGCAGCCAGCCGTTGGATGAGCTCAACAAGTCAACACAAAACGTTAGCCTTGAGGGTAAAGCTGCTGTTCAGGAGGGGGGTATTGGTAGCGCCCAACTACTCTAGATATTGGACCTAGGTTTATTATTGTGTGTCGCATAGCCTAGTTGTTGCAAGTTTACTATGAAATGGCTTTTGGAGTAAACGAGCAACCAGAGAAACAATATTTATAACTAATAGTGTGGCTTTGTAATATGTTTTGAATCCTTCTACTTCCTATGCATACTATGAAATGGCTTTTGTGTCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

针对此cDNA序列，其CDS区长度为663bp，共编码220个氨基酸，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

MsGPF的氨基酸序列：

MGGGSKSRTKKKSKSMKKKLTSSERQSIYDQIYGQVLSDIQAKKVAEEEEARRLAEEALAKKKAEEEEARRLAKEALAQKKLQARKAKEAAEKTRTLFSLWALADAMRRSYYPDMTRETLFRKLAKSTNTALDHEDDTLFQKLAKATNTALDHEDDTASPIQPVHMPTQYGKEVNYENDMKPLDASSSQPLDELNKSTQNVSLEGKAAVQEGGIGSAQLL。

基于NCBI中相关工具，对上述所获得的具体cDNA、DNA序列进行分析，分析过程中：利用DNAsist2.2软件分析MsGPF中外显子和内含子的结构组成；利用ORF finder功能分析MsGPF的开放阅读框(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)；利用GeneRunr软件分析编码蛋白的分子量和等电点；利用Blast比对进行了同源分析。具体结果如下：

MsGPF基因中，包括8个外显子和7内含子；其cDNA序列长度为991bp；MsGPF的CDS区长度为663bp，编码220个氨基酸，所编码蛋白的分子量约为24.3 kD，等电点是9.03。

同源序列比对表明：蒺藜状苜蓿的一条序列与MsGPF的DNA序列有75%覆盖度，覆盖序列的同源性98%；而 cDNA序列可比对到生物信息学分析预测的三个蒺藜状苜蓿的基因序列（XM_003621234.3，AC150777.2，XM_024770299.1），覆盖度分别为88%、81%、72%，覆盖序列的同源性分别是95%和98%，93%；氨基酸序列比对到蒺藜状苜蓿中的两个假设蛋白（xp003621282.2、ABD32736.1），同源性仅为77%和78%。因而基于这些比对结果，可以认为本申请所提供的MsGPF属于一个新的未报道过的基因。

实施例2

在实施例1基础上，发明人分析认为该MsGPF基因具有调节苜蓿生长功能，为此，发明人进一步进行了转基因验证，对该基因进行了超表达，以验证其是否具有促生长功能，相关验证过程简要介绍如下。

（一）构建过表达载体

首先设计带有合适酶切位点的引物如下：

正向引物S- NcoI：5’-CCATGGGTGGAGGCAGC-3’，

反向引物A-pmlI：5’-CACGTG CTACAGCAGCTGCGCGC-3’；

以实施例1中所提取的苜蓿基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增；PCR扩增时，50μL扩增体系设计如下：

H₂O，18μL；

正向引物S- NcoI (10umol/L)，1μL；

反向引物A-pmlI: (10umol/L)，1μL；

2×PCR master Mix，25μL；

基因组DNA (40ng/μL )，5μL；

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，参考现有常规技术与pMD18T克隆载体连接，得到阳性克隆质粒pMD18T-MsGPF。

然后利用NcoI和pmlI内切酶分别对过表达载体pCAMBIA3301和质粒pMD18T-MsGPF进行双酶切（37℃下酶切2h），并回收酶切产物（带粘性末端的线性pCAMBIA3301和MsGPF）；

酶切过程中，50μL的双酶切体系设计如下：

ddH₂O，10μL；

NcoI酶，2.5μL（20U）；

pmlI酶，2.5μL（20 U）；

表达载体pCAMBIA3301（或质粒pMD18T- MsGPF），30μL；

缓冲液，5μL。

再次，利用T4连接酶16℃条件下过夜连接带粘性末端的线性pCAMBIA3301和MsGPF，10μL体系设计如下：

酶切载体，2μL；

目的基因，6μL；

连接酶，1μL；

缓冲液，1μL；

最后，参考现有技术，将连接产物转化DH5α感受态细胞后，挑取阳性单菌落，依次通过菌液PCR鉴定，和对阳性菌液中质粒提取后的NcoI和pmlI双酶切鉴定来确保获得重组正确的过表达载体pCAMBIA3301- MsGPF。

（二）构建过表达工程菌

将所构建的重组过表达载体pCAMBIA3301- MsGPF转化农杆菌LBA4404，筛选、验证获得转化正确的过表达工程菌LBA4404-pCAMBIA3301- MsGPF），具体过程简要介绍如下。

取1μg左右步骤（一）中所构建的重组过表达载体pCAMBIA3301- MsGPF，加入到100μL 农杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴30min，液氮中放置10min；

再37℃水浴5min，接着冰浴2min；

加入800mL的YEB液体培养基，28℃、175rpm摇培3h后涂在含50μg/mL 卡那霉素的YEB平板上，28℃培养到形成单菌落。

参考现有技术，首先采用菌液PCR方式（采用正向引物S- NcoI、反向引物A-pmlI作为引物对进行PCR）鉴定阳性菌落，再提取阳性菌液的质粒并进行NcoI和pmlI双酶切鉴定以确保获得正确重组的过表达工程菌。

（三）侵染转化幼苗

以秋眠1级苜蓿品种驯鹿（一种常见的秋眠型苜蓿品种）为实验对象（MsGPF基因来源的正常生长野生型以WL903表示，以此作为对照），具体侵染操作过程为：

挑选优质饱满的苜蓿种子在滤纸（加入无菌水保持滤纸湿润）上萌发，约4 d后（真叶出现之前），在超净工作台中用灭菌手术刀从子叶节节点处切除一片子叶，制造出伤口；

将受伤的幼苗50株放入20ml农杆菌工程菌液（OD₆₀₀=0.6~0.8左右），28℃、100rpm振荡器中侵染1h；

侵染后用镊子将幼苗取出置于无菌干燥滤纸上吸干工程菌液，将侵染后的幼苗转入不含抗生素的MS固体培养基中28℃、16h光照条件下培养。

同样操作条件下，取未转染操作的萌发苜蓿种子转入MS固体培养基中28℃、16h光照条件下培养，以此作为阴性对照。

（四）转基因幼苗鉴定和表型统计

待步骤（三）中侵染幼苗根长至10cm时，移栽到营养土中， 24℃、16h光照条件下培养（对照组同样标准和方式进行操作）。

参考前述操作，对生长良好幼苗植株基因组DNA进行提取，利用载体上的Bar基因引物进行PCR鉴定，进一步筛选确定阳性转基因幼苗。

待转基因阳性苗（实验组）和对照组完全成活并长至约40cm植株后刈割，刈割后10天观察植株表型，并记录株高、茎的直径和叶面积。

统计结果表明：同样生长期和生长条件下，就植株高度而言，阴性对照组植株仅高14~15cm，而转基因阳性实验组植株株高45cm-48cm，野生型WL903株高 42~43cm；就各实验组植株直径而言，阴性对照组植株平均直径1.8mm，而转基因阳性对照组植株平均直径3mm，野生型WL903平均直径2.5mm；就叶片面积指标而言，阴性对照组植株叶面积平均1.86cm²，转基因阳性实验组植株平均叶面积2.69 cm²，WL903平均叶面积2.38 cm²。

从上述数据对比可以看出，在将MsGPF基因转化其他苜蓿品种后，相较于未转基因植株而言，转基因阳性植株的再生高度变高，茎变粗和叶变大，表现出较好的促生长作用，甚至比该基因来源的野生型WL903植株生长指标更优，具有一定的增产效果，表现出较好的应用潜力。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一个紫花苜蓿MsGPF基因

<130> none

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1782

<212> DNA

<213> Medicago sativa

<400> 1

attctttcaa aaaaaaaaaa attcaacaac tcagaaaaga aaacctaggg ttccgccgaa 60

tcgaaggaat ttcagaagag aagagaagaa aagaggattt tagggtgaaa tttccatttc 120

ctaatcattc tctttcgttc ttgtttcaat ttccaatttc gttcttcgat tctgtccttt 180

tcaggttttc aattcagcaa gaagagaaga aaagagagga ttttagggtg aaatttccgt 240

tcccgttcgt tcccatgggt ggaggcagca aaagccgaac aaaaaagaaa tccaagtcta 300

agaagaagaa actgagtctg ttcctctctc tatctatcta tcttttccaa ttttcataac 360

atttagtatt tatctttcaa ctaattccat tttttatttt tattttgtag catcttctga 420

acgtcaatct atttatgatc agatttatcg tcaggtgtgt ttaatttggt tatggtaaca 480

aaaacttata acataatgat gatgatgatg atcttggttc tctgtatagg tactatctga 540

tatacaagcc aaaaaagtag cagaagaaga ggaagcccgt cgattagcag cagaggctct 600

tgcccaaaaa aaactgcagg cccgcaaagc aaaagaggca gcagaaaaga ctcttgctct 660

aaattcactc tggtcattgg ctgatgcaat gcgctgtcat tcctacccaa acatgactac 720

aaaaacgctt tttctaaaac ttgcaaaatc tacaaacaca gccgtaggtt ttcttaaaaa 780

ttgctctagg attgtcttgt cctttcctta ctaagaaaca acgtgcttga attttgaatt 840

tattcatgaa attttgtaat ctgtatgcag ctggaccatg aagatgatac gctttttcga 900

aaacttgcaa aagctacaaa cacagccgta ggttttctta aaaattcctc taggattgtc 960

ttgkcctttc cttactaaga aacaacgtgc ttgaattttg aatttattca tgaaattttg 1020

taatctgtat gcagctggac catgaagatg atacagctcc accaattcaa cctgtgcaca 1080

tgccaacaca atatggcaag gtggtgagcc ttctacaaga ctttttttta tttttatatg 1140

acctgcataa acctatctcc tgttcatgaa actgcctaat gtgtgtgtct ggatattagt 1200

tgaatgcaac ctgaacattc atgtcaatca ataagtatac cacttctatt cacttttcat 1260

cttgaagtca gtgttaactt actttgtact cagtgattca aacatagcca tagcttttct 1320

ttaaaattgg gatacttctt gctaatacac caaatggaga gagccttagg caatgccctc 1380

taggactgtc ttctttcctt acttataaga aattaagcaa aagggacgtg cttcaatttt 1440

taattatgta tttgcaggtc aactatgaaa atgatatgaa gcccttggat gccagcagca 1500

gccagccgtt ggatgagctc aacaagtcaa cacaaaacat tagccttgag gataaagctg 1560

ctgttcagga ggggggtatt ggcagcgccc aactactcta gatattggac ctaggtttat 1620

tattttgtgt cgcatagcct agttgttgca agtgtactat gaaatggctt ctggagtaag 1680

cgagcaacca gagaaacaat atttataact aatagtgtgg ctttgtaata tgttctgaat 1740

ccttctactt cctatgcata ctatgaaatg gcttttgtgt cg 1782

<210> 2

<211> 991

<212> DNA

<213> Medicago sativa

<400> 2

attctttcaa aaaaaaaaaa attcaacaac tcagaaaaga aaacctaggg ttccgcggaa 60

tcgaaagaga agaaaagaga ggattttagg gttttcaatt caacaactcg ttcgttccgc 120

atgggtggag gcagcaaaag ccgaacaaaa aagaaatcca agtctatgaa gaagaaactg 180

acatcttctg aacgtcaatc tatttatgat cagatttatg gtcaggtact atctgatata 240

caagccaaaa aagtagcaga agaagaggaa gcccgtcgat tagcagaaga ggctcttgct 300

aaaaaaaaag cagaagaaga agaagcccgt cgattagcaa aagaggctct tgctcaaaaa 360

aaactgcagg cccgcaaagc aaaagaggca gcagaaaaga ctcgtactct attttcactc 420

tgggcattgg ctgatgcaat gcgccgttct tactacccag acatgactag agaaacgctt 480

tttcgaaaac ttgcaaaatc tacaaacaca gccctggacc atgaagatga tacgcttttt 540

caaaaacttg caaaagctac aaacacagcc ctggaccatg aagatgatac agcttcacca 600

attcaacctg tgcacatgcc aacacaatat ggcaaggagg tcaactatga aaatgatatg 660

aagcccttgg atgccagcag cagccagccg ttggatgagc tcaacaagtc aacacaaaac 720

gttagccttg agggtaaagc tgctgttcag gaggggggta ttggtagcgc ccaactactc 780

tagatattgg acctaggttt attattgtgt gtcgcatagc ctagttgttg caagtttact 840

atgaaatggc ttttggagta aacgagcaac cagagaaaca atatttataa ctaatagtgt 900

ggctttgtaa tatgttttga atccttctac ttcctatgca tactatgaaa tggcttttgt 960

gtcgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 991

<210> 3

<211> 220

<212> PRT

<213> Medicago sativa

<400> 3

Met Gly Gly Gly Ser Lys Ser Arg Thr Lys Lys Lys Ser Lys Ser Met

1 5 10 15

Lys Lys Lys Leu Thr Ser Ser Glu Arg Gln Ser Ile Tyr Asp Gln Ile

20 25 30

Tyr Gly Gln Val Leu Ser Asp Ile Gln Ala Lys Lys Val Ala Glu Glu

35 40 45

Glu Glu Ala Arg Arg Leu Ala Glu Glu Ala Leu Ala Lys Lys Lys Ala

50 55 60

Glu Glu Glu Glu Ala Arg Arg Leu Ala Lys Glu Ala Leu Ala Gln Lys

65 70 75 80

Lys Leu Gln Ala Arg Lys Ala Lys Glu Ala Ala Glu Lys Thr Arg Thr

85 90 95

Leu Phe Ser Leu Trp Ala Leu Ala Asp Ala Met Arg Arg Ser Tyr Tyr

100 105 110

Pro Asp Met Thr Arg Glu Thr Leu Phe Arg Lys Leu Ala Lys Ser Thr

115 120 125

Asn Thr Ala Leu Asp His Glu Asp Asp Thr Leu Phe Gln Lys Leu Ala

130 135 140

Lys Ala Thr Asn Thr Ala Leu Asp His Glu Asp Asp Thr Ala Ser Pro

145 150 155 160

Ile Gln Pro Val His Met Pro Thr Gln Tyr Gly Lys Glu Val Asn Tyr

165 170 175

Glu Asn Asp Met Lys Pro Leu Asp Ala Ser Ser Ser Gln Pro Leu Asp

180 185 190

Glu Leu Asn Lys Ser Thr Gln Asn Val Ser Leu Glu Gly Lys Ala Ala

195 200 205

Val Gln Glu Gly Gly Ile Gly Ser Ala Gln Leu Leu

210 215 220

Claims

1.一个紫花苜蓿MsGPF基因，其特征在于，该基因的DNA序列长度为1782bp，其中包含8个外显子和7个内含子，具体如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述紫花苜蓿MsGPF基因的cDNA，其特征在于，cDNA序列长度为991bp，具体如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求2所述紫花苜蓿MsGPF基因cDNA所编码氨基酸，其特征在于，共编码220个氨基酸，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1所述紫花苜蓿MsGPF基因的制备获得方法，其特征在于，通过PCR扩增方法制备获得，具体包括如下步骤：

(1)提取基因组DNA

提取紫花苜蓿WL903品种基因组DNA；

(2)设计扩增MsGPF基因用引物如下

MsGPFDNA-s:5’-ATTCTTTCAAAAAAAAAAAAATTC-3’，

MsGPF DNA-a:5’-CGACACAAAAGCCATTTCATAG-3’；

(3)PCR进行扩增MsGPF基因DNA序列

以步骤(1)中所制备的基因组DNA为模板，利用步骤(2)中所设计引物，进行PCR扩增，扩增产物即为MsGPF基因。

5.权利要求1所述紫花苜蓿MsGPF基因在苜蓿促生长中的应用，其特征在于，通过转基因技术将MsGPF超表达后，用于促进苜蓿的生长。

6.一种提高苜蓿生长特性的转基因品种培育方法，其特征在于，利用基因工程技术手段，借助于表达载体将紫花苜蓿MsGPF基因在目标植物内进行过表达，从而提高其生长量；

所述紫花苜蓿MsGPF基因序列如SEQ ID NO.1所示；

所述目标植物，具体为苜蓿驯鹿品种。

7.如权利要求6所述提高苜蓿生长特性的转基因品种培育方法，其特征在于，所述表达载体，具体为：pCAMBIA3301。